Borrelia + VIsE IgG ELISA

Instrucciones de Uso
Borrelia + VIsE IgG
ELISA
Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación
cualitativa o cuantitativa de anticuerpos IgG contra Borrelia burgdorferi
en suero humano, plasma y LCR.
Son detectadas las infecciones correspondientes a las tres subclases
de B. burgdorferi (garinii, afzelii y sensu strictu).
RE57201
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
Borrelia + VIsE IgG ELISA (RE57201)
1.
ESPAÑOL
USO PROPUESTO
Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación cualitativa o cuantitativa de
anticuerpos IgG contra Borrelia burgdorferi en suero humano, plasma y LCR. Son detectadas las
infecciones correspondientes a las tres subclases de B. burgdorferi (garinii, afzelii y sensu strictu).
2.
IMPLICACIONES CLÍNICAS
A Borrelia burgdorferi, uma bactéria da família Spirochaetaceae, é o agente etiológico da doença de Lyme
(Borreliose) sendo a doença mais comum na Europa e nos EUA transmitida pela carraça (Ixodes sp.) A
borreliose de Lyme é uma doença multi-sistémica com um espectro largo de sintomas clínicos. Um sintoma
típico da fase aguda é o eritema chronicum migrans (ECM), muitas vezes acompanhado por sintomas
semelhantes aos da gripe. Em estados mais avançados da doença pode ocorrer artrite, cardite bem como
manifestações neurológicas e dermatológicas. A borreliose de Lyme pode ser tratada com antibióticos em
todas as fases. Assim sendo, um diagnóstico laboratorial de borreliose, seguro e sensível, com capacidade
de detectar os estados mais precoces da doença, é da maior importância, uma vez que o tratamento
precoce é o mais conveniente.
Os anticorpos IgM aparecem normalmente três semanas após a infecção, os anticorpos IgG após quatro a
seis semanas. A resposta imunitária precoce é principalmente direccionada contra o peptídeo da flagelina
(41 kDa) e contra a OspC (Proteína C da Superfície externa – Outer surface protein C, 23 kDa) e alastra
depois para mais proteínas bacterianas. Normalmente a fase aguda é indicada pelos elevados títulos de
anticorpos IgM. Os título elevados de IgG podem ocorrer com ou sem a presença de anticorpos IgM
quando a borreliose está em declínio (devido a terapia ou espontaneamente) ou durante a fase crónica. A
realização do teste Borrelia IgG ELISA é importante especialmente para detectar a borreliose mesmo em
casos com títulos de 14 kDa + OspC negativos e para monitorizar o estado imunitário.
O teste Borrelia IgG ELISA utiliza o antigénio VIsE recombinante muito específico da Borrelia burgdorferi e
uma mistura de antigénios lisados altamente específicos da Borrelia burgdorferi sensu strictu, B. afzelii e B.
garinii, e portanto determina anticorpos IgG com elevada especificidade e sensibilidade.
3.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
Ensayo enzimático inmunológico (ELISA) basado en el principio de sandwich. Los pocillos son revestidos
con antígeno. Anticuerpos específicos de las muestras, que se encuentran unidos a los antígenos del
revestimiento de los pocillos, son detectados a través de una enzima secundaria conjugada con un
anticuerpo específico para IgG humana (E-Ab). Luego de que el substrato reacciona, la intensidad del color
es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de las muestras
pueden ser determinados directamente usando el índice del cut off.
4.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional.
2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida
del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo.
3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su
suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los
componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.
4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No
use reactivos vencidos.
5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio,
guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.
6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y
cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de
Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o
mediante solicitud directa a IBL.
7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos
peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad.
8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos.
9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel.
10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y
encontrados negativos para anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. Sin embargo, la presencia de estos u
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otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben
ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación.
5.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 °C. Manteniéndose
alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos
preparados se detalla en los capítulos correspondientes.
Una vez abierto el estuche, la placa de microtitración es estable hasta 3 meses en su envase roto, pero
herméticamente sellado, si se almacena a 2-8 °C .
6.
TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Suero, Plasma (EDTA)
Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad
química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras
fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse
antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado.
Almacenamiento Suero/Plasma/LCR:
2-8 °C
Estabilidad Suero/Plasma/LCR:
5 dias.
7.
12 meses
Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa.
Evite congelar y descongelar repetidamente.
MATERIALES SUMINISTRADOS
Cantidad
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 12 mL
ENZCONJ
1 x 4 x 1.5 mL
CAL A-D
1 x 1.5 mL
CONTROL +
1 x 1.5 mL
CONTROL -
1 x 100 mL
DILBUF
1 x 100 mL
WASHBUF CONC
1 x 15 mL
TMB SUBS
1 x 15 mL
TMB STOP
8.
≤ -20 °C
(Alícuotas)
Componente
Placa de Microtitulación
Tiras separables. Revestido con antígenos específicos.
Conjugado Enzimático
Listo para usar. Coloreado en verde. Contenido: anti IgG humano, conjugado con
peroxidasa.
Estándar A–D
2; 10; 50; 200 U/mL
Standard B = Cut-off Standard
Listo para usar. Contenido: IgG anticuerpos contra B. burgdorferi, estabilizadores.
Control Positivo
Listo para usar. Contenido: IgG anticuerpos contra B. burgdorferi, estabilizadores.
Control Negativo
Listo para usar. Contenido: Suero humano, estabilizadores.
Solución Buffer de Dilución
Listo para usar. Coloreado en azul.
Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x)
Contenido: Solución buffer fosfatada.
Solución de Substrato TMB
Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores.
Solución de Parada TMB
Listo para usar. 1 M H2SO4.
MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 5; 10; 100; 1000 µL
(ajustable)
2. Vortex
3. Tubos (≥ 1 mL) para la dilución de las muestras.
4. Incubadora, 37 °C
5. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo
6. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración
7. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de
referencia 600-650 nm)
8. Agua bidestilada o desionizada
9. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro
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INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO
1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede
alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas
de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo
pipetas u otros dispositivos calibrados.
2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que
los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que
todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) y agite suavemente por
rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.
3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva
para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén
en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.
4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de
pipeteo.
5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa.
6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo
orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de
8 canales.
7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados
conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático
de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las
placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al
enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado
y que no haya residuos en ellos.
8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura
ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa
resellada con desecante.
10.
INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO
10.1. Preparación de componentes concentrados
Diluya /
disuelva
Componente
100 mL
WASHBUF
CONC
agregue
1000 mL
Diluyente
Relación
Notas
agua
bidest.
1:10
Resolve los
cristales a
18-25°C.
Almacenamiento Estabilidad
2-8 °C
2 meses
10.2. Dilución de Muestras
10.2.1. Suero, Plasma
Muestra
para ser diluído
con
Relación
Notas
Suero, Plasma
DILBUF
1:101
p.e. 10 µL + 1 mL
generalmente
Las muestras que contengan concentraciones superiores al estándar más alto tienen que ser aún más diluidas.
10.2.2. Suero/LCR
Para el diagnóstico de líquido cefalorraquídeo (LCR), de acuerdo con Reiber, es necesario utilizar
aproximadamente concentraciones similares o de índices de corte (C0l) en el rango de DO de 1.0 a 0.1
para el suero y CSF. Para este fin, generalmente se realiza las siguientes diluciones:
Muestra
Suero
LCR
para ser diluído
generalmente
con
DILBUF
Relación
1:401
Notas
p.e. 5 µL + 2 mL
generalmente
DILBUF
1:4
50 µL + 150 µL
Los índices de corte son corregidos con los factores de dilución en relación a la dilución 1:101. El índice de
corte para la dilución de 1:401 en suero debe ser multiplicado por 4 y la dilución 1:4 LCR debe ser dividido
por 25.
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Si los resultados de la muestras de no se encuentran dentro del rango de DO 1.0 a 0.1, se deben realizar
un conjunto de diluciones. Las siguientes diluciones recomendadas son:
Suero
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
LCR
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Pipetee 100 µL de cada Estándar, Control y muestra en cada pocillo respectivo de la placa de
microtitulación. En el ensayo cualitativo se utiliza solamente el Estándar C (nivel de Corte).
Incube 1h a 37°C. Utilizar papel adhesivo o una cámara humeda.
Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µL de
Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa
invertida sobre una toalla de papel.
Pipetee 100 µL de Conjugado Enzimático en cada pocillo.
Incube 30 min a 37°C. Utilizar papel adhesivo o una cámara humeda.
Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µL de
Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa
invertida sobre una toalla de papel.
Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales.
La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite
la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen.
Pipetee 100 µL de Solución de Substrato TMB en cada pocillo.
Incube 30 min a TA (18-25°C) en la oscuridad.
Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µL de Solución de Paro TMB en cada pocillo.
Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa.
Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) dentro
de los 60 min de haber agregado la Solución de Paro.
CONTROL DE CALIDAD
Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además
el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables.
Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de
acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben
encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este
criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras
conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la
calidad adecuados.
En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los
reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de
lavado.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
La evaluación de la prueba se puede realizar ya sea cualitativamente o cuantitativamente.
13.1. Evaluación cualitativa
El valor de corte está dado por la densidad óptica (DO) del estándar B (nivel de corte). El índice de corte
(COl) se calcula a partir de la media de densidad óptica de la muestra y el valor de corte. Si la densidad
óptica de la muestra está dentro de un rango de 10 % de todo el valor de corte (Zona gris) la muestra tiene
que ser considerada como límite. Las muestras con mayor DOs son positivas, las muestras con menos DOs
son negativas.
Muestra tipica:
Índice de corte: DO (estándar B, estándar de corte) = 0.45
Muestra DO = 0.60
Índice de corte (COl): 0.60/0.45 = 1.33. La muestra ha de ser considerada positiva
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13.2. Evaluación cuantitativa
La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en
papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4
Parameter Logistics or Logit-Log.
Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no
emplear valores duplicados).
La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar.
La dilución inicial se ha tenido en cuenta al leer los resultados de la gráfica. Resultados de las muestras de
mayor predilución debe ser multiplicados por el factor de dilución.
Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se
describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente.
Curva de Calibración Tipica
(Ejemplo. ¡No usar para el cálculo!)
Estándar
U/mL
DO Media
A
2
0.008
B
10
0.267
C
50
1.097
D
200
2.114
(OD)
2.500
Borrelia + VlsE IgG ELISA
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1
14.
10
100
1000
(U/mL)
INTERPRETACION DE RESULTADOS
Método
Cuantitativa
(Curva de Calibración):
Cualitativa
(Índice de corte, COI):
Intervalo
> 11 U/mL
9 – 11 U/mL
< 9 U/mL
> 1.1
0.9 – 1.1
< 0.9
Interpretación
positivo
intermedio
negativo
positivo
intermedio
negativo
Los resultados por si solos no
deben ser la única razón para
un tratamiento terapéutico,
sino que deben correlacionarse
con observaciones clínicas y
ensayos de diagnóstico.
En el caso de resultados IgG negativo combinado con un resultado negativo con Borrelia 14 kDa + OspC
IgM ELISA, una borreliosis aguda es poco probable. Pero una infección reciente no puede ser descartada si
las muestras fueron tomadas within less than three weeks after the infection antes de las 3 semanas desde
la infección, ya que los anticuerpos se forman durante este período. Si la muestra resulta IgM positiva, se
indica una boreliosis aguda en su estado inicial.
Resultados IgG límites, acompañados por Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA positiva o negativa, pueden
presentarse en las infecciones crónicas o tardías, debido a estimulación policlónica causada por otras
infecciones. Una estimulación policlónica puede excluirse mediante un Western Blot de las muestras
usando borreliae sometido a ultrasonido. Resultados límites deben ser confirmados por un control a los 14
días. En el caso de boreliosis, las concentraciones de IgG se mantienen casi constantes, mientras que en el
caso de respuestas policlonales, las concentraciones disminuyen.
Resultados IgG positivos combinado con Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA límite o positivo indican una
infección aguda que requiere de tratamiento. Concentraciones especialmente altas de IgG, acompañadas
por IgM negativas, son típicas de reacciones inespecíficas causadas por estimulaciones policlonales. Estas
reacciones decrecen dentro de las dos o tres semanas y por lo tanto los ensayos de control deben
realizarse dos o tres semanas después. Muestras positivas tambien deben ser confirmadas por un análisis
Western Blot.
El test Borrrelia IgG ELISA presenta una elevada sensibilidad y especificidad para la detección de la
infección por Borrelia burgdorferi debido al uso de antígenos recombinantes de Borrelia burgdorferi VlsE
combinado con una mezcla de antígenos muy específicos de Borrelia burgdorferi sensu stricto B. afzelii y B.
garinii. Esta mezcla permite la detección de la infección con alta sensibilidad y especificidad en una etapa
temprana asi como en el caso de infecciones crónicas o persistentes.
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El test Borelia IgG ELISA es apto para controles de éxito de terapia. En este caso, debe tomarse en
cuenta que la concentración de anticuerpos no decrece significativamente sino hasta 2-4 meses después
de que la infección se ha curado.
Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben
correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico.
15.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE
MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles.
Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES.
La azida y el timerosal en concentraciones > 0.1 % interfieren en este ensayo y pueden conducir a falsos
resultados.
Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo (+/- 20% del esperado) en los
resultados del ensayo en las concentraciones indicadas a continuación.
Hemoglobina
Bilirrubina
Triglicéridos
16.
2.0 mg/mL
0.3 mg/mL
2.5 mg/mL
PRUEBAS FUNCIONALES
Grupo de pacientes
Especificidad Analítica
(Reactividad Cruzada)
Precisión
Intra-Ensayo
n = 24
Inter-Ensayo
n = 20
Linearidad
Especificidad rel.:
Comparación de
Métodos versus Immuno
Blot
Sensitividad rel.:
Comparación de
Métodos versus Immuno
Blot
Comparación de
ensayos
Automatización
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Resultados negativos /
muestras probadas
16/16
6/7
9/9
13/14
10/12
5/6
Lues (Treponema pallidum)
Factor reumatoide positivo
CRP elevado
CCP IgG positivo
Uric acid elevado
ANA positivo
Intervalo COI / U/mL
CV (%)
< 1 / < 10
7
> 1 / > 10
4
0.6 / 7
5.3
1.7 / 17
4.3
4.4 / 64
5.9
6.9 / 170
8.8
Intervalo (DO)
Rango de dilución en serie
Intervalo (%)
1.0 – 0.1
1:4 – 1:32
100 – 130
Borrelia afzelii IgG Blot
IBL-Assay
positivo
negativo
total
positivo
14
5
0
negativo
0
279
279
Especificidad rel. 98.3 %
total
14
284
298
Borrelia recombinant IgG Blot +
Borrelia afzelii IgG Blot
IBL-Assay
positivo
negativo
total
positivo
32
4
36
negativo
2
20
22
Sensitividad rel. 94.1 %
total
34
24
58*
Muestras
n
IBL-Assay
Ensayo
Ensayo
Competitivo 1 Competitivo 2
ECM
116
positivo
49 %
30 %
33 %
intermedio
0
3%
2%
Neuro38
positivo
74 %
68 %
58 %
borreliosis
intermedio
0
3%
0
Este prueba ha sido validada con, p.e., BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols)
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El Elisa para la IgG específica de Lyme se ha realizado con suero y con LCR
en 5 diluciones cada uno: Suero 1:100 - 1:1600 y CSF 1:2 -1:32. Los pares
Suero/LCR han sido tomados el mismo día y la determinación se ha basado
en la evaluación del programa para el diagnóstico con LCR del profesor
Determinación de LCR
Reiber. Para la evaluación de los pares de Suero/LCR líquido cefaloraquídeo
lumbal fue utilizado con y sin difusión patología desde la sangre al cerebro.
Todos los resultados de las pruebas de ELISA en IBL International se ajustan
a los síntomas clínicos de las pruebas de referencia.
* muestras positivas en el ensayo de la competencia.
17.
REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO
1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. P., Diagnosis of Lyme Borreliosis, Clin.
Microbiol. Reviews, 18(3), 484-509: (2005)
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P, Perez-Eid C, Peter O, Postic D, Raoult D, Tellez A, Tselentis Y, Wilske B; ESCMID Study Group on
Coxiella, Anaplasma, Rickettsia and Bartonella; European Network for Surveillance of Tick-Borne
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41 (2006)
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Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik. München: Urban & Fischer, 2000
(in Englisch via Internet unter DGHM.org oder NRZ-Borrelien.LMU.de).
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Borrelia + VIsE IgG ELISA (RE57201)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Ensaio imunoenzimático para diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa ou quantitativa de
anticorpos IgG contra Borrelia burgdorferi em soro humano, plasma e LCR. São detectadas infecções das
três subespécies de B. burgdorferi (garinii, afzelii e sensu strictu).
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A Borrelia burgdorferi, uma bactéria da família Spirochaetaceae, é o agente etiológico da doença de Lyme
(Borreliose) sendo a doença mais comum na Europa e nos EUA transmitida pela carraça (Ixodes sp.) A
borreliose de Lyme é uma doença multi-sistémica com um espectro largo de sintomas clínicos. Um sintoma
típico da fase aguda é o eritema chronicum migrans (ECM), muitas vezes acompanhado por sintomas
semelhantes aos da gripe. Em estados mais avançados da doença pode ocorrer artrite, cardite bem como
manifestações neurológicas e dermatológicas. A borreliose de Lyme pode ser tratada com antibióticos em
todas as fases. Assim sendo, um diagnóstico laboratorial de borreliose, seguro e sensível, com capacidade
de detectar os estados mais precoces da doença, é da maior importância, uma vez que o tratamento
precoce é o mais conveniente.
Os anticorpos IgM aparecem normalmente três semanas após a infecção, os anticorpos IgG após quatro a
seis semanas. A resposta imunitária precoce é principalmente direccionada contra a região de 14 kDa da
flagelina e contra a OspC (Proteína C da Superfície externa – Outer surface protein C). Normalmente a fase
aguda é indicada pelos elevados títulos de anticorpos IgM. Os título elevados de IgG podem ocorrer com ou
sem a presença de anticorpos IgM quando a borreliose está em declínio (devido a terapia ou
espontaneamente) ou durante a fase crónica. A realização do teste Borrelia IgG ELISA é importante
especialmente para detectar a borreliose mesmo em casos com títulos de 14 kDa + OspC negativos e para
monitorizar o estado imunitário.
O teste Borrelia IgG ELISA utiliza o antigénio VIsE recombinante muito específico da Borrelia burgdorferi e
uma mistura de antigénios lisados altamente específicos da Borrelia burgdorferi sensu strictu, B. afzelii e B.
garinii, e portanto determina anticorpos IgG com elevada especificidade e sensibilidade.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica
de sandwich. Os poços são revestidos com antigénios. Os anticorpos específicos da amostra ligados ao
antigénio que reveste os poços, são detectados por um anticorpo secundário conjugado com uma enzima
(E-Ab) específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato a intensidade de cor desenvolvida é
proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos. Os resultados das amostras podem ser
determinados directamente utilizando um índice de Cut-off.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de
produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
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Borrelia + VIsE IgG ELISA (RE57201)
PORTUGUÊS
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram
considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto
a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com
potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou
da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos
nas secções correspondentes.
As tiras da microplaca são estáveis até 3 meses depois de separadas, no saco hermeticamente fechado
quando armazenados de 2 a 8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro, Plasma (EDTA)
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade
química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize
amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser
centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento Soro/Plasma/LCR:
Estabilidade Soro/Plasma/LCR:
7.
≤ -20 °C (Alíquotas)
12 meses
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 12 mL
ENZCONJ
1 x 4 x 1.5 mL
CAL A-D
1 x 1.5 mL
CONTROL +
1 x 1.5 mL
CONTROL -
1 x 100 mL
DILBUF
1 x 100 mL
WASHBUF CONC
1 x 15 mL
TMB SUBS
1 x 15 mL
TMB STOP
8.
2-8 °C
5 dias
Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos.
Conjugado Enzimático
Pronto a usar. Colorido verde. Contêm: anti-humano IgG, conjugado com
peroxidase.
Padrão A–D
2; 10; 50; 200 U/mL
Standard B = Cut-off Standard
Pronto a usar. Contêm: IgG anticorpos contra B. burgdorferi, estabilizantes.
Controlo Positivo
Pronto a usar. Contêm: IgG anticorpos contra B. burgdorferi, estabilizantes.
Controlo Negativo
Pronto a usar. Contêm: Soro humano, estabilizantes.
Tampão de Diluição
Pronto a usar. Cor azul.
Tampão de Lavagem, Concentrado (10x)
Contêm: tampão fosfato.
Solução de Substrato TMB
Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes.
Solução de Paragem TMB
Pronto a usar. 1 M H2SO4.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 10; 100; 1000 µL
(ajustável)
2. Vortex
3. Tubos (≥ 1 mL) para diluição de amostras
4. Incubador, 37 °C
5. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
6. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
7. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de
referência 600-650 nm)
8. Água bidestilada ou bi-destilada
9. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
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9.
PORTUGUÊS
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de
pipetagem.
5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
7. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. Preparação de componentes liofilizados
Diluir /
dissolver
Componente
100 mL
WASHBUF
CONC
juntar
1000 mL
Diluente
Relação
Observações
Armazenamento
Estabilidade
agua
bidest.
1:10
Desfazer cristais
a 18-25°C.
2-8 °C
2 meses
10.2. Diluição de Amostras
10.2.1. Soro, Plasma
Amostra
diluir
com
Relação
Observações
Soro,
geralmente
DILBUF
1:101
p.ex. 10 µL + 1 mL
Plasma
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas.
10.2.2. Soro/LCR
Para diagnóstico no líquido cefalorraquidiano (LCR) de acordo com Reiber, é necessário utilizar
aproximadamente as mesmas concentrações ou índices de Cut-off (ICO) no intervalo de DO de 1.0 a 0.1
para soro e LCR. Isto é normalmente garantido com as seguintes diluições:
Amostra
A ser diluída
com
Rezão
Notas
Soro
geralmente
DILBUF
1:101
p.ex. 10 µL + 1 mL
LCR
geralmente
DILBUF
1:4
50 µL + 150 µL
Os índices de Cut-off são corrigidos pelos factores de diluição de cada diluição em relação à diluição 1:101:
O índice de Cut-off para a diluição de soro de 1:401 deve ser multiplicada por 4 e a diluição do LCR de 1:4
deve ser dividida por 25.
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PORTUGUÊS
Deverão ser executadas uma série de diluições, se os resultados das amostras não estiverem no intervalo
de 2.0 a 0.3 DO. São recomendadas as seguintes diluições:
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
Soro
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
LCR
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Dispense 100 µL de cada Padrão, Controlo e amostra diluída nos respectivos poços. Para o teste
qualitativo só é utilizado o Padrão B (Padrão de Cut-off).
Incubar 1 h a 37°C. Utilize folha adesiva ou câmara húmida.
Retire a folha. Elimine a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Solução de
Lavagem. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
Dispense 100 µL do Conjugado Enzimático em cada poço.
Incube durante 30 min a 37ºC. Utilize folha adesiva ou câmara húmida.
Retire a folha. Elimine a solução de incubação. Lave a placa 3x com 300 µL de Solução de
Lavagem. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
Para adicionar o Substrato e a Solução de Paragem, utilize, se possível, uma micropipeta de 8
canais. A pipetagem deve ser efectuada nos mesmos intervalos para o substrato e para a solução
de paragem. Utilize a pipetagem positiva e evite a formação de bolhas.
Dispense 100 µL de Solução de Substrato TMB em todos os poços.
Incube 30 min à TA, no escuro.
Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB em todos os poço.
Agite ligeiramente a placa para misturar brevemente o seu conteúdo.
Meça a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (comprimento de onda de referência:
600- 650 nm) até 60 min após a adição da Solução de Paragem.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além
disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis
equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de
acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de
aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é
válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em
ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
A avaliação do teste pode ser realizada qualitativamente ou quantitativamente.
13.1. Avaliação qualitativa
O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a
partir das densidades ópticas médias da amostra e do valor do cut-off. Se a densidade óptica da amostra
estiver num intervalo de 10 % á volta do valor de cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada
como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas.
Exemplo típico:
Cut-off = DO (Padrão B, padrão cut-off) = 0.45
DO amostra = 0.60
Índice cut-off (COI): 0.60 / 0.45 = 1.33. A amostra é positive.
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PORTUGUÊS
13.2. Avaliação quantitativa
As DOs dos padrões obtidas (eixo dos y, linear) são colocadas em gráfico face à sua concentração (eixo
dos x, logaritmo), quer em papel semi-logarítmico ou utilizando um método automático. Um bom ajuste é
conseguido utilizando interpolação cubic spline, 4 parâmetros ou Logit-Log.
Para o cálculo da curva de calibração deve usar todos os sinais dos padrões (pode ser omitido um outlier
óbvio e pode ser usado o valor único mais plausível).
A diluição inicial foi tida em consideração quando são lidos os resultados do gráfico. Os resultados de
amostras com uma pré-diluição superior devem ser multiplicados pelo factor de diluição.
As amostras que evidenciam concentrações acima do padrão mais alto devem ser diluídas como descrito
nas INSTRUÇÕES DE PREPARAÇÃO PRÉVIA DO TESTE e novamente testadas.
(OD)
2.500
Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
U/mL
DO Média
A
2
0.008
B
10
0.267
C
50
1.097
D
200
2.114
Borrelia + VlsE IgG ELISA
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1
14.
10
100
1000
(U/mL)
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Método
Quantitativa
(Curva Padrão):
Qualitativa
(Índice de Cut-off,
COI):
Intervalo
> 11 U/mL
9 – 11 U/mL
< 9 U/mL
> 1.1
0.9 – 1.1
< 0.9
Interpretação
positivo
limite
negativo
positivo
limite
negativo
Os resultados por si só não
devem ser a única razão para
qualquer acção terapêutica e
deverão ser correlacionados
com
outras
observações
clínicas
e
testes
de
diagnóstico.
No caso de resultados de IgG negativos com resultados de Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA negativos,
uma borreliose aguda é improvável. No entanto, uma infecção recente não pode ser totalmente excluída se
a amostra for colhida antes de três semanas após a infecção porque nesse período não há a formação de
anticorpos específicos. Se a amostra for positiva para IgM, o resultado indica uma borreliose aguda em fase
inicial de infecção que requer terapêutica.
Os resultados de IgG equívocos ou no limite acompanhados de resultados de Borrelia 14kDa + OspC
IgM ELISA positivos ou negativos podem ocorrer em situações de infecção tardia ou crónica bem como
estimulação de anticorpos policlonais causados por outras infecções. Uma estimulação policlonal pode ser
excluída com uma análise por Western Blot da amostra em causa utilizando borreliae tratada por ultra-sons.
Os resultados no limite (equívocos) devem ser confirmados após 14 dias. No caso de uma borreliose os
títulos de IgG serão praticamente constantes nesse período de tempo, enquanto que em respostas
imunitárias policlonais os títulos diminuirão nesse tempo.
Os resultados de IgG positivos com resultados de Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA positivos ou
equívocos são indicadores de uma infecção aguda persistente com necessidade de terapêutica.
Especialmente títulos muito elevados de IgG, acompanhados de resultados de IgM negativos, são típicos
de uma reacção inespecífica causada por estimulação policlonal. Estas reacções diminuem dentro de 2 a 3
semanas como em cima descrito e por isso a amostra deve ser testada duas ou três semanas depois. Uma
amostra positiva também deve ser confirmada por Western Blot.
O teste Borrelia IgG ELISA mostra elevada sensibilidade e especificidade para a detecção da
infecção por Borrelia burgdorferi devido à utilização do antigénio VIsE recombinante muito específico da
Borrelia burgdorferi combinado com uma mistura de antigénios da Borrelia burgdorferi sensu strictu, B.
afzelii e B. garinii. Com esta combinação são detectadas as fases iniciais da infecção por Borrelia bem
como as infecções crónicas ou persistentes com elevada sensibilidade e especificidade.
O teste Borrelia IgG ELISA também é adequado para o controlo de seguimento do sucesso da
terapêutica. Neste caso deve ser tido em consideração que os títulos de anticorpos não diminuem
significativamente até 2 – 4 meses após a infecção estar curada.
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15.
PORTUGUÊS
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/- 20% do esperado nos
resultados do teste até às concentrações descritas em baixo:
Hemoglobina
Bilirrubina
Triglicéridos
16.
2.0 mg/mL
0.3 mg/mL
2.5 mg/mL
DESEMPENHO
Grupo de Pacientes
Especificidade Analítica
(Reactividade Cruzada)
Precisão
Intra-Ensaio
n = 24
Inter-Ensaio
n = 20
Linearidade
Especificidade rel.:
Comparação do método
versus Immuno Blot
Sensibilidade rel.:
Comparação do método
versus Immuno Blot
Comparação do ensaio
Automação
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Resultados Negativos /
amostras positivas/testadas
16/16
6/7
9/9
13/14
10/12
5/6
Lues (Treponema pallidum)
Factor Reumatóide positivo
CRP elevado
CCP IgG positivo
Uric acid elevado
ANA positivo
Intervalo COI / U/mL
CV (%)
< 1 / < 10
7
> 1 / > 10
4
0.6 / 7
5.3
1.7 / 17
4.3
4.4 / 64
5.9
6.9 / 170
8.8
Intervalo (DO) Intervalo de diluição em série
1.0 – 0.1
1:4 – 1:32
Borrelia afzelii IgG Blot
IBL-Assay
positivo
negativo
total
positivo
14
5
0
negativo
0
279
279
total
14
284
298
Borrelia recombinant IgG Blot +
Borrelia afzelii IgG Blot
IBL-Assay
positivo
negativo
total
positivo
32
4
36
negativo
2
20
22
total
34
24
58*
Amostras
n
IBL-Assay
Intervalo (%)
100 – 130
Especificidade rel.
98.3 %
Sensibilidade rel.
94.1 %
Ensaio
Ensaio
Competitivo 1 Competitivo 2
positivo
49 %
30 %
33 %
ECM
116
limite
0
3%
2%
Neuropositivo
74 %
68 %
58 %
38
borreliose
limite
0
3%
0
Este teste foi validado com, p.ex., BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols)
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O teste ELISA para a IgG foi realizado com soro e LCR em 5 diluições
apropriadas cada: Soro 1:100 – 1:1600 e LCR 1:2 – 1:32. Os pares Soro/LCR
foram colhidos no mesmo dia e a determinação foi baseada no programa de
avaliação do Prof. Reiber. Para a avaliação foram colhidos pares soro/LCR com
Determinação LCR
produção específica de IgG para a doença de Lyme com ou sem taxa de difusão
patológica de sangue para o cérebro. Todos os resultados do teste ELISA IBL
estiveram de acordo com os sintomas clínicos e os resultados dos testes de
referência.
* amostras positivas no teste comparador.
17.
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(in Englisch via Internet unter DGHM.org oder NRZ-Borrelien.LMU.de).
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Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
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In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
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luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
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Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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