no cacaueiro
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO STÊNIO CARVALHO SANTOS ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Agosto de 2005 STÊNIO CARVALHO SANTOS CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte obtenção do das título exigências de Mestre Genética e Biologia Molecular. STÊNIO CARVALHO SANTOS ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Agosto de 2005 para em STÊNIO CARVALHO SANTOS CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular. APROVADA: 09 de agosto de 2005 Profª. Drª. Andréa Cristina Mariano Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto UNEB UEFS Prof. Dr. Júlio Cézar de Mattos Cascardo UESC - Orientador S237 Santos, Stênio Carvalho. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, causador da doença vassoura-de-bruxa no cacaueiro / Stênio Carvalho Santos. – Ilhéus, Ba: UESC, 2005. 56f. : il. Orientador: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular Inclui bibliografia. 1. Cacau – Doenças e pragas – Controle biológico. 2. Vassoura-de-Bruxa (Fitopatologia). 3. Fungos fitopatogênicos. 4. Cacau – Fungos e doenças. I. Título. CDD 633.7496 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Plácido Alves dos Santos e Adélia Agapito Carvalho Santos, pelo amor, carinho e doação, dedico. À minha esposa Heliana Argôlo Carvalho e ao meu filho, Stênio Carvalho Filho, pelo afeto e dedicação, ofereço. ii AGRADECIMENTOS A Deus, pela minha vida e saúde, e por todos que contribuíram de forma direta ou indireta, para o cumprimento desta jornada. À Coordenação e Secretaria do Mestrado em Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Santa Cruz, pelo apoio e incentivo. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia – FAPESB, pela concessão da bolsa de estudo de mestrado. Ao Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo, pela oportunidade, orientação, amizade, presteza e confiança. Aos pesquisadores Abelmon Gesteira (co-orientador), Fabienne Micheli e Carlos Priminho (colaboradores), Andréa Mariano, Acássia Pires, Fátima Alvim, Márcio Costa, Karina Gramacho, pelo apoio e cooperação durante o desenvolvimento da pesquisa. Aos professores Diego Frias, Edna Dora Martins, Irene Carzola, José Luiz Bezerra, Júlio Cascardo, Leandro Loguércio, Mônica Bertão e demais professores do programa, pela competência no exercício da docência e dedicação ao programa de mestrado. A todos os funcionários da Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho. Ao pessoal da iniciação científica em especial à Thaís Bomfim Santos, pela cooperação nos afazeres de bancada. A Jaci, Pelé e Robson, pelo apoio técnico e inestimável atividade laboratorial. Aos colegas do Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Genômica e Expressão Gênica, em especial Geruza Ceita, Jeiza Leal e Joci Neuby, pelo apoio, amizade e companheirismo. iii Aos colegas do Mestrado em Genética e Biologia Molecular da UESC, especialmente a Cristiano e Fabrício, e aos companheiros de turma Milde, Alayne, André, Dine, Dahy, Dori, Silsan, Maizete, Marcinha, Ritinha, Sônia, Valéria e Van, pelo convívio e amizade. A minha família (pais, esposa, filho, irmãos, sobrinhos, sogro e sogra, cunhados, tios e primos) e amigos, pelo amor, carinho e apoio constante. iv ÍNDICE EXTRATO .................................................................................................................vii ABSTRACT................................................................................................................ix LISTA DE FIGURAS..................................................................................................xi LISTA DE TABELAS ...............................................................................................xiii 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................3 2.1. O cacaueiro (Theobroma cacao L.)...................................................................3 2.2. Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer ................................................................4 2.3. Interação planta-patógeno ................................................................................9 2.4. Hidrofobinas ....................................................................................................10 2.4.1. Propriedades bioquímicas e biofísicas das hidrofobinas ..........................11 2.4.2. Funções biológicas das hidrofobinas ........................................................12 2.4.2.1. Família gênica ....................................................................................12 2.4.2.2. Surgimento de hifas aéreas................................................................13 2.4.2.3. Proteção das estruturas fúngicas .......................................................15 2.4.2.4. Fixação de patógenos a superfície de hospedeiros ...........................15 2.4.3. Potencial biotecnológico ...........................................................................15 3. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................17 3.1. Análises de seqüências gênicas e desenho de oligonucleotídeos específicos .............................................................................................................17 3.2. Cultivo de Crinipellis perniciosa ......................................................................19 3.3. Cultivo de C. perniciosa em sistema artificial ..................................................19 3.4. Material vegetal infectado por C. perniciosa ...................................................21 3.5. Extração do DNA genômico de C. perniciosa .................................................22 v 3.6. Extração do RNA total de C. perniciosa..........................................................23 3.7. Extração do RNA total de meristemas de T. cacao.........................................24 3.8. Extração de proteínas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa ........25 3.9. Southern Blot ..................................................................................................25 3.10. Síntese de cDNA por meio de RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) ....................................................................................27 4. RESULTADOS......................................................................................................31 4.1. Análise de seqüências de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa ....................31 4.2. Detecção do número de cópias gênicas de hidrofobinas de C. perniciosa .....36 4.3. Análise da expressão gênica de hidrofobinas de C. perniciosa em fases do desenvolvimento fúngico in vitro e em plântulas de cacau infectado .....................37 4.4. Indício de hidrofobinas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa .......41 5. DISCUSSÃO .........................................................................................................42 5.1. C. perniciosa codifica quatro hidrofobinas distintas e pertencentes a classe I................................................................................................................42 5.2. Hidrofobinas de C. perniciosa constituem uma família multigênica ................43 5.3. Hidrofobinas possuem expressão diferencial durante as fases do desenvolvimento fúngico e em plântulas de cacau infectado por C. perniciosa ....46 5.4. Oligomerização de hidrofobinas em cultivo de C. perniciosa..........................47 6. CONCLUSÕES .....................................................................................................48 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................49 vi EXTRATO SANTOS, Stênio Carvalho, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus - Ba, agosto de 2005. Caracterização de Hidrofobinas do Fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença Vassoura-de-Bruxa no Cacaueiro. Orientador: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Co-orientador: Abelmon da Silva Gesteira Colaboradores: Fabienne F. Lucienne Micheli e Carlos P. Pirovani. Dentre a enorme diversidade fúngica está presente o fungo filamentoso Crinipellis perniciosa, um basidiomiceto hemibiotrófico responsável pela doença vassoura-de-bruxa no cacaueiro, doença que nos últimos 15 anos vem provocando perdas significativas nas lavouras cacaueiras do Sul da Bahia. Este fungo propagase por basidiósporos produzidos em basidiomas e este evento é favorecido nas condições de monocultura e clima da região. O entendimento do ciclo de vida deste patógeno, bem como dos fatores que podem impedir a sua propagação, são de fundamental importância para a retomada da produção de cacau e da economia Sul Bahiana. Dentre as estratégias de controle, o melhoramento genético, é uma das estratégias mais promissoras. O sequenciamento de bibliotecas genômica do C. perniciosa, de ESTs da interação cacau-Crinipellis e do desenvolvimento do fungo em sistema artificial permitiu a identificação de genes importantes desse patógeno e de seu patosistema. A partir dos dados de sequenciamento dessas bibliotecas foram identificados os genes de hidrofobinas, que são proteínas de peso molecular em torno de 12 kDa, e que são secretadas por fungos filamentosos. Essas proteínas têm caráter anfipático, possuem entre 75 e 125 aminoácidos e são sintetizadas na forma monomérica, que quando encontram uma interface hidrofílica/hidrofóbica, formam vii um filme anfipático. As hidrofobinas possuem papel essencial durante a colonização, crescimento e desenvolvimento fúngico. Com isso, a hidrofobina torna-se um excelente alvo de estudo para o entendimento do ciclo biológico, visando o controle de infecção fúngica. A virulência do C. perniciosa está relacionada à indução dimórfica, apresentando fase parasítica (micélio monocariótico) e fase saprofítica (micélio dicariótico), onde as hidrofobinas devem ter participação desde a penetração do tubo germinativo dos basidiósporos nos tecidos meristemáticos de cacaueiros até a formação do basidioma. As sequências de hidrofobinas foram analisadas por ferramentas de bioinformática como BLAST, ClustalW 1.82, ORF finder e a partir dessas análises foram identificadas regiões consenso, feita a categorização de classe, os alinhamentos e agrupamento em árvore. O número de cópias do gene no genoma do fungo foi analisado. A expressão gênica foi estudada em nível transcricional por meio de RT-PCR semi-quantitativo, utilizando-se primers específicos. O fungo foi cultivado em sistema artificial (bolachas) e o RNA total extraído de diversas fases do desenvolvimento fúngico e de tecidos meristemáticos infectados. O sequenciamento das bibliotecas de ESTs de C. perniciosa permitiu a identificação de quatro cDNAs distintos que codificam para hidrofobinas. O alinhamento das seqüências deduzidas de aminoácidos, deduzidas, das hidrofobinas de C. perniciosa com outras, previamente descritas para outros fungos, mostrou que estas apresentam alta homologia com proteínas da classe I. O dendrograma mostrou que as hidrofobinas possuem um ancestral comum e, que a exemplo de outros basidiomicetos, não foram encontradas hidrofobinas da classe II. O Southern blot confirmou a presença de pelo menos quatro hidrofobinas distintas em C. perniciosa, pertencendo então a uma pequena família gênica. A análise de expressão dos genes por meio de RT-PCR mostrou que eles são expressos durante fases distintas do ciclo de vida do fungo, e em diferentes intensidades. A análise funcional desses genes poderá ajudar no entendimento da funcionalidade dos genes envolvidos durante a vassoura-de-bruxa. Palavras Chave: estudo funcional, hidrofobinas, vassoura-de-bruxa, interação planta-patógeno. viii ABSTRACT SANTOS, Stênio Carvalho, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Ba, August, 2005. Characterization of hydrophobins from the fungus Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, the causal agent Witches´ broom disease in cacao. Advisor: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Co-advisor: Abelmon da Silva Gesteira, Collaborators: Fabienne F. Lucienne Micheli and Carlos P. Pirovani. Among the enormous fungi genetic diversity, it is found the filamentous fungus Crinipellis perniciosa, a hemibiotrophic basidiomycete, responsible for the Witches´ broom disease in cacao, which is causing, for the last 15 years, significative losses in the cacao crop in Southeast Bahia. This fungus spreads through basidiospores, produced in basidiocarps, event that, found in Bahia ideal climate and host conditions. The understanding of this pathogen life cycle, allied with factors that might block its propagation, are crucial for the recovering of the cacao production, and consequently, the economy in the region. Between the control strategies, the genetic advance is one of the most promising one. The sequencing of the C. perniciosa partial genome, and ESTs from both, a cacao x C. perniciosa interaction library and a C. perniciosa simulated life cycle in artificial systems, allowed the identification of important genes from this pathogen and its pathosytem. The sequencing data revealed several hydrophobins genes. They comprehend a group of proteins with molecular weight mass around 12 kDa that are secreted from filamentous fungus. These proteins possess an amphipathic behavior, have between 75 to 125 amino acids and are synthesized as monomers, which polymerize, in the presence of a hydrophilic/hydrophobic interface, generating an amphipathic film. The hydrophobins ix play an essential role during colonization, growing and fungus development. Thus, hydrophobins are an excellent target, aiming to understand the biological life cycle, to control fungal infection. The virulence of C. perniciosa is associated to the dimorphic induction, with two distinct phases: one biotrophic (monokaryotic mycelium) and another saprophytic (dikaryotic mycelium), where the hydrophobins play an important role, from the penetration of the germinative basidiospores in the meristematic tissues, to the development of the fruit body. The hydrophobins sequences were analyzed using bioinformatic tools, such as: BLAST, ClustalW 1.82, ORF finder. From these analyses, consensus regions were identified; classes and a Phylogenetic clustering established categorized the genes. The gene copy number was identified. The mRNA expression levels were analyzed by semi-quantitative RT-PCR using specific primers. For this purpose, the fungus grew in artificial systems (cookies) and total RNA was extracted from several development times, also total RNA was extracted from infected cacao tissues. The sequencing of the ESTs revealed the presence of four distinct cDNAs hydrophobins genes. The alignment and the dendrogram of the deduced amino acid sequences, together with other previously described hydrophobins, showed that the C. perniciosa genes belong to proteins class I, and that they have a common ancestor, and, such as another basidiomycetes. No class II hydrophobins were detected. The genomic Southern blot confirmed the presence of at least four distinct genes, thus they can be considered as a small gene family. The expression analyses by RT-PCR showed that the different genes are expressed during distinct phases of the fungus life cycle, and at different levels. The functional analysis of these genes will help to elucidate the role of the genes involved in the disease development. Key words: functional studies, hydrophobins, witches’ broom disease, plantpathogen interactions. x LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ciclo de vida do fungo Crinipellis perniciosa. ...............................................6 Figura 2. Sintomas da vassoura-de-bruxa em cacau ..................................................8 Figura 3. Oligomerização de hidrofobinas formando interface hidrofílica/hidrofóbica ................................................................................................11 Figura 4. Comparação dos arranjos de pontes disulfeto de hidrofobinas de classe I (SC3) e classe II (CU) ...............................................................................................13 Figura 5. Modelo da formação da interface hidrofóbica/hidrofílica das hidrofobinas .14 Figura 6. Desenho de oligonucleotídeos específicos que visa a síntese de cDNA por meio de RT-PCR semi-quantitativo ...........................................................................18 Figura 7. Desenho esquemático do cultivo de C. perniciosa in vitro e em vassoureiro................................................................................................................20 Figura 8. Fases do desenvolvimento de C. perniciosa cultivado em sistema artificial.........................................................................................................21 Figura 9. Eletroforese dos produtos de extração de RNA total em gel de agarose...28 Figura 10. Síntese de cDNA e padronização da amplificação de primers específicos para análise de expressão semi-quantitativa ............................................................30 Figura 11. Alinhamento das seqüências de hidrofobinas classe I .............................33 Figura 12. Dendrograma ...........................................................................................34 Figura 13. Perfil hidropático e alinhamento das seqüências primárias de hidrofobinas..........................................................................................................35 Figura 14. Análise genômica do número de cópias de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa .................................................................................................36 Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de RT-PCR de cDNAs de C. perniciosa e cacaueiros infectados ...........................................................................39 xi Figura 16: Expressão relativa das hidrofobina de Crinipellis perniciosa normalizadas pela expressão da actina ..........................................................................................40 Figura 17. SDS-PAGE 12,5 % de proteínas hidrofóbicas secretadas pelo micélio de C. perniciosa ............................................................................................41 xii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Similaridade de seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C. perniciosa com hidrofobinas de classe I de diferentes basidiomicetos......................30 Tabela 2. Análise densitométrica da expressão semi-quantitativa de hidrofobinas de C. perniciosa via RT-PCR..........................................................................................36 Tabela 3. Análise de possível conservação evolutiva das funções das hidrofobinas de C. perniciosa.........................................................................................................45 xiii 1. INTRODUÇÃO O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma planta arbórea, neotropical, originada da América Central e da Amazônia, cujo principal produto comercial são as amêndoas, matéria-prima da indústria de chocolate. No sul da Bahia a cacauicultura sofreu prejuízos econômicos de grande escala devido à propagação da vassourade-bruxa, doença causada pelo fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer. O fungo Crinipellis perniciosa é um basidiomiceto, hemibiotrófico, que apresenta fase parasítica e fase saprofítica, provocando alterações histológicas, morfológicas e fisiológicas tecido-específicas e temporais no cacaueiro (FRIAS et al., 1991; ORCHARD et al., 1994; SILVA, 1997). O fungo infecta os lançamentos foliares novos, os frutos em desenvolvimento e as almofadas florais, podendo até provocar a morte da planta quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores abióticos (QUEIROZ et al., 2003). O controle dessa doença tem-se baseado em poda fitosanitária, controle químico e biológico, e o uso de cultivares resistentes. Entretanto, uma das alternativas mais promissoras para o manejo da vassoura-de-bruxa é a elaboração de novas estratégias de controle através do estudo molecular. Estudos moleculares do C. perniciosa e da interação T. cacao : C. perniciosa têm sido alvos de muitos projetos de pesquisas que visam elucidar a biologia do fungo e os diferentes mecanismos de defesa acionados pela planta contra o ataque do patógeno. A partir do sequenciamento genômico do C. perniciosa, de cDNAs das fases de desenvolvimento fúngico em sistema artificial e da interação cacau-Crinipellis estão sendo suscitados importantes conhecimentos sobre a interação planta-patógeno, o que contribuirá para uma melhor estratégia de controle. 1 Com o sequenciamento, já foram identificados genes envolvidos em rotas metabólicas, processo de colonização e de resposta de defesa nos tecidos do hospedeiro. Dentre estes genes estão os genes de hidrofobinas, proteínas secretadas por fungos filamentosos. As hidrofobinas são pequenas proteínas anfipáticas de 75 a 125 aminoácidos, que são sintetizadas na forma monomérica. Porém, quando encontram uma interface hidrofílica/hidrofóbica, polimerizam-se formando um filme anfipático. As hidrofobinas possuem papel crucial durante a infecção fúngica, no processo de penetração dos tecidos, cruzamento sexual, mudanças de fases, dentre outros (KERSHAW; TALBOT, 1998). Com isso, as hidrofobinas são excelentes alvos biológicos para terem sua função bloqueada, visando o controle de fungos fitopatogênicos. Estudos de caracterização molecular como identificação e alinhamento de seqüências, categorização de classe protéica, agrupamento através de similaridade de seqüências em árvore, determinação do número de copias gênicas, e análise de expressão semi-quantitativa e diferencial foram realizados. Portanto, nesta dissertação, visamos o estudo dessas hidrofobinas, que representa uma das mais importantes proteínas envolvidas durante a interação patógeno-hospedeiro, que certamente ajudará no entendimento e futuros estudos de seus modos de ação. A análise da regulação desses genes será de fundamental importância na caracterização de mecanismos envolvidos nas reações de resistência e de susceptibilidade à doença. 2 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. O cacaueiro (Theobroma cacao L.) O cacaueiro é uma espécie de clima tropical inicialmente descrita como Cacao fructus por Charles de L’ Écluse. Posteriormente, em 1737, foi descrita por Linneu como Theobroma fructus, permanecendo essa classificação até 1753, quando foi definitivamente denominado como Theobroma cacao L. (GRAMACHO et al., 1992). O cacaueiro foi originalmente classificado como uma dicotiledônea pertencente à família Sterculiaceae e gênero Theobroma. Este gênero inclui outras 21 espécies (CUATRECASAS, 1964), das quais apenas o cacau e o cupuaçu (Theobroma grandiflorum) são espécies comercializadas. Mais recentemente foi sugerida a reclassificação do cacaueiro como pertencente à família Malvaceae (ALVERSON et. al, 1999), muito embora não venha sendo adotado essa nova classificação botânica na maioria dos trabalhos científicos mais recentemente publicados. O cacaueiro é uma planta perene, arbórea, alógama, e nativa das florestas tropicais úmidas das Américas do Sul e Central, sendo que o seu centro de origem possivelmente situa-se nas nascentes dos rios Amazonas e Orinoco (GRAMACHO et al., 1992). É cultivada nas Américas do Sul e Central, Caribe, África e Ásia, e as suas amêndoas constituem a principal matéria prima para a indústria de chocolate, sendo o cacau consumido também na utilização da manteiga de cacau, polpa, licor, achocolatados, entre outros produtos. O Brasil sempre se destacou na produção de cacau, chegando a ser considerado o principal país produtor das Américas no ano 3 de 1994 (PURDY; SCHIMIDT, 1996). Diversas doenças como a vassoura-de-bruxa, podridão-parda, monilíase e morte-descendente são responsáveis pela diminuição da qualidade e quantidade da produção das lavouras cacaueiras nas Américas, sendo o Crinipellis perniciosa o patógeno que se destaca como principal causador da redução da produtividade das plantações de cacau brasileira (DIAS, 2001). 2.2. Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer O fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, agente etiológico da vassourade-bruxa, foi descrito primeiramente em 1785 por Ferreira, como “lagartão”, devido as malformações por ele observada (SILVA, 1987). Com a primeira investigação científica da vassoura-de-bruxa do cacau no Suriname em 1895, o patógeno foi nomeado Marasmius perniciosus (STAHEL, 1915); e renomeado para Crinipellis perniciosa por Singer (1942), ao revisar o gênero Marasmius. O C. perniciosa é da ordem Agaricales, família Tricholomataceae, e é endêmica da Bacia Amazônia na região da América do Sul (HOLIDAY, 1952); sendo o único patógeno do cacau que se desenvolve simultaneamente com o hospedeiro (PURDY; SHIMIDT, 1986). A vassoura-de-bruxa é a doença mais destrutiva do cacaueiro, provocando enormes prejuízos na América do Sul e Caribe (THAROLD, 1975). A vassoura-de-bruxa do cacaueiro foi inicialmente detectada em alguns países como: Peru (1930), Venezuela (1928), Suriname (1895), Guiana (1906), Colômbia (1917), Equador (1921), Trinidad & Tobago (Trinidad 1928; Tobago 1939), Panamá (1989) e Brasil, na Bahia em 1989 (PURDY; SCHIMIDT, 1996). O primeiro relato da doença no Brasil deu-se na região Sul do estado da Bahia no município de Uruçuca, em maio de 1989 (PEREIRA et al., 1989), seguido de uma segunda observação seis meses depois no município de Camacã, 120 Km ao sul. A área com plantas infectadas em Camacã era maior do que aquela encontrada em Uruçuca, sugerindo que a introdução se deu anteriormente à de Uruçuca. O aparecimento da doença em dois sítios distantes e distintos, bem no meio da região cacaueira, sugere que ocorreu mais do que uma introdução, provavelmente a partir da Região Amazônica, e possivelmente, por meio de intervenção humana (ARDEBRHAM et al., 1999; PEREIRA et al., 1996; ROCHA et al., 1993). A região sul bahiana compreende uma 4 das maiores regiões produtoras de cacau em área contínua no mundo. A região Sul Bahiana compreende uma área de 600.000 ha com predominância de cacaueiros da variedade “Comum“, considerado altamente suscetível, e apresentando baixa variabilidade genética, o que favoreceu a dispersão da doença causando progressivas perdas na produção de cacau (CASCARDO; FIGUEIRA, 1995). O C. perniciosa apresenta ciclo de vida hemibiotrófico (GRIFFITH; HEDGER, 1994), apresentando fase biotrófica e fase saprofítica (Figura 1), provocando alterações histológicas, morfológicas e fisiológicas tecido-específicas e temporais no cacaueiro. A infecção típica (vassoura vegetativa) se inicia quando o tubo germinativo dos basidiósporos penetra no tecido meristemático de gemas apicais em atividade. A resposta do hospedeiro, localizada no ponto de infecção, resulta em considerável aumento dos tecidos e no desenvolvimento de ramos laterais, sintomas que levam a perdas indiretas da produção por causar debilitação da árvore infectada (FRIAS et al., 1991; ORCHARD et al., 1994; SILVA, 1997). Quando há infecção em frutos, as sementes tornam-se impróprias para o consumo e há também a formação de frutos em forma de morangos e cenouras, O fungo permanece na fase primária (micélio biotrófico, monocariótico) por um tempo de 6 a 9 semanas dentro de tecidos em desenvolvimento, até que a vassoura verde inicie um processo de necrose, alteração associada à mudança do fungo para uma fase secundária (micélio saprofítico, dicariótico). Subseqüentemente à morte das vassouras, o micélio saprofítico frutifica formando basidioma (WHEELER, 1985). Os basidiósporos são dispersos pelo vento e chuva, tipicamente à noite e são os únicos propágulos em condições adequadas comprovadamente capazes de infectar o cacaueiro, geminando na superfície da planta e produzindo tubos monocarióticos, que são atraídos para os estômatos ou espaços intercelulares do hospedeiro (FRIAS et al., 1991; KILARU; HASENSTEIN, 2005; SILVA, 1997). Esses basidiósporos são produzidos em lamelas na parte inferior do píleo do basidioma e são liberados em condições ambientais em que a umidade está próxima a saturação com temperatura variando entre 20 e 30 ºC (ROCHA; WHELLER, 1985). Devido a sua sensibilidade a radiação UV-B e sua facilidade de dessecação, os basidiósporos perdem a capacidade de germinação rapidamente, e é muito improvável que estes possam se dispersar a um raio superior a 60 Km (ANDEBRHAN et al., 1993; FRIAS et al., 1991). 5 Figura 1. Ciclo de vida do fungo Crinipellis perniciosa. Figura extraída de Wheeler (1985). 6 A doença vassoura-de-bruxa inicia-se quando ocorre a infecção de tecidos em crescimento da planta, tais como, ramos apicais, almofadas florais, flores e frutos resultando em anormalidades, que variam de acordo com o tipo de tecido infectado, do estágio de desenvolvimento e o cultivar (SILVA et al., 2002). A partir da infecção do fungo ocorre um intumescimento e ramificação de ramos apicais e gema axilares desenvolvendo-se um grande número de ramos dando a aparência de uma vassoura (Figura 2a, b), resultado da perda de dominância apical dos ramos, apresentando também intumescimento dos pecíolos e pulvinos das folhas (Figura 2c). As vassouras apresentam coloração verde vívido quando jovem, e com o desenvolvimento da doença passam a apresentar uma coloração marrom. Cancros são formados a partir da infecção em folhas, pulvinos e pecíolos (Figura 2d). As infecções de flores resultam em vassouras de almofadas e desenvolvimento de fruto morango e cenoura (Figura 2e, f, g). As infecções em frutos jovens apresentam externamente nas áreas infectadas uma lesão negra, dura e irregular. A infecção tardia dos frutos causa lesões necróticas e irregulares. Quando internamente, a casca apresenta pontos necróticos de diferentes tamanhos com liquefação da mucilagem (Figura 2h). Em frutos próximo a maturação, a infecção é notada apenas quando esses são colhidos, sendo que em alguns frutos, parte das amêndoas podem ser aproveitadas para o beneficiamento, entretanto não podem ser utilizadas para o plantio (GRAMACHO et al., 1992; GRIFFITH et al., 2003; SILVA et al., 2002; WHEELER, 1985). Após necrose tecidual ocorre uma degradação pelo micélio saprofítico, provavelmente com o envolvimento de enzimas hidrolíticas que criam um ambiente adequado à sua sobrevivência (GRIFFITH et al., 1994; PURDY; SCHIMIDT, 1996), e posterior formação dos basidiomas (Figura 2i), estruturas reprodutivas do fungo onde se forma os basidiósporos que é a forma infectiva, que dará continuidade do ciclo de infecção (FRIAS et al., 1991; SILVA, 1997). Os mecanismos de mudanças das fases do desenvolvimento da doença e seus sintomas permanecem desconhecidos embora sejam indicativos de um desequilíbrio na regulação do crescimento da planta ou da utilização de recursos biológicos pelo patógeno (ORCHARD et al., 1994). 7 Figura 2. Sintomas da vassoura-de-bruxa em cacau. a – proliferação de vassouras axilares e infecção nos ramos em formação (seta); b – infecção de gema axilar; c – vassoura terminais, com intumescimento de pecíolos e pulvinos (setas); d – cancro do pecíolo foliar, dando origem a vassoura axilar (seta); e – vassoura de almofada floral composta; f – frutos morangos; g – frutos cenoura verde e seco preso a almofada floral; h – infecção interna em fruto, com liquefação da mucilagem; i – produção de basidiomas em vassouras penduradas. Figura extraída de Silva et. al. (2002). 8 2.3. Interação planta-patógeno As interações entre plantas e patógenos são bastante estudadas pela contínua exposição de plantas ao ataque de microorganismos capazes de causar doenças que ocasionam sérios danos à agricultura, sendo necessário a presença de mecanismos de defesa na planta para contribuir com a sua sobrevivência (CONRATH et al, 2002; JACKSON; TAYLOR, 1996). Fungos fitopatógenos possuem estratégias biotróficas, necrotróficas e hemibiotróficas para o alojamento em seus hospedeiros. Podendo essa colonização ser iniciada pela invasão de tecidos que se encontram previamente feridos, penetração nos tecidos superficiais por ataque enzimático, ou por orifícios naturais como lenticelas e estômatos. Os fungos biotróficos possuem caráter de vida oposto aos necrotróficos, pois eles necessitam de tecidos vivos para seu estabelecimento enquanto que os necrotróficos têm a necessidade da morte do tecido para o seu desenvolvimento (HAMMOND-KOSACK; JONES, 1997). Fungos hemibiotróficos, como o Crinipellis perniciosa, utilizam estratégia intermediária, primeiramente mantendo as células do hospedeiro vivas, voltando o metabolismo a seu favor, porém com o avanço da doença promovem a morte das células e completam seu ciclo de vida (HAMMOND-KOSACK; JONES, 2000; PURDY; SCHMIDT, 1996). A planta precisa de um sistema de vigilância para que possa reconhecer sinais de ataque de patógenos e acionar os mecanismos de defesa. Inicialmente a resposta de defesa da planta resulta na formação de condições não favoráveis ao desenvolvimento e propagação do patógeno, que apresenta como característica a morte celular localizada ao redor do ponto de invasão do patógeno. Esta resposta imediata da planta ao ataque de patógenos é chamada de resposta hipersensitiva, além desta, outros mecanismos de defesa também são acionados entre eles a ativação de genes relacionados a patogênese, como a presença de proteínas PR (pathogenesis related proteins) na vassoura verde, o que é sugestivo de uma tentativa de aumento da resposta de defesa do hospedeiro (DANGL et al., 2000; GRIFFITH et al. 2003), a secreção de toxinas do fungo ou da senescência acelerada do hospedeiro (EVANS, 1980). A identificação e a análise de expressão de genes envolvidos na interação planta-patógeno pode vir a elucidar fatores e ou mecanismos associados ao 9 patosistema, possivelmente abrindo um novo caminho para a produção de variedades de plantas resistentes a partir da transformação genética. Visto esta possibilidade é que pesquisadores da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) vem desenvolvendo pesquisas com genes codificadores de glucanases, quitinases e hidrofobinas, que são importantes proteínas envolvidas na interação cacauCrinipellis, um dos maiores problemas da cacauicultura da região Sul da Bahia. 2.4. Hidrofobinas As hidrofobinas constituem uma família de pequenas proteínas extracelulares, com aproximadamente 100 aminoácidos, que são moderadamente hidrofóbicas e secretadas em abundância por fungos filamentosos. Os genes codificadores de hidrofobinas já foram identificados em ascomicetos, deuteromicetos e basidiomicetos que representam o maior filo do reino fungi. O primeiro relato da existência das hidrofobinas foi em Schizophyllum commune, e essas podem compor 10% da proteína total deste organismo (WESSELS et al., 1991a,b). As hidrofobinas em sua maioria só são conhecidas por suas sequências gênicas, e sua importância com relação ao crescimento e desenvolvimento de fungos foi principalmente elucidada baseado no estudo de mutagênese, de modo que somente algumas de suas proteínas foram isoladas e estudadas. As hidrofobinas formam uma interface hidrofílica/hidrofóbica quando em contato entre água e ar, água e óleo, ou água e um sólido hidrofóbico como, por exemplo, o teflon (Figura 3), formando um filme anfipático (WÖSTEN; DE VOCHT 2000). Dentre as diversas funções realizadas pelas hidrofobinas durante o desenvolvimento fúngico está o direcionamento da saída do fungo do meio aquoso para o ambiente hidrofóbico, criando estruturas fúngicas aéreas como as hifas aéreas, os basidiomas e os esporos (WESSELS, 1997; WÖSTEN; WESSELS, 1997; WÖSTEN, 2001). Além disso, fornecem canais com coberturas hidrofóbicas em basidiomas, o que possibilita uma troca gasosa eficiente quando em ambiente aquoso (LUGONES et al., 1999; SCHERRER et al., 2000; VAN WETTER et al., 2000; WESSELS et al., 1996), elas também intermedeiam a fixação da hifa em 10 superfície hidrofóbica que é um passo importante da interação patogênica antes da penetração fúngica e da ocorrência da infecção (TALBOT et al., 1996; VAN WETTER et al., 2000; WÖSTEN et al., 1994b). Figura 3. Oligomerização de hidrofobinas formando interface hidrofílica/hidrofóbica. A – Filme hidrofóbico, como por exemplo teflon, fortemente formado por hidrofobinas de classe I imerso em uma solução aquosa formando ângulo de contato que varia ente 22 e 63°; B – Monômeros de hidrofobinas desidratados, localizados sob uma interfase hidrofílica (tal como, vidro ou papel filtro), quando em contato com uma solução aquosa tornam-se hidrofóbicos, formando ângulo de contato de 110°. Figura extraída de Wösten e De Vocht (2000). 2.4.1. Propriedades bioquímicas e biofísicas das hidrofobinas As hidrofobinas são pequenas proteínas de caráter hidrofóbico, caracterizadas por oito resíduos de cisteína conservados e padrões hidropáticos típicos (WESSELS, 1997). Estas oito cisteínas são confirmadas principalmente por meio do estudo de hidrofobina de Ophiostoma ulmin (CU) e Schizophyllum commune (SC3) que formam quatro ligações disulfeto intramolecular, com o acoplamento 11 provável de cys1-cys2, cys3-cys4, e assim por diante (Figura 4). As posições polares e apolares são bem preservados nos aminoácidos que conferem o padrão de hidrofobicidade para todas as hidrofobinas. As diferenças nos padrões de hidrofobicidade e das propriedades biofísicas permitem realizar a classificação das hidrofobinas em classes I e II (DE VRIES et al., 1993; WESSELS, 1994). As membranas formadas pelo agrupamento das hidrofobinas de classe I são altamente insolúveis, capazes de suportar uma concentração de 2% de SDS e uma temperatura de 100 °C, sendo dissociado apenas pela ação do ácido fórmico ou ácido trifluoroacético. Entretanto, as membranas formadas pelo agrupamento das hidrofobinas de classe II são menos estáveis, podendo ser dissociadas facilmente com etanol a 60% ou com SDS a 2% (RUSSO et al., 1982). Comparando as seqüências de aminoácidos das hidrofobinas de classe I e II pode-se observar que o comprimento do segmento entre as pontes cys3 e cys4 em hidrofobinas de classe II é muito mais curto que as de classe I (Figura 4). Também é verificado que as hidrofobinas de classe II contêm aminoácidos mais carregados que as de classe I (WÖSTEN; DE VOCHT, 2000). 2.4.2. Funções biológicas das hidrofobinas 2.4.2.1. Família gênica As hidrofobinas parecem estar sempre presente no reino fungi. Seus genes são encontrados em ascomicetos, deuteromicetos e basidiomicetos, sendo que as hidrofobinas de classe II até hoje não foram identificadas em basidiomicetos. Alguns fungos contêm mais de um gene de hidrofobina formando uma pequena família gênica. Em S. commune foram identificados quatro genes de hidrofobina de classe I, com o gene SC3 ativo em micélio monocariótico e dicariótico, e os genes SC1, SC4 e SC6 ativos somente em micélio dicariótico, na formação do basidioma. Deste modo, é visto que diferentes hidrofobinas são expressas em fases diferentes do desenvolvimento fúngico e são responsáveis por funções biológicas diferentes (KERSHAW et al., 1998; VAN WETTER et al., 2000; WÖSTEN et al., 1994a). 12 Pesquisas com ensaios de complementação mostraram que hidrofobinas de mesma classe podem substituir funcionalmente até certo ponto uma outra, porém não se sabe se entre as classes a substituição pode ser funcional (KERSHAW et al., 1998). Figura 4. Comparação dos arranjos de pontes disulfeto de hidrofobinas de classe I (SC3) e classe II (CU). O cumprimento da parte N-terminal que precede o primeiro resíduo de cisteína e o comprimento do segundo segmento ente a cys 3 e cys 4 são diferentes entre as hidrofobinas de classe I e II. Notase que o comprimento da parte N-terminal das hidrofobinas de classe I e II que precede o primeiro resíduo de cisteína, inclui uma sequência sinal (± 20 aa) que está ausente nas proteínas maduras. Figura extraída de Wösten e De Vocht (2000). 2.4.2.2. Surgimento de hifas aéreas O passo inicial para os fungos formarem hifas aéreas é a saída das hifas do substrato úmido para o ar (WÖSTEN et al., 1999), essas hifas surgem recobertas por uma camada hidrofóbica, e essa camada é decorrente do agrupamento dos monômeros de hidrofobina que formam um filme anfipático (Figura 5). O lado hidrófilo do filme é voltado para a parede da hifa que tem caráter hidrofílico, enquanto o seu lado hidrofóbico está exposto. É provável que o monômero de hidrofobina secretado na extremidade de uma hifa aérea não pode ser difundido 13 para fora do oligômero da parte em desenvolvimento desta hifa, considerando que o ápice desta, pode ainda conter monômeros (WESSELS, 2000). Tanto na classe I como na classe II das hidrofobinas, a cobertura das estruturas aéreas fúngicas com uma camada hidrofóbica, é útil para o seu crescimento e desenvolvimento (CLASSEN et al., 2003; ELLIOT et al., 2003). Figura 5. Modelo da formação da interface hidrofóbica/hidrofílica das hidrofobinas. a - Hifa crescendo em ambiente úmido, cercado por uma película da água. Durante o crescimento, monômeros de hidrofobinas são secretadas em abundância. Os monômeros são descritos como tendo dois domínios hidrofóbicos e dois domínios hidrofílicos; b – A oligomerização reduz a tensão da superfície, permitindo que a hifa cresça e escape para o ar, sendo contínua a secreção de hidrofobinas; c – A hifa aérea cresce com contínua secreção de monômeros de hidrofobinas. O filme anfipático formado contorna a camada externa da parede da hifa. Figura extraída de Talbot (1999). 14 2.4.2.3. Proteção das estruturas fúngicas As camadas de hidrofobina nas estruturas aéreas são muito resistentes a substâncias químicas e tratamento enzimático, proporcionando assim, a proteção dessas estruturas contra condições ambientais adversas, como dessecação (WÖSTEN et al., 1993). 2.4.2.4. Fixação de patógenos a superfície de hospedeiros As hifas dos fungos patogênicos são fixadas firmemente a superfícies hidrofóbicas de seus hospedeiros devido à formação da membrana anfipática de hidrofobinas, como visto em S. commune (WÖSTEN et al., 1994b). A membrana anfipática pode juntar duas superfícies incompatíveis. A afinidade da superfície hidrófila da membrana pela parede celular pode ser mediada pela atividade de lectinas, e o lado hidrofóbico da membrana interage fortemente com sólidos hidrofóbicos por interações de mesmo caráter (BECKERMAN; EBBOLE, 1996). 2.4.3. Potencial biotecnológico As hidrofobinas possuem várias aplicações industriais. Suas aplicações potenciais estão baseadas nas atividades de superfície e das propriedades de polimerização. A natureza anfipática dos oligopeptídeos das hidrofobinas sugere que elas possam ser úteis alterando as propriedades de superfície para as quais elas são aplicadas. As hidrofobinas se agrupam com a aeração, alterando sua forma e estabilidade formando um filme para cobrir as vesículas de gás. Estas formam espumas muito estáveis em condições laboratoriais (WÖSTEN et al., 1993). O uso de hidrofobinas pode fornecer uma melhoria natural em processos industriais, como a produção de produtos de nata, confeitaria, refrigerantes, e cerveja. Além disso, hidrofobinas de classe Il que também produzem espumas estáveis em aeração mostram uma diferença de solubilidade quando pressurizados (TAKAI; RICHARDS, 1978). Esta característica sugere utilidade efetiva em alimentos pressurizados onde 15 a formação de uma espuma estável é requerida na abertura de um recipiente pressurizado. As hidrofobinas também alteram a afinidade hídrica de superfícies (TALBOT et al., 1996; WÖSTEN et al., 1993) permitindo seu uso em fabricação de produtos para tratamento de cabelo. Seu filme pode formar adesivo plástico capaz de mudar propriedades de superfícies. O uso de hidrofobinas na indústria médica pode estar relacionado na cobertura de superfícies como em cobertura de cateteres, cirurgia como transplantes e implantes. Seu uso também é potencialmente útil em muitos processos por ser uma proteína natural, utilizada na alimentação humana, presente nas superfícies de cogumelos comestíveis, sugerindo a sua não toxidade, estando seguro a sua introdução em uma variedade de produtos (KERSHAW; TALBOT, 1998). 16 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Análises de seqüências gênicas e desenho de oligonucleotídeos específicos As seqüências identificadas nos bancos de dados do Projeto Genoma do Crinipellis perniciosa, na biblioteca de ESTs da Interação Cacau:Crinipellis e na biblioteca de ESTs do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial foram analisadas com programas disponíveis nos seguintes endereços eletrônicos: análise de similaridade de seqüências, BLAST - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; tradução das seqüências de nucleotídeos, ORF finder - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html; predição do sítio de clivagem do peptídeo sinal, SignalP - http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; análise de padrões de hidrofobicidade, ProtScale - http://au.expasy.org/tools/protscale.html; alinhamento de seqüências, MultAlin - http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html e ClustalW 1.82 - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/, também utilizado para construir um dendrograma. A análise das seqüências possibilitou o desenho de cinco oligonucleotídeos específicos sendo quatro primers senso e um anti-senso (Figura 6) que flanqueiam os quatros distintos cDNAs de hidrofobinas de C. perniciosa com a finalidade de avaliar a expressão desses genes via RT-PCR (Reverse transcriptase - polymerase chain reaction) semi-quantitativo. 17 Figura 6. Desenho de oligonucleotídeos específicos que visa a síntese de cDNA por meio de RT-PCR semi-quantitativo. 18 3.2. Cultivo de Crinipellis perniciosa Micélios de C. perniciosa foram inoculados e cultivados em meio de cultura composto por Glicose 1 % (p/v), NH4H2PO4 0,1 % (p/v), KCl 0,02 % (p/v), MgSO4.7H2O 0,02 % (p/v), CuSO4 0,005 % (p/v), ZnSO4.7 H2O 0,001 % (p/v), extrato de levedura 0,5 % (p/v); Para confecção do meio sólido foi adicionado ágar 1,5 % (m/v), antes da autoclavagem. O meio de cultura foi esterilizado através de autoclavagem a 121 ºC e pressão de 1 atm por 20 minutos. Após a inoculação o fungo foi cultivado a temperatura de 28 ºC em B.O.D., sem agitação quando em meio sólido e com agitação de 200 rpm quando em meio líquido, por 10 - 14 dias. Após o período de incubação, o micélio cultivado foi utilizado para extração de DNA e o meio líquido para purificação de proteínas secretadas. 3.3. Cultivo de C. perniciosa em sistema artificial O fungo C .perniciosa foi cultivado em sistema de bolachas (NIELLA et al., 1999), que propicia o desenvolvimento de todas as fases de crescimento de forma artificial (Figura 7). Discos de micélio dos isolados fúngicos 998, 1189 e 1441 (CEPEC/CEPLAC), cultivados em meio BDA a 25 °C por 15 dias, foram utilizados para inocular bolachas (vermiculita 38,6 %, gesso 11,6 %, farelo de trigo 48,4 %, calcário 1,4 %, água destilada suficiente para atingir o ponto de saturação) contidas em placas de Petri. As bolachas foram mantidas entre 21 e 25 °C, com 100 % de umidade e fotoperíodo de 12 horas até que o micélio tomasse toda a placa, aproximadamente 15 dias. Após este período as bolachas foram cobertas por um terriço de cacau autoclavado e mantidas nas mesmas condições anteriormente descritas até que o micélio novamente tomasse toda a placa, mais ou menos 15 dias, e então penduradas no vassoureiro com temperatura variando entre 21 e 25 °C, com 100 % de umidade e fotoperíodo de 12 horas. As coletas foram realizadas em seis diferentes estágios do cultivo, sendo a primeira coleta realizada logo após as bolachas terem sido penduradas no vassoureiro, com 35 dias de cultivo (fase 19 branca); a segunda coleta quando ocorreu a primeira mudança de coloração, quando apresentavam a cor amarela com 37 dias (fase amarela); a terceira coleta foi feita a aproximadamente 40 dias após o inicio do cultivo (fase rosa), quando ocorreu a segunda mudança de coloração, apresentando a cor rosa. Decorrido aproximadamente 15 dias após a colocação das bolachas no vassoureiro, apresentando a coloração rosa, ocorreu a sujeição de um estresse hídrico de quatro dias. Logo após o estresse hídrico, quando as bolachas apresentavam uma coloração rosa escuro foi realizada a quarta coleta (fase rosa escuro). A quinta coleta foi realizada quando as bolachas apresentavam a formação de primórdios dos basidiomas (fase de primórdios), e a sexta coleta foi a do último estágio do desenvolvimento fúngico, os basidiomas presentes nas bolachas (Figura 8). Figura 7. Desenho esquemático do cultivo de C. perniciosa in vitro e em vassoureiro (bolachas). 20 Figura 8. Fases do desenvolvimento de C. perniciosa cultivado em sistema artificial (bolachas). A – Bolachas antes da inoculação fúngica; B – Fase micelial branca; C – Fase micelial amarela; D – Fase micelial rosa; E – Fase micelial rosa escuro, de primórdios e basidioma; F – Formação de primórdios e basidioma. Fotos: Acássia B. Leal Pires. 3.4. Material vegetal infectado por C. perniciosa Sementes de Theobroma cacao da variedade catongo (susceptível ao C. perniciosa) foram plantadas em tubetes plásticos contendo solo esterilizado. As plântulas foram cultivadas em condições controladas em casa de vegetação no CEPEC/CEPLAC (Centro de Pesquisas da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira – Ilhéus Bahia) onde permaneceram até inoculação. As plântulas de T. cacao com trinta dias de crescidas foram inoculadas artificialmente por aspersão, com uma suspensão de 1 x 105 basidiósporos viáveis de Crinipellis perniciosa.ml-1 (isolado 1441 CEPEC/CEPLAC) na gema apical. Após 21 as inoculações, as plântulas permaneceram por 24 horas em câmara climatizada a 25 ºC ± 2 ºC e umidade relativa próxima a 100 % para favorecer a germinação dos basidiósporos e, a penetração no hospedeiro e conseqüentemente o estabelecimento da infecção, retornando em seguida à casa de vegetação (FRIAS et al., 1995; SILVA et al., 2000). A coleta dos meristemas apicais infectados e não infectados (controle) foram coletados 45, 60 e 90 dias após a inoculação. Após cada coleta, o material necessário às extrações de RNA total foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer -80 ºC. 3.5. Extração do DNA genômico de C. perniciosa O DNA genômico do Crinipellis perniciosa foi extraído conforme o método descrito por Zolan e Pukkila (1986). O micélio fúngico foi macerado em nitrogênio líquido e nas alíquotas de 20 a 40 mg do macerado adicionou-se 500 µL de tampão de extração (CTAB 1 %, NaCl 0,7 mol.L-1, Tris-HCl 20 mmol.L-1, pH 8,0, EDTA 10 mmol.L-1, pH 8,0 e β-mercaptoetanol 1 %) homogeneizando bem. Em seguida, foi adicionado 500 µL de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v), centrifugado a 20.000 x g por 5 minutos e a fase aquosa contendo o DNA foi recolhida. O DNA foi precipitado por adição de igual volume de isopropanol, seguido de incubação por 10 minutos a temperatura ambiente e centrifugado a 20.000 x g por 1 minuto. O precipitado de DNA foi ressuspenso em 300 µL de água milli-Q, seguido da adição de 100 µg/mL de RNAse (DNAse free) e incubado por 30 minutos a 37 ºC para a degradação dos RNAs presentes. A suspensão de DNA foi purificada com a adição de 300 µL de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v), seguida de agitação e centrifugação a 20.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa foi recolhida adicionandose 75 µL de CH3COONH4 7,5 mol.L-1 e 750 µL de etanol 95 %, incubando-se por 20 minutos a -20 ºC com a finalidade de precipitar o DNA. Após a centrifugação a 20.000 x g por 1 minuto, o DNA foi lavado com etanol 70 %, seco a temperatura ambiente e solubilizado em 50 µL de água milli-Q. Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1, 22 visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema Kodak EDAS 290. 3.6. Extração do RNA total de C. perniciosa A extração do RNA total dos distintos estágios de desenvolvimento do C. perniciosa cultivado em sistema artificial foi realizada utilizando-se o kit RNeasy® Midi (QIAGEN) conforme as recomendações do fabricante. O tecido micelial presente nas bolachas foi macerado em nitrogênio líquido e às alíquotas de 250 mg do macerado adicionado-se 5 mL de tampão RLT (fornecido pelo kit) com a adição de 50 µL de β-Mercaptoetanol. Em seguida a mistura foi homogeneizada vigorosamente e incubado em banho-maria a 56 ºC por 3 minutos, e então centrifugado a 5000 x g por 10 minutos. A solução sobrenadante foi transferida para um novo frasco, adicionando metade do volume transferido de etanol 96-100% sendo imediatamente homogeneizado por vigorosa agitação. A amostra foi então aplicada à coluna RNeasy® midi, que colocada em um tubo de centrifuga de 15 mL foi centrifugada a 5000 x g por 5 minutos. O filtrado foi descartado e à coluna foi adicionado 4 mL do tampão RW1 (fornecido pelo kit), a fim de lavar a coluna. Após a adição do tampão RW1 o tubo de centrifuga contendo a coluna foi centrifugado a 5000 x g por 5 minutos. Novamente o filtrado foi descartado e 2,5 mL do tampão RPE (fornecido pelo kit) foi adicionado à coluna presente num tubo de centrifuga que foi novamente centrifugada a 5000 x g por 2 minutos para uma nova lavagem, sendo este passo repetido por mais uma vez, sendo que ao final da última centrifugação fosse drenado todo o tampão. A coluna foi transferida para um novo tubo de centrifuga de 15 mL, e para a eluição do RNA total foi adicionada 200 µL de H2O milliq RNAse free diretamente sobre a membrana de sílica e homogeneizada delicadamente. Após a incubação a temperatura ambiente por 1 minuto, centrifugouse a coluna a 5000 x g por 3 minutos, sendo então coletado a solução de RNA total. Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1, 23 visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema Kodak EDAS 290. 3.7. Extração do RNA total de meristemas de T. cacao A extração do RNA total de tecido meristemático de T. cacao infectados e não infectados por C. perniciosa foi realizado como descrito por Gesteira et al. (2003). As amostras foram maceradas em nitrogênio líquido e às alíquotas de 80 mg adicionouse 1,5 mL de tampão de extração (ácido bórico 0,2M, EDTA 10 mmol.L-1 pH 7,6 , ajustado com Tris base), 200 µL de SDS 25 % e 200 µL de β-mercaptoetanol 13,4 mol.L-1, misturando-se bem, deixado sob agitação em vortex por 10 minutos e centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. A fase aquosa foi recuperada (cerca de 1 mL), transferida para um novo tubo e então adicionado igual volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico 25:24:1 (v/v), seguida de agitação por 10 minutos e centrifugação de 15.000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. Novamente foi recuperado a fase aquosa (cerca de 0,9 – 1 mL) e adicionado igual volume de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v). Em seguida foi homogeneizado por 10 minutos e centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Após a centrifugação, foi colhido 700 µL da fase aquosa, transferido para um novo tubo e adicionado 70 µL de NaAc 3 mol.L-1 pH 4,5 e 308 µL de butanol terciário (0.4 volume) para a eliminação da goma. Foi incubado em gelo por 30 minutos, sob agitação constante. Após a incubação foi centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a 4 ºC, recuperando a fase aquosa por inversão. Ao tubo contendo a fase aquosa foi adicionado 594 µL de butanol terciário (0,6 volume) homogeneizando bastante com o auxilio de vortex e deixado no gelo por 30 minutos. Após 20 minutos de centrifugação a 15.000 x g a 4 ºC o pellet foi lavado com EtOH 70 % gelado, seco a temperatura ambiente por 10 minutos, solubilizado em 50 µL de água milli-Q RNAse free e estocado a -80 °C. Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1, visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema Kodak EDAS 290. 24 3.8. Extração de proteínas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa O meio de cultura de C. perniciosa foi recolhido após 15 dias de cultivo do fungo, filtrado em papel filtro umedecido em água milliq e em seguida procedeu-se a extração de proteína hidrofóbicas baseado no método descrito por Santos e Cascardo (2002). Em um funil de decantação colocou-se 300 mL de meio de cultura filtrado agitando-o vigorosamente. Ao meio foi adicionado 300 mL de 2-butanol:clorofórmio 1:1 (v/v), submetendo a mistura a uma vigorosa agitação por 10 minutos. Após completa homogeneização o funil contendo a mistura foi mantido em repouso para promover a formação de três fases distintas (solventes orgânicos, proteínas hidrofóbicas totais e fase aquosa). Em seguida foi coletada a interfase, que contém as proteínas hidrofóbicas totais, e submetidas a tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) como descrito por WANG et al. (2004). As proteínas foram tratadas e solubilizadas com 250 µL de ácido trifluoroacético (TFA) e secas com jato de nitrogênio gasoso. Após completa secagem, as proteínas foram suspensas em 250 µL de tampão de corrida (Tris-HCl 25 mmol.L-1, glicina 200 mmol.L-1, EDTA 1 mmol.L-1e SDS 3,5 mmol.L-1), sendo analisadas por SDS-PAGE 12,5 % para posterior purificação em HPLC Akta System (GE Health Care). 3.9. Southern Blot A análise de fragmentos via Southern Blot permite visualizar o número de cópias desse fragmento presente no genoma de uma espécie. Para tal foi feita a extração do DNA genômico do C. perniciosa, sendo a técnica de transferência realizada segundo Sambrook et al. (1989) e para marcação e detecção do sinal da sonda utilizou-se o kit AlkPhos DirectTM Labelling and Detection system (Amersham Biosciences) conforme as recomendações do fabricante. Quatro alíquotas de 6 µg de DNA genômico de C. perniciosa foram clivadas com 12 unidades das enzimas de restrição Sma I, Eco RI, Bam HI e Xho I, enzimas que não promovem clivagem nas seqüências codificantes das hidrofobinas de 25 Crinipellis perniciosa. O DNA genômico digerido foi separado por eletroforese em gel de agarose 0,8 % corado com brometo de etídeo 0,25 µg.mL-1. Após a eletroforese e a fotodocumentação, o gel incubado sob leve agitação em uma solução de depurinação (HCl 0,2 mol.L-1) por 15 minutos, seguido de duas incubações de 30 minutos em solução de desnaturação (NaOH 0,5 N e NaCl 1,5 mol.L-1) e duas incubações de 30 minutos em solução de neutralização (Tris-HCl 0,5 mol.L-1, pH 7,2 e NaCl 1,5 mol.L-1). O DNA foi transferido para membrana de náilon Hybound N+ (Amersham Biosciences) por capilaridade durante 16 horas. Para a transferência foi utilizada uma cuba de eletroforese horizontal contendo SSC 20X (NaCl 3 mol.L-1, citrato de sódio 0,3 mol.L-1, pH 7,0) em seu reservatório. Sobre a plataforma da cuba foram colocadas três folhas de papel filtro (3M) com as extremidades embebidas em SSC 20 X, formando assim uma ponte. Sobre essa ponte foram colocados o gel, a membrana de náilon e três pedaços de papel filtro umedecidos em SSC 20 X, e camadas sucessivas de papel toalha, atingindo aproximadamente 10 cm de altura, sobre esta foi colocada uma placa de vidro e um peso de aproximadamente 1 kg. O aparato de transferência foi desmontado e a membrana lavada em SSC 2 X (NaCl 0,3 mol.L-1 e citrato de sódio 0,03 mol.L-1, pH 7,0). O DNA foi fixado na membrana por incidência de luz UV usando Spectro LinkerTM XL-1000 UV Crosslynker (Fisher Scientific). A marcação da sonda foi realizada com o kit AlkPhos DirectTM Labelling and Detection system (Amersham Biosciences), seguindo as recomendações do fabricante. Na reação foram usados 200 ηg de um fragmento de 314 pb correspondente à região codificante da seqüência de HCp-3, amplificado por PCR (Polimerase Chain Reaction) a partir do cDNA utilizando oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de hidrofobinas amplificados e purificados utilizando-se o kit Prep-A-Gene® DNA Purification Systems (BIO-RAD), conforme recomendações do fabricante, foi desnaturado por aquecimento e a sua marcação deu-se via ligação covalente da enzima fosfatase alcalina ao DNA fita simples. A membrana foi pré-hibridizada com 0,2 mL..cm-2 de tampão de hibridização do fabricante, com NaCl 0,5 mol.L-1 e reagente de bloqueio do kit 4 % (p/v), por 1 hora a 55 °C. Em seguida, a sonda foi adicionada ao tampão procedendo a hibridização por 16 horas a 55 °C em forno de hibridização (Fisher Scientific). As lavagens da membrana foram realizadas a 55 °C por duas vezes de 10 minutos em tampão contendo uréia 2 mol.L-1, SDS 0,1 % (p/v), NaH2PO4 50 mmol.L-1, pH 7,0, 26 NaCl 150 mmol.L-1, MgCl2 1 mmol.L-1 e reagente de bloqueio 0,2 % (p/v) e por duas vezes de 5 minutos a temperatura ambiente em Tris base 50 mmol.L-1, NaCl 0,1 mol.L-1 e MgCl2 2 mmol.L-1, pH 10,0. A detecção do sinal foi realizada por degradação do substrato dioxetano, CDP Star (Amersham Biosciences), pela ação enzimática da fosfatase alcalina. A energia luminosa emitida foi observada por sensibilização do Hyperfilm ECL após 20 horas de exposição, seguida de revelação por autoradiografia. 3.10. Síntese de cDNA por meio de RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) Alíquotas de RNAs totais, das seis diferentes fases de desenvolvimento do C. perniciosa (cultivadas em sistema de bolachas inoculadas com o isolado 1189 CEPEC/CEPLAC) e de meristemas de T. cacao, foram tratadas com DNAse I – RNAse Free (Fermentas), seguindo recomendações do fabricante, quantificados (Figura 9) e amplificados por PCR (polymerase chain reaction) para verificar a eficácia do tratamento. Após o tratamento, os RNAs totais foram submetidos a transcrição reversa utilizando a enzima RevertAidTMH Minus M-MuLV (Fermentas) conforme recomendações do fabricante. A síntese de cDNAs foi realizada utilizando 10µL de RNA total como molde, 20 unidades de inibidor de RNAse (Fermentas), 10 mmol.L-1 de dNTPs Mix, 0,5 µg de primer oligo(dT) e 200 unidades de RevertAidTMH Minus MMuLV. A reação foi incubada a 42°C por 60 minutos, sendo a enzima transcriptase reversa inativada por incubação a 70 °C por 10 minutos. Com a finalidade de padronizar a técnica de RT-PCR foram realizadas amplificações dos cDNAs utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene de actina de C. perniciosa ( ActinCP-F 5’CCACAATGGAGGACGAAGTCG3’ e ActinCP-R 5’ CCCGAGATAGGAGTCCTTCTG3’). Os volumes de cDNAs necessários para a correta análise semi-quantitativa da expressão dos genes de hidrofobinas, durante as diferentes fases de desenvolvimento de C. perniciosa e nos diferentes estágios da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, foram determinadas pela análise densitométrica 27 dos genes de actina e do RNA total de cacau, utilizando o software Kodak Digital ScienceTM ID Image Analysis. A B Figura 9. Eletroforese dos produtos de extração de RNA total em gel de agarose. A – Eletroforese dos RNAs totais extraídos nas distintas fases do desenvolvimento artificial de C. perniciosa. As fases mencionadas referese a coloração desenvolvida nos micélios durante o cultivo; B Eletroforese dos RNAs totais extraídos dos diferentes estágios da vassoura-de-bruxa em plântulas de cacaueiro. A linha C corresponde ao RNA total de uma plântula controle (não infectado), as linhas 45, 60 e 90 DAI correspondem aos RNAs de plântulas infectadas após 45, 60 e 90 dias após inoculação. A padronização das reações de PCR (polymerase chain reaction) foram realizadas a partir da amplificação dos distintos ESTs de hidrofobinas com os primers específicos, ocorrendo amplificação exclusiva dos fragmentos quando utilizado os respectivos primers na presença dos cDNAs que fazem correspondência, confirmando assim a especificidade dos mesmos (Figura 10). Os fragmentos de hidrofobinas foram amplificados utilizando as seguintes condições de amplificação: 94 °C 2 min.; 2 ciclos: 94 °C por 30 seg., 71 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 2 ciclos: 94 °C por 30 seg., 69 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 2 ciclos: 94 °C por 30 seg., 67 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 25 ciclos: 94 °C por 30 seg., 65 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 72 °C por 7 min.; 15 °C continuamente. Os produtos da transcrição reversa (cDNA) foram amplificado por meio de PCR e separados em gel de agarose 2 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1. As bandas foram visualizadas sobre luz ultravioleta, fotodocumentadas pelo 28 sistema Kodak EDAS 290 e analisados por densitometria utilizando o software Kodak Digital ScienceTM ID Image Analysis. A normalização da expressão dos genes de hidrofobinas de C. perniciosa foi realizada a partir dos dados da análise densitométrica do gene da actina, gerados em pixels, baseado na área das bandas fotodocumentadas. O valor referente a banda que corresponde a menor expressão de actina foi dividido pelos demais valores, referentes as expressões de actina nas distintas fases. Os resultados obtidos foram utilizados como coeficiente de erro. O coeficiente de erro encontrado na expressão de actina de uma determinada fase foi então multiplicado pelos valores gerados com a expressão dos demais genes nesta mesma fase, estimando assim a legítima expressão gênica. 29 A B Figura 10. Síntese de cDNA e padronização da amplificação de primers específicos para análise de expressão semi-quantitativa. A – Alinhamento dos cDNAs de hidrofobinas de C. perniciosa com referências a ancoragem dos correspondentes primers. B – Eletroforese de fragmentos amplificados a partir de cDNAs de hidrofobinas com primers específicos. A linha M corresponde ao padrão de pares de bases; As linhas 1, 2, 3 e 4 correspondem aos cDNAs utilizados nas reações de PCR, sendo 1 correspondente ao gene HCp-1, 2, 3 e 4 aos genes HCp-2, HCp-3 e HCp4, respectivamente. Hidro 1, 2, 3 e 4 refere-se ao primer utilizado. 30 4. RESULTADOS 4.1. Análise de seqüências de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa Durante o processo de sequenciamento e anotação do Projeto Genoma do C. perniciosa, http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/, foram observadas seqüências (reads) genômicas correspondentes aos fragmentos de genes de hidrofobinas. O alinhamento destes reads resultou na montagem de 27 contigs (seqüência contínua gerada pelo agrupamento de reads sobrepostos). No banco de dados da Biblioteca de ESTs do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial foram encontradas quatro cDNAs distintos, sendo dois destes, também encontrados no banco de dados da Biblioteca de ESTs da Interação cacau:Crinipellis. As seqüências de nucleotídeos foram comparadas com o banco de dados público GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, utilizando o programa BlastX (ALTSCHUL et al., 1997), confirmando a similaridade com seqüências de hidrofobinas já caracterizadas. As seqüências de nucleotídeos foram traduzidas em quatro ORFs (open reading frame) sendo denominadas como HCp-1 com 333 nucleotídeos, HCp-2 com 321 nucleotídeos, HCp-3 com 336 nucleotídeos e HCp-4 com 330 nucleotídeos que codificam proteínas de 110, 106, 111 e 109 aminoácidos respectivamente. As ORFs HCp-1 e HCp-3 foram também identificadas no banco de dados da biblioteca de ESTs correspondente a interação T. cacao-C. perniciosa. As seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa quando comparadas com seqüências do GenBank apresentaram similaridade com hidrofobinas de classe I de diferentes basidiomicetos (Tabela 1). A menor similaridade encontrada foi de 70 % 31 com a proteína de Agaricus bisporus e a maior foi de 87 % com a proteína de Pleurotus ostreatus. O alinhamento das seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa com as seqüências de hidrofobinas de classe I de basidiomicetos como Agaricus bisporus, Coprinopsis cinerea, Dictyonema glabratum, Lentinula edodes, Pholiota nameko, Pleurotus ostreatus e Schizophyllum commune, permitiu a identificação de alguns aminoácidos comuns a todas as hidrofobinas. Inclusive os oito resíduos de cisteína característicos, com conservação dos espaçamentos entre os resíduos, característico das seqüências de hidrofobinas de classe I (Figura 11). Tabela 1. Similaridade de seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C. perniciosa com hidrofobinas de classe I de diferentes basidiomicetos. Organismos Número de acesso Similaridade % Agaricus bisporus CAC03466.1 70 Coprinopsis cinerea_CoH1 CAA71652.1 80 Dictyonema glabratum_hyd3 CAC86006.1 77 Lentinula edodes_hyd1 AAG00900.1 80 Pholiota nameko_hyd315 BAB84547.1 75 Pleurotus ostreatus CAA74987.1 87 Schizophyllum commune_Sc3 JH0184 79 Schizophyllum commune_Sc1 JU0321 72 Um dendrograma baseado nas seqüências de hidrofobinas de classe I dos basidiomicetos presentes na tabela 1 e hidrofobinas de classe II de ascomicetos, foi construído usando o programa ClustalW 1.82 (Figura 12). As hidrofobinas de classe II foram agrupadas distintamente, as hidrofobinas de C. perniciosa foram agrupadas com seqüências de hidrofobinas de classe I de basidiomicetos, demonstrando particular similaridade entre HCp-1 com as proteínas de P. nameko_hyd315 e L. edodes_hyd1; HCp-2 com proteínas de D. glabratum_hyd3 e S. commune_Sc3; HCp-3 com C. cinerea-CoH1; e HCp-4 com maior similaridade a C. cinerea-CoH1 e HCp-3. 32 Figura 11. Alinhamento das seqüências de hidrofobinas classe I. Seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C. perniciosa foram alinhadas com auxílio do ClustalW 1.82, com seqüências de proteínas relacionadas, depositadas no GenBank. Em vermelho encontram-se os resíduos conservados em todas as proteínas. Os asteriscos destacam os oito resíduos de cisteínas conservados entre as seqüências. A caixa verde refere-se aos sítios de clivagem do peptídeo sinal. O perfil hidropático das seqüências de hidrofobinas maduras de C. perniciosa demonstra um padrão semelhante de hidrofobicidade (Figura 13A, B). A hidrofobicidade foi calculada de acordo com Kyte e Doolittle (1982) utilizando o programa ProtScale, http://au.expasy.org/tools/protscale.html. O alinhamento das seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa permitiu a identificação de segmentos conservados em todas seqüências. Além dos segmentos, alguns aminoácidos isolados são comuns a todas as hidrofobinas, destacando-se a presença de oito resíduos de cisteínas com espaçamento conservados em todas as seqüências. Na extremidade carboxila das proteínas foi identificada o sítio de clivagem do peptídeo sinal, representado pelos resíduos de aminoácidos das posições 19, 16 e 17 em HCp-1, HCp-2 e HCp-4, e HCp-3 (Figura 33 13C) resultando em proteínas maduras com 91, 90, 93 e 94 aminoácidos e com massas estimadas de 8.692, 8.873, 9.483 e 9.255 Da, respectivamente. Figura 12. Dendrograma. Agrupamento com estimativa filogenética baseada na análise de distância das seqüências de hidrofobinas classe I e II. 34 Figura 13. Perfil hidropático e alinhamento das seqüências primárias de hidrofobinas. A – Comparação do perfil de hidrofobicidade das hidrofobinas maduras de classe I (Sc-3) e classe II (CU); B – Comparação do perfil de hidrofobicidade das hidrofobinas madura de C. perniciosa; C – Alinhamento de seqüências primárias. Em vermelho estão os aminoácidos comuns às quatro ORFs. Os asteriscos destacam os oito resíduos de cisteína característicos e na caixa azul encontram-se os sítios de clivagem do peptídeo sinal nas diferentes hidrofobinas. 35 4.2. Detecção do número de cópias gênicas de hidrofobinas de C. perniciosa O DNA genômico de Crinipellis perniciosa foi sondado com um fragmento de 314 pares de bases, correspondente à região central do gene HCp-3, possuindo regiões homologas com as demais hidrofobinas do organismo. A hibridação foi realizada em condições de baixa estrigência, permitindo a identificação de pelo menos quatro bandas de diferentes tamanhos nos produtos de digestão do DNA (Figura 14). Figura 14. Análise genômica do número de cópias de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa. A – Fracionamento das reações de digestão do DNA genômico de C. perniciosa com Sma I (S), Eco RI (E), BamH I (B) e Xho I (X); B - Southern Blot não radioativo revelado por autoradiografia, hibridizado com os fragmentos gênicos de hidrofobinas. 36 4.3. Análise da expressão gênica de hidrofobinas de C. perniciosa em fases do desenvolvimento fúngico in vitro e em plântulas de cacau infectado Após normalização (Tabela 2) e execução de uma curva de amplificação do gene da actina para evitar erros e saturação dos fragmentos amplificados, foram realizadas as amplificações dos cDNAs correspondentes as diferentes fases do desenvolvimento de C. perniciosa em sistema artificial com os primers específicos para os distintos genes de hidrofobinas de C. perniciosa. Os produtos das amplificações foram separados por eletroforese em gel de agarose revelando a expressão semi-quantitativa desses genes. Os genes HCp-1, HCp-2 e HCp-4 apresentaram expressão diferencial nos cDNAs das diferentes fases do desenvolvimento fúngico (isolado 1189). O gene HCp-3 apresentou expressão quando amplificados em cDNAs das fases de crescimento fúngico que foram cultivados a partir dos isolados 998 e 1441. O gene HCp-1 foi expresso em todas as fases do crescimento fúngico, possuindo distintos níveis de expressão, sendo mais intenso na fase micelial rosa escuro e em primórdios com discreta expressão em basidioma. O gene HCp-2 não apresentou expressão na fase micelial branca, mostrando expressão nas demais fases, sendo esta intensificada na fase micelial amarela e em basidioma. O gene HCp-4 apresentou discreta expressão em todas as fases sendo estas aumentada nas fases miceliais branca e rosa sendo sua expressão diminuída com o desenvolvimento do fungo (Figura 15a e 16). O gene HCp-3 não revelou expressão quando amplificado com cDNAs originados do cultivo do isolado fúngico 1189, mas apresentou expressão em cDNAs de dois outros isolados. Nas fases miceliais branca, amarela e rosa do isolado 998 foram detectadas expressões em todas fases, excetuando quando amplificado a partir do cDNA confeccionado com RNA total extraído da camada externa da bolacha. Na fase micelial rosa escuro, primórdios e basidioma do isolado 1441 ocorreram expressões apenas nos dois primeiros pontos, sendo a expressão em primórdios bastante intensificada (Figura 15b). Devido a não otimização na amplificação das reações de PCR com os primers específicos para o gene S18 (SHIMIZU et al., 2001), foi realizado a avaliação densitométrca do RNA total de cacau a fim de minimizar os erros nas análises semiquantitativas de expressão gênica com os cDNAs confeccionados a partir desse 37 material. A amplificação dos cDNAs evidenciou apenas a expressão dos genes HCp1 e HCp-2. O HCp-1 foi evidenciado na fase terminal da vassoura com 90 dias após a inoculação. O HCp-2 foi expresso unicamente na fase inicial da vassoura, 45 dias após a inoculação (Figura 15c). Tabela 2. Análise densitométrica da expressão semi-quantitativa de hidrofobinas de C. perniciosa via RT-PCR. Análise densitométrica1 Genes Fase Branca Fase Amarela Fase Rosa Fase Rosa Escuro HCp-1 129,0 118,6 143,9 191,4 182,6 109,9 HCp-2 - 109,7 89,9 93,7 89,3 113,3 HCp-4 98,4 79,4 100,3 83,4 62,3 46,6 Actina 130,1 139,2 136,5 133,5 126,7 116,7 1 Primórdios Basidioma Os dados da análise densitométrica são gerados em pixels baseado na área das bandas fotodocumentadas com a eletroforese em gel de agarose 2 %, observadas sobre luz UV (365 nm). 38 A B C Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de RT-PCR de cDNAs de C. perniciosa e cacaueiros infectados. Os fragmentos de hidrofobina foram amplificados a partir do cDNA com auxilio de primers específicos. A – Expressão gênica semi-quantitativa de hidrofobinas em diferentes fases do desenvolvimento de C. perniciosa (isolado 1189); B - Expressão gênica semi-quantitativa de HCp-3 em diferentes fases do desenvolvimento de C. perniciosa. As três primeiras fases correspondem ao isolado 998 e as demais fases ao isolado 1441). A letra I corresponde a camada interna da bolacha e E a camada externa; C - Expressão gênica semi-quantitativa de hidrofobinas em diferentes estágios de vassoura-de-bruxa em cacaueiros. 39 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 iom a Ba sid dio ór Pr im Es cu ro R. Ro sa ar e Am Br an la HCp-1 HCp-2 HCp-4 ca Expressão relativa Expressão das Hidrofobinas de C. perniciosa nornalizadas pela Actina Fase de desenvolvimento do fungo Figura 16: Expressão relativa das hidrofobina de Crinipellis perniciosa normalizadas pela expressão da actina. 40 4.4. Indício de hidrofobinas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa Discos de micélios de C. perniciosa foram cultivados em meio líquido e após 15 dias de cultivo, proteínas hidrofóbicas secretadas pelo fungo foram purificadas do sobrenadante. As proteínas foram fracionadas por SDS-PAGE 12,5 % sendo então identificada uma banda de aproximadamente 10 kDa, correspondente à migração esperada para as hidrofobinas de C. perniciosa (Figura 17). Essas proteínas serão purificadas em colunas de interação hidrofóbica C-18 com auxílio de um HPLC Akta System (GE Health Care) para produção de anticorpos monoclonais. 45.0 kDa - MW 1 2 3 4 5 35.0 kDa 25.0 kDa 18.4 kDa 14.4 kDa - Figura 17. SDS-PAGE 12,5 % de proteínas hidrofóbicas secretadas pelo micélio de C. perniciosa. A linha MW refere-se ao padrão de massa molecular em kDa; A linha 1, 2, 3 e 4 corresponde diferentes frações do extrato de proteínas hidrofóbicas secretadas e 5 meio de cultura após a extração protéica. A seta indica a presença da banda de 10 kDa correspondente as hidrofobinas secretadas por C. perniciosa. 41 5. DISCUSSÃO 5.1. C. perniciosa codifica quatro hidrofobinas distintas e pertencentes a classe I A análise de três bibliotecas construídas com isolados distintos de Crinipellis perniciosa, sendo uma genômica e as outras de cDNA, da Interação Cacau:Crinipellis e do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial, permitiu a identificação de quatro seqüências gênicas que codificam para a proteína hidrofobina. Contigs referentes as quatro seqüências foram identificadas no banco de dados do Projeto Genoma de C. perniciosa, http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/. Hcp-1, Hcp-2, Hcp-3 e Hcp-4 foram identificadas na biblioteca de cDNA do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial, sendo também identificado Hcp-1 e Hcp-3 na biblioteca de Interação Cacau:Crinipellis. Todas as seqüências apresentaram similaridade com hidrofobinas de classe I, não sendo até agora identificadas hidrofobinas da classe II em basidiomicetos. Sua estrutura primária mostra diversas sequências de aminoácidos, no entanto é caracterizada pela presença de oito resíduos de cisteína com espaçamento conservado, seqüência de endereçamento secretório entre os primeiros 20 aminoácidos, e semelhantes padrões de hidrofobicidade (WESSELS, 1994, 1997). As hidrofobinas formam quatro pontes disulfeto intramolecular. O acoplamento das ligações disulfeto da origem as alças que possuem segmentos com distintos números de aminoácidos, sendo essa uma das propriedades biofísicas bastante peculiar na classificação das hidrofobinas (WÖSTEN; DE VOCHT, 2000). A presença de ligações disulfeto pode levar a inferência de que mutações que 42 desestabilizem estas interações podem acarretar em mudanças conformacionais na estrutura terciária dessas proteínas, e conseqüentemente, afetar sua função biológica. O alinhamento das sequências de hidrofobina evidência a região de clivagem do peptídeo sinal, segmento característico de proteínas que são secretadas. A funcionalidade do sinal de endereçamento foi confirmada por estudos de imunolocalização (LUGONES et al., 1996) e pela presença dos oligômeros e monômeros nos extratos de proteínas hidrofóbicas secretadas em meio de cultura por C. perniciosa. Hidrofobinas são proteínas secretadas em abundância por fungos filamentosos envolvidos nos processos de crescimento e desenvolvimento fúngico, cruzamento sexual, mudanças de fases (KERSHAW; TALBOT, 1998), no processo de desenvolvimento hifal de um ambiente hidrófilo (substrato) para um ambiente hidrofóbico (ar), envolvidas na formação de estruturas aéreas hidrofóbicas como hifas aéreas, esporos e basidiomas (LUGONES et al., 1996; TALBOT et al., 1996; WÖSTEN et al., 1993, 1999). O estudo das hidrofobinas durante o desenvolvimento da vassoura-de-bruxa e transição entre os sintomas de vassoura é de fundamental importância para o entendimento de mecanismos acionados pelo fungo durante o desenvolvimento da doença no cacaueiro. 5.2. Hidrofobinas de C. perniciosa constituem uma família multigênica A análise de Southern Blot para a confirmação do número de copias dos genes de hidrofobinas em C. perniciosa revelou a presença de pelo menos quatro bandas. Resultado este, que corrobora com o sequenciamento da biblioteca de cDNA de C. perniciosa, onde também foi identificado quatro diferentes genes de hidrofobina sendo expressos durante o desenvolvimento do fungo em sistemas artificiais de produção de basidioma. O número de genes de hidrofobinas no genoma do fungo demonstra que a exemplo de outros fungos, como por exemplo, S. commune que também possui quatro distintos genes de hidrofobina (KERSHAW et al., 1998), o genoma de C. perniciosa também possui uma família multigênica. 43 Os resultados encontrados não isentam da possibilidade de encontrar isoformas ou seqüências em tandem no genoma de C. perniciosa, visto que bibliotecas de cDNA de diferentes estágios da doença e de fases de desenvolvimento fúngico estão sendo confeccionadas com isolados diferentes, e também que estudos têm demonstrado uma relativa variabilidade genética entre isolados distintos C. perniciosa (ANDEBRHAN et al., 1999). O agrupamento das hidrofobinas no dendrograma formou quatro grupos, três dos quais, as hidrofobinas de C. perniciosa aparecem. Baseado nas classes das proteínas compôs dois grupos. As hidrofobinas de classe II (ascomicetos) e as de classe I (basidiomicetos). As hidrofobinas de C. perniciosa agruparam distintamente entre os demais basidiomicetos e em concordância com a sua função biológica. O gene HCp-1 apresentou similaridade com um gene de Lentinula edodes_hyd1, envolvido na formação do basidioma (NG et. al., 2000), fazendo correspondência com a função identificada para HCp-1. O HCp-2 apresentou similaridade com um gene de Dictyonema glabratum_hyd3, hidrofobina de uma espécie de líquen, envolvida na formação de canais de gás em basidiomas (TREMBLEY et. al., 2002), ambas possuem expressão em basidioma. HCp-3 e HCp-4 apresentaram similaridade de seqüência com Coprinopsis cinerea_CoH1 (Coprinus cinereus), cuja expressão parece ser restrita ao micélio monocariótico, possuindo baixa expressão em micélio vegetativo dicariótico e completamente ausentes em basidiomas (ÁSGEIRSDÓTTIR et. al., 1997). O HCp-3 apresenta expressão em micélio dicariótico ocorrendo também sua expressão na formação de basidiomas, pois foi detectada uma alta expressão na fase de formação de primórdios nos sistemas de bolachas. HCp-4 apresenta expressão em micélios dicarióticos possuindo atividade em todas as fases do desenvolvimento fúngico em sistema artificial. O padrão de expressão dos genes de hidrofobinas são coincidentes entre o C. perniciosa e alguns organismos, esses resultados sugerem uma conservação evolutiva das funções desses distintos genes entre os fungos filamentosos (Tabela 3). 44 45 5.3. Hidrofobinas possuem expressão diferencial durante as fases do desenvolvimento fúngico e em plântulas de cacau infectado por C. perniciosa Os oligonucleotídeos específicos construídos para amplificar os distintos cDNAs de hidrofobinas foram capazes de discriminar a expressão diferencial dos quatro genes de hidrofobina por meio de RT-PCR semi-quantitativo. A expressão dos genes de hidrofobinas observada nas fases de cultivo de C. perniciosa e nos diferentes estágios da doença mostrou que os diferentes genes são expressos nas distintas fases do desenvolvimento fúngico e da doença. O gene HCp-1 teve maior expressão na fase micelial rosa escuro, na fase de aparecimento dos primórdios e no último estágio da doença (90 DAI), correspondendo a uma possível produção do basidioma, tanto nas bolachas, como na vassoura seca. A expressão do gene HCp-2 foi intensificada na fase micelial amarela e em basidiomas, foi verificada também sua expressão na fase inicial da vassoura, sugerindo que a mesma ocorre tanto em micélio monocariótico como em dicariótico, visto que aos 30 DAI o fungo ainda se encontra na fase parasítica, intercelular, nos tecidos infectados. O gene HCp-4 tem sua expressão em todas as fases do desenvolvimento fúngico na bolacha, indicando sua presença em micélios dicarióticos. Embora não tenha sido identificada a expressão de HCp-4 nos estágios de desenvolvimento da vassoura e no basidioma, é comprovada sua expressão no desenvolvimento fúngico. HCp-3 foi o único gene que não evidenciou expressão nem nas fases do desenvolvimento artificial do fungo nem nas fases de vassoura, porém em estudo com diferentes isolados foi verificada sua expressão. Também é constatada a expressão de HCp-3 em vassouras verdes, pois este gene foi encontrado no sequenciamento da biblioteca de ESTs da interação cacau-Crinipellis. Transcritos da HCp-3 foram encontrados em abundância na fase de primórdios nos sistemas de bolachas, sugerindo sua participação na produção do basidioma. Tal qual o observado em S. commune foram identificadas expressões dos genes de hidrofobina em micélio monocariótico e dicariótico, e que diferentes hidrofobinas são responsáveis por distintas funções biológicas (KERSHAW et al., 1998; WÖSTEN et al., 1994a). Ao separar as bolachas em camadas, interna e externa, e efetuar a análise de expressão via RT-PCR, observou-se que HCp-3 sempre mostrou uma maior 46 expressão na camada externa (com exceção da fase branca), isto era esperado, visto que é a parte de maior contato com o ar. Apenas a expressão de HCp-1, HCp-2 e HCp-4 foram observadas nos basidiomas. A análise da expressão via imunoblotting poderá auxiliar no estudo de expressão gênica de hidrofobinas durante o desenvolvimento da vassoura-de-bruxa no cacaueiro. 5.4. Oligomerização de hidrofobinas em cultivo de C. perniciosa A secreção de proteínas é complexa e envolve vários compartimentos celulares. É certo que a secreção de proteínas envolve processos de tradução e translocação através do retículo endoplasmático, desse modo é que fungos filamentosos como o basidiomiceto C. perniciosa secreta suas hidrofobinas. O filme anfipático com interfase hidrofílica/hidrofóbica formado por monômeros de hidrofobinas de classe I é altamente insolúvel, sendo seus oligômeros dissociados apenas com a ação de ácido fórmico ou ácido trifluoroacético (TFA). Em contraste, os oligômeros formados por hidrofobinas de classe II são menos estáveis (DE VRIES et al., 1993; WESSELS et al., 1991a). Baseado nestas informações é que cultivamos C. perniciosa para a purificação de hidrofobinas. Após purificação das mesmas, anticorpos monoclonais serão produzidos, titulados e utilizados para verificar a expressão dos genes de hidrofobina, via imunoblotting, em diferentes estágios da vassoura-de-bruxa no cacaueiro. 47 6. CONCLUSÕES A família multigênica de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa possui pelo menos quatro diferentes genes codificadores de hidrofobinas de classe I. Os genes codificadores para hidrofobinas são expressos diferencialmente nas fases biotróficas e necrotróficas do ciclo de vida do fungo C. perniciosa causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro. As hidrofobinas de C. perniciosa apresentam similaridade de seqüências com as de outros basidiomicetos, apresentando semelhança de funções biológicas e envolvimento em fase de vida. 48 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T.L.; SCHÄFFER, A.A. et al.,. Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. v. 25, p. 389-3402, 1997. 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