CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL
USO E CONSERVAÇÃO DE RECURSOS HÍDRICOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
SYOMARA KER DE MELO
CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM
AMOSTRAS DE Escherichia coli ISOLADAS DE LAGOAS
DO PARQUE ESTADUAL DO RIO DOCE, MINAS GERAIS
OURO PRETO
2006
SYOMARA KER DE MELO
CARACTERIZAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM
AMOSTRAS DE Escherichia coli ISOLADAS DE LAGOAS
DO PARQUE ESTADUAL DO RIO DOCE, MINAS GERAIS
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia ambiental com ênfase no
Uso
e
Conservação
de
Recursos
Hídricos da Universidade Federal de
Ouro Preto.
Orientadora:
Profa.Dra. Maria Célia S. Lanna
Laboratório de Microbiologia Geral – ICEB /UFOP
Co-orientador:
Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa
Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras – ICB/UFMG
OURO PRETO
2006
M528c
Melo, Syomara Ker de.
Caracterização de fatores de virulência em amostras de
Eschericha coli
isoladas de lagoas do Parque Estadual do Rio Doce - MG
[manuscrito]/
Syomara Ker de Melo. – 2006.
xiii, 100 f. : il. color., graf., tabs., mapas.
Instituto
Hídricos -
Teses.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Célia Silva Lanna.
Co-orientador: Prof. Carlos Augusto Rosa.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Recursos
Pró-Água. Programa de Mestrado em Engenharia Ambiental.
Área de concentração: Microbiologia.
1. Escherichia coli - Teses. 2. Água - Qualidade - Minas Gerais 3. Virulência (Microbiologia) - Teses. I. Universidade Federal de
Catalogação: [email protected]
Esta dissertação é dedicada a minha mãe
(Sônia), meus irmãos (Leca, Dim, Júnior, Poly,
Dan), e Demian.
“Aprender é construir, reconstruir, constatar
para mudar, o que não se faz sem abertura
ao risco e à aventura do espírito.
Paulo Freire (1921-1997)
AGRADECIMENTOS
________________________________________________________
Os meus mais sinceros agradecimentos à Deus, pela proteção e amparo
durante vários momentos ao longo dessa minha jornada, e principalmente, por ter
colocado pessoas certas, nas horas certas em minha vida.
Aos meus amados pais e irmãos pela incessante fonte de amor e incentivo
dispensados à mim.
Ao meu grande amor Demian, pela paciência, companheirismo, carinho,
incentivo, compreensão e por todas as alegrias que compartilhamos juntos,
durante todo esse tempo.
À minha orientadora Profa. Dra. Maria Célia Silva Lanna pelo apoio,
amizade, confiança e, principalmente pela oportunidade de realização desse
trabalho.
Agradecimento muito especial, ao meu co-orientador, Prof. Dr. Carlos
Augusto Rosa pelo exemplo de profissionalismo e comprometimento com o
conhecimento científico, pelos ensinamentos, amizade, e, principalmente, por
nunca ter medido esforços para que esse trabalho acontecesse. O seu apoio
incondicional a esse projeto foi fundamental para que tudo desse certo. A você
serei eternamente grata. Obrigada pela confiança.
À toda a família do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras
pela grande amizade, convivência e troca de experiência: Cris Roscoe, Fátima,
Bia, Luíz Rosa, Prix, Carol, Inayara, Carla Daniela, Adriana, Marjore, Fatinha,
Ilana, Biinha, Fernandinha, Fernanda Badotti, Lud, Lia, Lú, Fabiana, Michelle,
Suzane, César, Renata, Raquel, Natália, Aline, Isabela, Mariângela, Mariana e
Vívian. Todos vocês são muito especiais para mim. Muito Obrigada por tudo.
Adoro vocês!
Agradecimento mais do que especial às amigas de laboratório: Cris
Roscoe, Fátima, Bia e Carol pelo apoio incondicional nos experimentos de biomol.
E principalmente à Prix pelo auxílio em todos os momentos.
O meu muito obrigada, ao Prof. Dr. Francisco A. R. Barbosa pela
oportunidade de fazer parte de tão importante e grandioso projeto como o PELD.
Agradeço também aos amigos conquistados na Limnologia: Fábio, José
Fernandes, Dinho, Meg, Luciana, Sophia, Felipe, Nelson, Pedro, Juliàn e Tiago
pelo companheirismo, amizade e alegrias compartilhadas durante as coletas no
Parque.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia da UFOP, Luís, Ricardo, Ivan,
Marly. E principalmente à Vivian, pela amizade e cumplicidade.
À amiga Lianna Nakahodo pela sincera amizade e pelos bons momentos
vividos em Ouro Preto.
Agradecimento muito especial ao amigo Igor, pela amizade, pelas
coincidências e reencontros em nossas vidas e também pelo auxílio na etapa final
desse trabalho.
Aos eternos amigos de Ouro Preto, Vinícius Albano, Madú e Bina que
apesar da distância sempre torceram muito por mim.
Ao Prof. Dr. Luiz Simeão, pelo apoio indispensável na identificação das
amostras.
Ao Prof. Dr. Tomomasa Yano e toda à sua equipe, principalmente à
Daniela Alves pela colaboração.
Ao Prof. Dr. Edilberto Nogueira Mendes, à Profa. Dra. Paula Prazeres pelo
auxílio e esclarecimentos.
Ao Departamento de Microbiologia da UFMG pelo apoio indispensável na
realização desse trabalho.
À Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), em especial ao
Departamento de Pós-Graduação Uso e Conservação de Recursos Hídricos, pela
oportunidade de aperfeiçoamento profissional e pela bolsa concedida durante o
curso de mestrado.
COLABORADORES
________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa – Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de
Leveduras - Departamento de Microbiologia – ICB / UFMG.
•
Departamento de Pós-Graduação em Microbiologia da UFMG – ICB.
Prof. Dr. Francisco Antônio Rodrigues Barbosa – Laboratório de Limnologia Departamento de Ecologia, Conservação e Manejo de Vida Silvestre-ICB / UFMG.
i
SUMÁRIO
_________________________________________________________________
Lista de Tabelas.................................................................................................
iv
Lista de Figuras.................................................................................................. vi
Lista de Abreviaturas.......................................................................................... viii
Resumo..............................................................................................................
...............................................................................................................
Abstract..............................................................................................................
x
xii
1. Relevância e Justificativa...............................................................................
1
2. Revisão Bibliográfica...................................................................................
3
2.1 – Contaminação microbiológica de corpos d’água naturais e potenciais
riscos à saúde humana....................................................................................
3
2.2 – Grupo Coliforme como Indicador de Qualidade de Água.........................
4
2.3 - Escherichia coli .........................................................................................
7
2.4 – Fatores de Virulência em Escherichia coli
8
2.5 – Escherichia coli enteropatogênicas e as Gastroenterites.........................
10
2.6 – Principais Subgrupos de E.coli diarreogênicas.........................................
12
2.6.1 - Escherichia coli enteropatogênica (EPEC).............................................
12
2.6.2 - Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC)............................................... 14
2.6.3 - Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC)..........................................
16
2.6.4 – Escherichia coli enteroagregativa (EAEC).............................................
18
2.6.5 - Escherichia coli enteroinvasora (EIEC)..................................................
19
2.6.6 – Escherichia coli Difusamente Aderente (DAEC)....................................
20
2.7 – Susceptibilidade de Escherichia coli a antimicrobianos ...........................
20
3. Objetivos.......................................................................................................
22
4. Materiais e Métodos.....................................................................................
23
4.1 - Origem e Caracterização das amostras..................................................... 23
4.1.1 - Área de Estudo.......................................................................................
23
4.1.2 - Locais de Coleta.....................................................................................
26
4.1.2.1 - Lago Dom Helvécio.............................................................................
26
4.1.2.2 - Lagoa Jacaré.......................................................................................
26
4.1.2.3 - Lagoa Carioca...................................................................................... 27
ii
4.1.2.4 - Lagoa Gambazinho.............................................................................. 27
4.1.3 - Procedimentos de coleta........................................................................
31
4.2 - Análise Laboratorial das amostras............................................................ 31
4.2.1 - Determinação da Qualidade Microbiológica das lagoas......................... 31
.................................
4.2.2 - Análise estatística dos dados para avaliação das diferenças entre as
lagoas................................................................................................................. 32
.............................
4.4.3 - Isolamento de Escherichia coli das lagoas ............................................ 32
4.2.4 - Identificação dos isolados de Escherichia coli........................................ 33
........................................
4.2.5 - Investigação dos tipos diarreiogênicos dos isolados de Escherichia
coli ..................................................................................................................... 33
4.2.5.1 - Extração do DNA ................................................................................
33
4.2.5.2 - Pesquisa dos genes de virulência pela Reação em Cadeia da
Polimerase…………………………………………………………………………… 33
4.2.5.3 - Eletroforese em gel de agarose…………………………………………. 34
................................
4.2.6 - Pesquisa dos sorogrupos de Escherichia coli diarreiogênicas pelo
Teste de Aglutinação em Lâmina....................................................................... 36
4.2.7 - Fermentação do sorbitol e da ramnose na diferenciação dos isolados
de Escherichia coli enterohemorrágica.............................................................. 36
..................
4.2.8 – Determinação da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli
aos antibacterianos............................................................................................ 37
.................................................................
5 - Resultados...................................................................................................
38
5.1 - Qualidade Microbiológica das lagoas....................................................... 38
................. ..............................................................
5.2 – Isolados de Escherichia coli obtidos das lagoas....................................... 39
...................................
5.3 – Tipos diarreiogênicos dos isolados de Escherichia coli das lagoas.......... 39
5.3.1 - Genes de virulência dos isolados de Escherichia coli pela PCR ........... 39
5.4 – Sorogrupos diarreiogênicos dos isolados de E. coli ................................ 40
5.4.1 - Determinação dos sorogrupos EHEC, EPEC e EIEC............................. 40
5.4.2 - Freqüência dos sorogrupos diarreiogênicos nas lagoas......................
41
5.5 – Perfil de resistência das linhagens de E. coli isoladas das lagoas........... 41
6 – Discussão...................................................................................................
69
6.1 - Análise da Qualidade da água das lagoas................................................
69
6.2 – Potencial patogênico dos isolados de Escherichia coli ............................
70
6.3 - Tipos diarreiogênicos isolados nas lagoas................................................ 71
6.3.1 - Presença dos genes stx1 e stx2 característicos Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC)................................................................................ 71
.
iii
6.3.2 - Presença do gene eae característico de Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC).................................................................................. 74
6.3.3 - Presença do gene eltI característico de Escherichia coli
enterotoxigênica (ETEC).................................................................................... 74
6.3.4 - Ausência de genes de virulência em isolados de E. coli ambientais...... 75
6.4- Sorogrupos diarreiogênicos de E. coli isolados das lagoas....................... 76
6.5 – Linhagens do sorotipo O157: H7 isolados das lagoas.............................. 76
6.6 – Linhagens resistentes a antibióticos isolados nas lagoas......................... 76
7 – Conclusões................................................................................................... 79
8 - Referências Bibliográficas............................................................................. 80
Anexo 1: Linhagens de Escherichia coli isoladas do Lago Dom Helvécio e
selecionadas para detecção de fatores de virulência por PCR......................... 99
Anexo 2: Linhagens de Escherichia coli isoladas das Lagoas Carioca,
Jacaré, Gambazinho e selecionadas para a detecção de fatores de virulência
por PCR.............................................................................................................. 100
iv
LISTA DE TABELAS
_________________________________________________________________
Tabela 1 - Padrões de Balneabilidade determinados pelo CONAMA, através da
Resolução nº 274, de 29 de novembro de 2000......................................................5
Tabela 2 – Sorogrupos, Seqüências do gene, Tamanho do Produto Amplificado e
Temperaturas de anelamento dos iniciadores.......................................................35
Tabela 3 - Determinação do Número Mais Provável (NMP/100ml) para coliformes
fecais de amostras de água coletadas em dois pontos (região litorânea e região
limnética) das Lagoas Carioca, Gambazinho e Jacaré no Parque Estadual do Rio
Doce.......................................................................................................................43
Tabela 4 - Determinação do Número Mais Provável (NMP/100ml) para “coliformes
fecais” de amostras de água coletadas em seis pontos (P1, P2, P3, P4, P5 e P6)
do Lago Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.....................................44
Tabela 5 - Análise de Variância (ANOVA, medidas repetidas) comparando as
regiões litorâneas e limnéticas das lagoas, Carioca, Jacaré, Gambazinho, Dom
Helvécio, e os meses de amostragem no Parque Estadual do Rio
Doce.......................................................................................................................45
Tabela 6 - Número de linhagens de Escherichia coli isoladas das Lagoas Carioca,
Gambazinho e Jacaré no Parque Estadual do Rio Doce.......................................51
Tabela 7 - Número de linhagens de Escherichia coli isoladas do Lago Dom
Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce............................................................52
Tabela 8 - Isolados de E. coli positivos para os genes stx2, eltI e eae que
codificam diferentes fatores de virulência detectadas por PCR.............................53
Tabela 9 - Ocorrência de genes de virulência e fermentação de carboidratos em
linhagens soropositivas de E. coli enterohemorrágica O157:H7 (EHEC), isoladas
das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do Parque Estadual do
Rio Doce ..............................................................................................................58
Tabela 10 - Ocorrência de genes de virulência em linhagens soropositivos de E.
coli enteropatogênica clássica (EPEC) isoladas das lagoas Carioca, Jacaré,
Gambazinho e Dom Helvécio do Parque Estadual do Rio Doce...........................59
Tabela 11 - Distribuição das linhagens soropositivos de E. coli enteroinvasora
(EIEC), isoladas das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do
Parque Estadual do Rio Doce em função do local e data de amostragem
EIEC.......................................................................................................................61
Tabela 12 - Distribuição dos sorogrupos de Escherichia. coli (EHEC, EPEC e
EIEC) nas regiões litorâneas e limnéticas das Lagoas Carioca, Jacaré
Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce...........................62
v
Tabela 13 - Freqüência das linhagens de Escherichia coli resistentes a antibiótico
isoladas nas regiões litorâneas e limnéticas das lagoas do Parque do Rio
Doce.......................................................................................................................64
Tabela 14 - Origem, sazonalidade dos isolados de Escherichia coli multiresistentes aos antibióticos....................................................................................65
vi
LISTA DE FIGURAS
_________________________________________________________________
Figura 1 - Mapa da área de abrangência do Parque Estadual do Rio Doce e dos
municípios no seu entorno .....................................................................................25
Figura 2 - Foto da área de Praia do Lago Dom Helvécio, principal local dentro do
Parque onde é permitido o banho dos turistas e onde foram realizadas as coletas
da região litorânea (P1, P2, P3, P4, P5) e região Limnética (P6)..........................28
Figura 3 - Foto da Lagoa Jacaré mostrando os locais de coleta e extensas
plantações de Eucalyptus no seu entorno.............................................................28
Figura 4 - Foto identificando as regiões litorânea e limnética da Lagoa Carioca um
dos principais locais de coleta...............................................................................29
Figura 5 - Foto da Lagoa Gambazinho destacando os locais de coleta na região
litorânea e região limnética....................................................................................29
Figura 6 - Localização das lagoas dentro e no entorno do Parque Estadual do Rio
Doce.......................................................................................................................30
Figura 7 - Densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) ao longo do período de
amostragem nas lagoas, Carioca, Gambazinho, Jacaré e Dom Helvécio no
Parque Estadual do Rio Doce..................................................................................46
Figura 8 - Análise de Correspondência para os pontos amostrados nas lagoas
Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce
considerando a densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) nessas
lagoas.....................................................................................................................47
Figura 9 - Análise de Correspondência para os meses de amostragem nas lagoas
Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce,
considerando a densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) e
sazonalidade..........................................................................................................48
Figura 10 - Análise de Agrupamento para as lagoas Carioca, Jacaré,
Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce considerando a
densidade
de
coliformes
fecais
(NMP/100ml)
nesses
corpos
d´água....................................................................................................................49
Figura 11 - Análise de Agrupamento para os meses de amostragem nas lagoas
Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do Parque Estadual do Rio Doce,
considerando a densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) nos pontos
amostrados. ..........................................................................................................50
Figura 12 - Freqüência de fatores de virulência em linhagens de E. coli isoladas
de lagoas do Parque Estadual do Rio Doce-MG. O gene stx2 codifica expressão
da toxina Shiga em E. coli enterohemorrágica (EHEC); o gene eae codifica a
vii
intimina em E. coli enteropatogênica (EPEC); e o gene elt I codifica para toxina
LTI de E. coli enterotoxigênica (ETEC)..................................................................54
Figura 13 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para o gene
stx2. Canaleta 1: Padrão de peso molecular, Lambda λ (1Kb); Canaleta 2:
Controle positivo de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) para o gene stx2;
Canaletas 3, 4, 6, 7 e 8: Linhagens ambientais de E. coli 236, 330, 344, 292, 280
e 34, isoladas do PERD e, positivas para a amplificação do gene stx2. Canaletas
5, 9 e 10: Linhagens ambientais de E. coli negativas para amplificação do gene
stx2.........................................................................................................................55
Figura 14 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para o gene
eae. Canaleta 1: Padrão de peso molecular, Lambda λ (1Kb); Canaleta 2:
Controle positivo de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) para o gene eae;
Canaleta 9: Linhagem ambiental de E. coli 373, isolada do PERD e, positivo para
amplificação do gene eae. Canaletas 3, 4, 5, 6, 7 e 8: Linhagens ambientais de E.
coli do PERD negativas para amplificação do gene eae......................................56
Figura 15 - Eletroforese em gel de agarose para o produto de PCR do gene eltI.
Canaleta 1: Padrão de Peso Molecular lambda 1Kb; Canaleta 2: Controle
positivo de E. coli enterotoxigênica (ETEC). Canaletas 3,4,5,7,8 e 9: Linhagens
de E. coli ambientais isoladas de lagoas do PERD e negativas para amplificação
do gene eltI. Canaleta 6: Isolado de E. coli ambiental positivo para o fragmento de
gene etl..................................................................................................................57
Figura 16 - Perfil da susceptibilidade aos antimicrobianos de linhagens
ambientais de E. coli isoladas das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom
Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce............................................................63
Figura 17 - Foto do perfil da susceptibilidade a antimicrobianos da linhagem
ambiental E. coli 58 isolada da região litorânea da lagoa Carioca no Parque
Estadual do Rio Doce............................................................................................67
Figura 18 - Foto do perfil da susceptibilidade a antimicrobianos da linhagem
ambiental E. coli 34 isolada da região litorânea da lagoa Jacaré no Parque
Estadual do Rio Doce............................................................................................68
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
_________________________________________________________________
EPEC - Escherichia coli enteropatogênica
ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica
EHEC - Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC - Escherichia coli enteroinvasora
EAEC - Escherichia coli enteroagregativa
DHEC - Escherichia coli difusamente aderente
PERD – Parque Estadual do Rio Doce
PIE - Programa integrado de ecologia
PELD – Projeto Ecológico de Longa Duração
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente
C LT – Região Litorânea da Lagoa Carioca
C LM – Região Limnética da Lagoa Carioca
G LT - Região Litorânea da Lagoa Gambazinho
G LM – Região Limnética da Lagoa Gambazinho
J LT – Região Litorânea da Lagoa Jacaré
J LM – Região Limnética da Lagoa Jacaré
DH – Lago Dom Helvécio
DH LM – Região Limnética do Lago Dom Helvécio
NMP – Número Mais Provável
EMB – Eosina Azul de Metileno
BHI – Brain Heart Infusion
TSA – Tryptic Soy Agar
TE - Tris-EDTA
IAL – Instituto Adolfo Lutz (Meio Rugai Modificado)
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
LEE – Locus of Enterocyte Effacement
Lesão A/E – Lesão attaching/effacing
SUH – Síndrome Urêmica Hemolítica
EAF – EPEC Adherence Factor
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
_________________________________________________________________
BFP – Bundle forming pili
CFA – Fator Antigênico de Colonização
PIC – Protein Involved in intestinal colonization
AAF- Fimbria de Aderência Agregativa
SHET1 – Shigella enterotoxin 1
STa e STb - Toxina termo estável
LTI e LTII - Toxina termo lábil
STx1 e STx2 – Toxina Shiga
PET - Plasmid encoded toxin
AMP - Ampicilina
CFL - Cefalotina
AMC - Amoxilina + Clavulanato
CRX - Cefuroxima
CFO - Cefoxitina
CRO - Ceftriaxona
GEN - Gentamicina
CAZ - Ceftazidima
AMI - Amicacina
CIP - Ciprofloxacina
CPM - Cefepime
SUT - Sufazotrim
CTX - Cefotaxima
ATM - Aztreonam
CLO - Cloranfenicol
TET - Tetraciclina
TOB - Tobramicina
TIC - Ticarcilina + Clavulanato
x
RESUMO
_________________________________________________________________
Os coliformes fecais cujo principal representante é a Escherichia coli fazem
parte da microbiota intestinal do homem e outros animais de sangue quente,
estes microrganismos têm sido extensivamente utilizados no monitoramento da
qualidade de águas e quando detectados em corpos d´água indicam a possível
presença de contaminação fecal recente, e consequentemente, a presença de
patógenos entéricos. Além das linhagens comensais, várias grupos patogênicos
distintos de E. coli diarreiogênicas são reconhecidos: E. coli enteropatogênica
(EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enterohemorrágica ou Produtora
de Toxina Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC), E. coli difusamente aderente (DAEC). As linhagens
patogênicas de E. coli causadoras de infecções intestinais possuem numerosos
fatores de virulência localizados em cromossomos, plasmídios ou DNAs de
bacteriófagos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi determinar a freqüência
de ocorrência e os fatores de virulência de amostras de Escherichia coli isoladas
em lagoas do Parque Estadual do Rio Doce - MG (PERD - MG). As coletas foram
realizadas mensalmente entre Maio de 2004 e Fevereiro de 2005 nas lagoas
Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio. Utilizando a Técnica de Tubos
Múltiplos verificou-se que as lagoas amostradas apresentaram baixas contagens
para coliformes fecais na maioria das amostras analisadas. A densidade de
coliformes fecais variou significativamente (E. coli F= 2,11; p = 0,035) apenas em
relação aos meses de coleta. Um total de 456 (89,94%) das linhagens ambientais
isoladas foram positivas em relação às provas bioquímicas específicas para a
identificação da espécie Escherichia coli. A técnica de PCR foi utilizada para
detecção dos genes de virulência stx1 e stx2 de EHEC, eae de EPEC e eltI de
ETEC. O gene stx2 foi detectado em cinco linhagens de E. coli ambas isoladas
das lagoas Carioca e Jacaré. Nenhum dos 80 isolados de E. coli investigados
apresentou o fragmento de DNA correspondente ao gene stx1. Para o gene eae e
elt I, apenas os isolados E. coli 373 (C LT) e E. coli 58 (C LT) respectivamente,
amplificaram o fragmento de gene de interesse. Pela técnica de aglutinação em
lâmina 61,3% dos isolados de E. coli aglutinaram na presença de soro específico
para EPEC clássica, 18,2% das linhagens aglutinaram para o sorotipo O157: H7
de EHEC e 20,5% aglutinaram na presença do soro específico de EIEC. Na
caracterização fenotípica do sorotipo O157: H7, cinco isolados de E. coli
ambientais não fermentaram o sorbitol e apenas dois não fermentaram a
ramnose. Altas frequências de linhagens de E. coli resistentes à ampicilina (20%),
cefalotina (50%) e cefuroxima (14%) foram verificadas, para os demais
antibióticos testados a resistência quando verificada ocorreu em menos de 10%
dos isolados. Todos os lagos amostrados apresentaram níveis de coliformes
fecais abaixo dos valores permitidos pela resolução do CONAMA, para
balneabilidade. Por outro lado, a presença de genes de virulência nas linhagens
de E. coli analisadas sugere que existe a probabilidade dos banhistas adquirirem
doença gastrointestinal transmitida pelas águas dos lagos investigados. A Técnica
de Aglutinação em Lâmina, específica para determinados sorogrupos nem
sempre correlaciona com a patogenicidade da linhagem e a discriminação de
subgrupos de EPEC, ETEC, EHEC e EIEC requer a utilização de técnicas
moleculares baseadas em genes de virulência. Alta incidência de isolados de E.
coli multi-resistentes a antibióticos indicam a possível disseminação de linhagens
resistentes pelos banhistas e animais, e também um risco para saúde dos
mesmos. Os dados obtidos no presente estudo podem contribuir para manter o
equilíbrio dos ecossistemas estudados e ampliar o estudo da ecologia da espécie
E. coli considerando o isolamento dos subtipos no meio ambiente.
xii
ABSTRACT
_________________________________________________________________
The fecal coliforms whose main representative is the Escherichia coli
belong to the intestinal flora of humans and other warm-blooded animals, these
microorganisms have been extensively used at water quality control and when
found at water are an indicator of recent contamination by feces, and as
consequence, enteric pathogenic microorganisms are made present. Beyond the
commensal strains, there are various distinct types of diarrhoeagenic E. coli are
acknowledged: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC),
enterohaemorragic E. coli or shiga toxine producer (EHEC/STEC), enteroinvasive
E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAggEC), diffusely adherent E. coli
(DAEC). The pathogenic strains of E. coli that are intestine infectious host
numerous factors of virulence located at chromossome, plasmidis or DNA phages.
Thus, the objective of the research was to determine the frequency of ocurrence
and the virulence of E. coli samples isolated at lakes inside the "Parque Estadual
do Rio Doce-M.G." (PERD - MG). The sample collection happened in a monthly
basis between May, 2004 and February, 2005 at Carioca, Jacaré, Gambazinho
and Dom Helvécio lakes. By using the Multiple Tube Technique, it was verified
that the researched lakes with samples inside had low rate of fecal coliform at the
broad majority of the analysed samples. The fecal coliform density varied
meaningfully (E. coli F=2,11 ; p = 0,35) but only in relation to the sample gathering
months. The final results were of 458 (91%) of the environment strains of
Escherichia coli isolated at the sampled lakes showed positive results regarding
the specific biochemical tests for recognition of the E. coli species. The PCR
technique was used for detection of the virulence genes stx1 and stx2 of EHEC,
eae of EPEC and eltI of ETEC. The stx2 gene was detected within five E. coli
strains, when isolated at the Carioca and Jacare lakes. None of the 80 isolated E.
coli examinated showed the DNA segment corresponding to the stx1 gene, for the
eae and elt I gene, only the isolated E. coli 373 (C LT) and E. coli 58 (C LT),
respectively amplified the segment of the relevant gene. By using the agglutination
technique at a sample 61,3% of the isolated E. coli agglutinated within the
presence of a classic EPEC specific serum, 18.2% of the strains agglutinated to
the serum type O157:H7 of EHEC and 20,5% were agglutinated at the presence of
the EIEC specific serum. The characterization of the serym type O157: H7, five
environments E. coli isolated did not ferment the sorbitol and only two did not
ferment the rhamnose. High frequencies of E. coli strains which were resistant to
ampiciline (20%), cefalotine (50%) and cefuroxime (14%) were verified, to the
other antibiotics tested, the resistance when verified occurred in less than 10% of
the isolated. All the sampled lakes showed fecal coliform levels much below than
the allowed values by the CONAMA, as it refers to the batheability. In another
side, the presence of virulence genes at the E. coli strains analysed sugests that
there is a possibility to that the bather acquires gastrointestinal disease transmitted
by the waters of the researched lakes. The Agglutination Technique, specificly
meant for some determined types of serum is not always relationed to the
pathogenicity of the strains and discrimination of sub-groups of EPEC, ETEC,
EHEC and EIEC, requires the use of molecular techniques based in virulence
genes. High frequency of antibiotic multi-resistant isolated E. coli will indicate
possible spread of resistant strains by the bather and animals, there is also a risk
for their health. The obtained data at this research can contribute to the keep of
the ballance at the researched ecosystems and to amplify the research of the
ecology of the E. coli Species considerating the isolation of the subtypes at the
environment.
1 - RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
_________________________________________________________________
O Parque Estadual do Rio Doce possui a maior área de Mata Atlântica
preservada do estado de Minas Gerais. São aproximadamente 36.000 ha, que
abrange parte dos municípios de Timóteo, Marliéria e Dionísio. No seu interior
ocorrem cerca de 42 lagoas naturais que ocupam uma área de 3.530 ha,
correspondentes a 9,8% da área total do parque, sendo a maior delas a lagoa
Dom Helvécio, também conhecida como lagoa do Bispo, com área de 687 ha e
profundidade máxima de 35m (TUNDISI et al., 1985).
As Lagoas Dom Helvécio, Jacaré, Carioca e Gambazinho foram escolhidas
para a realização deste trabalho e apresentam diferentes características, tais
como: extensão, profundidade e riqueza de espécies animais e vegetais.
Atualmente já é possível perceber o efeito impactante da atividade humana dentro
do Parque em função das atividades recreacionais e em áreas circunvizinhas
devido ao extenso desmatamento, a intensa produção de carvão vegetal e o
cultivo de eucalipto.
O Lago Dom Helvécio é o lago mais procurado pelo público para a
realização das atividades de lazer e recreação por oferecer uma completa infraestrutura constituída por área de camping, restaurante, base para pescaria,
prestação de serviços para passeios de barco, além da área de praia destinada
ao banho dos turistas. As Lagoas Carioca e Gambazinho localizam-se dentro dos
limites do PERD e são de acesso restrito aos visitantes, sendo permitido somente
a visitação por pesquisadores e funcionários do Parque. Apesar da proibição, as
práticas ilegais de pescaria e acampamento vêm acontecendo com freqüência
nessas lagoas, colocando em risco a perfeita estabilidade desses dois
ecossistemas ainda tão preservados. A Lagoa Jacaré encontra-se localizada no
entorno do Parque, numa área onde há uma grande predominância de plantações
de eucalipto. As instalações às margens da Lagoa Jacaré são extremamente
inadequadas,
não
oferecem
qualquer
infra-estrutura
para
recreação,
acampamento e a prática de pescaria, sendo possível detectar em alguns pontos
da lagoa o escoamento de esgoto para dentro do corpo d’água.
Considerando que a utilização de reservas ecológicas para fins
recreacionais
pode
muitas
vezes
ser
feita
de
maneira
inadequada,
1
comprometendo a qualidade da água a ser utilizada pelos turistas, a identificação
dos tipos patogênicos de E. coli irá possibilitar uma avaliação da diversidade
ecológica e o grau de virulência desses microrganismos que circulam nas lagoas
do Parque Estadual do Rio Doce. É importante ressaltar que uma série de
doenças podem ser veiculadas pela água, tais como: gastroenterites, hepatites,
poliomielite, doenças parasitárias e fúngicas. Escherichia coli diarreogênica é o
grupo de bactérias mais comumemente detectado nos estudos em países em
desenvolvimento, causando cerca de 30 a 40% de episódios de diarréia aguda
em crianças (O`RYAN et al., 2005)
Alta prioridade científica e política é dada à conservação da Floresta
Atlântica, reconhecida como um dos biomas mais diversos e ameaçados do
mundo (MYERS et al., 2000), principalmente devido ao desmatamento, atividades
de mineração, siderurgia, poluição (esgoto não tratado) e introdução de espécies
exóticas. Ainda assim, estudos detelhados dos ecossistemas aquáticos inseridos
neste bioma são raros (BARBOSA, 1994). As águas naturais possuem um valor
inestimável
para
indicar
as
condições
ambientais
de
um
determinado
ecossistema. A avaliação dos recursos hídricos, bem como o gerenciamento e
planejamento ambiental, não pode ser realizada sem este tipo de estudo
(PIMENTEL, 2001).
Este trabalho visa estabelecer parâmetros que possam ser utilizados em
estudos futuros, permitindo embasar, com dados microbiológicos, as condições
ambientas do Parque Estadual do Rio Doce, promovendo critérios para o controle
e monitoramento da degradação ambiental que afeta em todos os níveis a fauna,
a flora e a qualidade de vida do ser humano.
Este projeto está inserido no Programa integrado de ecologia (PIE), subprograma: pesquisas ecológicas de longa duração (PELD), intitulado Dinâmica
Biológica e a conservação da Biodiversidade da Mata Atlântica do Médio Rio
Doce-MG. A duração do projeto é de 10 anos (1999-2008), tendo como objetivo
geral o desenvolvimento de estudos ecológicos de longa duração voltados ao
inventário e propostas de conservação da biodiversidade de grupos de
organismos aquáticos e terrestres, considerando-se ainda os processos
ecológicos responsáveis pela manutenção desta biodiversidade.
2
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
_________________________________________________________________
2.1 - Contaminação microbiológica de corpos d´água naturais e os
potenciais riscos à saúde humana.
Os ambientes aquáticos são utilizados em todo o mundo com distintas
finalidades, entre as quais se destacam o abastecimento de água, a geração de
energia, a irrigação, a navegação, a aquicultura, recreação e a harmonia
paisagística (LOPEZ-PIILA et al., 2000; MORAES & JORDÃO, 2002; LEBARON
et al., 2005). O interesse mundial na qualidade da água a ser utilizada pela
população está na associação entre água contaminada e a transmissão de
doenças infecciosas (MUSA et al., 1999). Cada um dos usos da água requer
características qualitativas diferentes, isto é, as exigências quanto ao grau de
pureza variam com o emprego que será feito da água (BRANDÃO, 2001). Os
padrões bacteriológicos de qualidade da água são baseados especificamente na
proteção do consumidor, evitando então as doenças de veiculação hídrica
(NOGUEIRA et al., 2003).
Os agentes patogênicos podem entrar em corpos d´água utilizados para
recreação através de descargas de esgoto “in natura” ou inadequadamente
tratados, águas de arraste das chuvas em regiões urbanas ou rurais, dejetos de
animais domésticos ou silvestres e, possivelmente, por meio dos próprios
indivíduos que utilizam estas águas para recreação, aumentando o risco de
transmissão de doenças para os banhistas (PAUL et al., 1995; WIGGINS, 1996;
DOMBECK et al., 2000). Segundo ALM et al. (2003), a contaminação fecal em
águas destinadas ao banho pode ser arriscada para os usuários, pois as fezes
podem conter bactérias, vírus e protozoários que podem ser ingeridos e causar
doença intestinal. Além disso, esses autores relatam que a agitação da água em
conseqüência das atividades recreacionais também pode ressuspender bactérias
do sedimento, apresentando um risco para as pessoas que se divertem no local
de banho. Assim, quanto maior a contaminação, maior a probabilidade da água
conter microrganismos patogênicos de origem entérica, tais como Salmonella
spp., Shigella spp., vírus da hepatite A, vírus Norwalk causadores de doenças
como gastroenterites, hepatite A, poliomielite, dentre outras (GREENBERG et al.,
3
1992; DOMBECK et al., 2000). De 1999 a 2000, 59 surtos de doenças nos
Estados Unidos foram atribuídos a exposição das pessoas em águas
recreacionais, e 61% desses surtos foram de gastroenterites (ALM et al., 2003).
2.2- Grupo Coliforme como Indicador de Qualidade de Água
A quantificação bacteriana em corpos d´água é de grande interesse para
saúde pública, uma vez que a detecção de altos níveis bacterianos estão
frequentemente associados com elevados níveis de patógenos entéricos (USEPA,
1996). Segundo ASHBOLT (2004), os microrganismos patogênicos, causadores
de doenças transmitidas pela água, são predominantemente de origem fecal,
sendo conhecidos como patógenos entéricos. ROMPRÉ et al. (2002) relatam que
enteropatógenos tais como a E.coli O157:H7 geralmente aparecem em
concentrações muito baixas em águas ambientais quando comparada à
diversificada microbiota existente. Em decorrência do fato de que os
microrganismos patogênicos usualmente aparecem de forma intermitente e em
baixo número na água, pode-se pesquisar outros grupos de microrganismos que
coexistem com os patogênicos nas fezes (AMARAL et al. , 1994). SHIBATA et al.
(2004), afirmam que os microrganismos tipicamente utilizados como indicadores
são aqueles encontrados em elevadas concentrações nas fezes humanas. Os
coliformes
fecais,
um
subgrupo
dos
coliformes
totais
representados
principalmente pela espécie Escherichia coli, têm sido extensivamente utilizados
no monitoramento da qualidade de águas e são considerados os mais específicos
indicadores de qualidade de águas destinadas a potabilidade e balneabilidade
(LÓPEZ-PILA & SZEWZYK, 2000; YOUN-JOO AN et al., 2002; ALM et al., 2003;
NOGUEIRA et al., 2003; LEBARON et al., 2005). A qualidade bacteriológica de
águas recreacionais é avaliada pelos mesmos indicadores recomendados para
águas destinadas ao consumo humano, isto é, coliformes totais e coliformes
fecais (YOSHPE-PURER et al.,1987).
O Conselho Nacional do Meio Ambiente - CONAMA, no uso das
competências que lhe são conferidas pela Lei nº 6938, de 31 de agosto de 1981,
considerando que há a necessidade de serem criados instrumentos para avaliar a
qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a balneabilidade,
4
de forma que se assegurem as condições necessárias à recreação de contato
primário, subdividiu as águas nas seguintes categorias:
Tabela 1 - Padrões de Balneabilidade determinados pelo CONAMA (Resolução nº 274, de 29 de
novembro de 2000) - Limites de Coliformes Fecais /100 mL por categoria.
Categoria
Limite
de
Coliforme
Fecal (NMP/100mL)
Limite de E.coli
Limite
de
Enterococos
(NMP/100mL)
(NMP/100mL)
Própria
Excelente
250
200
25
Muito Boa
500
400
50
Satisfatória
1000
800
100
Imprópria
> 2.500
> 2.000
>400
O grupo coliforme é constituído por bactérias pertencentes aos gêneros
Citrobacter, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella (NOGUEIRA et al., 2003) São
bacilos aeróbios ou anaeróbios facultativos, Gram negativas e não formadores de
esporos, oxidase-negativos, fermentam a lactose com produção de ácido, gás a
35,0 + 0.5ºC em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima βgalactosidase (APHA,1998). Os coliformes fecais, mais especificamente a E. coli,
fazem parte da microbiota intestinal do homem e outros animais de sangue
quente, estes microrganismos quando presentes na água indicam a presença de
contaminação fecal recente, e consequentemente, a presença de patógenos
entéricos (YOUN-JOO AN et al., 2002; LEBARON et al., 2005). Nos últimos anos
as características que fazem da E. coli o melhor indicador de contaminação fecal
têm sido questionadas. Vários estudos têm demonstrado que a E. coli tem
capacidade de persistir e se multiplicar num ambiente externo ao corpo do
hospedeiro e, na ausência de contaminação fecal (FUJIOKA et al., 1999; SOLOGABRIELLE et al., 2000; GORDON, 2001; POWER et al., 2005). De 2002 a 2004,
POWER et al. (2005) monitoraram freqüentes episódios de florescência e,
detectaram altíssimas concentrações de E. coli nos Lagos Burragorang e Burley
Griffin localizados na cidade de Sidney, Austrália. Esses corpos d´água são
utilizados para o abastecimento público e atividade recreacional respectivamente
e, não recebem aporte de esgoto fecal. Os resultados desse estudo sugerem que
algumas cepas de E. coli desenvolveram um estilo de vida livre que não requer a
5
condição de um hospedeiro para sobreviver. Para os autores a presença da
cápsula em linhagens de E. coli isoladas de episódios de florescência pode
aumentar consideravelmente o tempo de sobrevivência desses microrganismos
no ambiente externo, pois a cápsula desempenha importantes funções, tais como:
barreira física protetora contra a dessecação, contra a radiação ultravioleta e
predação; intensifica a formação de biofilmes e ameniza a pressão ambiental pela
absorção de íons e aumento do potencial redutor (WEINER et al., 1995). Apesar
da E.coli ser um habitante comensal do trato intestinal de mamíferos, linhagens
diferentes de E.coli têm preferência por diferentes nichos ecológicos, podem
também ser encontrados em outros locais, oriundos de vegetais e do solo
(RIVERA et al., 1988; FUJIOKA et al., 1999; GORDON & COWLING, 2003).
RIVERA et al. (1988) isolaram E. coli de águas naturais preservadas de
contaminação fecal como águas acumuladas em bromélias e águas de chuvas
em florestas tropicais. Neste estudo, os autores supõem que em algum momento
essas bactérias tiveram origem fecal e que, ao longo da evolução desenvolveram
mecanismos para sobreviver indefinidamente em ambientes tropicais como parte
da microbiota normal de alguns vegetais ou, que a E. coli sempre fez parte da
microbiota natural de áreas tropicais. RIVERA et al. (1988) afirmam que a
ocorrência natural de coliformes fecais em águas não poluídas nega a validade do
uso deste grupo de bactérias como indicador de contaminação fecal recente.
Esses autores acreditam que é preciso reavaliar o uso dessa bactéria como
indicadora de contaminação fecal, isto não significa que os tradicionais padrões
bacteriológicos para análise de água devem ser abandonados, mas deve-se
considerar que estas bactérias são de fato capazes de sobreviver e proliferar em
outras condições além daquelas do trato intestinal de animais de sangue quente.
Apesar dessas divergências conceituais, para HIGUTE et al. (1998), a
utilização das bactérias do grupo coliforme têm demonstrado eficiência no
monitoramento de águas doces em relação à presença de contaminação fecal.
BORGES et al (2003) em estudos realizados ao longo da Bacia do Arroio Feijó
localizada em Porto Alegre – RS, detectaram concentrações de E.coli de 26 a
2400 NMP/ 100 ml em amostras de águas coletadas, sendo que estes níveis
encontram-se bem acima do limite de 1000 NMP 100 ml–1 estipulado pelo
CONAMA para balneabilidade. Os resultados deste estudo demonstraram que a
diversidade genética encontrada entre os isolados de E. coli é conseqüência de
6
fatores ambientais tais como: despejo de esgoto fecal na área de estudo,
presença de animais domésticos e de criação rural no entorno e, assoreamento
do corpo d´água.
2.3 - Escherichia coli
Escherichia coli é um habitante normal da microbiota intestinal de humanos
e outros animais de sangue quente (YOUN-JOO AN et al., 2002). A espécie foi
descrita pela primeira vez em 1885 por Theodor Escherich, um pediatra Alemão,
que mencionou a alta prevalência dessa bactéria na microbiota normal de
indivíduos saudáveis, bem como o seu alto potencial de causar doenças quando
presente em sítios intestinais e extraintestinais (ROBINS-BROWNE et al., 2002).
Segundo KUHNERT et al. (2000), existe uma grande diversidade de linhagens de
E. coli comensal pertencentes a diferentes sorotipos e, que podem ser isoladas
das fezes de indivíduos saudáveis. Estas linhagens são eliminadas maciçamente
no ambiente e podem contaminar os alimentos, a superfícies de corpos d`água e
os sedimentos, geralmente sem causar nenhum efeito adverso a saúde humana.
A cepa E. coli K-12, por exemplo, é uma variante dentro da espécie e, é
considerada um habitante normal da microbiota intestinal de humanos e animais.
Os referidos autores relatam que mais de 20% da informação genética
encontrada na maioria das linhagens patogênicas de E. coli não estão presentes
em E. coli K-12 que é um sorotipo não patogênico. MUHLDORFER et al. (1996)
demonstram em seus estudos que nenhum gene de virulência foi detectado em
linhagens de E. coli K-12 isoladas das fezes de indivíduos saudáveis. De acordo
com BLUM et al. (1996), a maioria das linhagens de E. coli K-12 apresentam uma
mutação dentro do agrupamento de genes rfb que afeta a organização do
antígeno -O e então essas linhagens representam um sorotipo não patogênico.
Laboratórios de pesquisa em todo o mundo utilizam extensivamente derivados
dessa
linhagem
em
experimentos
científicos,
que
têm
contribuído
significativamente para esclarecer os mecanismos elementares da biologia
molecular e das bases genéticas da vida (BLUM et al., 1996; KUHNERT et al.,
2000).
7
A E. coli comensal da microbiota intestinal é considerada inofensiva para o
hospedeiro e é um patógeno oportunista. Segundo BERG (1996), a microbiota
normal associada ao trato digestivo é responsável por três funções importantes
para a saúde do hospedeiro. Essas funções são as seguintes: resistência à
colonização devido a inibição da multiplicação de microrganismos exógenos;
imunomodulação que permite uma resposta imune mais rápida e adequada
durante uma agressão infecciosa; e contribuição nutricional que fornece
vitaminas, substratos energéticos e reguladores na forma de ácidos graxos
voláteis. Somente em algumas raras circunstâncias as linhagens de E. coli
comensal podem tornar-se uma ameaça para o indivíduo saudável (KUHNERT et
al, 2000). Para SANTOS et al. (2003), os microrganismos da microbiota intestinal
indígena podem causar doença e tornar uma ameaça para o indivíduo quando
ocorre um eventual desequilíbrio do ecossistema digestivo ou quando estes
microrganismos alcançam sítios estéreis do corpo. Este desequilíbrio pode ser
devido a uma imunossupressão do indivíduo ou terapias com antimicrobianos.
Pacientes com o sistema imune debilitado são incapazes de conter os
microrganismos comensais no seu habitat natural após o rompimento da barreira
natural entre o intestino e outros sítios estéreis do corpo (KUHNERT et al., 2000).
Segundo FINLAY & FALKOW (1997) as linhagens patogênicas de E.coli podem
ser derivadas de cepas comensais pela aquisição de operons de virulência.
Desse modo, E. coli comensal entérica pode ser considerada um potencial
reservatório natural para o surgimento de cepas patogênicas.
2.4 - Fatores de virulência em Escherichia coli
As linhagens patogênicas de E. coli, causadoras de infecções intestinais ou
extraintestinais, abrigam numerosos fatores de virulência localizados em
cromossomos, plasmídeos ou DNAs de bacteriófagos. A patogenicidade das
cepas de E. coli está relacionada ao impacto cumulativo de um ou vários fatores
de virulência, os quais servem para diferenciar cepas patogênicas de não
patogênicas (JOHNSON, 1991). De acordo com NATARO & KAPER (1998) várias
grupos patogênicos distintos de E. coli diarreiogênicas são reconhecidos, sendo
cada grupo definido por um conjunto de determinantes associados a virulência
que agem adequadamente para determinar os aspectos clínicos, patológicos e
8
epidemiológicos da doença que eles causam. KUHNERT et al. (2000) citam que a
maioria dos genes encontrados em E. coli patogênica codificam vários fatores que
determinam a virulência e o sorogrupo da linhagem. Segundo ROBINS-BROWNE
et al. (2002), os grupos de E. coli representam uma família de clones onde parte
do código genético desses microrganismos abrigam regiões contendo seqüências
gênicas determinantes para a virulência da cepa, as quais foram adquiridas por
transferência horizontal de genes de E. coli e outras espécies bacterianas. BRITO
et al. (2004) relatam que as características de virulência das linhagens
patogênicas de E. coli podem ser transferidas de cepas patogênicas para não
patogênicas através de plasmídios.
Para ROBINS-BROWNE et al. (2002), a patogenicidade de E. coli é um
complexo mecanismo multi-fatorial envolvendo um grande número de fatores de
virulência os quais variam de acordo com a classificação dos grupos dentro da
espécie. A esse respeito ROBINS-BROWNE et al. (2002) ainda relatam que, os
determinantes de virulência de cada grupo de E. coli são diferentes, entretanto
eles podem ser categorizados como: “fatores de colonização” que favorecem a
íntima ligação da bactéria à mucosa intestinal e impede a remoção da mesma
pelo peristaltismo, e a “liberação de toxinas”, as quais interferem nos processos
fisiológicos normais da célula hospedeira. KUHNERT et al. (2000) definiram os
mecanismos de virulência em E. coli como: fatores capazes de modificar a
superfície celular, fatores com função de fixação à célula hospedeira, toxinas,
invasinas, sistemas de secreção que exportam proteínas, dentre outros.
As investigações sobre fatores de virulência em E. coli têm revelado
interessantes informações a respeito da evolução e surgimento de novas
linhagens patogênicas. Acredita-se, atualmente, que o surgimento dos vários tipos
patogênicos de E. coli seja um processo evolutivo à partir de cepas comensais.
Embora E. coli seja encontrada no ambiente e ocorra no intestino animal, a
transferência de genes entre as cepas tem permitido a transição de tipos
comensais para patogênicos (FINLAY & FALKOW, 1997). Além desse processo,
a instabilidade genética também tem sido apontada como mecanismo explicativo,
uma vez que o rearranjo genético espontâneo seja freqüentemente demonstrado.
O detalhamento desse mecanismo embora não totalmente elucidado, parece ser
um processo importante considerando a tendência natural dos organismos de se
ajustarem ao nicho ecológico onde se encontram (CLARKE, 2001). Por exemplo,
9
uma comparação entre a seqüência genômica da linhagem não patogênica da
E.coli K-12 e EHEC O157:H7 revelou que essas bactérias apresentam em comum
uma determinada seqüência de DNA, que contém numerosos genes que foram
adquiridos ao longo da evolução pela integração de plasmídeos, transposons e
bacteriófagos.
A técnica de PCR tem se mostrado uma ferramenta indispensável para a
identificação de genes de virulência em isolados bacterianos, uma vez que
oferece a possibilidade de rápido diagnóstico nos casos específicos de infecções
por E. coli (PASS et al., 2000). Os resultados dos estudos de MUHLDORFER et
al. (1996) revelaram que 63,4% das linhagens de E. coli isoladas das fezes de
indivíduos saudáveis e 41% das linhagens isoladas de água apresentaram genes
de virulência específicos para E. coli causadora de infecções extraintestinais. Por
outro lado, nenhum gene de virulência específico para E. coli enteropatogênica foi
detectado entre os isolados de água e, 4,5% das linhagens isoladas das fezes
carreavam simultaneamente genes de virulência intestinal e extraintestinal.
Segundo MALDONADO et al. (2005), a presença de linhagens patogênicas de E.
coli no ambiente pode ser uma fonte potencial para a contaminação de alimentos
e águas de abastecimento.
2.5 - Escherichia coli enteropatogênicas e as Gastroenterites
A doença diarréica continua sendo uma das principais causas da alta
morbidade e mortalidade entre crianças e adultos em todo o mundo e, a água,
permanece como a principal rota de transmissão de patógenos entéricos em
países subdesenvolvidos. Dados de 1980 sugerem que a freqüência de diarréias
na infância permaneceu relativamente constante, mas houve um declínio
significativo no número de mortes associadas a essa doença (PRASHAR et al.,
2003 ). Estimativas indicam que em 1990 ocorreram aproximadamente 1,4 bilhões
de episódios de diarréia entre as crianças menores de 5 anos de idade que vivem
em países subdesenvolvidos. Aproximadamente 2 a 2,5 milhões de mortes
associadas à diarréia foram estimadas anualmente dentro dessa faixa etária, a
grande maioria dos casos de mortes concentradas em áreas empobrecidas do
mundo (RYAN et al., 2005; KOSEK et al., 2003). RYAN et al. (2005) relatam que
as crianças que vivem em regiões sócio-economicamente pobres estão mais
10
susceptíveis a freqüentes episódios de diarréia, freqüentes quadros de
desidratação, e o índice de morte é muito mais elevado quando comparadas
àquelas que vivem em áreas desenvolvidas. Estes eventos são um reflexo de
numerosas condições típicas do quadro de pobreza em que vivem a maioria das
pessoas em regiões subdesenvolvidas, e que incluem: deficiência em infraestrutura como rede de esgoto e água tratada, constante aglomeração e
exposição de animais junto a população e no peridomicílio, falta de padrões de
higiene pessoal e para o manuseio de alimentos, dificuldades de acesso a
serviços médicos e baixo nível educacional da população. Segundo PRASHAR et
al. (2003), 85% das mortes por diarréia ocorrem nos países menos privilegiados
do mundo que estão localizados principalmente nos continentes da Ásia, África,
Índia e América Latina. Os estudos demonstram que em países de baixa renda a
diarréia representa 21% do total de mortes em crianças menores de cinco anos
de idade, já nos países desenvolvidos essa porcentagem representa pouco mais
de 1% das mortes (O`RYAN et al., 2005)
Segundo JOSÉ & BOBADILLA (1994), as gastroenterites causadas por E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), Shigella sp., Vibrio
cholerae e rotavírus têm sido as principais causas da alta morbidade e
mortalidade infantil em quase todos os países do mundo e estão frequentemente
associadas com precárias condições sanitárias e casos de crianças subnutridas.
Entre os enteropatógenos bacterianos, a E. coli tem sido considerada o principal
agente etiológico de doença diarrêica para humanos. De acordo com pesquisa
realizada na cidade do Rio de Janeiro envolvendo 253 crianças maiores de três
anos de idade constatou-se que linhagens de E. coli diarreiogênica foram
encontradas em 70 (27,6%) crianças, incluíndo 54 crianças (27,1%) com diarréia
e 16 crianças (29,6%) sem diarréia (REGUA–MANGIA et al., 2004). Para
BENICIO et al. (2000), a doença diarréica em crianças é um dos maiores
problemas de saúde pública enfrentados pelos países em desenvolvimento,
constituindo, nessas sociedades, uma das principais causas de mortalidade
precoce, um determinante crucial do retardo do crescimento na infância e uma
das razões mais freqüentes para procura de serviços de saúde.
11
2.6 - Principais subgrupos de E. coli diarreiogênicas
As linhagens diarreiogênicas de E. coli são classificadas em seis categorias de
acordo com as características de patogenicidade: E. coli enteropatogênica
(EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enterohemorrágica ou Produtora
de Toxina Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC), E. coli difusamente aderente (DAEC) (KAPER et al.,
2004). YATSUYANAGI et al. (2003) fizeram a caracterização genética de cepas
de E. coli associadas a um surto de diarréia transmitido pela água, e que
envolveram estudantes na faixa etária de 12 a 15 anos. Dos 75 estudantes
investigados, 41 apresentaram os sintomas clínicos da doença e, a análise
genética das amostras de E. coli isoladas, revelaram a presença de genes
específicos e essenciais para a caracterização de E. coli enteropatogênica
(EPEC) e E. coli enteroagregativa (EAEC), por outro lado nenhum gene para
E.coli enterohemorrágica (EHEC) foi detectado.
2.6.1 - Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)
KOBAYASHI et al. (2000), CLARKE (2001) relatam que o subgrupo de E.
enteropatogênica (EPEC) são linhagens de E. coli diarreiogênicas historicamente
associadas
a
surtos
de
diarréia
infantil
principalmente
em
países
subdesenvolvidos. Segundo NATARO & KAPER (1998) esse patógeno atinge
principalmente crianças menores de dois anos de idade e os sintomas são
bastante severos. As crianças contaminadas apresentam diarréia aquosa
persistente, febre e vômitos. Para TRABULSI et al. (2002), EPEC pertence a um
limitado número de sorotipos, sendo que cerca de 80% das amostras isoladas das
fezes de crianças pertencem aos sorotipos O55:H6, O86:H34, O111:H2,
O119:H6, O127:H6, O142:H6 e O142:H34. A maioria desses sorotipos
corresponde a clones geneticamente próximos quando estudados por métodos
moleculares. VILJANEN et al. (1990) afirmam que embora as infecções por EPEC
sejam predominantes em crianças, a bactéria também pode causar diarréia em
adultos quando houver ingestão de grande quantidade do inóculo, cerca de 108 a
1010 ufc.
12
De acordo com NATARO & KAPER (1998), a EPEC tem como principal
reservatório o homem, raramente são encontradas em animais, e quando
presentes, os sorotipos identificados não correspondem aqueles de humanos.
Assim como outras E. coli diarreiogênicas a transmissão da EPEC é fecal-oral.
KUHRNERT et al. (2000) relatam que usualmente a bactéria é transmitida pela
água, alimentos contaminados e colonizam o intestino delgado. As bactérias
aderem firmemente às vilosidades das células epiteliais intestinal e causam uma
lesão típica, denominada lesão “attaching/effacing” ou lesão A/E. O principal
aspecto dessa lesão é o desarranjo do citoesqueleto e acúmulo de actina
polimerizada logo abaixo do local de adesão, incluindo destruição da borda das
vilosidades e a formação de uma estrutura do tipo pedestal no topo da vilosidade,
onde a bactéria se liga e permanece em íntimo contato com as células (KAPER et
al., 2004). EPEC usualmente não invade a mucosa intestinal e não produz toxinas
(TRABULSI et al., 2002). Segundo ZHANG et al. (2002), genes codificados por
cromossomos e plasmídeos são necessários para formação da lesão A/E. Os
principais fatores de virulência das EPEC típicas incluem a fímbria BFP (“ bundleforming pili ”); uma proteína chamada intimina; um aparelho de secreção do tipo III
e várias proteínas secretadas. O gene eae que codifica a proteína intimina e o
gene esp que codifica a secreção de proteínas envolvidas na sinalização celular
encontram-se localizados em ilhas de patogenicidade, denominada região LEE
(“Locus of
Enterocyte Effacement”). Um grande plasmídio denominado EAF
(“EPEC Adherence Factor”) abriga o agrupamento de genes bfp (“ bundle-forming
pili”) e regula a expressão de eae. BFP é um tipo de fímbria responsável pela
ligação da EPEC nas células epiteliais e formação de microcolônias, um processo
denominado de aderência localizada (LA) (NATARO & KAPER, 1998;
KOBAYASHI et al., 2000; ROBINS-BROWNE & HARTLAND, 2002; TRABULSI et
al., 2002; ZHANG, et al., 2002; CLARKE et al., 2003; KAPER et al., 2004).
Para VIDOTTO et al. (2000), diagnósticos de infecções por EPEC
realizados por meio de métodos convencionais, tais como, os testes sorológicos
são restritos quanto a sensibilidade e especificidade. Entretanto a utilização de
técnicas moleculares como análise de seqüências de DNA e a PCR (“Reação em
Cadeia da Polimerase”), são considerados métodos de alta especificidade,
portanto necessários para uma adequada caracterização de linhagens de EPEC
associadas a episódios de diarréia em diferentes regiões. De acordo com
13
KOBAYASHI et al. (2000), no Brasil a diarréia ainda é um importante problema de
saúde pública e em várias partes do país linhagens de EPEC tem sido isoladas de
crianças com baixo nível sócio-econômico durante episódios de diarréia. Os
referidos autores KOBAYASHI et al. (2000) verificaram em estudos realizados no
Hospital Universitário de Londrina-PR, que dentre as 442 amostras de E. coli
isoladas de crianças menores de dois anos de idade e com diarréia, 18,6% dos
isolados apresentaram um ou mais fatores de virulência característicos para
EPEC.
2.6.2 - Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC)
Para WOLF (1997), a E. coli enterotoxigênica (ETEC) é uma causa comum
de diarréia infecciosa especialmente em países de climas tropicais onde água
tratada e de boa qualidade não encontra-se totalmente disponível para população.
REGUA-MANGIA et al. (2004) afirmam que essas bactérias estão associados à
precárias condições de higiene e de saneamento básico e são, de maior
importância em países subdesenvolvidos. De acordo com GAASTRA &
SVENNERHOLM (1996) e KUHRNERT et al. (2000), a E. coli enterotoxigênica é a
causa mais comum de diarréia em crianças nos países subdesenvolvidos e em
viajantes dessas áreas. A doença no adulto é conhecida como diarréia do viajante
e é usualmente uma doença aguda com sintomas consistindo de fezes líquidas,
náusea, vômito e cólicas abdominais (KAPER et al., 2004). Como a maioria dos
agentes enteropatogênicos, as ETEC são de transmissão fecal-oral. Os casos de
infecções provavelmente ocorrem devido a ingestão de água ou alimentos
contaminados com a bactéria (KUHRNERT et al., 2000). WOLF (1997) cita que
em relação ao número de casos da doença e quanto a severidade dos sintomas,
a infecção atinge principalmente crianças e recém-nascidos. Um outro importante
grupo de risco envolve os viajantes que entraram em contato com a bactéria em
regiões subdesenvolvidas, mas a mortalidade não é um problema eminente
dentro desse grupo.
VICENTE et al. (2005) relatam que de janeiro a março de 1998, surtos
severos causados por ETEC foram notificados em duas pequenas vilas
localizadas ao longo do rio Solimões – Amazonas. Na colônia da Vila Juruá, a
diarréia aguda acarretou a morte de quatro crianças na faixa etária de 2 a 12
14
meses de vida e a morte de um adulto de 24 anos. Na outra vila afetada, Vila
Envira, formada por uma comunidade de seringueiros, pelo menos 11 adultos
foram hospitalizados e uma morte foi constatada. ADHIKARI et al. (1985) e
DANIELS et al. (2000) afirmam que a E. coli enterotoxigênica (ETEC) não é um
patógeno comum em países desenvolvidos embora tenha sido identificada
durante surtos de gastroenterite infantil em hospitais dessas regiões e também
em outros episódios de surtos envolvendo a contaminação de água e alimentos.
Segundo ROSENBERG et al. (1977), um dos maiores surtos causados por ETEC
nos Estados Unidos ocorreu dentro de um parque nacional e envolveu mais de
2000 pessoas que utilizaram a água de um lago recreacional.
Segundo WOLF (1997), a diarréia causada por ETEC é muito semelhante à
cólera, ambas resultam da ingestão de grande quantidade do inóculo da bactéria
que então coloniza o intestino delgado e passa a produzir toxinas que causam a
secreção de líquido para dentro da luz intestinal.
Para VICENTE et al. (2005), a virulência das linhagens de ETEC é devido a
habilidade da bactéria de produzir enterotoxinas e expressar adesinas de
superfície que permitem a colonização das células do epitélio intestinal. Os
principais fatores de virulência das ETEC são as enterotoxinas LT e ST e as
adesinas (ECHEVERRIA et al., 1993). Dois diferentes grupos de enterotoxinas
são produzidas por ETEC, as toxinas termo lábeis (LT-I e LT-II) codificadas pelos
genes eltI e eltII, respectivamente, e as toxinas termoestáveis (STa e STb)
codificadas pelos genes stIA e stIB (KAPER et al., 2004). Os genes que codificam
as enterotoxinas LT e ST de ETEC estão localizados em plasmídeos
(ECHEVERRIA et al.,1993). A LT-I é antigenicamente semelhante a toxina
produzida pelo V. cholerae, sendo que as seqüências de aminoácidos de ambas
apresentam aproximadamente 80% de homologia, e tem o mesmo modo de ação
(CLARKE, 2001; WOLF, 1997). As toxinas LT-I e STa são produzidas por cepas
de E. coli isoladas de seres humanos, já as toxinas LT-II e STb são produzidas
por cepas de E. coli isoladas de animais, mas atualmente já existem relatos do
isolamento de cepas E. coli produtoras destas toxinas em seres humanos
(TRABULSI et al., 2002; KAPER, et al., 2004).
Segundo WOLF (1997), além das enterotoxinas, três outros fatores de
virulência são investigados para identificar e caracterizar linhagens de ETEC:
sorogrupo O, sorogrupo H, e o fator antigênico de colonização (CFAs). Tais
15
investigações são baseadas em lipopolissacarídeos, flagelos e adesinas fimbrais,
respectivamente. Esses fatores são importantes uma vez que todos estão
expostos na superfície celular da bactéria e atualmente são considerados
antígenos promissores a serem testados para síntese de vacinas contra ETEC.
2.6.3 - Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC)
Dentre
os
isolados
de
E.
coli
enterohemorrágica
(EHEC),
aqueles
pertencentes ao sorogrupo O157 são os mais importantes em termos de
episódios de doença humana (BOLTON 1998; PATON & PATON, 1998).
Segundo CLARKE (2001), o principal componente de virulência desse grupo é a
produção de uma toxina que tem atividade citotóxica sobre células Vero e, é
denominada Verotoxina (VT), essa toxina também é reconhecida como toxina
Shiga (Stx) ou toxina “Shiga-like" (SLT), devido sua similaridade com a toxina
produzida pela Shigella dysenteriae. A toxina Shiga foi primeiramente identificada
em S. dysenteriae. Essa proteína é codificada por um gene cromossomal que
pode ser facilmente transferido para linhagens de E. coli por intermédio de
bacteriófagos (ROBINS-BROWNE & HARTLAND, 2002). Dois principais grupos
antigênicos distintos da toxina ocorrem e são identificados como Stx1 que é
similar a toxina tipo I de S. dysenteriae, e a Stx2 que apresenta 11 variantes
distintas (PATON & PATON, 1998; GARCIA –ALJARO et al., 2005). Portanto, o
subgrupo da espécie que comumente é denominado E. coli enterohemorrágica
(EHEC), é também nomeado de E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) ou E.
coli verocitotoxigênica (VETEC) (CAPRIOLI et al, 2005; GARCIA–ALJARO et al.,
2005).
No início da década de 80, a E. coli enterohemorrágica (EHEC) sorotipo O157:
H7 emergiu como patógeno humano após o relato da ocorrência de dois surtos
provocados por essa bactéria nos Estados Unidos (RILEY et al., 1983). Desde
então, novos surtos em várias partes do mundo são notificados, incluindo,
América do Norte, Europa Ocidental, Austrália e Ásia (COWDEN et al., 2001;
ELLIOT et al., 1995; YAMAMOTO et al., 2001).
As EHEC são encontradas nas fezes da maioria dos animais domésticos, mas
em termos de infecção humana o reservatório mais importante é o gado bovino
16
aparentemente saudável (CLARKE, 2001; TRABULSI et al., 2002). KARCH et al.
(1999) citam que a E. coli O157:H7 também já foi isolada de cães, cavalos,
carneiros e gaivotas. A transmissão da bactéria pode ocorrer pela ingestão de
alimentos contaminados, tais como, carnes, leite não pasteurizado, água, pelo
contato pessoal, ou transmitida por animais (CLARKE, 2001). A causa mais
comum de infecção tem sido a ingestão de carnes mal passadas principalmente
de origem bovina. Nos últimos anos vem aumentando o envolvimento de outros
veículos de transmissão, entre eles águas de recreação e da rede pública,
vegetais, frutas e sucos fermentados (TRABULSI et al., 2002; ALFREDO et al.,
2005).
As infecções humanas por EHEC estão associadas a uma variedade de
síndromes
clínicas,
incluindo
diarréia
com
presença
de
sangue,
colite
hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica (SUH) que é caracterizada por
falência renal aguda, anemia hemolítica e trombocitopenia (MULLER et al., 2001;
CLARKE, 2001). Os dados revelam que 2% a 7% dos indivíduos infectados
normalmente desenvolvem a síndrome urêmica hemolítica que é mais comum em
crianças (CLARKE, 2001). Uma característica fenotípica bem descrita do
sorogrupo O157: H7 é sua incapacidade para fermentar sorbitol. O crescimento
de colônias não fermentadoras de sorbitol em ágar MacConkey Sorbitol pode ser
uma indicação presuntiva de E. coli O157: H7, principalmente quando as culturas
originarem de fezes com presença de sangue (MARCH & RATNAM, 1986;
OJEDA et al., 1995). Ágar seletivos baseados na incapacidade de E. coli O157:
H7 fermentar sorbitol ou ramnose tem sido usado para isolar essa linhagem de
uma variedade de amostras pelo método de cultura direta (MARCH & RATNAM,
1986; CHAPMAN et al., 1991).
De acordo com NATARO & KAPER (1998), a dose infecciosa é bastante
baixa, menos de 100 microrganismos é suficiente para causar a doença conforme
relatado nas investigações em episódios de surtos. Surtos envolvendo a
transmissão de E. coli O157:H7 por meio de águas recreacionais, águas de poços
e águas oriundas de sistemas de abastecimento têm sido relatados (KEENE et
al., 1994; SWERDLOW et al., 1992). A habilidade desses microrganismos de
causar doença, sendo a água o principal veículo de transmissão, foi demonstrado
em dois grandes surtos, onde em um deles à população consumiu água de
abastecimento inadequadamente tratada (SWERDLOW et al., 1992), e no outro
17
as pessoas infectadas nadaram em águas de um lago contaminado (KEENE et
al., 1994). Segundo HRUDEY et al. (2003), um dos grandes surtos de E. coli
O157:H7 transmitidos pela água ocorreu em Walkerton, Ontário – Canadá, onde
1.346 casos de gastroenterites foram notificados e 167 casos foram confirmados
para infecção por E. coli O157:H7. GRIFFIN & TAUXE (1991) sugerem que há
uma aparente atenuação na transmissão de E. coli O157: H7 pela água onde
esses microrganismos encontram-se diluídos, mas ainda sim eles são capazes de
causar doença quando ingeridos, pois uma baixa dose infectante é suficiente para
causar a infecção.
2.6.4 - Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)
EAEC são reconhecidas como causa de diarréia persistente em crianças e
adultos, tanto em países em desenvolvimento como nos desenvolvidos. EAEC
são definidas como um grupo de E. coli que se adere em determinadas linhagens
celulares cultivadas in vitro , como as células Hep-2 e HeLa num padrão de
adesão denominado “ stacked-brick “ ( NATARO & KAPER, 1998).
O padrão de adesão agregativo é mediado por fímbrias de aderência
agregativas (AAFs) (CZECZULIN et al., 1997). Recentemente foi descrita uma
proteína chamada dispersina que forma uma camada frouxamente associada com
a superfície de EAEC e parece conter um forte efeito agregativo com as adesinas
AAFs, facilitando a multiplicação e penetração através da mucosa (KAPER et al.,
2004).
As amostras EAEC são genética e fenotipicamente heterogêneas devido a
algumas apresentarem as fímbria AAF/I e/ou AAF/II, e diversas toxinas. Dentre
estas toxinas, duas são codificadas no mesmo “lócus” cromossômico, em fitas
separadas. Um gene codifica para uma protease que possui atividade mucolítica,
chamada PiC (“protein involved in intestinal colonization”). A fita oposta codifica
uma enterotoxina que é conhecida como Shigella “enterotoxin” 1 (SHEt1), estando
presente na maioria das linhagens de Shigella flexineri. Uma Segunda
enterotoxina descrita é a EAST-1, codificada pelo gene astA, presente em 40%
das amostras de EAEC. EAST-1 é uma enterotoxina termoestável homóloga a
STa de ETEC. Muitas cepas EAEC secretam uma toxina chamada PET
18
(“Plasmid-encoded toxin”), que é codificada por um plasmídio de virulência. PET
possui atividade enterotóxica, provocando alterações no citoesqueleto e
arredondamento celular pela clivagem da proteína do citoesqueleto espectrina
(KAPER et al., 2004).
A patogênese de EAEC envolve três estágios: aderência na mucosa
intestinal por meio das fímbrias de aderência agregativa (AAF) ou outros fatores
de aderência; aumento da produção de muco pela bactéria formando biofilme;
produção de toxinas e processo inflamatório, resultando em lesões na mucosa
intestinal (NATARO & KAPER, 1998).
Segundo TRABULSI et al. (2002), números crescentes de relatos
epidemiológicos associando EAEC à doença diarréica aguda tanto em países
desenvolvidos
quanto
em
desenvolvimento,
demonstram
que
EAEC
é
considerada um patógeno emergente.
2.6.5 - Escherichia coli enteroinvasora (EIEC)
EIEC compreende um grupo de E. coli que invade e destrói o epitélio do
cólon produzindo uma doença caracterizada por febres e cólicas, com presença
de sangue e leucócitos nas fezes (CLARKE, 2001). A infecção intestinal causada
por EIEC é estritamente relacionada à infecção por Shigella dysenteriae e são
mais freqüentes em crianças maiores de dois anos de idade e no adulto
(TRABULSI et al., 2002).
A patogênese de EIEC/Shigella compreende penetração nas células
epiteliais (células M), seguido de lise do vacúolo endocítico, multiplicação
intracelular, movimento através do citoplasma e invasão basolateral para as
células adjacentes (NATARO & KAPER, 1998). A invasão da mucosa por EIEC
provoca intensa reação inflamatória tecidual e disentérica (LEVINE, 1987). Os
genes requeridos para o mecanismo de patogenicidade estão presentes em um
plasmídio (pInv) encontrado em EIEC e em Shigella. Um terço deste plasmídeo é
composto por seqüências de inserção (IS), as quais são muito importantes para a
evolução do plasmídeo de virulência. Este plasmídeo codifica fatores de virulência
como as múltiplas proteínas do sistema de secreção do tipo III, responsáveis por
eventos de sinalização, rearranjos do citoesqueleto, lise do vacúolo endocítico e
19
outras ações (KAPER et al., 2004). Embora o sistema de secreção tipo III seja
essencial para as características invasivas de EIEC, fatores de virulência
adicionais, tais como, serina protease (SepA), sistema de aquisição de ferro e
outras proteases têm sido descritas ( NATARO & KAPER, 1998).
2.6.6 - Escherichia coli Difusamente Aderente (DAEC)
As linhagens de DAEC são definidas pelo padrão de adesão difusa em
cultura de células Hep-2 e HeLa.
DAEC tem sido implicada como causa de
diarréia em vários estudos, particularmente em crianças com mais de um ano de
idade (KAPER et al., 2004). A maioria das linhagens de DAEC apresenta uma
adesina chamada F1845, que seria responsável pela aderência difusa da bactéria
ao epitélio intestinal. O gene que codifica esta fímbria pode estar no cromossomo
ou em plasmídeos (NATARO, 1996). Estas linhagens induzem efeito citopático
que é caracterizado pelo desenvolvimento de longas extensões celulares, que
envolvem o local ao redor da bactéria aderida, mas sem internalização da bactéria
(KAPER et al., 2004).
2.7 - Susceptibilidade de Escherichia coli a antimicrobianos
A maioria dos estudos sobre resistência a antimicrobianos em ambientes
aquáticos tem envolvido bactérias de origem fecal, pois estas são utilizadas como
indicadores de poluição e podem estar associadas a doenças infecciosas
(FRENCH et al., 1987; GONI – URRIZA et al., 2000; ASH et al., 2002). Os
coliformes fecais podem carrear elementos genéticos extra cromossômico
frequentemente denominado de fator de resistência, fator R ou plasmídeo R que
determina a resistência a antibióticos, esses plasmídeos podem ser transferidos
entre membros da família Enterobacteriaceae bem como para outras bactérias
patogênicas e não patogênicas (CLOWES, 1972; COOKE, 1976). Linhagens de
E. coli resistentes a antibiótico tem sido isoladas de rios, lagos e água potável
(ASH et al., 2002; BEDARD et al., 1986), áreas costeiras (WEBSTER et al.,
2004), água do mar e moluscos marinhos (COOKE, 1976), esgotos (COOKE,
1976) e ambientes hospitalares (EL KHOLY et al., 2003). A presença de fatores
20
de resistência a antibióticos nas bactérias encontradas nas águas de consumo ou
de recreação contaminadas, pode constituir uma ameaça direta ao homem, pela
transferência eventual destes plasmídeos para a microbiota intestinal normal
(DRAPEAU & KASATYA, 1977).
A seleção de organismos resistentes na natureza provavelmente resulta da
produção de antibióticos por organismos do solo (ASH et al., 2002), do uso
indiscriminado de antimicrobianos nas medicinas humana e veterinária e práticas
agrícolas. Atualmente é comum a detecção de linhagens de Escherichia coli
isoladas de humanos e animais resistentes a pelo menos duas classes de
antibióticos, tal fato acarreta um impacto crescente nas opções terapêuticas
disponíveis (VON BAUM & MARRE, 2005). As infecções causadas por
microrganismos resistentes dificultam a terapia restringindo o uso dos antibióticos.
Qualquer origem potencial de bactérias resistente a antibiótico pode, entretanto
ser considerado um risco para saúde. Esta é a razão pelo interesse no teste de
susceptibilidade aos antimicrobianos para linhagens bacterianas como E. coli que
sobrevive em diferentes condições ambientais (BALDINI et al., 1991).
21
3 - OBJETIVOS
_________________________________________________________________
3.1 - Objetivo Geral
Determinar o potencial patogênico de linhagens de Escherichia coli isoladas
de lagoas do Parque Estadual do Rio Doce, a partir da avaliação da freqüência dos
fatores de virulência e demais indicadores como o perfil de resistência a antibióticos.
3.2 - Objetivos Específicos
- Determinação do grau de contaminação fecal das lagoas utilizando como
indicadores os coliformes fecais.
- Isolamento e identificação da espécie Escherichia coli a partir dos pontos
contaminados por coliformes.
- Investigação dos genes stx1, stx2, eae e eltI que codificam fatores de
virulência característicos dos tipos diarreiogênicos de E. coli dentre os isolados
obtidos.
- Determinação da incidência de sorogrupos patogênicos de E. coli nos
diferentes pontos da área de estudo.
- Avaliar a susceptibilidade a antibióticos das linhagens de Escherichia coli
isoladas na área de estudo.
22
4 – MATERIAIS E MÉTODOS
____________________________________________________________________
4.1 – Origem e caracterização das amostras
4.1.1 - Área de Estudo
Parque Estadual do Rio Doce (PERD)
O estudo foi desenvolvido na região do trecho médio da bacia do Rio Doce,
especificamente, no Parque Estadual do Rio Doce (PERD) onde está localizado o
Sistema Lacustre do médio Rio Doce, formado por 158 lagos com diferentes
características (BARBOSA, 1997). O Parque Estadual do Rio Doce é o maior
remanescente do bioma Mata Atlântica no Estado de Minas Gerais (SILVA, 2001).
Situa-se entre os meridianos 42o 38’ W e 48o 28’W, e os paralelos 19o 45’S e 19o
30’S, com altitudes variando entre 230 e 515 m acima do nível do mar (BARBOSA &
MORENO, 2002). Os limites naturais são o rio Doce à leste e o rio Piracicaba ao
Norte, sendo que a nascente localiza-se na região de Ouro Preto-MG (IEF, 2001).
São 36.000 ha de mata na qual se distribuem florestas em diferentes estágios de
sucessão, desde ambientes de capoeirinha até florestas em estágio clímax. No
interior do Parque Estadual do Rio Doce ocorrem cerca de 42 lagoas que ocupam
uma área de 3.530 ha, correspondentes a 9,8% da área total. O clima pode ser
classificado como tropical quente semi-úmido com uma estação chuvosa no verão e
uma seca no inverno (NIMER, 1989). Apresenta temperaturas médias entre 20ºC e
22ºC, e pluviosidade média anual variando entre 1.250 e 1.500 mm, com chuvas
concentradas nos meses de verão, havendo uma estação seca com 4 a 5 meses de
duração (IEF, 2001).
O PERD é considerado uma área de extrema importância biológica tal o papel
desempenhado
pelo
mesmo
na
conservação
da
biodiversidade
brasileira,
especificamente da diversidade biológica da mata atlântica (CI et al, 2000). A região
23
abriga no mínimo 148 espécies de mamíferos, que corresponde a mais de 50% da
riqueza mastozoológica da Mata Atlântica. No caso de primatas, o PERD abriga 40%
de todas as espécies do bioma. Destaca-se também a ocorrência de carnívoros de
grande porte, com o registro de populações dos maiores felinos com ocorrência no
Brasil (IEF, 2001).
Os lagos do PERD e o conjunto de lagos de seu entorno
representam cerca de 1/3 de toda a ictiofauna da bacia, com cerca de 26 espécies.
No entanto, esta riqueza de espécies está ameaçada pelos intensos impactos de
origem antrópica, que vão desde a destruição da mata ciliar até a introdução de
espécies exóticas de peixes. Segundo COSTA et al. (1998), o PERD é indicado
como uma área de importância biológica especial por se constituir em um ambiente
único, sem igual no Estado, pela presença de aves de distribuição restrita e alta
riqueza de espécies ameaçadas de diversos grupos faunísticos.
24
Figura 1: Mapa da área de abrangência do Parque Estadual do Rio Doce e dos
municípios no seu entorno .
25
4.1.2 - Locais de Coleta
As coletas foram realizadas no Lago Dom Helvécio, na Lagoa Jacaré, na
Lagoa Carioca e Lagoa Gambazinho. No Lago Dom Helvécio a amostragem foi
realizada em cinco pontos (P1, P2, P3, P4 e P5) da região litorânea do lago, onde é
permitida a recreação de contato primário (banho e natação), e em um ponto (P6), na
região limnética (centro da lagoa) onde os turistas não têm acesso (Figura 2). Nas
Lagoas Jacaré, Carioca e Gambazinho as coletas foram realizadas em um ponto na
região litorânea (LIT) e em um outro ponto na região limnética (LIMN) de cada lagoa
(Figuras 3, 4 e 5 ).
4.1.2.1 - Lago Dom Helvécio
O Lago Dom Helvécio (Figura 2) é o maior lago desse sistema lacustre,
possuindo 6,87 Km2 de área e 45Km de perímetro, com formato dendrítico e
profundidade máxima de 32,5 m (HENRY et al., 1997). Constitui um sistema isolado,
sem conexão direta com a dinâmica do rio principal. O entorno é formado por mata
secundária e abriga atividade turística (SOUZA, 2005). É o lago mais procurado pelo
público para a realização das atividades de lazer e recreação por oferecer uma
completa infra-estrutura constituída por área de camping, restaurante, base para
pescaria, prestação de serviços para passeios de barco, além da área de praia
destinada ao banho dos turistas.
4.1.2.2 - Lagoa Jacaré
A Lagoa Jacaré (Figura 3) situa-se fora dos limites do PERD. Possui 1,03 Km2
de área e 11,3 Km de perímetro, com um formato dendrítico e profundidade máxima
de 8,5 m. Abriga atividade pesqueira intensa e o entorno é formado por extensas
monoculturas de Eucalyptus (SOUZA, 2005). As instalações às margens da Lagoa
Jacaré são extremamente inadequadas, não oferecem qualquer infra-estrutura para
recreação, acampamento e a prática de pescaria, sendo possível detectar em alguns
pontos da lagoa o escoamento de esgoto para dentro do corpo d’água.
26
4.1.2.3 - Lagoa Carioca
A Lagoa Carioca (Figura 4) localiza-se em uma área protegida da ação
antrópica, constituindo um sistema ecológico “fechado”, sem afluente nem efluente; é
considerada uma lagoa rasa, de formato arredondado (BARBOSA & TUNDISI, 1980)
com as seguintes características morfométricas: área: 13,3 Km2 ; profundidade
máxima: 11,8; profundidade média: 2,76 m; volume: 713.489,8 m3. Localizada em um
vale relativamente profundo, circundada por vegetação de mata secundária de
grande porte, apresenta alto grau de proteção das margens à ação do vento e,
consequentemente elevada estabilidade térmica (BARBOSA, 2004). A ictiofauna
apresentou grandes alterações desde a introdução do tucunaré (Cichla ocelaris). Em
1987, dois anos após o primeiro registro desta espécie, oito espécies nativas de
peixes não foram mais observadas (SUNAGA & VERANI, 1997). Atualmente
predominam o tucunaré (Cichla ocelaris) e a piranha (Pygocentrus nattereri).
4.1.2.4 - Lagoa Gambazinho
A Lagoa Gambazinho (Figura 5) é de acesso restrito aos visitantes, sendo
permitido somente a visitação por pesquisadores e funcionários do Parque. Pode ser
considerada um dos locais de estoque da ictiofauna nativa do PERD, pois apresentase bem protegida e não possui canal de escoamento, o que facilitaria a dispersão de
peixes exóticos. A ictiofauna inclui espécies zooplanctívoras como os lambaris
(Oligosarcus
solitarius,
Moenkausia
doceana,
Astyanax
taeniatus)
e
acará
(Cichlasoma facetum e Geophagus brasiliensis). Também são registradas a traíra
(Hoplias malabaricus) e o piau (Leporinus steindachneri). A lagoa apresenta as
seguintes características morfométricas: comprimento máximo: 620 m; largura
máxima: 185 m ; profundidade máxima: 10,3 m; profundidade média: 3,59 m;
perímetro: 1.528 m; área total : 10,43 ha; volume total: 347.450 m³
27
P5
P4
P6
P2
P1
P3
Figura 2 : Foto da área de Praia do Lago Dom Helvécio, principal local dentro do
Parque onde é permitido o banho dos turistas e onde foram realizadas as coletas
da região litorânea (P1, P2, P3, P4, P5) e região limnética (P6).
LIT
LIMN
Figura 3 – Foto da Lagoa Jacaré mostrando os locais de coleta e extensas
plantações de Eucalyptus no seu entorno.
28
LIT
LIMN
Figura 4: Foto identificando as regiões litorânea e limnética da
Lagoa Carioca um dos principais locais de coleta.
LIT
LIMN
Figura 5: Foto da Lagoa Gambazinho destacando os locais de
coleta na região Litorânea e região Limnética.
29
Figura 6: Localização das lagoas dentro e no entorno do
Parque Estadual do Rio Doce.
Jacaré
Jacaré
Carioca
Carioca
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Gambazinho
Gambazinho
30
4.1.3 - Procedimentos de Coleta
As coletas foram realizadas mensalmente entre Maio de 2004 e Fevereiro de
2005. As amostragens das lagoas nas regiões litorâneas e limnéticas foram feitas na
superfície da água, sendo que nas regiões litorâneas a distância do ponto de coleta
em relação à margem da lagoa foi de aproximadamente 3 m de distância. As
amostras foram coletadas em frascos estéreis e transportadas para laboratório em
recipientes contendo gelo para serem processadas no máximo em 24 horas.
4.2 - Análise Laboratorial das Amostras
4.2.1 - Determinação da Qualidade Microbiológica das lagoas
A avaliação do índice de contaminação por E. coli nas coleções de água da
área de estudo foi feita utilizando o método padrão da ”American Public Health
Association” (APHA, 1998) por meio da avaliação representativa do índice de
coliformes fecais, empregando-se a Técnica de Fermentação em Tubos Múltiplos,
que é baseado na habilidade das bactérias coliformes produzir gás a partir da
fermentação da lactose (APHA, 1998). O procedimento experimental compreendeu
das seguintes etapas: teste presuntivo em 24/48h e teste confirmativo em 24h. O
teste presuntivo foi realizado por meio da inoculação de volumes de 10 mL, 1mL e
0,1 mL de água bruta respectivamente, em uma série de 5 tubos de ensaio com 10
mL de caldo lactosado (em concentração dupla e simples) contendo tubos de Durhan
invertidos no interior. Após a inoculação, os tubos foram incubados em uma estufa
na temperatura de 37ºC. A leitura foi feita após 24h/48h. Foram considerados
positivos os tubos que se apresentaram turvos, com fermentação e bolha no tubo de
Durhan. Os tubos positivos foram repicados para 2mL do meio E.C.-mug (DIFCO, Le
Pont de Claix, France) e incubados na estufa a uma temperatura de 37ºC. A
positividade para coliforme fecal foi avaliada pela fluorescência das amostras quando
expostas à luz ultravioleta após 24h.
31
4.2.2 - Análise estatística dos dados para avaliação das diferenças entre as
lagoas
Para testar as diferenças entre os ambientes estudados, em relação ao NMP
de coliformes fecais, foi utilizada “Análise de Variância” (ANOVA, medidas repetidas).
Essas análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa Statistic 5.0.
Para analisar possíveis gradientes ambientais foi feita a “Análise de
Correspondência” utilizando o programa Statistic 6.0. A Análise de Correspondência
é um método de ordenação que ordena os pontos de acordo com os eixos, e prevê
possíveis gradientes ambientais. Uma vez fornecido os valores o programa gera os
dados distribuídos em um hiperespaço e então analisa-se a distribuição em função
da inércia de cada ponto. Quanto maior a inércia maior é a explicação da variância
dos dados. O valor da inércia só é considerado significativo quando estiver acima de
70%. A “Análise de Agrupamento” também foi realizada utilizando o programa
Statistic 6.0.
4.2.3 - Isolamento de Escherichia coli das lagoas
O isolamento das amostras de E. coli foi feito à partir das amostras positivas no
teste confirmativo para coliforme fecal. Com o auxílio de uma alça bacteriológica, as
amostras foram semeadas em placas de Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)
(HiMedia Laboratories, Mubai, Índia), um meio seletivo para Enterobacteriaceae, e
em seguida incubadas a 37ºC por 24h. Decorrido o tempo necessário para o
crescimento, as colônias típicas de E. coli que apresentaram brilho verde metálico
foram selecionadas e inoculadas em 2 ml de caldo “Brain Heart Infusion” (BHI)
(DIALAB Diagnósticos, Minas Gerais, Brasil), e posteriormente incubadas a 37ºC por
24 h. Os isolados foram então acondicionados em tubos criogênicos com três gotas
de glicerol e congelados a uma temperatura de − 86ºC para posterior identificação
dessas linhagens.
32
4.2.4 - Identificação dos isolados de Escherichia coli
A identificação de todos os isolados foi feita utilizando o meio de cultura
Instituto Adolfo Lutz - IAL, (meio Rugai, MBiolog, Belo Horizonte, Brasil),
modificado por PESSOA & SILVA (1974), que consiste em um tubo contendo
substratos para a visualização das provas bioquímicas: indol, fermentação de
sacarose, LTD, fermentação de glicose, produção de H2S e gás, hidrólise de uréia,
lisina e motilidade (KONEMAN, 2001). Para a inoculação do meio de Rugai foi
realizado o repique de colônias isoladas com agulha de níquel cromo estéril,
seguido de estriamento da superfície do ágar. Os tubos semeados foram
incubados a 37ºC por 24 horas. A interpretação dos resultados foi realizada
mediante comparação dos resultados obtidos com tabela descrita em PESSOA &
SILVA (1974).
4.2.5 – Investigação dos tipos diarreiogênicos dos isolados de Escherichia coli
4.2.5.1 - Extração do DNA
A partir dos resultados obtidos nos testes bioquímicos, 80 isolados de
Escherichia coli (Anexo 1 e 2) foram selecionados para pesquisa de genes que
codificam para fatores de virulência. Os isolados foram cultivadas em caldo BHI, a
37ºC por 24horas. Posteriormente, foram semeadas em “Tryptic Soy” Agar (TSA) e
incubadas a 37ºC por 24 horas. O crescimento de cada amostra foi ressuspendido
em 400µL de tampão TE estéril. A suspensão bacteriana foi fervida por 10 minutos e
centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos. Os sobrenadantes foram utilizados para
reação de PCR (BLANCO et al., 2004).
4.2.5.2 - Pesquisa dos genes de virulência pela Reação em Cadeia da
Polimerase
Após a extração do DNA, as 80 amostras (Anexos 1 e 2) foram submetidas à
reação de PCR utilizando iniciadores específicos para os genes stx1, stx2, eltI e eae
33
(Tabela 2) que codificam para Toxina Shiga ou “shiga-like”, toxina LT (termo estável)
e intimina, respectivamente. As reações de PCR foram realizadas utilizando o DNA
das linhagens de referência EPEC ATCC 0127a, EHEC ATCC 933, ETEC UNICAMP
como controles positivos e E. coli ATCC 25723 como controle negativo.
Todas as reações de PCR foram realizadas para um volume final de 30 µL, e
os reagentes utilizados foram: água deionizadda: 17,1 µL; PCR buffer 10x: 2 µL;
dNTP 10 mM : 0,6 µL; Iniciador 1: 1,5 µL; Iniciador 2: 1,5 µL; 50 mM MgCl2 : 2 µL;
Taq polimerase (500 U): 0,3µL; DNA extraído: 5 µL (SCHULTSZ, et al., 1994;
BLANCO, et al., 1996; BLANCO, et al., 2004).
Todas as reações foram submentidas a 30 ciclos que tiveram as seguintes etapas:
1 - Desnaturação Inicial: 94ºC por 5 minutos
2 - Desnaturação: 94ºC por 1 minuto
3 - Anelamento : ºC por 30 segundos – (Tabela 2 )
4 - Extensão: 72ºC por 30 segundos
5 - Fechamento: 72ºC por 10 minutos
4.2.5.3 - Eletroforese em gel de agarose
Para a leitura do resultado das amplificações, 2 µL do tampão de amostra
(0,25% de azul de bromofenol; 0,25% de xilenocianol; 25% de ficol) foram misturados
ao produto da reação. Foram aplicados 12 µL da mistura em gel de agarose 1%, em
tampão TBE (Tris 2M, ácido bórico 0,045M, EDTA 0,5M pH8). Após a eletroforese o
gel foi corado com solução de bromento de etídio por 20 minutos e o produto
amplificado dos genes foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta e
fotografados.
34
Tabela 2 – Sorogrupos, Seqüências, tamanho do produto amplificado e temperaturas de anelamento dos iniciadores.
Sorogrupo
Gene
Seqüência do Primer
de E. coli
EHEC
stx1
1: CGC TGA ATG TCA TTC GCT CTG C
Produto
Temperatura
Amplificado
de Anelamento
(pb)
(ºC)
302
55 ºC
BLANCO, et al., 2004
516
55 ºC
BLANCO, et al., 2004
696
50ºC
SCHULTSZ, et al., 1994
815
63 ºC
BLANCO, et al., 1996
Referências
2: CGT GGT ATA GCT ACT GTC ACC
EHEC
stx2
1: CTT CGG TAT CCT ATT CCC GC
2: CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC
ETEC
eltI
1: GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC
2: CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC
EPEC
eae
1: ACG TTG CAG CAT GGG TAA CTC
2: GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG
35
4.2.6 - Pesquisa dos sorogrupos de Escherichia coli diarreiogênicas pelo Teste
de Aglutinação em Lâmina
Os testes de aglutinação em lâmina foram realizados utilizando soros
PROBAC do Brasil LTDA. Para a determinação dos sorogrupos EHEC utilizou-se o
soro anti E. coli O157:H7 de EHEC, para a determinação do sorogrupo EPEC
utilizou-se o soro polivalente anti E. coli enteropatogênica clássica sorotipos: O26,
O55, O111, O119, O114, O125, O142, O158, O86, O126, O127 e O128 e para
determinação dos sorogrupos EIEC utilizou-se o soro polivalente anti E. coli
enteropatogênica invasora sorotipos: O28ac, O29, O136, O144, O152, O112ac,
O124, O143, O164, O167. Para a realização do ensaio as 80 linhagens ambientais
de E. coli (Anexos 1 e 2) foram enriquecidas em caldo BHI e incubadas 37ºC por 24
horas. Na seqüência as culturas puras foram semeadas em placas de ágar MullerHinton (DIALAB Diagnósticos, Minas Gerais, Brasil) e incubadas a 37ºC por 24
horas. A partir das colônias crescidas na placa de ágar Muller-Hinton foi preparada
uma suspensão bacteriana obtida pela diluição das colônias em 300 µl de salina
estéril. Em um aglutinoscópio foi adicionado 20µl da suspensão bacteriana e uma
gota dos soros comerciais de identificação, após esse procedimento o aglutinoscópio
foi submetido a movimentos circulares durante 2 minutos para finalmente fazer a
leitura dos resultados.
4.2.7 - Fermentação do sorbitol e da ramnose na diferenciação dos isolados de
Escherichia coli enterohemorrágica O157: H7
Para identificação fenotípica do sorotipo O157: H7 de EHEC, 80 linhagens de
E. coli ambientais (Anexos 1 e 2) foram analisados para fermentação do sorbitol, e,
as linhagens positivas no teste de aglutinação em lâmina para o sorotipo O157: H7
de EHEC foram analisados para fermentação da ramnose. Inicialmente os isolados
foram enriquecidas em caldo BHI por 24 h a 37ºC. Na seqüência as culturas foram
semeadas em placas de Ágar base MacConkey Sorbitol (Ágar SMAC) e Ágar base
MacConkey Sorbitol Ramnose (Ágar SMAC) por 18 h a 37ºC. A interpretação dos
36
resultados para verificar a fermentação do sorbitol e da ramnose é baseada nas
características fenotípicas das colônias. O fenótipo colônias rosa indicam
fermentação positiva do sorbitol e da ramnose, já as colônias brancas indicam
fermentação negativa desses açúcares (MARCH & RATNAM, 1986; CHAPMAN et
al., 1991)
4.2.8 – Determinação da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli aos
antibacterianos
Os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram realizados com 80
linhagens de E. coli ambientais (Anexos 1 e 2) pelo método de Kirby-Bauer de
difusão de discos (NCCLS, 2004). Os antibióticos (LABORCLIN) escolhidos para
serem testados nas linhagens de E. coli foram : Ampicilina (AMP 10µg), Cefalotina
(CFL 30µg), Amoxicilina + Clavulanato (AMC 20/10µg), Cefuroxima (CRX 30µg),
Cefoxitina (CFO 30µg), Ceftriaxona (CRO 30µg), Gentamicina (GEN 10µg),
Ceftazidima (CAZ 30µg), Amicacina (AMI 30µg), Ciprofloxacina (CIP 5µg), Cefepime
(CPM 30µg), Sufazotrim (SUT 25µg), Cefotaxima (CTX 30µg), Aztreonam (ATM 30
µg), Cloranfenicol (CLO 30µg), Tetraciclina (TET 30µg), Tobramicina (TOB 10µg),
Ticarcilina + Clavulanato (TIC 75/10µg) sugeridos pelo U. S. FDA – Approved
Antimicrobial Agents.
As bactérias foram crescidas em caldo BHI por 24 horas a 37ºC. Com o auxílio
de um swab, o inóculo foi semeado em placas contendo ágar Mueller- Hinton
(DIALAB Diagnósticos, Minas Gerais, Brasil). Os discos de antibióticos foram
aplicados com o auxílio de uma pinça estéril, e as placas incubadas por 24 horas a
37ºC. A leitura dos halos de inibição foi realizada com uma régua, e de acordo com a
medida do diâmetro deste halo o microrganismo foi classificado em resistente (R),
intermediário ( I ) e sensível (S), de acordo com os critérios do National Comittee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2004).
37
5 - Resultados
______________________________________________________
5.1 – Qualidade Microbiológica das lagoas
Os resultados da qualidade microbiológica da água nos ambientes estudados
estão representados nas tabelas 3 e 4.
A tabela 5, comparando região e meses, representam os resultados de
análises estatísticas em relação ao NMP de coliformes fecais. Todos os pontos das
lagoas amostradas apresentaram baixas contagens para densidade de coliformes
fecais, a densidade de coliformes fecais variou significativamente (F= 2,11; p =
0,035) apenas em relação a região x meses conforme mostrado na tabela 5.
A figura 7 mostra a variação na densidade de coliformes fecais entre as lagoas
e regiões estudadas ao longo do período de amostragem. Para todos os lagos
analisados no presente estudo, as maiores contagens de coliformes fecais
coincidiram com os meses de coleta correspondentes à estação chuvosa, embora
esta variação não tenha sido significativa (Figura 7). Na Lagoa Carioca, a maior
densidade de coliformes fecais foi verificada no mês de outubro de 2004; para Lagoa
Gambazinho, as maiores contagens foram identificadas em dezembro de 2004; na
Lagoa Jacaré em janeiro de 2005 e no Lago Dom Helvécio em novembro de 2004.
As figuras 8 e 9 representam os resultados da Análise de Correspondência
para lagoas-regiões e meses amostrados, respectivamente. A figura 8 indica que no
lago Dom Helvécio a densidade de coliformes fecais apresentou uma distribuição
diferenciada das demais lagoas, entretanto, essa distribuição não foi significativa. Na
figura 9, o eixo 1 explica 47,91% da inércia e da variância dos dados, os meses de
outubro/04 e novembro/04 foram os que apresentaram maior inércia, portanto, maior
variância dos dados. Por outro lado, o eixo 2, explica 24,24% da variância dos dados
e os meses de janeiro/05 e maio/04 os que apresentaram maior variância. Além
disso, os dados mostram que não foi possível detectar uma variação na densidade
de E. coli em função da sazonalidade.
38
As figuras 10 e 11 representam os resultados da Análise de Agrupamento
para lagoas – regiões amostradas e os meses de coleta, respectivamente. Os dados
mostrados na figura 10 indicam que o agrupamento (DH1.4, J2, G1, G2, e C2)
apresentou densidade de E. coli bastante semelhante ao longo do período de
amostragem. Por outro lado, os pontos DH1.5 e DH1.1 diferiram dos demais pontos
amostrados em relação ao NMP de E. coli /100ml. Em relação aos meses
amostrados (Figura 11), houve diferença na densidade de E. coli em maio de 2004 e
novembro de 2004. Para os demais meses amostrados a densidade de E. coli foi
equivalente.
5.2 – Isolados de Escherichia coli obtidos das lagoas
Dos 507 isolados ambientais provenientes das Lagoas Carioca, Gambazinho,
Jacaré e Dom Helvécio ao longo do ano de 2004 e início de 2005, 456 (89,94%)
linhagens foram positivas para as provas bioquímicas específicas para a
identificação da espécie E. coli utilizando o meio de cultura IAL ou Rugai modificado
(Tabelas 6 e 7). Além das linhagens identificadas como E. coli, 45 isolados (8,87%)
pertenceram ao gênero Klebsiella e seis dos isolados (1%) foram identificados como
Citrobacter.
5.3 – Tipos diarreiogênicos dos isolados de Escherichia coli das lagoas
5.3.1 - Genes de virulência dos isolados de Escherichia coli pela PCR
Dos 456 isolados de E. coli, 80 isolados (17,5/%) foram selecionados de modo
que uma linhagem de cada ponto amostrado por mês de coleta foi investigada para a
presença dos genes stx1, stx2, eltI e eae. Somente os genes stx2, eltI e eae foram
encontrados nas amostras analisadas conforme mostrado na tabela 8 e na figura 12.
O gene stx 2 foi detectado em cinco linhagens de E. coli ambientais isoladas
de duas lagoas do Parque Estadual do Rio Doce, a Lagoa Jacaré e a Lagoa Carioca.
Estas linhagens de E. coli foram denominadas: E. coli 34 (J LT), E. coli 236 (J LT), E.
39
coli 280 (J LT), E. coli 292 (C LT) e E. coli 330 (C LT) (Figura 13). Por outro lado,
nenhum dos isolados de E. coli ambiental oriundos das Lagoas Dom Helvécio e
Gambazinho foram positivos para a presença do gene stx2. Quanto ao gene stx1,
nenhum dos 80 isolados de E. coli foi positivo. A presença do gene eae foi detectada
no isolado de E. coli 373 (C LT) (Figura 14). Dentre os 80 isolados de E.coli
investigados para a presença do gene elt I de ETEC, somente o isolado ambiental,
denominado E. coli 58 (C LT), foi positivo para à presença do fragmento de DNA
correspondente à amplificação do gene investigado (Figura 15).
5.4 – Sorogrupos diarreiogênicos dos isolados de E. coli
5.4.1- Determinação dos sorogrupos EHEC, EPEC e EIEC
Nos testes de aglutinação em lâmina para a determinação dos sorogrupos
EHEC, EPEC e EIEC, respectivamente, a amostra padrão EHEC E. coli CDC 933,
usada como controle positivo reagiu positivamente com o soro EHEC; a amostra
padrão EPEC E. coli ATCC O127a reagiu positivamente com o soro EPEC, a
amostra padrão EIEC E. coli ATCC 1284 reagiu positivamente com o soro EIEC. As
reações desses controles mostrando aglutinação positiva com os respectivos soros,
assim como a ausência de aglutinação da amostra padrão de E. coli ATCC 25723,
usada como controle negativo permitiu a validação dos resultados do teste de
aglutinação em lâmina com os isolados de E.coli, conforme apresentado nas tabelas
9, 10 e 11.
Os resultados apresentados na tabela 9 mostram que os isolados de E. coli (
DH 57, DH 83, 236 J LT, 260 C LT, 280 J LT, 330 C LT e 344 G LT) aglutinaram
positivamente na presença de soro específico para EHEC sorotipo O157: H7. Dentre
os isolados tipados para EHEC apenas três apresentaram o gene de virulência stx2
característico de grupo. Além disso, cinco isolados não fermentaram o sorbitol e dois
não fermentaram a ramnose provas características para confirmação do sorotipo
O157: H7. A tabela 10 indica que as linhagens de E. coli identificadas como: DH 05,
DH 11, DH 28, DH 34, DH 38, DH 44, DH 45, DH 59, DH 63, 34 J LT, 47 G LM, 178
40
J LM, 72 C LM, 91 G LT, 207 C LM, 312 G LT, 373 C LT, 386 C LM, DH 80, DH 85,
DH 87, DH 90, DH 98, DH 101, DH 103 e 395 G LT aglutinaram positivamente na
presença do soro específico para a determinação do sorogrupo EPEC. A tabela 11
mostra que os isolados DH 18, DH37, DH 39, DH74, DH 78, DH 94, 05 C LT, 15 G
LM e 250 C LT foram positivos na sorotipagem para determinação do sorogrupo de
EIEC.
5.4.2 - Freqüência dos sorogrupos diarreiogênicos nas lagoas
A tabela 12 mostra a distribuição dos sorogrupos EHEC, EPEC e EIEC
Escherichia coli nas regiões litorâneas e limnéticas das Lagoas Carioca, Jacaré
Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.
5.5 – Perfil de resistência das linhagens de E. coli isoladas das lagoas
Conforme mostrado na figura 16, dos 80 isolados ambientais de E. coli
analisados para susceptibilidade aos agentes antimicrobianos, 20% foram resistentes
à ampicilina (AMP), 50% foram resistentes à cefalotina (CFL) e 14% dos isolados
apresentaram resistência para o antibiótico cefuroxima (CRX). Para os demais
antibióticos testados a resistência quando verificada ocorreu em menos de 10% dos
isolados. A figura 16 indica que 100% das linhagens de E. coli foram sensíveis para o
antimicrobiano cefepima (CPM), 99% foram sensíves para ciproflofloxacin (CIP), 98%
foram sensíveis para gentamicina (GEN), e 96% dos isolados foram sensíveis para
sulfazotrim (SUT) e cloranfenicol (CLO) respectivamente. Os antibióticos Cefotaxima
(CTX), Ciprofloxacina (CIP) e Cefepima (CPM) foram os únicos para os quais os
isolados de Escherichia coli, não apresentaram resistência (figura 16). As figuras 17
e 18 mostram os resultados da investigação do perfil de susceptibilidade aos
antibióticos, no teste de difusão em ágar, apresentados por duas linhagens
ambientais de E. coli isoladas de lagoas do Parque Estadual do Rio Doce.
A tabela 13 mostra a incidência das linhagens de E. coli resistentes aos
antibióticos isolados nas regiões litorânea e limnética das lagoas no Parque Estadual
41
do Rio Doce. A Tabela 14 indica que os isolados DH 24, DH 28, DH 34, DH 44, DH
63, DH 67, DH 80, DH 81, 25 G LM, 88 J LM, 292 C LT, 301 C LT e 354 J LT
apresentaram multiresistência aos antibióticos testados, dentre esses, seis isolados
foram tipados como pertencentes ao sorogrupo EPEC e apenas o isolado 292 C LT
apresentou o gene stx 2 específico de EHEC.
42
Tabela 3 - Determinação do Número Mais Provável (NMP/100ml) para coliformes fecais de amostras de água coletadas
em dois pontos (região litorânea e região limnética) das Lagoas Carioca, Gambazinho e Jacaré no Parque Estadual do
Rio Doce.
Meses
Mai / 04 Jun / 04
Jul / 04
Ago / 04
Set / 04
Out / 04
Nov / 04
Dez / 04
Jan / 05
Fev / 05
Lagoa Carioca
Litorânea
33
11
4
130
30
300
23
110
50
80
Limnética
30
<2
<2
8
23
34
17
30
11
30
Lagoa
Gambazinho
Litorânea
<2
<2
<2
2
4
34
6
14
30
30
Limnética
23
<2
<2
4
4
30
<2
50
13
4
Litorânea
<2
<2
8
11
8
11
240
17
300
22
Limnética
<2
2
2
4
4
6
<2
13
4
2
Lagoa Jacaré
43
Tabela 4 – Determinação do Número Mais Provável (NMP/100ml) para coliformes fecais de amostras de água coletadas
em seis pontos (P1, P2, P3, P4, P5 e P6) do Lago Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.
Meses
Dom
Helvécio
Mai / 04 Jun / 04
Jul / 04
Ago / 04
Set / 04
Out / 04
Nov / 04
Dez / 04
Jan / 05
Fev / 05
P1
33
4
<2
30
13
<2
900
50
8
34
P2
240
4
13
8
8
8
220
13
11
4
P3
300
<2
<2
8
2
<2
350
17
8
4
P4
50
8
<2
2
4
2
34
21
12
4
P5
50
4
<2
2
2
2
>1600
17
9
2
P6
2
<2
2
<2
<2
<2
220
23
2
2
* P1, P2, P3, P4 e P5 pontos de amostragem localizados na região litorânea do lago Dom Helvécio.
* P6 ponto de amostragem localizado na região limnética do lago Dom Helvécio.
44
Tabela 5 - Análise de Variância (ANOVA, medidas repetidas) comparando as
regiões litorâneas e limnéticas das lagoas, Carioca, Jacaré, Gambazinho, Dom
Helvécio, e os meses de amostragem no Parque Estadual do Rio Doce.
1- Regiões; 2- Meses
1- Regiões; 2- Meses
F
P
1
4,415091
0,061951
2
2,116903
0,035921*
12
1,268307
0,265135
* Valor significativo em relação à densidade de coliformes fecais
45
Maio/2004
Junho/2004
Julho/2004
Agosto/2004
Setembro/2004
Outubro/2004
Novembro/2004
Dezembro/2004
Janeiro/2004
Fevereiro/2004
Maio/2004
Junho/2004
Julho/2004
Agosto/2004
Setembro/2004
Outubro/2004
Novembro/2004
Dezembro/2004
Janeiro/2004
Fevereiro/2004
Maio/2004
Junho/2004
Julho/2004
Agosto/2004
Setembro/2004
Outubro/2004
Novembro/2004
Dezembro/2004
Janeiro/2004
Fevereiro/2004
-100
Maio/2004
Junho/2004
Julho/2004
Agosto/2004
Setembro/2004
Outubro/2004
Novembro/2004
Dezembro/2004
Janeiro/2004
Fevereiro/2004
NMP E. coli/ 100ml
700
600
500
400
300
200
100
0
Carioca
Gambazinho
Jacaré
Dom Helvécio
Região
Litorânea
Região
Limnética
Figura 7: Densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) ao longo do período de amostragem nas lagoas, Carioca,
Gambazinho, Jacaré e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.
46
Dimensão 2; Autovalor: ,30286 (24,24% de Inércia)
2,0
1,5
JLT
1,0
GLT
0,5
DHLM DHLT
DHLT
0,0
JLM
CLT
CLM
GLM
DHLT
-0,5
-1,0
-2,0
DHLT
DHLT
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Dimensão 1; Autovalor: ,59860 (47,91% de Inércia)
Figura 8: Análise de Correspondência para os pontos amostrados nas lagoas Carioca,
Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce, considerando a
densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) nessas lagoas.
Legenda :
DH LT - Lago Dom Helvécio – região litorânea
J LT – Lagoa Jacaré região litorânea
DH LM – Lago Dom Helvécio - região limnética
J LM – Lagoa Jacaré região limnética
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
G LT – Lagoa Gambazinho – região litorânea
C LM – Lagoa Carioca – região limnética
G LM – Lagoa Gambazinho – região limnética
47
2,0
Dimensão 2; Autovalor: ,30286 (24,24% de Inércia)
Jan/05
1,5
1,0
0,5
Nov/04
Fev/05
Jul/04
0,0
Ago/04
Out/04
Set/04
Dez/04
Jun/04
-0,5
Maio/04
-1,0
-1,5
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Dimensão 1; Autovalor: ,59860 (47,91% de Inércia)
Figura 9: Análise de Correspondência para os meses de amostragem nas lagoas
Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce,
considerando a densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) e sazonalidade.
48
Ligação Simples
Distâncias Euclidianas
120
(Dlink/Dmax)*100
100
80
60
40
20
0
DH1.5
J1
DH1.1
DH1.2
DH1.3
DH1.4
DH2
G1
J2
C2
G2
C1
Figura 10: Análise de Agrupamento para as lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e
Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce considerando a densidade de
coliformes fecais (NMP/100ml) nesses corpos d´água.
Legenda:
C 1 – Carioca litorânea
J 1 – Jacaré litorânea
DH 1.3 – Dom Helvécio litorânea ponto 3
C 2 – Carioca limnética
J 2 – Jacaré limnética
DH 1.4 – Dom Helvécio litorânea ponto 4
G 1 – Gambazinho litorânea
DH 1.1 – Dom Helvécio litorânea ponto 1
DH 1.5 – Dom Helvécio litorânea ponto 5
G 2 – Gambazinho limnética
DH 1.2 – Dom Helvécio litorânea ponto 2
DH 2 - Dom Helvécio limnética
49
Ligação Simples
Distâncias Euclidianas
120
100
(Dlink/Dmax)*100
80
60
40
20
0
Nov/04
Jan/05
Out/04
Dez/04
Ago/04
Fev/05
Set/04
Jul/04
Jun/04
Mai/04
Figura 11: Análise de Agrupamento para os meses de amostragem nas lagoas Carioca,
Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do Parque Estadual do Rio Doce, considerando a
densidade de coliformes fecais (NMP/100 ml) nos pontos amostrados.
50
Tabela 6 - Número de linhagens de Escherichia coli isoladas das Lagoas Carioca, Gambazinho e Jacaré no Parque Estadual
do Rio Doce.
Meses
Mai / 04 Jun / 04
Jul / 04
Ago / 04
Set / 04
Out / 04
Nov / 04
Dez / 04
Jan / 05
Fev / 05
Total
Lagoa Carioca
Litorânea
9
4
0
5
15
24
11
10
11
13
102
Limnética
6
0
0
2
16
28
7
10
3
13
85
Lagoa
Gambazinho
Litorânea
0
0
0
1
2
36
4
3
1
9
56
Limnética
5
0
0
2
5
9
0
5
7
0
33
Litorânea
0
0
3
2
0
17
3
16
9
12
62
Limnética
0
1
2
0
5
2
0
0
1
3
14
Total
20
5
5
12
43
116
25
44
32
50
352
Lagoa Jacaré
51
Tabela 7 - Número de linhagens de Escherichia coli isoladas do Lago Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.
Meses
Lago
Dom Helvécio Mai / 04 Jun / 04
Jul / 04
Ago / 04
Set / 04
Out / 04
Nov / 04
Dez / 04
Jan / 05
Fev / 05
Total
P1
6
2
0
7
4
0
0
5
0
5
29
P2
2
1
3
0
3
3
5
1
4
0
22
P3
3
0
0
5
1
0
3
1
2
1
16
P4
4
0
0
2
2
1
0
3
4
0
16
P5
3
2
0
0
2
0
3
1
2
0
13
P6
2
0
1
0
0
0
0
4
1
0
8
Total
20
5
4
14
12
4
11
15
13
8
104
* P1, P2, P3, P4 e P5 pontos de amostragem localizados na região litorânea do lago Dom Helvécio.
* P6 ponto de amostragem localizado na região limnética do lago Dom Helvécio
52
Tabela 8 - Determinação dos isolados de Escherichia coli positivos para a pesquisa dos
genes stx2, eltl e eae pela Reação em Cadeia da Polimerase.
Gene
Isolados positivos
Local de coleta
Mês / ano
stx2
E. coli 34
C LT
Julho / 04
stx2
E. coli 236
J LT
Novembro / 04
stx2
E. coli 280
J LT
Dezembro / 04
stx2
E. coli 292
C LT
Dezembro / 04
stx2
E. coli 330
J LT
Janeiro / 05
eltI
E. coli 58
C LT
Setembro / 04
eae
E. coli 373
C LT
Fevereiro / 05
Legenda: C LT - Lagoa Carioca - região litorânea
J LT - Lagoa Jacaré - região litorânea
Gene stx2 : codifica para toxina shiga tipo 2 de E. coli enterohemorrágica (EHEC)
Gene eltI : codifica para enterotoxina LT tipo I de E. coli enterotoxigênica (ETEC)
Gene eae : codifica para o fator de aderencia intimina de E. coli enteropatogênica clássica (EPEC)
53
6%
1%
1%
92%
stx2
eae
elt I
Ausência de fatores de virulência
Figura 12: Freqüência de fatores de virulência em linhagens de E.
coli isoladas de lagoas do Parque Estadual do Rio Doce-MG. O
gene stx2 codifica expressão da toxina Shiga em E. coli
enterohemorrágica (EHEC); o gene eae codifica a intimina em E.
coli enteropatogênica (EPEC); e o gene elt I codifica para toxina
LTI de E. coli enterotoxigênica (ETEC).
54
5
6
7
8
292 C LT
280 J LT
34 C LT
EHEC
4
344 G LT
λ 1 Kb
3
330 J LT
2
236 J LT
1
9
10
516 pb
Figura 13: Eletroforese em gel de agarose dos
produtos de PCR para o gene stx2. Canaleta 1:
Padrão de peso molecular, Lambda λ (1Kb);
Canaleta 2: Controle positivo de Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC) para o gene stx2;
Canaletas 3, 4, 6, 7 e 8: Linhagens ambientais de E.
coli 236, 330, 344, 292, 280 e 34, isoladas do PERD
e, positivas para a amplificação do gene stx2.
Canaletas 5, 9 e 10: Linhagens ambientais de E.
coli negativas para amplificação do gene stx2.
55
2
λ 1 Kb
EPEC
3
4
5
6
7
8
9
10
373 C LT
1
815 pb
Figura 14: Eletroforese em gel de agarose dos
produtos de PCR para o gene eae. Canaleta 1:
Padrão de peso molecular, Lambda λ (1Kb);
Canaleta 2: Controle positivo de Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC) para o gene eae;
Canaleta 9: Linhagem ambiental de E. coli 373,
isolada do PERD e, positivo para amplificação do
gene eae. Canaletas 3, 4, 5, 6, 7 e 8: Linhagens
ambientais de E. coli do PERD negativas para
amplificação do gene eae.
56
3
4
5
6
7
8
9
58 C LT
2
ETEC
λ 1 Kb
1
696 pb
Figura 15: Eletroforese em gel de agarose para
o produto de PCR do gene eltI. Canaleta 1:
Padrão
de
Peso
Molecular
Canaleta 2: Controle
lambda
1Kb;
positivo de E. coli
enterotoxigênica (ETEC). Canaletas 3,4,5,7,8 e
9: Linhagens de E. coli ambientais isoladas de
lagoas do PERD e negativas para amplificação
do gene eltI. Canaleta 6: Isolado de E. coli
ambiental positivo para o fragmento de gene etl.
57
Tabela 9: Ocorrência de genes de virulência e fermentação de carboidratos em
linhagens soropositivas de E. coli enterohemorrágica O157:H7 (EHEC), isoladas
das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do Parque Estadual do
Rio Doce .
Linhagem de E.coli
Gene de
Fermentação do
Fermentação da
(local/mês)
virulencia
Sorbitol
Ramnose
stx2
Não
Não
DH 57
P4 - agosto/04
ausente
Sim
Sim
DH 83
P4 - dezembro/04
ausente
Sim
Sim
236
J LT - novembro/04
stx2
Não
Sim
260
C LM - novembro/04
Ausente
Não
Sim
280
J LT – dezembro/04
stx2
Não
Não
330
C LT – janeiro/05
stx2
Não
Não
344
G LT – janeiro/05
Ausente
Não
Sim
Padrão EHEC
E.coli CDC 933
Legenda :
DH (P4) - ponto de coleta na região litorânea do Lago Dom Helvécio.
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
C LM – Lagoa Carioca – região limnética
G LT – Lagoa Gambazinho – região litorânea
J LT – Lagoa Jacaré região litorânea
58
Tabela 10: Ocorrência de genes de virulência em linhagens soropositivos de E. coli
enteropatogênica clássica (EPEC) isoladas das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho
e Dom Helvécio do Parque Estadual do Rio Doce.
Linhagens de E.coli no
Gene de
Linhagens de E.coli
Gene de
Lago Dom Helvécio/
virulência
nas lagoas Carioca,
virulência
mês de detecção
Jacaré e Gambazinho
mês de detecção
DH 05
P1 – maio/04
ausente
34
J LT – julho/04
stx2
DH 11
P2 – maio/04
ausente
47
G LM – agosto/04
ausente
DH 28
P5 – maio/04
ausente
178
J LM – outubro/04
ausente
ausente
72
C LM – setembro/04
ausente
ausente
91
G LT – setembro/04
ausente
ausente
207
C LM – outubro/ 04
ausente
ausente
312
G LT – dezembro/04
ausente
ausente
373
C LT – fevereiro/05
ausente
386
C LM – fevereiro/05
DH 34
LM – maio/04
DH 38
P2 – junho/04
DH 44
LM – julho/04
DH 45
P1 – agosto/04
DH 59
P1 – setembro/04
DH 63
P2 – setembro/04
eae
ausente
59
Continuação Tabela 10
Linhagens de E.coli no
Gene de
Linhagens de E.coli
Gene de
Lago Dom Helvécio/
virulência
nas lagoas Carioca,
virulência
mês de detecção
Jacaré e Gambazinho
mês de detecção
DH 80
P2 – dezembro/04
ausente
DH 85
P5 – dezembro/04
ausente
DH 87
LM – dezembro/04
ausente
DH 90
P2- janeiro/05
ausente
DH 98
P4 – janeiro/05
ausente
DH 101
P5 –janeiro/05
ausente
DH 103
LM – janeiro/05
ausente
Legenda :
395
G LT – fevereiro/05
ausente
DH ( P1, P2, P4 e P5) - pontos de coleta na região litorânea do Lago Dom Helvécio
LM – região limnética do Lago Dom Helvécio
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
C LM – Lagoa Carioca – região limnética
J LT – Lagoa Jacaré região litorânea
J LM – Lagoa Jacaré região limnética
G LT – Lagoa Gambazinho – região litorânea
G LM – Lagoa Gambazinho – região limnética
60
Tabela 11 : Distribuição das linhagens soropositivos de E. coli enteroinvasora
(EIEC), isoladas das lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho e Dom Helvécio do
Parque Estadual do Rio Doce em função do local e data de amostragem.
Legenda :
Linhagens de E.coli
Local e Mês de coleta
DH 18
P3 – maio/04
DH 37
P1 – junho/04
DH 39
P2 – junho/04
DH 74
P4 – outubro/04
DH 78
P1 – dezembro/04
DH 94
P3 – janeiro/05
05
C LT – maio/04
15
G LM – maio/04
250
C LT – novembro/04
DH ( P1, P2, P3, P4) - pontos de coleta na região litorânea do Lago Dom Helvécio
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
G LM – Lagoa Gambazinho – região limnética
61
Tabela 12: Distribuição dos sorogrupos de Escherichia. coli (EHEC, EPEC e EIEC) nas
regiões litorâneas e limnéticas das Lagoas Carioca, Jacaré Gambazinho e Dom Helvécio no
Parque Estadual do Rio Doce.
N°° e % de
isolados do
sorogrupo
EHEC
N°° e % de
isolados do
sorogrupo
EPEC
N°° e % de
isolados do
sorogrupo
EIEC
N°° e %
N°° e %
isolados
isolados
positivos positivos
para gene para gene
eae
stx2
N°° e %
isolados
positivos
para gene
eltI
DH LT
DH LM
Subtotal
2
0
2 (28,5%)
12
4
16 (61,5%)
6
0
6 (66,6%)
0
0
0
0
0
0
C LT
C LM
Subtotal
1
1
2 (28,5%)
1
3
4 (15,3%)
2
0
2 (22,2%)
2
0
2
1
0
1
1
0
1
G LT
G LM
Subtotal
1
0
1 (14,2%)
3
1
4 (15,3%)
0
1
1 (11,1%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
J LT
J LM
Subtotal
2
0
2 (28,5%)
1
1
2 (7,6%)
0
0
0
3
0
3
0
0
0
0
0
0
26/42
9/42
5
1
1
61,9%
21,4%
Local de
isolamento
N° sorogrupo 7/42
isolado /
N°sorogrupos 16,6%
totais
Total de isolados de E.coli : 80
Total de isolados de E.coli : 80
Total de sorogrupos patogênicos isolados : 42
Total de linhagens positivos para
% Sorogrupos isolados: 52,5%
genes de virulência: 7
% Genes virulência isolados: 8,7%
Legenda :
DH LT Lago Dom Helvécio região litorânea
J LT – Lagoa Jacaré região litorânea
DH LM – Lago Dom Helvécio região limnética
J LM – Lagoa Jacaré região limnética
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
G LT – Lagoa Gambazinho – região litorânea
C LM – Lagoa Carioca – região limnética
G LM – Lagoa Gambazinho – região limnética
62
Resistente
Intermediário
40
Sensível
120
20
100
9 9 %1 0 0 %
9 8 %
9 5 %
9 0 %
Porcentagem (%)
8 4 %
5 6 %
20
4 2 %
3 8 %
3 6 %
3 4 %
3 4 %
2 0 %
1 6 %
8 2 %
8 0 %
5 2 %
5 0 %
40
8 6 %
8 2 %
8 0 %
80
60
9 6 %
9 6 %
9 1 %
1 8 %
1 4 %
8 %
8 %
4 %
1 %
1 %
0
1 5 %
1 3 %
8 % 8 %
1 % 1 %
4 %
5 %
1 %
R I S
R I S
R I S
R I S
R I S
R I S
R I S
R I S
R I S
AMP
CFL
AMC
CRX
CFO
CRO
GEN
CAZ
AMI
1 3 %
9 %
7 %
I S
S
R S
I S
R I S
CIP CPM SUT CTX
ATM
3 %
5 %
1 %
6 %
4 %
5 %
R I S
R I S
R I S
R I S
CLO
TET
TOB
TIC
Antibióticos
Figura 16: Perfil da susceptibilidade aos antimicrobianos de linhagens ambientais de E. coli isoladas das lagoas Carioca, Jacaré,
Gambazinho e Dom Helvécio no Parque Estadual do Rio Doce.
Legenda: Antibióticos
1- AMP 10 µg
Ampicilina
7 - GEN 10 µg
Gentamicina
13 - CTX 30 µg
Cefotaxima
2 - CFL 30 µg
Cefalotina
8 - CAZ 30 µg
Ceftazidima
14 - ATM 30 µg
Aztreonam
Amoxicilina + Clavulanato
9 - AMI 30 µg
Amicacina
15 - CLO 30 µg
Cloranfenicol
3 - AMC 20/10µg
4 - CRX 30 µg
Cefuroxima
Ciprofloxacina
16 - TET 30 µg
Tetraciclina
5 - CFO 30 µg
Cefoxitina
10 - CIP 5 µg
11 - CPM 30 µg
Cefepima
17 - TOB 10 µg
Tobramicina
6 - CRO 30 µg
Ceftriaxona
12 - SUT 25 µg
Sulfazotrim
18- TIC 75/10 µg
Ticarcilina + Clavulonato
63
Tabela 13: Freqüência das linhagens de Escherichia coli resistentes a antibiótico
isoladas nas regiões litorâneas e limnéticas das lagoas do Parque do Rio Doce.
Lagoa
N°° (%) isolados
N°° (%) isolados
Total de
resistentes de 1 a 7
sensíveis aos
Isolados
antibióticos
antibióticos
Litorânea
18 (54,5 %)
15 (45 %)
33
Limnética
2 (50,0%)
2 (50,0%)
4
Total
20 (54,1%)
17 (45,9%)
37
Litorânea
8 (80,0%)
2 (20,0%)
10
Limnética
4 (66,7%)
2 (33,3%)
6
Total
12 (75,0%)
4 (25,0%)
16
Litorânea
5 (71,4 %)
2 (28,6%)
7
Limnética
5 (71,4%)
2 (28,6%)
7
Total
10 (71,4%)
4 (28,6%)
14
Litorânea
5 (71,4%)
2 (28,6%)
7
Limnética
5 (83,3%)
1 (16,7%)
6
Total
10 (76,9%)
3 (23,1%)
13
52 (65%)
28 (35%)
80
Região
Lago
Dom Helvécio
Lagoa
Carioca
Lagoa
Gambazinho
Lagoa
Jacaré
Total
64
Tabela 14: Origem, sazonalidade dos isolados de Escherichia coli multi-resistentes aos
antibióticos
Local
de
de E.coli coleta
Isolado
Mês de
Sorogrupo
Gene de
coleta
patogênico virulência
Perfil de resistência aos
antibióticos
DH 24
P4
Maio/04
EPEC
Não
AMP, CFL,CRX, CRO
DH 28
P5
Maio/04
EPEC
Não
AMP, CFL, CRX, GEN, AMI
DH 34
LM
Maio/04
EPEC
Não
CFL, CAZ, CTX
DH 44
LM
Julho/04
EPEC
Não
CFL, CRX, AMI
DH 63
P2
Setembro/04
EPEC
Não
CFL, CRX, AMI
DH 67
P4
Setembro/04
Não
Não
CFL, CRX, CFO
DH 80
P2
Dezembro/04
EPEC
Não
CFL, CRX, TET
DH 81
P3
Dezembro/04
Não
Não
AMP, CFL, CRX, TET
25
G LM
Maio/04
Não
Não
CAZ, ATM, CLO, TET
88
J LM
Setembro/04
Não
Não
AMP, CFL, AMC, CFO, SUT,
TET, TIC
292
C LT Dezembro/04
Não
stx2
AMP, CFL, SUT, TIC
301
C LT Dezembro/04
Não
Não
AMP, CFL,CAZ, SUT, TET,
TIC
354
J LT
Fevereiro/04
Não
Não
AMP, AMC, CFO
65
Tabela 14 - Legenda 1 : Locais de Coleta
DH - P2, P3, P4 e P5 - pontos de coleta na região litorânea do Lago Dom Helvécio
LM – região limnética do Lago Dom Helvécio
C LT – Lagoa Carioca – região litorânea
J LT – Lagoa Jacaré região litorânea
J LM – Lagoa Jacaré região limnética
Tabela 14 - Legenda 2: Antibióticos
AMP 10µg: ampicilina
TET 30 µg: tetraciclina
CFL 30µg: cefalotina
CRO 30 µg: ceftriaxona
AMC 20µg : amoxilina+clavulanato
GEN 10 µg:gentamicina
CFO 30µg: cefoxitina
AMI 30µg: amicacina
SUT 25µg : sulfazotrim
CAZ 30µg: ceftazidima
CRX 30 µg: cefuroxima
CTX 30µg : cefotaxima
ATM 30 µg : aztreonan
TIC 75/10 µg: ticarcilina+clavulanato
66
Figura 17: Foto do perfil da susceptibilidade a antimicrobianos da linhagem ambiental E. coli 88
isolada da região limnética da lagoa Jacaré no Parque Estadual do Rio Doce.
67
Figura 18: Foto do perfil da susceptibilidade a antimicrobianos da linhagem ambiental E. coli
292 isolada da região litorânea da lagoa Carioca no Parque Estadual do Rio Doce.
68
6 – Discussão
______________________________________________________
6.1 - Análise da Qualidade da água das lagoas
A
água
é
comumente
avaliada
pela
enumeração
de
indicadores,
principalmente E. coli e coliformes fecais. Este dado indica em que grau a água está
recebendo poluição fecal, bem como o risco da presença de patógenos entéricos
(WHO,1997). Os resultados das análises bacteriológicas realizadas ao longo dos dez
meses de estudo nas lagoas investigadas revelaram uma baixa incidência para o
grupo coliforme fecal. Segundo o CONAMA (Conselho Nacional de Meio Ambiente)
que rege todos os corpos d’água do Brasil, as águas próprias para recreação de
contato primário podem apresentar até 800NMP de Escherichia coli /100mL de
amostra de água. Águas que apresentarem contagens acima destes valores são
consideradas impróprias para balneabilidade.
Os resultados encontrados no presente estudo estão de acordo com ACKMAN
et al. (1997) que verificaram que dos 40 pontos amostrados num lago recreacional
próximo à Nova York, nenhum excedeu 600 ufc/100ml para coliforme total ou 70
ufc/100ml para coliforme fecal. MEDEIROS (2005) também verificou que o Lago Dom
Helvécio e a Lagoa Carioca no Parque Estadual do Rio Doce, apresentaram baixas
contagens para E. coli e Enterococcus spp. na maioria das amostras analisadas e
não foram encontradas diferenças significativas entre as densidades de E. coli para
estes dois lagos.
A sobrevivência dos coliformes fecais em água é influenciada por uma série
de fatores ambientais. Os fatores físicos e biológicos tais como: radiação solar,
salinidade, aumento de temperatura, elevação do pH, altos níveis de oxigênio
dissolvido, perda de nutrientes e predação contribuem significativamente para o
decaimento e morte desses microrganismos em água (GAMESON & SAXON, 1967;
GANNON et al., 1983; MCCAMBRIDGE & MCMEEKIN, 1984; FLINT, 1987; DAVIES
& EVISON, 1991 CURTIS et al., 1992; SINCLAIR et al., 1993; VAN DER STEEN et
al., 2000;). Além disso, GANNON et al. (1983) sugerem que os coliformes fecais em
69
águas de lago são removidos predominantemente por adsorção em partículas
suspensas e subseqüentemente são sedimentados. A partir destas informações, é
possível inferir que a baixa densidade de coliformes nas lagoas investigadas pode
ser atribuída ao processo de sedimentação dos microrganismos.
As maiores contagens para coliformes fecais foram encontrados nos meses
correspondentes à estação chuvosa. FUJIOKA et al. (1999); RIVERA et al., (1988) e
ALM et al., (2003) sugerem que o solo é a fonte ambiental primária de bactérias
indicadoras de contaminação fecal (coliformes fecais, estreptococos fecais, E. coli,
enterococos). Estas bactérias se reproduzem no solo e a chuva transporta altas
concentrações destas para a coluna d´água aumentando os níveis de contaminação
da água. Segundo ALM et al. (2003), muitas variáveis ambientais afetam a
abundância dos indicadores fecais em água, mas o sedimento pode servir como
proteção ambiental para as bactérias entéricas. A atividade recreacional humana
pode ter sido a principal origem de altas contagens para coliformes fecais no mês de
novembro no Lago Dom Helvécio. ALM et al. (2003) afirmam que a prática de banho
em águas de lagos recreacionais pode ressuspender sedimentos do fundo do lago
juntamente com bactérias fecais e elevar os níveis bacterianos na superfície da
água.
Muitos autores relatam o isolamento de coliformes fecais do trato
intestinal de várias espécies de peixes de água doce e marinha (GELDREICH et
al.,1966; EL-ZANFALY et al.,1982) Segundo GELDREICH et al. (1966), os coliformes
fecais e estreptococos fecais não são habitantes naturais da microbiota intestinal dos
peixes, mas por outro lado, os peixes são capazes de reter esses microrganismos no
intestino, carreá-los no corpo d´água e influenciar nas condições bacteriológicas da
água.
6.2 – Potencial patogênico dos isolados de Escherichia coli
Atualmente, para definir o verdadeiro potencial patogênico desempenhado por
uma linhagem bacteriana, vários autores JOHNSON et al. (1991); BRITO et al.
(2004) e REGUA-MAGIA et al. (2004) reforçam a necessidade tanto da
70
caracterização dos fatores de virulência na forma dos genes de virulência e seus
correspondentes fenótipos, como também da determinação dos sorogrupos que
reúnem os sorotipos portadores desses fatores. No caso específico do sorotipo
O157: H7, a negatividade dos testes de fermentação do sorbitol e de ramnose são
marcas bioquímicas características deste sorotipo que são sempre recomendadas
como provas comprobatórias (MARCH & RATNAM, 1986; CHAPMAN et al.,1991;
OJEDA et al.,1995). Além disso, a determinação do perfil de resistência aos
antibióticos de linhagens de Escherichia coli constitui parte integrante na abordagem
do seu potencial patogênico como apresentado por BRITO et al. (2004).
6.3 - Tipos diarreiogênicos isolados nas lagoas
6.3.1 - Presença dos genes stx1 e stx2 característicos Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC)
Muitos vírus, bactérias e patógenos parasitas estão evolvidos em surtos de
doenças em águas recreacionais (ACKMAN et al.,1997). No período de 1991 à 1992,
11 surtos de gastroenterites associados ao uso de águas recreacionais foram
notificados pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças - EUA (CDC, 1993).
Em muitos desses surtos, a mais provável fonte de contaminação foi à presença dos
banhistas. Vários procedimentos durante o banho, tais como: colocar a cabeça
debaixo d´água, colocar água na boca ou ingerir água, aumentam o risco de adquirir
doença gastrointestinal (KEENE et al.,1994; SORVILLO et al., 1988).
Apenas cinco dentre os 80 isolados de E. coli analisados neste estudo foram
positivos para a presença do fragmento de gene stx2. Este resultado sugere que
existe a probabilidade dos banhistas adquirirem doença gastrointestinal causada por
EHEC transmitida pelas águas dos lagos investigados. MULLER et al. (2001)
observaram que de 196 colônias de E. coli isoladas de água de rios e represas no sul
da África, apenas uma amostra foi positiva na detecção do gene stx2. Os resultados
obtidos por MULLER et al. (2001) indicam uma baixa incidência de E.coli O157:H7
na água examinada e sugerem que a probabilidade de aquisição de doença pela
71
ingestão dessa água é baixa. ARVANITIDOU et al. (1996) sugerem que muitos
parâmetros físicos, como temperatura, pH, radiação solar, e salinidade, podem
influenciar a sobrevivência de E. coli O157:H7 em águas de lagos.
Tendo em vista que as linhagens de E. coli investigadas neste trabalho são de
origem ambiental e que foram isoladas de águas de lagoas de uma reserva ecológica
que abriga diferentes ecossistemas constituídos por fauna e flora diversificados,
supõe-se que há uma grande probabilidade das linhagens positivas para o gene stx2
serem de origem animal e não exclusivamente de origem humana. Segundo
GARCIA-ALJARO et al. (2005), seis variantes genéticas do gene stx2 já foram
detectadas pela análise da seqüência de nucleotídeos: stx2, stx2c, stx2d, st2e, stx2f
e stx2g. Alguns desses variantes genéticos de stx2 foram encontrados associados a
EHEC de carneiros (stx2d), porcos (stx2e), aves (stx2f) e bovinos (stx2g). Por outro
lado, os genes stx2 e stx2c estão associados a sorogrupos de EHEC altamente
virulentos que causam severas doenças tais como, colite hemorrágica e SUH.
Em diversos estudos, a presença do gene stx2 em linhagens de E.coli foi
correlacionada com severas doenças em humanos (CAPRIOLI et al., 2005).
ACKMAN et al. (1997) relataram 12 casos de infecções por EHEC associado a
banhistas de um lago recreacional no município de Dutchess, nas proximidades de
Nova York. Todos os doze pacientes tiveram diarréia sangrenta, 11 sentiram cólicas
abdominas, e 10 tiveram febre. A contaminação dos turistas do parque ocorreu
devido a ingestão proposital ou acidental de água contaminada do lago. Além disso,
15% das crianças que visitaram o parque durante o surto tiveram gastroenterite
branda. Esta alta incidência de doença moderada pode ser explicada pela baixa
concentração da E.coli O157:H7 na água contaminada, ou pela pequena quantidade
de água ingerida pelos banhistas.
As linhagens de EHEC que causam infecções humanas pertencem a um amplo
número de diferentes sorotipos O:H. A maioria dos surtos de colite hemorrágica e
SUH (Síndrome Urêmica Hemolítica) são atribuídos ao sorogrupo O157:H7.
Entretanto, como as EHEC não pertencentes ao sorogrupo O157 são mais
prevalentes em animais e contaminam gêneros alimentícios, os humanos estão
frequentemente expostos a essas linhagens (GARCÍA-ALJARO et al., 2005).
72
Atualmente, as informações disponíveis e as técnicas desenvolvidas para
identificação e isolamento de EHEC, são baseadas em estudos com linhagens
isoladas de humanos ou fezes de animais, utilizando meios de cultura seletivos.
Vários trabalhos relatam que os isolados clínicos indicam o tipo de contaminação que
está presente no ambiente natural de um determinada área geográfica (MULLER et
al., 2001; DAVIS et al., 2003. GARCÍA-ALJARO et al., 2005). Entretanto, essa
hipótese deve ser verificada por meio de estudos ambientais, para confirmar se
nenhuma seleção diferenciada tem ocorrido, e se as linhagens clínicas isoladas
realmente correspondem àquelas presentes no ambiente.
De acordo com DAVIS et al. (2003), o monitoramento de genes de virulência
em linhagens de E. coli ambientais é uma tarefa indispensável para o controle de
E.coli patogênica no ambiente e em suprimentos alimentícios. Os dados obtidos no
presente trabalho podem contribuir para ampliar o estudo da ecologia da espécie E.
coli considerando o isolamento dos subtipos no meio ambiente.
O gene stx1 que também codifica a expressão da Toxina Shiga em EHEC, um
importante fator de virulência desse subgrupo, não foi detectado em nenhum dos 80
isolados analisados. Resultado semelhante ao do presente trabalho foi descrito por
DAVIS et al. (2003) que verificaram que dos 604 isolados ambientais testados,
nenhum deles amplificou o gene stx1 ou stx2. Segundo CHALMERS et al. (2000), o
isolamento de linhagens de EHEC do ambiente normalmente é dificultado pela baixa
proporção desse patógeno quando comparado à alta concentração da microbiota
local, consequentemente, a confirmação presuntiva do agente patogênico nem
sempre é devidamente alcançada (CHALMERS et al., 2000).
ARVANITIDOU et al. (1996) também observaram que de 1974 colônias de E.
coli isoladas da água potável e da água de um lago recreacional no norte da Grécia,
nenhuma delas apresentou o antígeno somático O157. Além disso, MULLER et al.
(2001) relataram que dentre as 196 amostras de E.coli analisadas e isoladas de
águas de rios e represas no sul da Àfrica, o gene stx1 foi detectado em apenas dois
isolados. É importante ressaltar que em muitos estudos a E. coli O157:H7 não foi
detectada de amostras de água mesmo nos países onde esse patógeno é mais
frequentemente isolado (ARVANITIDOU et al., 1996; CAPRIOLLI et al., 2005).
73
6.3.2
–
Presença
do
gene
eae
característico
de
Escherichia
coli
enteropatogênica (EPEC)
Apenas o isolado ambiental de E. coli 373 (CAR LIT) amplificou o fragmento do
gene eae presente em EPEC. A detecção do gene eae em EPEC é mais freqüente
em linhagens isoladas das fezes de crianças com diarréia (KESKIMAKI et al., 2001;
REGUA-MANGIA et al., 2004; RAPELLI et al., 2005). Outros estudos também
relatam a alta prevalência do gene eae em linhagens de EPEC isoladas de águas
contaminadas por esgoto fecal e águas residuais (OBI et al., 2004). Segundo
NATARO & KAPER (1998), o gene eae é responsável pela quase totalidade da
virulência de EPEC mas não é o único fator responsável pela virulência do grupo. A
presença do plasmídio EAF (Fator de Aderência em EPEC) que codifica o gene bfp
também é frequentemente associado à virulência de alguns sorotipos de EPEC
(REGUA-MANGIA et al., 2004). Para NATARO & KAPER (1998), linhagens de EPEC
possuem um plasmídio de virulência, e numerosos genes codificados por
cromossomos que juntos são responsáveis pela expressão de fatores de virulência
tais como BFP (“Bundle forming pili”), proteínas secretadas e intimina.
6.3.3 - Presença do gene eltI característico de Escherichia coli enterotoxigênica
(ETEC)
Dentre os 80 isolados de E. coli ambiental investigados para a presença do
gene elt I que codifica a síntese da Toxina LTI (termo-estável) em ETEC, somente o
isolado ambiental 58 (CAR LIT) apresentou o fragmento de DNA correspondente à
amplificação do gene investigado. Segundo VALENTINI et al. (1992), as linhagens
enteropatogênicas de E.coli podem perder plasmídios que abrigam genes de
virulência durante o processo de isolamento das colônias.
Considerando que a Lagoa Carioca é um ecossistema bastante preservado e
não disponível para prática de banho dos turistas que freqüentam o parque, acreditase que a presença do gene elt I em uma única linhagem de E. coli não representa um
risco potencial para transmissão de doença. De acordo com NATARO & KAPER
74
(1998), a dose infectante de ETEC necessária para causar doença em humanos está
em torno de 108 ufc. Além disso, sabe-se que a detecção da presença do gene de
virulência no microrganismo investigado não implica necessariamente na expressão
do mesmo. ROSENBERG et al. (1977) associaram a ingestão de água contaminada
por E. coli enterotoxigênica (ETEC) sorotipo O6:H16, como a origem de um surto de
diarréia. BLACK et al. (1981) detectaram ETEC do mesmo sorotipo nas fezes e na
água de abastecimento residencial de pacientes com diarréia.
MULLER et al. (2001) relatam que a detecção de um único gene de virulência
em um único isolado de E. coli ambiental é pouco significativo para acarretar riscos à
saúde de humanos e animais. Entretanto acredita-se que o permanente
monitoramento das lagoas e a caracterização dos microrganismos isolados desses
ambientes irão contribuir para manter o equilíbrio dos ecossistemas estudados,
evitando o surgimento de novas linhagens patogênicas e possíveis episódios de
doenças de veiculação hídrica.
6.3.4 - Ausência de genes de virulência em isolados de E. coli ambientais
Apesar de ser o único lago do parque com freqüente presença de banhistas,
nenhum fator de virulência foi detectado nas amostras de E. coli isoladas do Lago
Dom Helvécio. O mesmo foi verificado para as linhagens de E. coli isoladas da Lagoa
Gambazinho, embora nesta lagoa seja proibida a prática de banho e a realização de
atividades recreacionais. Este resultado é semelhante àqueles encontrados por
VALENTINI et al. (1992), que verificaram que das 38 linhagens de E. coli
enteropatogênicas isoladas de diferentes fontes ambientais, tais como, águas de
lago recreacional, de rios, de represas, minas e poços artesianos, nenhuma
apresentou fatores de virulência. Segundo ACKMAN et al. (1997), a maioria dos
estudos sobre a transmissão de doenças gastrointestinais entre banhistas, tem sido
feita em águas marinhas e em águas de lagos que recebem escoamento de esgoto.
O monitoramento de pequenos lagos para avaliar a contaminação fecal por sistemas
sépticos e banhistas tem sido pouco investigado.
75
6.4- Sorogrupos diarreiogênicos de E. coli isolados das lagoas
RAPELLI et al. (2005) afirmam que a identificação de E. coli diarreiogênica não
pode ser baseada somente na cultura ou provas bioquímicas, uma vez que estes
métodos são indistinguíveis entre E. coli comensal e E. coli patogênica normalmente
encontrada nas fezes de humanos e animais. Além disso, a técnica de sorotipagem
específica para determinados sorogrupos nem sempre correlaciona com a
patogenicidade da linhagem. A discriminação de subgrupos de EPEC, ETEC, EHEC
e EIEC requer a utilização de técnicas moleculares baseadas em genes de virulência
(REGUA-MANGIA et al., 2004).
6.5 – Linhagens do sorotipo O157: H7 isolados das lagoas
Diferente da maioria das linhagens de E. coli, o sorotipo O157: H7 não
fermenta sorbitol nem ramnose, os testes para verificar a fermentação desses
açúcares são sugeridos como um recurso simples para caracterização desse
microrganismo. MARCH & RATNAM (1986) constataram que dos 84 isolados clínicos
de E. coli analisados em ágar MacConkey Sorbitol (SMAC), nenhum fermentou o
sorbitol, e destes, 76 (90%) foram identificadas como O157:H7. Os referidos autores
relatam que as amostras fecais analisadas foram coletadas de pacientes durante a
fase aguda da doença, e a alta incidência de E. coli O157: H7 nas culturas de fezes
pode ter sido um resultado direto disto. A ocorrência de apenas 5 isolados de E. coli
que não fermentaram o sorbitol dentre as 80 linhagens analisadas no presente
estudo pode ser explicado considerando que as amostras estudadas são de origem
ambiental e não foram isoladas diretamente das fezes de humanos que
apresentavam os sintomas da doença provocada por E. coli O157: H7.
6.6 – Linhagens resistentes a antibióticos isolados nas lagoas
A resistência aos antimicrobianos em E. coli tem sido relatada em todo
mundo. A ocorrência do patógeno e o perfil de susceptibilidade, entretanto,
76
apresentam variações geográficas bem como significantes diferenças em várias
populações e ambientes (VON BAUM & MARRE, 2005). No presente trabalho, o
número de linhagens de Escherichia coli resistentes a antibióticos, nas lagoas, foi
considerável. Este resultado foi importante pela alta proporção de isolados
resistentes, haja visto que 65% dos isolados mostrou-se resistente a pelo menos um
antibiótico. Além disso, deve-se destacar que 16% dos isolados eram multiresistentes para até sete antibióticos e o alerta se faz também porque mais da
metade destes foram sorotipos diarreiogênicos ou se mostraram positivos para o
gene de virulência stx2 característico de linhagens enterohemorrágicas. Segundo
BALDINI et al. (1991), a presença de linhagens de Escherichia coli resistentes a
antibióticos no ambiente constitui um problema principalmente considerando aquelas
que carregam o plasmídeo R de resistência, pois a transferência deste plasmídeo
entre linhagens taxonômicas próximas é um fato, e dessa forma contribui para a
disseminação desse estado indesejável. Para PARVEEN et al (1997), o perfil de
resistência a antibióticos em E. coli está associado a origem da poluição no
ambiente. Os referidos autores observaram que 82% das linhagens de E. coli
isoladas de água residual urbana e rural apresentaram resistência a vários
antibióticos testados. A resistência entre isolados de E. coli provavelmente ocorre
devido o uso indiscriminado de agentes antimicrobianos que pode refletir na
ocorrência de transferência de plasmídeos no trato digestivo de humanos e no
ambiente (TREVORS et al., 1987; PARVEEN et al., 1997). BOON & CATTANACH
(1999) isolaram linhagens de E. coli resistentes a antibióticos de aquíferos com
diferentes origens de poluição, encontraram maior índice de linhagens resistentes
naqueles com contaminação fecal de origem humana do que em outros com
contaminação fecal de origem animal. Compatíveis com esses resultados foram os
encontrados no presente trabalho pois, o Lago Dom Helvécio, local do parque de
maior visitação pelos turistas, foi o que mostrou maior índice (54%) de linhagens de
Escherichia coli resistentes e a multi-resistência até sete antibióticos também foi
observada.
As linhagens de Escherichia coli resistentes e multiresistente a antibióticos
isolados nas lagoas têm um importante significado clínico e ecológico. A importância
77
clínica refere-se ao fato da resistência aos antibióticos constituir um fator de risco
para o agravamento de uma patologia infecciosa, pois, uma vez instalada a doença
clínica, torna-se difícil a escolha do antibiótico de eficácia terapêutica. Assim,
atualmente, a abordagem da resistência aos antibióticos, constitui um dos
parâmetros para a definir o grau de importância de uma linhagem bacteriana
associada a uma patologia (VON BAUM & MARRE, 2005). Além dos fatores de
virulência definidos por toxinas e elementos responsáveis pela aderência e
invasibilidade associados aos mecanismos desencadeadores de doença, a detecção
de perfis de susceptibilidade a antibióticos caracterizado por multi-resistência
representa componente necessário à determinação do potencial patogênico de uma
linhagem bacteriana.
78
CONCLUSÕES
____________________________________________________________________
•
Todos os ambientes aquáticos amostrados no Parque Estadual do Rio Doce
apresentaram baixa densidade de bactérias do grupo coliforme e foram
considerados próprios para balneabilidade de acordo com a Resolução
CONAMA 274/2000.
•
A espécie Escherichia coli foi identificada em todos os pontos amostrados ao
longo de todo período de coleta indicando a freqüente presença de
contaminação fecal de origem humana ou animal nos ecossistemas
estudados.
•
Os genes de virulência stx2, eae e elt I foram encontrados em sete dos 80
isolados ambientais das lagoas investigadas. Este resultado sugere que existe
a probabilidade dos banhistas adquirirem doença gastrointestinal transmitida
pelas águas dos lagos investigados.
•
A Técnica de Aglutinação em Lâmina, específica para determinados
sorogrupos nem sempre correlaciona com a patogenicidade da linhagem e a
discriminação de subgrupos de EPEC, ETEC, EHEC e EIEC requer a
utilização de técnicas moleculares baseadas em genes de virulência.
•
Alta incidência de isolados de E. coli multi-resistentes a antibióticos indicam a
possível disseminação de linhagens resistentes pelos banhistas e animais, e
também um risco para saúde dos mesmos.
79
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
____________________________________________________________________
ACKMAN, D., MARKS, S., MACK, P., CALDWELL, M., ROOT, T., BIRKHEAD, G.
Swimming-associated haemorrhagic colitis due to Escherichia coli O157:H7 infection:
evidence of prolonged contamination of a fresh water lake. Epidemiology and
Infection. v. 119, p. 1-8, 1997.
ADHIKARI, M., COOVADIA, Y., HEWITT, J. Enteropathogenic Escherichia coli
(EPEC) and enterotoxigenic (ETEC) related diarrhoeal disease in a neonatal unit.
Annals of Tropical Paediatrics. v. 5, p. 19-22, 1985.
ALM, E. W., BURKE, J., SPAIN, A. Fecal indicator bacteria are abundant in wet sand
at freswater beaches. Water Research. v. 37, p. 3978-3982, 2003.
AMARAL, L. A., ROSSI, O. D. J., NADER, A. F., ALEXANDRE, A. V. Avaliação da
qualidade higiênico-sanitária da água de poços rasos localizados em uma área
urbana: utilização de colifagos em comparação com indicadores bacterianos de
poluição fecal. Revista Saúde Publica. v. 28 (5), p. 345-348, 1994.
AMERICAN
PUBLIC
HEALTH
ASSOCIATION.
Standard
methods
for
the
examination of water and wastewater, 20th ed. American Public Health Association,
Washington, D.C. 1998.
ARVANITIDOU, M.,CONSTANTINIDIS, T. C., KATSOUYANNOPOULOUS, VAS.
Searching for Escherichia coli O157:H7 in drinking and recreational waters in
northern Greece. Water Research. v. 30 (2), p. 493 – 494, 1996.
ASH, R. J., MAUCK, B., MORGAN, M. Antibiotic resistence of Gram-negative
bacteria in rivers, United State. Emerging Infectious Diseases. v.8, 713 – 716, 2002.
80
ASHBOLT, N. J. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in
developing regions. Toxicology. v.198, p. 229-238, 2004.
BALDINI, M. D., CABEZALI, C. B. Occurrence of antibiotic-resistant Escherichia coli
isolated from environmental simples. Marine Pollution Bulletin. v. 22(10), p. 500-503,
1991.
BARBOSA, F. A. R. The importance of diurnal cycles for the conservation and
management of tropical waters: exemples from the Rio Doce Valley lakes system. In:
p. 449-456. TUNDISI, G. & SAIJO, Y. (Eds.). Limnological studies on the Rio Doce
valley lakes, Brazil. Brazilian Academy of Sciences. São Carlos. 528 p, 1997.
BARBOSA F. A. R. Workshop: Brazilian programe on conservation and management
of inland waters. Sociedade Brasileira de Limnologia. Fundação Biodiversitas. Belo
Horizonte. p.222. 1994.
BARBOSA, F. A . R., MORENO, P. Mata Atlântica e o sistema lacustre do Médio Rio
Doce. In: 69-81, 2002.
BARBOSA, F. A. R., TUNDISI, J. G. Primary production of phytoplankton and
evironmental characteristics of a shallow Quaternary lake at Eastern Brazil. Archiv
Hydrobiologie. 90 (2), p. 39 -161, 1980.
BARBOSA, G. L. Variação diurna na composição, estrutura e biomassa da
comunidade fitoplanctônica da lagoa carioca – Parque Estadual do Rio Doce, MG.
Programa de pós-graduação em Ecologia, Conservação e Manejo de Vida Silvestre –
UFMG; 148 p. (Dissertação de Mestrado). Abril de 2004.
BEDARD, L., DRAPEAU , A. J., KASATIYA, S. S., PLANTE, R. Plasmides de
resistance aux antibiotiques chez les bacteries isolées d´eaux potables. Eau Quebec.
v.15, p. 59 – 66, 1982.
81
BENICIO, M. H. A., CARDOSO, M. R. A., GOUVEIA, N. C., MONTEIRO, C. A.
Tendência secular da doença diarreica na infância na cidade de São Paulo (19841996). Revista Saúde Pública. v. 34, p. 83-90, 2000.
BERG, R. D. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends in Microbiology.v.4,
p. 430-435, 1996.
BLACK , R. L. , MERSON, M. H., ROWE, B., TAYLOR, P. R. , ABDUL, A. R. M. A.,
GROSS, R. J., SACK, D. A. Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea: acquired
immunity and transmission in na endemic area. Bulletin of the World Health
Organization (WHO). v. 59, p. 263-268, 1981.
BLANCO J. E., BLANCO, M, BLANCO, J., MORA, A., BALAGUER, L., MOURINO,
M., JUAREZ, A., JANSEN, W. H. O Serogroups, Biotypes, and eae Genes in
Escherichia coli Strains Isolated from Diarrheic and Healthy Rabbits. Journal of
Clinical Microbiology. v. 34 (12), p. 3101-3107, 1996.
BLANCO J. E., BLANCO, M., ALONSO, M. P., MORA, A., DAHBI, G., COIRA, M. A.,
BLANCO, J. Serotypes, Virulence Genes, and Intimin Types of Shiga Toxin
(Verotoxin)-Producing Escherichia coli Isolates from Human Patients: Prevalence in
Lugo, Spain, from 1992 through 1999. Journal of Clinical Microbiology. v. 42 (1), p.
311-319, 2004.
BLUM, G., MUHLDORFER, I., KUHNERT, P., FREY, J., HACKER, J. Comparative
methodology to investigate the presence of Escherichia coli K-12 strains in
environmental and human stool samples. FEMS Microbiology Letters. v.143, p.77-82,
1996.
BOLTON , F. J. Verocytotoxin –producing Escherichia coli O157 public health and
microbiological significance. British Journal of Biomedical Science. v. 55, p. 127-135,
1998.
82
BOON, P. I., CATTANACH, M. Antibiotic resistance of native and faecal bacteria
isolated from rivers, reservoirs and sewage treatment facilities in Victoria, southeastern Austrália. Letters in Applied Microbiology. v. 28 (3), p. 164-168, 1999.
BORGES, L. G. A., VECHIA, V. D., CORÇÃO, G. Characterisation and genetic
diversity via REP-PCR of Escherichia coli isolates from pollutted waters in southern
Brazil. FEMS Microbiology Ecology. v. 45, p. 173-180, 2003.
BRANDÃO, L. A. M. P. Melhoria da qualidade da água em bacia de decantação de
uma mina de ferro – S. A. Mineração da Trindade. Samitri. Dissertação de mestrado.
Departamento de Geologia – UFOP. 112p, 2001.
BRITO, B. G., VIDOTTO, M. C., BERBEL, M. M., TAGLIARI, K. C. Fatores de
virulência presentes em amostras de Escherichia coli uropatogênIcas – UPEC para
suínos. Ciência Rural. v. 34(2), p. 645-652, 2004.
CAPRIOLI, A., MORABITO, S., BRUGERE, H. OSWALD, E. Enterohaemorrhagic
Escherichia coli : emerging issues on virulence and modes of transmission.
Veterinary Research. v. 36, p. 289-311, 2005.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL (CDC). Surveillance for waterborne disease
outbreaks – United States. v.42, p. 1-22, 1993.
CHALMERS, R. M., AIRD, H., BOLTON, F. J. Waterborne Escherichia coli O157.
Applied Microbiology Symposium Supplement. v. 88, p.124-132, 2000.
CHAPMAN, P. A. SIDDONS, C. A., ZADIK, P. M., JEWES, L. An improved selective
medium for the isolation of Escherichia coli O157:H7. Journal of Medical
Microbiology.v.35, p.107-110, 1991.
CI
(Conservation
Internacional),
Fundação
SOS
Mata
Atlântica,
Fundação
Biodiversitas, Instituto de Pesquisas Ecológicas, Secretaria de Meio Ambiente do
83
Estado de São Paulo, SEMAD/ Instituto Estadual de Florestas-IEF/MG, 2000.
Avaliação e Ações Prioritárias para a conservação da biodiversidade da Mata
Atlântica e Campos Sulinos. Brasília: MMA/ SBF. 40p.
CLARKE, S.C. Diarrhoeagenic Escherichia coli – an emerging problem? Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease. v. 41, p. 93 - 98, 2001.
CLOWES, R.C. Molecular structure of bacterial plasmids. Microbiology and Molecular
Biology Reviews. v.36, p. 361- 405, 1972.
COOKE, M.D. Antibiotic resistance in coliform and fecal coliform bacteria from natural
waters and effluents. New Zeland Journal of Marine and Freshwater Research. v.10,
p. 391- 397, 1976.
COOKE, M.D. Antibiotic resistance among coliform and fecal coliform bacteria
isolated from sewage, seawater, and marine shellfish. Antimicrobial Agents
Chemotherapy. v. 9 (6), p. 879 - 884, 1976.
COSTA, C. M. R., HERRMANN, G. MARTINS, C. S., LINS, L.V., LAMAS, I.R.
Biodiversidade em Minas Gerais: um atlas para sua conservação. Belo Horizonte
Fundação Biodiversitas. 92 p, 1998.
COWDEN, J. M., AHMED, S., DONAGHY, M., RILEY, A. Epidemiological
investigation of the central Scotland outbreak of Escherichia coli O 157 infection,
November to December 1996. Epidemiology and Infection. v. 126 (3), p. 335-341,
2001.
CURTIS, T.P., MARA, D. D., SILVA, S. A. Influence of pH, oxigen
and
humic
substances on ability of sunlight to damage fecal coliform in waste stabilization pond
water. Applied and Environmental Microbiology. v. 58, p. 1335-1343, 1992.
84
CZECZULIN, J.R., BALEPUR, S., HICKS, S., PHILLIPS, A., HALL, R., KOTHARY,
H., NAVARRO-GARCIA, F., NATARO, J. P. Aggregative adherence fimbria II, a
second fimbrial antigen mediating aggregative adherence in enteroaggregative
Escherichia coli. Infection and Immunity. v.65, p. 4135-4145, 1997.
DANIELS, N. A., NEIMANN, J., KARPATI, A., PARASHAR, U. D., GREENE, K. D.,
WELL, J.G., SRIVASTAVA, A ., TAUXE, R. V., MINTZ, E. D., QUICK, R. Traveler`s
diarrhea at sea: three outbreaks of waterborne enterotoxigenic Escherichia coli on
cruise ships. Journal of Infectious Diseases. v. 181, p. 1491-1495, 2000.
DAVIES, C. M., EVISON, L. M. Sunlight and the survival of enteric bacteria in natural
waters. Journal Applied Bacteriology. v.70, p. 265-274, 1991.
DAVIS, K.C., NAKATSU, C. H., TURCO, R., WEAGANT, S.D., BHUNIA, A. K.,
analysis of environmental Escherichia coli isolates for virulence genes using the
TaqMan PCR system. Journal of Applied Microbiology. v. 95, p. 612-620, 2003.
DOMBECK , P. E., JOHNSON, L A. , ZIMMERLEY, S. T., SADOWSKY, M. J. Use of
Repetitive DNA Sequences and the PCR to Differentiate Escherichia coli Isolates
from Human and Animal Sources. Applied and Environmental Microbiology. v. 66(6),
p. 2572-2577, 2000.
DRAPEAU, A. J., KASATIYA, S. S. Coliformes a plasmides de resistence: um danger
serieus pour l`homme. Eau du Quebec. v. 10, p. 300-301, 1977.
ECHEVERRIA, P., SAVARINO, S. J., YAMAMOTO, T. Escherichia coli diarrhoea.
Bailliere`s Clinical Gastroenterology. v.7 (2), p.243-262, 1993.
EL KHOLY, A., BASEEM, H., HALL, G. S., PROCOP, G. W., LONGWORTH, D. L.
Antimicrobial resistence in Cairo, Egypt 1999 – 2000 : a survey of five hospitals. The
Journal of Antimicrobial Chemotherapy. v.51, p. 625-630, 2003.
85
ELLIOT, S. J., NATARO, J. P. Enteroaggregative and diffusely adherent Escherichia
coli. Reviews Medical Microbiology. v.6, p. 196-206, 1995.
EL-ZANFALY, H. T, IBRAHIM, A. A. Occurrence of bacterial pollution indicators in
Boulti (Tilapia nilotica Linn.) fish. European Journal of Nutrition. v.21 (3), p. 246-253,
1982.
FINLAY, B.B., FALKOW, S. Common themes in microbial pathogenicity revisited.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. v.61, p. 136-139, 1997.
FLINT, K. P. The long-term survival of Escherichia coli in river water. Journal Applied
Bacteriology. v. 63, p. 261-270, 1987.
FRENCH, G. L., LING, J., GHOW, K. L., MARK, K. K. Occurrence of multiple
antibiotic resistence and R-plasmids in gram-negative bacteria isolated from faecally
contaminated fresh-water streams in Hong Kong. Epidemiology and Infectiology. v.
98, p. 285-299, 1987.
FUJIOKA , R., SIAN-DENTON, C., BORJA, M., CASTRO, J., MORPHEW, K. Soil: the
environmental source of
Escherichia coli and enterococci in Guam´s streams.
Journal of Applied Microbiology. v.85, p. 83-89, 1999.
GAASTRA,
W.,
SVENNERHOLM,
A.
M.
Colonization
factors
of
human
enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends in Microbiology. v. 4 (11), p. 444452, 1996.
GAMESON, A. L., SAXON, J. R. Field studies on effect of daylight on mortality of
coliform bacteria. Water Research . v.1, p. 279 – 295, 1967.
GANNON, J. J., BUSSE, M. K., SCHILLINGER, J. E. Fecal coliform disappearance in
a river impoundment. Water Research. v. 17, p. 1595 – 1601, 1983.
86
GARCIA – ALJARO, C., MUNIESA, M., BLANCO, J.E., BLANCO, M., BLANCO, J.,
JOFRE, J., BLANCH, A. R. Characterization of Shiga toxin – producing Escherichia
coli isolated from aquatic environments. FEMS Microbiology Letters. v. 246, p.55-65,
2005.
GELDREICH, E. E., CLARKE, N. A. Bacterial Pollution Indicators in the Intestinal
Tract of Freshwater Fish. Applied Microbiology. v. 14 (3) , p. 429-437,1966.
GONI-URRIZA, M., CAPDEPUY, M., ARPIN, C., RAYMOND, N., CUMETTE, P.,
QUENTIN, C. Impact
of an Urban Effluent on antibiotic resistance of riverine
Enteobacteriaceae and Aeromonas spp. Applied and Environmental Microbiology.
v.66. p.125-132, 2000.
GORDON, D. M. Geographical structure and host specificity in bacteria and the
implications for tracing the source of coliform contamination. Microbiology. v.147, p.
1079-1085, 2001.
GORDON, D. M., COWLING, A. The distribution and genetic structure of Escherichia
coli in Australian vertebrates: host and geographic effects. Microbiology. v.149, p.
3575-3586, 2003.
GREENBERG, A. E., CLESCERI, L.S. , EATON, A. D. American Public Health.
Standart
methods
for
the
examination
of
water
and
wastewather.
18th
ed.Victorgraphics Inc., Baltimore, 1992.
GRIFFIN, P. M., TAUXE, R. V. The epidemiology of infections caused by Escherichia
coli O157: H7, and other enterohaemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic
uremic syndrome. Epidemiologic Reviews. v. 13, p. 60-98,1991.
HENRY, R., TUNDISI, J.G., CALIJURI, M.C., IBAÑEZ, M.S.R. A comparative study
of thermal structure, heat content and stability of stratification lakes. In: p. 69-77.
87
Tundisi, J. G. & Saijo, Y. (Eds.). Limnological studies on the Rio Doce valley lakes,
Brazil. Brazilian Academy of Sciences. São Carlos. 528 p. 1997.
HIGUTE, I. H., MACENA, I. R. , MASUNARI, S., FILHO M, B. O., BLASKOWISKI, M.
M. M., NASCIMENTO, A. J. Occurence of coliforms in water samples of the Penequê
and Penedo Rivers in Paraná, Brazil. Archives of Biology and Technology. v.41, p.
417-422, 1998.
HRUDEY, S. E., PAYMENT, P., HUCK, P. M., GILLHAM, R. W., HRUDEY, E. J. Fatal
waterborne disease epidemic in Walkerton, Ontário: comparison with other
waterborne outbreaks in the developed world. Water Science & Technology. v. 47 (3),
p. 7-14, 2003.
INSTITUTO ESTADUAL DE FLORESTAS (IEF) – Informações gerais da unidade de
conservação Parque Estadual do Rio Doce. 66p. 2001.
JOHNSON, J. R. Virulência factors in Escherichia coli urinary tract infection. Clinical
Microbiology Reviews. v.4, (1), p.80-128, 1991.
JOSÉ, M. V., BOBADILLA, J. R. Epidemiological model of diarrhoeal diseases and its
application in prevention and control. Vaccine. v.12 (2), p.109 -116, 1994.
KAPER, J.B., NATARO, J.P., MOBLEY, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature
Reviews. v.2, p.123-139, 2004.
KARCH, H., BIELASZEWSKA, M., BITZAN M., SCHMIDT, H. Epidemiology and
diagnosis
of
Shiga
toxin-producing
Escherichia
coli
infections.
Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease. v.34, p. 229-243, 1999.
KEENE, W. E., MCANULTY, J. M., HOESLY, F.C., WILLIAMS, L. P., HEDBERG, K. ,
OXMAN, G. L., BARRET, T. J., PFALLER, M. A., FLEMING, D.W. A swimming-
88
associated outbreak of haemorrhagic colitis caused by Escherichia coli O157:H7 and
Shigella sonnei . New England Journal of Medicine. v. 331, p. 579-584, 1994.
KESKIMAKI, M. EKLUND, M. PESONEN, H., HEISKANEN, T., SIITONEN, A. EPEC,
EAEC and STEC in stool specimens: Prevalence and molecular epidemiology of
isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. v.40, p. 151-156, 2001.
KOBAYASHI, R. K. T., SARIDAKIS, H. O., DIAS, A., M.G., VIDOTTO, M. C.
Molecular identification of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) associated with
infant diarrhea in Londrina, Parana, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology. v.31, p.
275-280, 2000.
KONEMAN, E. W. , Diagnóstico Microbiológico . Texto e Atlas. 5. Ed., Rio de Janeiro,
MEDSI. 1465 p., 2001.
KOSEK M., BERN, C., GUERRANT, RL. The global burden of diarrhoeal disease, as
estimated from studies published between 1992 and 2000. Bulletin World Health
Organization. v.81, p. 197- 204, 2003.
KUHNERT, P. BOERLIN, P. FREY, J. Target genes for virulence assessment of
Escherichia coli isolates from water, food and the environment. FEMS Microbiology
Reviews. v. 24, p. 107-117, 2000.
LEBARON, P., HENRY,A., LEPEUPLE, A. S., PENA, G., SERVAIS, P. An
operational method for the real-time monitoring of E. coli numbers in bathing waters.
Marine Pollution Bulletin. v.50, p. 652-659, 2005.
LEVINE,
M.
M.
Escherichia
coli
that
cause
diarrhea:
enterotoxigenic,
enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorragic and enteroadherent. Journal of
Infectious Diseases. v.155, p. 377-389, 1987.
89
LÓPEZ-PILA, J. M., SZEWZYK, R. Estimating the infection risk in recreational waters
from the faecal indicator concentration and from the ratio between pathogens and
indicators. Water Research. v. 34(17), p. 4195-4200, 2000.
MALDONADO, Y., FISER, J. C. NAKATSU, C. H., BHUNIA, A. K. Citotoxicity
Potential
and Genotypic Characterization of Escherichia coli Isolates from
Environmental and Food Sources. Applied and Environmental Microbiology. v. 71(4),
p. 1890-1898, 2005.
MARCH, S. B., RATNAM, S. Sorbitol - MacConkey Medium for Detection of
Escherichia coli O157: H7 Associated with Hemorrhagic Colitis. Journal of Clinical
Microbiology. v. 23 (5), p. 869-872, 1986.
MCCAMBRIDGE, J., MCMEEKIN, T.A. Effect of solar radiation and predacious
microrganisms on survial of fecal and other bacteria. Applied and Environmental
Microbiology. v. 41, p. 1083 – 1087, 1984.
MEDEIROS, A. O. Influência de impactos antrópicos em fungos isolados em
ambientes aquáticos. Belo Horizonte. Departamento de Microbiologia da UFMG.
107p. (Tese de Doutorado). 2005.
MORAES, D. S. L., JORDÃO, B. Q. Water resources deterioration and its impact on
human health. Revista de Saúde Pública. v. 36 (3), p. 370-374, 2002.
MUHLDORFER, I., BLUM, G. DONOHUE-ROLFE, A. HEIER, H., OLSCHLAGER, T.,
TSCHAPE, H., WALLNER, U., HACKER, J. Characterization of Escherichia coli
strains isolated from environmental water habitats and from stool samples of healthy
volunteers. Research in Microbiology. v.147( 8), p. 625-635, 1996.
90
MULLER, E. E., EHLERS, M. M., GRABOW, K.W. The occurrence of E. coli O157:
H7 in South African water sources intended for direct and indirect human
consumption. Water Research. v.35 (13), p. 3085-3088, 2001.
MUSA, H. G., SHEARS P., KARL S., ELSABAY S. K. Water quality and public health
in northern Sudan: a study of rural and peri-urban communities. Journal Applied
Microbiology. v. 87: 676-682, 1999.
MYERS, N., MITTERMEIER, R. A., MITTERMEIER, C.G., FONSECA, G.A.B., KENT,
J. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature. v. 403 (24), p.853-858,
2000.
NATARO, J. P. Non-EPEC Escherichia coli that adhere to HEP-2 cells. Microbiology
Reviews. v. 27, p. 76-71, 1996.
NATARO, J. P., KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology
Reviews. v.11(1), p. 142-201, 1998.
NCCLS (National Committee of Laboratory Standards). Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing, fourteenth informational supplement. M100-S14.
NCCLS, Wayne, PA, USA, 2004.
NIMER, E. Climatologia do Brasil. Rio de Janeiro. IBGE, 421p.,1989.
NOGUEIRA, G., NAKAMURA, C. V., TOGNIM , M. C. B., FILHO B., A. A., DIAS, B.
P. F. Qualidade microbiológica de água potável de comunidades urbanas e rurais,
Paraná. Revista de Saúde Pública. v. 37 (2), p.232- 236, 2003.
OBI, C. L., GREEN, E., BESSONG, P. O., VILLIERS, B., HOOSEN, A. A., IGUMBOR,
E. O., POTGIETER, N. Gene encoding virulence markers among Escherichia coli
91
isolates from diarrhoeic stool samples and river sources in rural Venda communities
of South Africa. Water SA. v. 30 (1), p. 37-42, 2004.
OJEDA, A., PRADO, V., MARTINEZ, J., ARELLANO, C., BORCZYK, A., JOHNSON,
W., LIOR, H., LEVINE, M.M. Sorbitol-negative phenotype among enterohemorrhagic
Escherichia coli strains of different sorotypes and from different sources. Journal of
Clinical Microbiology. v.33 (8), p. 2199-2201, 1995.
O`RYAN, M., PRADO, V., PICKERING, L.K. A Millennium Update on Pediatric
Diarrheal IIIness in the Developing World. Pediatric Infectious Diseases. v. 16, p. 125136, 2005.
PARVEEN, S., MURPHREE, R. L., EDMISTON, L., KASPAR C. W., PORTIER, K. M.,
TAMPLIN, M. L. Association of multiple-antibiotic resistence profiles with point and
nonpoit sources of Escherichia coli in Apalachicola bay. Applied and Environmental
Microbiology. v. 63 (7), p. 2607-2612, 1997.
PASS, M. A., ODEDRA, R., BATT, R.M. Multiplex PCRs for identification of
Eschericha coli virulence genes. Journal of Clinical Microbiology. v.38 (5), p. 20012004, 2000.
PAUL, J. H., ROSE, J. B,., JIANG, S., KELLOGG, C., SHINN, E. A. Occurrence of
fecal indicator bacteria in surface waters and the subsurface aquifer in Key Largo,
Florida. Applied and Environmental Microbiology. v.61 (6), p.2235-2241,1995.
PATON, J. C., PATON, A. W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing
Escherichia coli infections . Clinical Microbiology Reviews. v.11, p. 450-479,1998.
PESSOA, G. V., SILVA, E. A. A new medium for the rapid presumptive identification
of Enterobacteriae, Aeromonas and Vibrios. Annual Review of Microbiology, 125A(3):
341-7, 1974.
92
PIMENTEL, H. S. Caracterização Geoquímica das águas na serra de Ouro Preto,
Minas Gerais. Departamento de Geologia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro
Preto, MG. Dissertação de Mestrado, 112 p., 2001.
POWER, M. L., LITTLEFIELD- WYER, J., GORDON, D. M., VEAL, D. A., SLADE, M.
B. Phenotypic and genotypic characterization of encapsulated Escherichia coli
isolated from blooms in two Australian lakes. Environmental Microbiology. v.7(5), p.
631-640, 2005.
PRASHAR, U., BRESEE, J., GLASS, R. The global burden of diarrheal disease in
children. Bull World Health Organization. v.81, 236p., 2003.
RAPELLI, P. FOLGOSA, E., SOLINAS, M. L. , COSTA, J. L., PISANU, C., SIDAT, M.,
MELO, J., CAPPUCCINELLI, P., COLOMBO, M. M. Pathogenic enteric Escherichia
coli in children with and without diarrhea in Maputo, Mozambique. FEMS Immunology
and Medical Microbiology. v. 43, p.67-72, 2005.
REGUA-MANGIA, A. H., GOMES, T. A. T., VIEIRA, M. A. M. ANDRADE, J. R.C.,
IRINO, K. TEIXEIRA, L. M. Frequency and characteristics of diarrhoeagenic
Escherichia coli strains isolated from children with and without diarrhea in Rio de
Janeiro, Brazil. Journal of Infection. v. 48, p. 161-167, 2004.
RILEY, L.W., REMIS, R. S., HELGERSON, S. D. Hemorrhagic colitis associated with
a rare Escherichia coli serotype. The New England Journal of Medicine. v.308, p.
681-685, 1983.
RIVERA, S. C., HAZEN, T. C., TORANZOS, G. A. Isolation of fecal coliforms form
pristine sites in a tropical rain forest. Applied and Environmental Microbiology. v.
54(2), p. 513 –517, 1988.
93
ROBINS-BROWNE, R. M., HARTLAND, E. L.
Escherichia coli as a cause of
diarrhea. Journal of Gastroenterology and Hepatology. v.17, p. 467-475, 2002.
ROMPRÉ, A., SERVAIS, P., BAUDART, J., ROUBIM, M.R., LAURENT, P. Detection
and enumetation of coliforms in drinking water: current methods and emerging
approaches. Journal of Microgiological Methods. v.49, p.31-54, 2002.
ROSENBERG, M. L., KOPLAN, J. P., WACHSMUTH, I. K., WELLS, J. G.,
GANGAROSA, E. J., GUERRANT, R. L., SACK, D. A. Epidemic diarrhea at Crater
Lake from enterotoxigenic Escherichia coli. A large waterborne outbreak. Annals of
Internal Medicine. v.86, p. 714-718, 1977.
RYAN O, M., PRADO, V., PICKERING, L. K. A Millennium Update on Pediatric
Diarrheal Illness in the Developing World. Pediatric Infectious Diseases. v.16, p.125136, 2005.
SANTOS, S.G., SERUFO, J.G., SILVA, R.A.P., MARRA, B.A., REIS, C.M.F.,
HAMDAN, J.S., NICOLI, J.R., CARVALHO, M.A.R., FARIAS, L.M. Microbiologic
profile of intra-abdominal infections at Belo Horizonte, Brazil. American Journal of
Infection Control. v.31(3), p. 135-143, 2003.
SCHULTSZ, C.,
POOL, G. J., vAN KETEL, R., WEVER, B., SPEELMAN, P.,
DANKERT, J. Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli in Stool Samples by
Using Nonradioactively Labeled Oligonucleotide DNA Probes and PCR. Journal of
Clinical Microbiology. V. 32 (10), p. 2393-2397, 1994.
SHIBATA, T., SOLO-GABRIELE, H. M., FLEMING, L. E., ELMIR, S. Monitoring
marine recreational water quality using multiple microbial indicators in an urban
tropical environment. Water Research. v.38, p. 3119-3131, 2004.
94
SILVA, L.V.C. Diagnóstico da cobertura vegetal. Contribuição para o plano de
manejo do Parque Estadual do Rio Doce. Relatório Técnico. 2001.
SINCLAIR , J. L., KAMPBELL. D. H. COOK, M. L. WILSON , J. T. Protozoa in
subsurface sediments from sites contaminated with aviation gasoline or jet fuel.
Applied and Environmental Microbiology. v. 59, p. 467- 472, 1993.
SOLO-GABRIELE, H. M., WOLFERT, M. A., DESMARAIS, T. R., PALMER, C. J.
Sources of Escherichia coli in a Coastal Subtropical Environmental. Applied and
Environmental Microbiology v.66 (1), p. 230-237, 2000.
SORVILLO, F. J., WATERMAN, S. H., VOGT, J. K. ENGLAND, B. Shigellosis
associated with recreational water contact in Los Angeles County. American Journal
of Tropical Medicine and Hygiene. v.38, p. 613-617, 1988.
SOUZA, M.B.G. Flutuação temporal da cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii
(Nostocales) no Lago Dom Helvécio, Parque Estadual do Rio Doce, e avaliação do
seu potencial invasor em um lago natural do trecho médio da bacia do Rio Doce, MG.
Dissertação de Mestrado. Programa de pós-graduação em Ecologia, Conservação e
Manejo de Vida Silvestre – UFMG. 115p Fevereiro de 2005.
SUNAGA, T., VERANI, J.R. The fish communities of the lakes in Rio Doce Valley,
Northeast Brazil. Internationale Vereinigung fuer Theoretische und Angewandte
Limnologie. Verhandlungen . v. 24 (4) p. 2563-2566, 1991.
SWERDLOW, D. L., WOODRUFF, B. A., BRADY R. C., GRIFFIN, P. M., TIPPEN, S.,
DONNEL, H. D., GELDREICH, E., PAYNE, B.J., MEYER, A., WELLS, J. G. A
waterborne outbreak in Missouri of Escherichia coli O157:H7 associated with bloody
diarrhea and death. Annals Internal Medicine. v.117, p. 812-819, 1992.
95
TRABULSI, L. R., KELLER, R., TARDELLI GOMES, T.A.,. Typical and atypical
enteropathogenic Escherichia coli. Emerging Infectious Diseases. v.8, p. 508-513,
2002.
TREVORS, J. T., BARKAY, T., BOURQUIN, A. W. Gene transfer among bacteria in
soil and aquatic environments: a review. Canadian Journal of Microbiology. v. 33, p.
191-198, 1987.
TUNDISI, J. G., SAIJO, Y., HENRY, R. & NAKAMOTO, N. Primary productivity,
phytoplankton biomass and light photosynthesis responses of four lakes in the Rio
Doce Lake System. In: Y. Saijo, & J. G. Tundisi, [eds.], Limnological studies in Rio
Doce Valley Lakes and Pantanal Wetland, Brazil. 2nd. Report. Nagoya, Japan, p. 2149, 1985.
UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Ambient water
quality criteria for bacteria EPA-440/5-84-002. U.S. Environmental Protection Agency
Washington, D.C. 1986.
VALENTINI, S. R., GOMES, T. A. T., FLACÃO, D. P. Lack of virulence factors in
Escherichia coli strains of enteropathogenic serogroups isolated from water. Applied
and Environmental Microbiology. v. 58 (1), p. 412-414, 1992.
VAN DER STEEN, P., BRENNER, A., SHABTAL, Y., ORON, G. Improved fecal
coliform decay in integrated duckweed and algal ponds. Water Science &
Technology. v.42, p. 363 – 370, 2000.
VICENTE, A. C. P. , TEIXEIRA, L. F. M., INIGUEZ-ROJAS, L., LUNA, M.G., SILVA,
L., ANDRADE, J. R. C., GUTH, B. E. C. Outbreaks of cholera-like diarrhoea caused
by enterotoxigenic Escherichia coli in the Brazilian Amazon Rainforest. Royal Society
of Tropical Medicine and Hygiene. v.99, p. 669-674, 2005.
96
VIDOTTO, M.C., KOBAYASHI, R. K. T., DIAS, A.M.G. Unidentified serogroups
enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) associated with diarrhoea in infants in
Londrina, Paraná, Brazil. Journal of Medical Microbiology. v.49, p.1-4, 2000.
VILJANEN, M. K., PELTOLA, T., JUNNILA, S. Y., OLKKONEN, L., JARVINEN, H.,
KUISTILA, M., HUOVINEN, P. Outbreak of diarrhoea due to Escherichia coli O111 :
B4 in schoolchildren and adults: association of Vi antigen-like reactivity. Lancet.
v.336, p.831-834, 1990.
VON BAUM, H., MARRE, R. Antimicrobial resistence of Escherichia coli and
therapeutic implications. International Journal of Medical Microbiology. v.295, p. 503 511, 2005.
WEBSTER, L.F., THOMPSON, B.C., FULTON, M.H., CHESTNUT, D. E., VAN
DOLAH, R. F., LEIGHT, A. K., SCOTT, G. I. Identification of sources of Escherichia
coli in South Carolina estuaries using antibiotic resistence analysis. Journal of
Experimental Marine Biology and Ecology. v. 298, p. 179-195, 2004.
WEINER,
R.,
LANGILLE,
S.,
QUINTERO,
E.
Structure,
function
and
immunochemistry of bacterial exopolysaccharides. Journal of Industrial Microbiology
and Biotechnology. v.15, p.339-346, 1995.
WIGGINS, B. A. Discriminate analysis of antibiotic resistance patterns in fecal
streptococci, a method to differentiate human and animal source of fecal pollution in
natural water. Applied and Environmental Microbiology. v.62, p. 3997-4002, 1996.
WOLF, M. K. Occurrence, Distribution and Associations of O and H Serogroups,
Colonization Factor antigens, and Toxins of Enterotoxigenic Escherichia coli. Clinical
Microbiology Reviews. v.10 (4), p. 569-584, 1997.
97
YAMAMOTO, J., ISHIKAWA, A., MIYAMOTO, M., NOMURA, T., UCHIMURA, M.,
KOIWAI, K. Outbreak of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 mass infection
caused by whole roasted cow. Japanese Journal of Infectous Diseases. v. 54 (2), p.
88-90, 2001.
YATSUYANAGI, J., SAITO, S., MIYAJIMA, Y., AMANO, KI., ENOMOTO, K.
Characterization of Atypical Enteropathogenic Escherichia coli strains Harboring the
astA Gene That Were Associated with a Waterborne Outbreak of Diarrhea in Japan.
Journal of Clinical Microbiology. v.41(5), p. 2033-2039, 2003.
YOSPHE-PURER, Y., GOLDERMAN, S. Occurrence of Staphylococcus aureus and
Pseudomonas aeruginosa in Israeli Coastal Water. Applied and Environmental
Microbiology. p.1138-1141,1987.
YOUN-JOO AN, KAMPBELL, D. H., BREIDENBACH, G. P. Escherichia coli and total
coliforms in water and sediments at marinas. Environmental Pollution. v.120, p.771778, 2002.
ZHANG, W. L., KOHLER, B., OSWALD, E., BEUTIN, L., KARCH, H., MORABITO, S.,
CAPRIOLI, A., SUERBAUM, S., SCHMIDT, H. Genetic diversity of intimin genes of
attaching and effacing Escherichia coli strains. Journal of Clinical Microbiology . v.
40(12), p. 4486-4492, 2002.
98
ANEXO 1
Linhagens de Escherichia coli isoladas do Lago Dom Helvécio e selecionadas para
detecção de fatores de virulência por PCR.
Linhagens de
E. coli
DH 05
DH 11
DH 18
DH 24
DH 28
DH 34
DH 37
DH 38
DH 39
DH 41
DH 44
DH 45
DH 52
DH 57
DH 59
DH 63
DH 66
DH 67
DH 70
DH 74
DH 77
DH 78
DH 80
DH 81
DH 83
DH 85
DH 87
DH 90
DH 91
DH 93
DH 94
DH 97
DH 98
DH 101
DH 103
DH 104
DH 113
Ponto de Coleta
Lagoa Coletada
Mês
P1
P2
P3
P4
P5
Limnética
P1
P2
P5
P2
Limnética
P1
P3
P4
P1
P2
P3
P4
P5
P4
P1
P1
P2
P3
P4
P5
Limnética
P2
P2
P2
P3
P4
P4
P5
Limnética
P1
P3
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Dom Helvécio
Maio / 04
Maio / 04
Maio / 04
Maio / 04
Maio / 04
Maio / 04
Junho / 04
Junho / 04
Junho / 04
Julho / 04
Julho / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Outubro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Fevereiro / 05
Fevereiro / 05
99
ANEXO 2
Linhagens de Escherichia coli isoladas das Lagoas Carioca, Jacaré, Gambazinho
e selecionadas para a detecção de fatores de virulência por PCR.
Linhagens de
E. coli
05
15
25
28
32
34
36
40
45
47
48
50
58
72
88
91
95
140
150
165
178
207
225
236
250
260
263
280
292
301
312
316
320
328
330
341
344
348
354
366
373
386
395
Ponto de Coleta
Lagoa Coletada
Litorânea
Limnética
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Litorânea
Litorânea
Limnética
Limnética
Limnética
Litorânea
Litorânea
Limnética
Litorânea
Litorânea
Litorânea
Litorânea
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Limnética
Litorânea
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Gambazinho
Lagoa Carioca
Lagoa Jacaré
Lagoa Jacaré
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Jacaré
Lagoa Gambazinho
Lagoa Gambazinho
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Jacaré
Lagoa Gambazinho
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Lagoa Gambazinho
Lagoa Jacaré
Lagoa Jacaré
Lagoa Carioca
Lagoa Carioca
Lagoa Gambazinho
Mês
Maio / 04
Maio / 04
Maio / 04
Junho / 04
Junho / 04
Julho / 04
Julho / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Agosto / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Setembro / 04
Outubro / 04
Outubro / 04
Outubro / 04
Outubro / 04
Outubro / 04
Outubro / 04
Novembro / 04
Novembro / 04
Novembro / 04
Novembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Dezembro / 04
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Janeiro / 05
Fevereiro / 05
Fevereiro / 05
Fevereiro / 05
Fevereiro / 05
Fevereiro / 05 100