isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
DEIZE RAQUEL DOS REIS CRUZ
ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO
PARCIAL DA LECTINA DE FOLHAS DE Bauhinia cheilantha
(BONGARD) STEUDEL, NATIVA DO BIOMA CAATINGA
Petrolina-PE
2015
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Vale do São Francisco – UNIVASF, campus
Petrolina, como requisito para a obtenção do título
de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.
Área
de
concentração:
Química
e
biológica.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Pereira Felix
Petrolina-PE
2015
atividade
C957i
Cruz, Deize Raquel dos Reis.
Isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de
folhas de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do
bioma caatinga / Deize Raquel dos Reis Cruz—Petrolina, 2015.
89p.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido)
- Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus
Petrolina, Petrolina-PE, 2015.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Pereira Felix
1. Bauhinia cheilantha – Purificação. Caracterização parcial.
2. Lectina - Propriedades. 3. Caatinga – Recursos naturais. 4. I.
Universidade Federal do Vale do São Francisco. II. Felix,
Wagner Pereira. III. Título.
CDD 581.5
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas
da UNIVASF.
Bibliotecária: Maria Betânia de S. da Silva – CRB4-1747.
Dissertação apresentada como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais
do Semiárido, pela Universidade Federal do Vale do
São Francisco.
Aprovado em ______/_______/______
__________________________________
Prof. Dr. Wagner Pereira Felix
Orientador (UNIVASF)
_______________________________
Prof. Dr. Dráulio Costa da Silva
Examinador externo (UNIVASF)
___________________________________
Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira
Examinador externo (UNIFOR)
“Não te mandei eu? Esforça-te e tem
bom ânimo; Não te atemorizes, nem te
espantes; porque o Senhor teu Deus está
contigo, por onde quer que andares”.
(Bíblia Sagrada, Josué 1:9).
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a Deus, minha força, meu rochedo e minha fortaleza, por
me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as
dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e suprir todas as minhas
necessidades.
À minha mãe, que sempre esteve ao meu lado orando para que os planos de Deus
se cumprissem em minha vida.
Ao meu pai (vivo em minhas lembranças), pelo seu amor incondicional, proteção e
incentivo, por ser uma pessoa de coração puro e simples que ajudou a construir meu
caráter. Obrigada pelos momentos maravilhosos que Deus nos permitiu, mesmo
com todas as dificuldades enfrentadas. Amo-te mais que tudo nessa vida!
Aos meus irmãos, especialmente Benita e Renato, pelo amor, carinho e incentivo.
À minha cunhada Jeane e ao meu irmão Nairo, pelo amor e orações.
À minha cunhada e amiga Eliana, por estar sempre presente em todos os momentos
da minha vida.
Ao meu querido Humberto Marçal, por seu amor, carinho, compreensão, e pelas
palavras de incentivo e conforto nos momentos de tribulação.
Ao meu amigo, orientador e colega de trabalho, professor Dr. Wagner Pereira Felix,
a quem serei grata eternamente pelos ensinamentos, confiança, amizade, apoio e
orientação. Pelos valiosos conselhos e tempo dedicado a mim. Todos os seus
ensinamentos foram de grande valia para meu crescimento pessoal e profissional.
À professora Dra. Ana Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, por ter me recebido tão
bem em seu laboratório na UNIFOR e, com tanta gentileza, ter me orientado com
relação às minhas dúvidas. Seus ensinamentos e colaboração foram importantes
para a finalização deste trabalho.
Ao Professor Dr. Renato de Azevedo Moreira pelo apoio e ensinamentos no período
que estive em Fortaleza e pela disponibilidade em participar da banca examinadora
desta dissertação.
Ao professor Dr. Dráulio Costa da Silva, por aceitar o convite para participar da
banca examinadora.
Ao Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho, pela identificação botânica da espécie.
Ao Dr. Frederico Moreno (Pepeu), pela contribuição nas análises de espectrometria
de massas. Agradeço também a Marina Lobo, pela ajuda e disponibilidade nessa
parte da pesquisa.
À equipe do Laboratório de Bioquímica- CCA, Cárita, Isabel, Láyla, Laís, Thaís,
Vitor, Wiliam e João, que sempre se colocaram disponíveis para auxiliar na
execução desse projeto.
Aos meus queridos, Yasmin e Adijailson pela amizade, carinho, palavras de conforto
e participação na correção do texto deste trabalho.
Aos professores do colegiado de Pós-graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, por terem proporcionado momentos gloriosos na aprendizagem.
À UNIVASF, por ter disponibilizado o curso e me proporcionado esse titulo de
Mestre.
Ao pessoal do Laboratório de Genética da UNIVASF- CCA, pela disponibilização de
materiais e equipamentos que foram importantes na realização dos experimentos.
Ao professor Aldrin Silva e aos veterinários Alane, Felipe e Wasley, pelas coletas de
sangue dos animais.
Às minhas amigas de longa data, Elisangela Cordeiro e Eliatania Costa, pela
amizade, carinho, força, incentivo, momentos de descontração e pela participação
direta nas correções do texto deste trabalho.
À Rosangela, Erivando, Levi e Lucas, família maravilhosa que me acolheu tão bem
em Fortaleza a quem eu vou agradecer eternamente.
À Maria Forte e Edu pelo apoio e momentos de alegria nos dias que estive em
Fortaleza.
Às amigas, Scheila, Poliana, Geórgia, Jaqueline, Keyte, Bethy, Adriana, Eliane,
Bruna, Thaíse, Ana Paula, Amanda e Sandra pela amizade verdadeira e pelos
momentos de descontração, os que passaram e os que ainda virão!
Às minhas colegas de mestrado, pela solidariedade nos momentos de incerteza e
ansiedade e pela alegria compartilhada nos nossos encontros.
Aos meus novos amigos de Fortaleza, Rogênio, Hyldecia, Rossueti, Fernanda,
Camilo, Taís, Márcio, Vinícius e, especialmente a Felipe Sousa, que, com
ensinamentos, ajuda e amizade, contribuiu bastante para a finalização deste
trabalho.
RESUMO
Lectinas estão amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em seres
unicelulares, animais e vegetais. Em vegetais, as lectinas são frequentemente
isoladas de sementes, principalmente das leguminosas. Elas também podem ser
encontradas em outras partes da planta, como por exemplo, em folhas, mas a
extração proveniente destas ainda é pouco explorada. Desta forma, estudos foram
realizados em extratos foliares com a Bauhinia cheilantha, para avaliar as
propriedades físico-químicas e biológicas da sua lectina, denominada BcL. Das
extrações obtidas em diferentes valores de pH, observou-se que a melhor solução
tampão de extração proteica foi o Tris- HCl 0,1M pH 7,8, pois o Extrato Bruto
preparado com esse tampão apresentou uma maior atividade hemaglutinante.
Lectina de B. cheilantha foi purificada por cromatografia de afinidade numa matriz de
galactomanana reticulada de cadeia principal constituída de D-manose com
ramificações de D-galactose. A homogeneidade da lectina foi demonstrada por SDSPAGE na presença e ausência de β-mercaptoetanol, apenas uma banda de proteína
com uma massa molecular aparente de 32 kDa foi observada. A amostra foi
analisada por espectrometria de massa usando MALDI-TOF e o espectro de
peptídeos foi analisado por bases de dados do programa MASCOTE. O perfil dos
peptídeos trípticos revelou homologia com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia
simplicifolia de massa molecular 28,351 kDa. A BcL mostrou especificidade por Dgalactose e D-lactulose. Nos ensaios de hemaglutinação, observou-se que essa
proteína aglutina fortemente eritrócitos de coelho e é termoestável mantendo sua
atividade hemaglutinante mesmo após incubação a 60°C durante 30min. Ela
também foi resistente a uma ampla faixa de pH, e não necessita de íons metálicos
Ca2+ e Mn2+ para exercer sua atividade hemaglutinante.
Na atividade
antimicrobiana, verificou-se que a lectina de B. cheilantha não apresentou atividade
inibitória frente às cepas Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli.
Palavras-chave: Bauhinia cheilantha. Lectina. Purificação. Caracterização parcial.
ABSTRACT
Lectins are widely distributed in the nature being found in unicellular beings, animal
and vegetable. In plants, lectins are often isolated from seeds, particularly legumes.
They can also be found in other plant parts, such as leaves, but the extraction from
these still little bit explored. Therefore, studies were performed on leaf extracts with
the Bauhinia cheilantha to evaluate the physicochemical and biological properties of
a lectin, known BcL. From the extractions obtained in different values of pH observed
that the best buffer of proteic extraction was the Tris-HCl 0.1M pH 7.8 because the
Crude Extract prepared with that buffer showed a great hemagglutinating activity.
The lectin from B. cheilantha was purified for affinity chromatography on cross-linked
galactomannan matrix, which containing terminal D-galactose, with main chain
compound of D-mannose. The homogeneity of the lectin was demonstrated by SDSPAGE in the presence and absence of β-mercaptoethanol, so only one proteic band
with an apparent molecular mass of 32 kDa was observed. The sample was
analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF and the spectrum of peptides was
analyzed by MASCOT program databases. The tryptic peptides profile revealed
homology with the chain A of lectin IB4 from Griffonia simplicifolia, molecular mass of
28,351 kDa. The BcL demonstrated specificity for D-galactose and D-lactulose. In the
hemagglutination assays, it could observe this protein agglutinates strongly rabbit
erythrocytes and it is thermostable maintaining its hemagglutinating activity even
after incubation to 60°C during 30 min. it was also resistant to a wide pH variation
and does not need of metallic ions Ca2+ and Mn2+ to execute its hemagglutinating
activity. In the antibacterial activity, it verified that the lectin from B. cheilantha did not
show inhibitory activity on the strains of Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli.
Key-words: Bauhinia cheilantha. Lectin. Purification. Partial characterization
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Interações da lectina com carboidrato na superfície celular
mediam
interações
célula-célula
e/
ou
célula-matriz
extracelular através do reconhecimento específico de
glicoconjugados.......................................................................
Figura 2 -
Foto
da
espécie
Bauhinia
cheilantha
23
(Bongard)
Steudel.....................................................................................
31
Figura 3 -
Distribuição geográfica de B. cheilantha no Brasil................... 31
Figura 4 -
Purificação da lectina de B. cheilantha por cromatografia de
afinidade em galactomanana...................................................
Figura 5 -
Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida- SDS da lectina
purificada de B. cheilantha (32kDa)........................................
Figura 6 -
45
48
Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da
lectina de folhas de B. cheilantha (BcL)................................... 50
Figura 7 -
Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina de
folhas de B. cheilantha (BcL)...................................................
Figura 8 -
51
Sequência de aminoácidos de Griffonia simplicifolia. Em
vermelho está o peptídeo homólogo a lectina de BcL (p < ,,,,,,,,,
0,05).........................................................................................
53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Atividade Hemaglutinante (AH) dos Extratos Brutos (EB)
preparados
com
tampões
de
diferentes
valores
de
pH......................................................................................
Tabela 2 -
42
Atividade Hemaglutinante (AH) do EB com diferentes
eritrócitos.................................................................................. 43
Tabela 3 -
Inibição da Atividade Hemaglutinante da F0-90% de B.
cheilantha por carboidratos ..................................................... 43
Tabela 4 -
Purificação da lectina de Bauhinia cheilantha ......................... 47
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 -
Funções das lectinas...............................................................
24
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AH: Atividade Hemaglutinante
AHE: Atividade Hemaglutinante Específica
AHT: Atividade Hemaglutinante Total
ATCC: American Type Culture Collection
BcL: Lectina de Bauhinia cheilantha
BHI: Brain Heart Infusion
BSA: Albumina Sérica Bovina
BUL: Lectina de Bauhinia ungulata
Ca2+:Cátion divalente de Cálcio
CIM: Concentração Inibitória Mínima
Con A: Concanavalina A
CRD: Domínio de reconhecimento de carboidrato
EB: Extrato Bruto
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
ESI: Ionização por Electrospray
HCl: Ácido Clorídrico
HDL: Lipoproteínas de Alta Densidade
HVASF: Herbário Vale do São Francisco
kDa: Kilodalton
M: concentração Molar (Mol.L-1)
MaxEnt: Entropia máxima
Mn2+: Cátion divalente de Manganês
MS: Espectrometria de Massas
NaCl: Cloreto de sódio
NI: Não Inibidor
OH: grupo Hidroxila
pH: Potencial Hidrogeniônico
PHA: Lectina de Phaseolus vulgaris
PI: Primeiro Pico
PII: Segundo Pico
PVPP: Polivinilpolipirrolidona
SDS: Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Tris: Tris-(hidroximetil)-aminometano
UH.mL-1: Unidade de Hemaglutinação por Mililitro
WGA: Lectina de Germe de Trigo
OBS: as abreviaturas e os símbolos utilizados neste trabalho e que não constam
nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas
universalmente.
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO
2.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
23
2.1
Lectinas
23
2.2
A interação lectina-carboidrato resulta em diferentes efeitos biológicos
25
19
2.2.1 Atividade antitumoral das lectinas de planta
25
2.2.2 Atividade antimicrobiana e antifúngica das lectinas de plantas
25
2.2.3 Atividade inseticida das lectinas de plantas
26
2.3
Classificação quanto ao sítio de ligação para carboidratos
26
2.4
Considerações sobre a família Fabaceae
27
2.5
Aspectos gerais do gênero Bauhinia
28
2.6
Considerações sobre a espécie Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud
30
3.
OBJETIVOS
33
3.1
Geral
33
3.2
Específicos
33
4.
MATERIAL E MÉTODOS
35
4.1
Coleta do material vegetal
35
4.2
Obtenção do Extrato Bruto (EB)
35
4.3
Precipitação com Sulfato de Amônio
35
4.4
Eritrócitos
36
4.5
Determinação da Atividade Hemaglutinante
36
4.6
Determinação da concentração de proteínas
36
4.7
Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares
37
4.8
Purificação da BcL
37
4.9
Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
38
4.10 Efeito da temperatura
38
4.11 Efeito do pH
38
4.12
Efeito do EDTA e de Cátions Divalentes sobre a Atividade Hemaglutinante
38
4.13 Avaliação de presença de glicídios constituintes
39
4.14 Atividade Antimicrobiana
39
4.14.1 Determinação de concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus, 39
Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli.
4.15 Espectrometria de Massa
40
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
42
5.1
Determinação da atividade Hemaglutinante (AH)
42
5.2
Inibição da Atividade Hemaglutinante por açúcares
43
5.3
Purificação da BcL
45
5.3.1 Cromatografia de Afinidade
45
5.3.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
48
5.4
Avaliação de presença de glicídios constituintes
49
5.5
Estabilidade da BcL frente a diferentes fatores
49
5.5.1 Efeito da temperatura
49
5.5.2 Efeito do pH na atividade hemaglutinante da lectina
50
5.5.3 Efeito de cátions divalentes na atividade hemaglutinante da lectina
51
5.6
52
Atividade antimicrobiana
5.6.1 Determinação de Concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli.
52
5.7
Espectrometria de Massa
52
6
RESUMO DOS RESULTADOS
55
7
CONCLUSÕES
57
REFERÊNCIAS
59
APÊNDICE
71
1. INTRODUÇÃO
CRUZ, D. R. R. Isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas de Bauhinia
cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma Caatinga.
19
1. INTRODUÇÃO
Proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células. Elas ocorrem
em todas as células vivas e em todas as partes das mesmas relacionando-se
praticamente com todas as funções fisiológicas. Quimicamente, as proteínas são
polímeros de alta massa molecular, cujas unidades básicas são os aminoácidos,
ligados entre si por ligações peptídicas (LEHNINGER; NELSON; COX, 2000). Entre
os milhares tipos de diferentes proteínas encontram-se as lectinas, que são
proteínas ou glicoproteínas de origem não imune, com pelo menos um domínio não
catalítico, aglutinantes de células e glicoconjugados, com capacidade de ligar-se
reversivelmente a mono/oligossacarídeos específicos através de ligações de
hidrogênio e interações de Van der Waals sem alterar a estrutura covalente destes.
(LANNOO; VAN DAMME, 2010; LIS; SHARON, 1998; PEUMANS; VAN DAMME,
1995).
A primeira lectina de planta foi descoberta em 1888 pelo estudante de medicina
Hermann Stillmark quando estudava a mamona (Ricinus communis L.). Em seus
experimentos, constatou a presença de um fator proteico tóxico em extratos dessa
planta que também aglutinava eritrócitos de diferentes animais. Para indicar a fonte
dessa proteína, o nome ricina foi adotado (PEUMANS; VAN DAMME, 1998;
SHARON; LIS, 2004). Esse fato é considerado o verdadeiro ponto de partida da
investigação sobre lectinas de plantas. Sharon e Lis (2004) relataram que em 1889
Hellin descreveu em sua tese de doutorado na Universidade de Dorpat (atual Tartu,
Estônia) uma nova hemaglutinina tóxica, a abrina, encontrada nos extratos de
sementes de feijão jequiriti (Abrus precatorius) que também era capaz de aglutinar
hemácias. Poucos anos depois, Paul Ehrlich utilizando ricina e abrina em estudos
imunológicos estabeleceu os fundamentos da Imunologia básica (KENNEDY et al.,
1995).
Outro fato histórico marcante ocorreu em 1907 quando Landsteiner e
Raubitschek descobriram a presença de aglutininas não tóxicas em sementes de
Lens culinaris (lentilha), Phaseolus vulgaris (feijão comum), Vicia sativa e Pisum
sativum (ervilha). A partir daí, muitas outras hemaglutininas atóxicas foram
descobertas com o passar dos anos, tornando-se claro que as lectinas de plantas
são comuns no reino vegetal (SOL et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2012).
20
Segundo Sharon e Lis (2004), James B. Sumner, em 1919, purificou pela
primeira vez uma proteína de Canavalia ensiformis e a nomeou de Concanavalina A
(Con A), e foi apenas em 1936, juntamente com Howell atestaram que essa proteína
era capaz de aglutinar hemácias e alguns fungos. A especificidade da lectina ao
carboidrato foi revelada pela primeira vez quando observaram em seus
experimentos que a hemaglutinação por Con A foi inibida por sacarose.
Em 1940, Boyd constatou que extratos de Phaseolus limensis e Vicia craca
aglutinavam seletivamente eritrócitos humanos do tipo A, mas não do tipo B ou O, já
os extratos de Lotus tetragonolobus, aglutinava especificamente eritrócitos do tipo O.
Essa descoberta pode ser considerada um marco na história das lectinas de plantas
(SHARON; LIS, 2004).
Em 1960, Peter Nowell descobriu que a lectina de Phaseolus vulgaris (PHA)
possui atividade mitogênica, esse fato causou um impacto revolucionário na
imunologia e fez com que novas pesquisas fossem realizadas nesse sentido, sendo
então possível utilizar as lectinas como ferramentas para o estudo da interação entre
células e análise de eventos bioquímicos que ocorrem durante a estimulação de
linfócitos in vitro (BRANDO-LIMA et al., 2006).
AUB e colaboradores (1963; 1965) relataram que a aglutinina de germe de trigo
(WGA) tem a habilidade de aglutinar preferencialmente células malignas e isso levou
a acreditar que as mudanças nos açúcares da superfície celular estão associadas ao
desenvolvimento de câncer e, consequentemente, a uma alta probabilidade dessas
células serem reconhecidas por lectinas.
A capacidade desta classe de proteína em distinguir entre eritrócitos de
diferentes tipos sanguíneos levou Boyd e Shapleigh (1954), a nomeá-las de lectinas,
termo derivado do latim lego que significa selecionar, escolher.
Como já relatado, as primeiras lectinas foram isoladas a partir de plantas, e até
hoje, esta classe de proteínas provenientes de vegetal ainda estão entre as mais
estudadas, destacando-se as pertencentes à Fabaceae, que compreendem um
amplo grupo de proteínas estruturalmente similares, que apesar do seu elevado grau
de homologia, apresentam distintas atividades biológicas. A maior parte dos
estudos, no entanto, se concentra na subfamília Papilionoideae, estando estes
escassos na subfamília Caesalpinoideae, da qual faz parte a espécie Bauhinia
cheilantha.
21
Diante da imensa riqueza vegetal presente nos solos brasileiros, principalmente
no bioma Caatinga, e dos poucos estudos químicos e biológicos das espécies
endêmicas desse bioma exclusivamente brasileiro, este trabalho relata o isolamento,
purificação e caracterização parcial da lectina de folhas de Bauhinia cheilantha
(Bongard) Steudel, espécie nativa do bioma Caatinga, no qual foi possível obter
informações relevantes a respeito das propriedades físico-químicas e atividade
biológica dessa proteína que ainda não possui estudos referenciados na literatura.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
23
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Lectinas
Lectinas são consideradas um grupo heterogêneo de proteínas oligoméricas
que variam em suas estruturas, entre os sítios de ligação a carboidratos, tamanho e
organização molecular (CAMACHO, 2007). Estão amplamente distribuídas na
natureza, sendo encontradas em seres unicelulares (IMBERT et al., 2004), animais
(MOURA et al., 2006) e vegetais (LEITE et al., 2005) Em vegetais, as lectinas são
frequentemente
isoladas
de
sementes,
principalmente
das
leguminosas
(FERNANDES et al., 2011) como também de raízes ( SOUZA et al., 2011), folhas
(SILVA, et al, 2010), tubérculos (KAUR et al., 2006) e cerne (SÁ et al., 2008). Esta
ampla distribuição reflete uma multiplicidade de funções biológicas, algumas
mostradas no Quadro 1, que estão relacionadas à sua habilidade de reconhecer
carboidratos e glicoconjugados na superfície celular (Figura 1). O estudo de suas
propriedades biológicas tem sugerido importantes aplicações biotecnológicas, dentre
estas aplicações, destaca-se a identificação de receptores de membrana e a
detecção de estruturas características de neoplasias (LIS; SHARON, 1998).
Figura 1 - Interações da lectina com carboidrato na superfície celular mediam interações
célula-célula e/ ou célula-matriz extracelular através do reconhecimento específico de
glicoconjugados.
Fonte: Baseado no diagrama original de BioCarbAB (Adaptado de SHARON; LIS, 2004).
24
Quadro 1- Funções das lectinas
Lectinas
Papel biológico
MICRORGANISMOS
Ameba
Infecção
Bactéria
Infecção
Vírus da Influenza
Infecção
PLANTAS
Várias
Defesa
Leguminosas
Simbiose com bactérias fixadora de Nitrogênio
ANIMAL
Calnexina, Calreticulina, ERGIC53
Controle de biossíntese de glicoproteínas
Colectinas
Imunidade
Dectinas- 1
Imunidade
Regulação das células de crescimento e
Galectinas
apoptose; regulação dos ciclos celulares,
modulação célula-célula e interação substrato
célula.
Selectina-L
E-selectina e P-selectina
Siglec
Espermadesinas
Fonte: SHARON; LIS, 2004.
Direcionamento de linfócitos
Carregamento de linfócitos para o local de
inflamação
Interação célula-célula no sistema imunológico
e nervoso
Interação espermatozoide/oócito
25
2.2. A interação lectina-carboidrato resulta em diferentes efeitos biológicos
2.2.1. Atividade antitumoral das lectinas de planta
Lectinas de planta são amplamente utilizadas como sondas na histoquímica
para caracterizar vários tipos de células em vários estágios de diferenciação e
maturação de câncer (CAMPBELL; SAMPATHKUMAR; YAREMA, 2007; JIM´ENEZCASTELLS et al., 2006; RÊGO et al., 2013; SOBRAL et al., 2010). Foi confirmado
que elas contribuem para o reconhecimento de células tumorais (marcadores de
superfície), para a estimulação mitogênica, localização e adesão celular, apoptose
(“morte celular programada‖), transdução de sinal através das membranas e
citotoxicidade (HAMID et al., 2013). Estudos recentes comprovam cada vez mais os
importantes papéis desempenhados por essas proteínas. Uma lectina isolada a
partir de sementes de Lotus corniculatus apresentou atividade anticarcinogênica
(RAFIQ et al., 2013). Vega e Pérez (2006) estudaram a lectina de sementes de
Salvia bogotensis que mostrou alta afinidade por antígenos de células tumorais e
pode ser usada como ferramenta para estudos imunohistoquímicos e celulares,
enquanto Maciel e colaboradores (2012) purificaram a lectina da casca do caju
(Anacardium occidentale) e concluíram que a mesma pode ser utilizada como matriz
para obtenção de glicoconjugados de interesse biotecnológico.
Estas funções biológicas estão relacionadas à diversidade estrutural das
lectinas e dos carboidratos presentes em células opostas, as quais podem ser do
mesmo tipo ou não.
2.2.2. Atividade antimicrobiana e antifúngica das lectinas de plantas
Lectinas de distintas especialidades podem impedir o crescimento de
microrganismos e/ou serem agentes bactericidas e/ou fungicidas. Estas proteínas
são
dotadas
de
uma
grande
habilidade
em
reconhecer
seletivamente
microrganismos que causam doenças em plantas e no homem, por isso são muito
utilizadas como agente antimicrobiano (SILVA et. al., 2013).
A maioria das lectinas desempenham funções no próprio vegetal que a produz,
tais como função de defesa e interação com glicoconjugados de outros organismos.
Sá e colaboradores (2009) mostraram esse evento quando isolaram uma lectina do
26
cerne de Myracrodruon urundeuva, conhecida como aroeira. Eles avaliaram sua
atividade contra bactérias e fungos que atacam plantas e constataram que essa
lectina tem um papel importante na resistência do cerne de M. urundeuva contra
deterioradores biológicos.
A atividade antifúngica também foi observada na lectina de sementes de Talisia
esculenta (pitombeira) na qual a interação da lectina com as estruturas dos fungos
Fusarium oxysporum, Colletotrichum lindemuthianum e Saccharomyces cerevisiae
inibiu o crescimento dos mesmos (FREIRE et al., 2002). Já Brustein e colaboradores
(2012) avaliaram o efeito antibacteriano da lectina de Eugenia malaccensis no
tratamento da cicatrização de feridas cutâneas em ratos.
2.2.3. Atividade inseticida das lectinas de plantas
Lectinas são as únicas proteínas de plantas que reconhecem e se ligam
especifica e reversivelmente a glicoconjugados presentes na superfície de
microrganismos ou expostos no trato intestinal de insetos, mamíferos e herbívoros.
Esse evento leva a acreditar que elas podem desempenhar importante papel de
defesa na planta. As lectinas ligantes de quitina são as principais responsáveis pelo
mecanismo de defesa das plantas contra o ataque de insetos; interagindo com esse
carboidrato que é um elemento estrutural importante do trato digestivo dos insetos
(LERNER; RAIKHEL, 1992; PEUMANS; VAN DAMME, 1995).
Muitos estudos comprovam essa propriedade, por exemplo, a lectina da folha
de Bauhinia monandra causou mortalidade significativa a Zabrotes subfaciatus e a
Callosobruchus maculatus, quando incorporados em uma dieta artificial (MACEDO et
al., 2007). Isso acontece porque as lectinas interagem com as glicoproteínas e
formam um complexo que provoca no local um efeito deletério (PEUMANS; VAN
DAMME, 1995). Araújo e colaboradores (2012) isolaram a lectina da casca de
Crataeva tapia e mostram que a mesma possui atividades adsorventes e inseticidas.
2.3. Classificação quanto ao sítio de ligação para carboidratos
Lectinas de plantas apresentam semelhanças em sua estrutura, porém
diferenças em sua especificidade de ligação a carboidratos; sendo assim, elas estão
27
subdivididas em cinco grupos de acordo com o monossacarídeo pelo qual elas
apresentam maior afinidade, são eles: D-manose/D-glucose, D-galactose/Nacetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, L-fucose, e ácido siálico (GOLDSTEIN;
WINTER; PORETZ, 1997). Portanto, dependendo da especificidade, a lectina irá
ligar-se seletivamente a um destes açúcares acima que são componentes típicos de
superfícies de células eucarióticas (LIS; SHARON, 1998).
Lectinas ligantes de manose geralmente reagem com glucose e vice-versa,
mas também podem interagir em menor quantidade com N-acetil-glucosamina, esse
evento acontece porque algumas lectinas toleram variações na posição do C2 do
anel piranosídico. Em relação ao C3, poucas variações são toleradas, mas a
configuração do C4, no que se refere à posição do grupo OH é considerada crítica já
que lectinas específicas para glucose/manose não reagem com a galactose e viceversa (ZANETTI, 2007).
As lectinas de plantas podem ser classificadas em sete famílias de proteínas
relacionadas evolutivamente, são elas: as famílias das lectinas de leguminosas,
lectinas com domínio pra heveína, monocotiledôneas ligantes de manose, proteínas
inativadoras de ribossomo tipo 2, lectinas relacionadas à jacalina, amarantinas e
lectinas de floema de Curcubitáceas (VAN DAMME et al., 2004).
2.4. Considerações sobre a família Fabaceae
Fabaceae é uma das principais famílias de angiospermas com mais de
19.000 espécies. No Brasil, é uma das mais diversas e abundantes famílias de
plantas superiores, presente praticamente em todos os seus maiores biomas
(LEWIS et al., 2005). Está representada por três subfamílias muito distintas
(Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae), 36 tribos e aproximadamente
727 gêneros. Tem grande importância econômica, especialmente no setor
farmacológico, medicinal, industrial, madeireiro, ornamental e na produção
alimentícia, além de contribuir bastante para a melhoria de solos agrícolas
(MOURÃO; KARAM; SILVA, 2011).
Lectinas de Fabaceae constituem o grupo mais investigado de lectinas de
plantas, sendo que uma grande parte destas já possuem suas estruturas
tridimensionais bem descritas (SHARON; LIS, 1990; PEUMANS; VAN DAMME,
28
1998).
É bem documentado que essas proteínas diferem bastante no que diz
respeito à sua especificidade de ligação a carboidratos e em suas funções
biológicas, mas apresentam elevada semelhança estrutural, sendo compostas por
duas ou quatro subunidades, idênticas ou ligeiramente diferentes, com massas
moleculares de 25 a 30 kDa e são normalmente constituídas por uma única cadeia
polipeptídica com aproximadamente 250 aminoácidos. Cada subunidade das
lectinas de leguminosas apresenta os íons Ca2+ e Mn2+ que são essenciais para a
atividade de ligação ao carboidrato. Além disso, uma grande parte das lectinas de
leguminosas são glicoproteínas. (SHARON; LIS, 1990; SHARON; LIS, 2002; WEIS;
DRICKAMER, 1996).
2.5. Aspectos gerais do gênero Bauhinia
O gênero Bauhinia está inserido na família Fabaceae.
A subfamília
Caesalpinioideae tem se mostrado parafilética nas principais filogenias abordando
Fabaceae (DOYLE et al., 2000) e por tal razão muitos taxa estão em mudança como
é o caso da tribo Cercideae no qual se encerra o gênero Bauhinia L. Tal gênero é o
maior da tribo sendo composto por árvores e arbustos de distribuição pantropical,
apresenta cerca de 310 espécies organizadas em 22 seções e 30 séries (VAZ;
TOZZI, 2005). No Brasil, existem aproximadamente 98 espécies nativas desse táxon
e por causa do formato de suas folhas, é conhecido popularmente como ―Pata-devaca‖ (CECHINEL FILHO, 2009; VAZ 2001).
As folhas, caules e raízes das plantas desse gênero, são bastante utilizados
em forma de chás e outras preparações fitoterápicas para o tratamento de várias
patologias devido às suas propriedades antibacterianas, antifúngicas, antiinflamatórias e principalmente antidiabéticas (CECHINEL FILHO, 2000; SILVA;
CECHINEL FILHO, 2002).
No Brasil, cresce cada vez mais o interesse pelas espécies do gênero
Bauhinia, uma vez que estudos experimentais têm confirmado as suas propriedades
terapêuticas relatadas. As espécies mais estudadas fitoquimicamente são: B.
manca, B. candicans, B. uruguayensis, B. purpurea, B. forficata e B. splendens, nas
quais vários compostos de interesse medicinal como lactonas, flavonoides,
29
terpenóides, esteroides, triterpenos, taninos e quinonas já foram isolados e
identificados (SILVA; CECHINEL FILHO, 2002).
A B. forficata é utilizada desde muito tempo nas comunidades rurais porque é
capaz de reduzir o índice de glicose no sangue. Esse potencial terapêutico foi
confirmado em estudos clínicos pela primeira vez por Juliane em 1929 (MARQUES
et al., 2013) e continua atraindo cada vez mais a atenção dos pesquisadores. Nesse
sentido, os estudos farmacológicos foram realizados nos extratos de folhas (aquosos
e alcoólicos) dessa espécie, a fim de verificar a atividade antidiabética em diferentes
modelos in vivo (CUNHA et al., 2010; MENEZES et al., 2007; PEPATO et al., 2010).
Outros estudos mostraram que o extrato de B. forficata é útil no tratamento de
diabetes mellitus tipo II após reduzir a taxa de glucose, triglicérides, colesterol total e
HDL em modelo in vivo (LINO et al., 2004).
Da mesma forma, Menezes e colaboradores (2004) relataram que os extratos
aquosos obtidos a partir das folhas de B. monandra e B. forficata apresentaram
atividade hipoglicemiante quando avaliados em camundongos, sugerindo que esta
ação pode estar relacionada com a presença de flavonoides glicosilados. Esta
hipótese é confirmada por estudos recentes que mostram que vários flavonoides
naturais exibem um potencial antidiabético (MORIKAWA, 2007).
Muitas outras espécies de Bauhinia destacam-se pelas suas propriedades
biológicas, entre elas estão a B. purpurea com atividade citotóxica (PETTIT et al.,
2006), B. racemosa com atividades antioxidante, antitumoral, antiúlcera (AKTHAR;
AHMAD, 1995; GUPTA et al., 2004; KUMAR et al., 2005) e a B. variegata com
atividade antitumoral (RAJKAPOOR; JAYAKAR; MURUGESH, 2003).
O estudo fitoquímico recente das folhas e flores de B. purpurea demonstrou
que esta espécie contêm diversos componentes químicos (carboidratos, alcaloide,
esteroides, esteróis, glicosídeos, saponinas, flavonoides, taninos, compostos
fenólicos, proteínas, aminoácidos e óleo fixo) que podem ser aplicados no
tratamento de doenças (MARIMUTHU; DHANALAKSHMI, 2014).
Em relação às lectinas, um grande número já foi isolado e caraterizado a partir
da
família
Fabaceae.
Contudo,
as
lectinas
de
espécies
da
subfamília
Caesalpinioideae ainda estão entre as menos estudadas. O gênero Bauhinia,
pertencente à tribo Cercideae é o principal táxon com o maior número de lectinas
que já foram caracterizadas bioquimicamente. Recentemente, algumas espécies têm
demonstrado atividades biológicas importantes, por exemplo, a lectina das sementes
30
de B. ungulata (BUL) possui atividade antifúngica contra espécies fitopatogênicas e
uma atividade antiproliferativa in vitro contra linhagens tumorais, HT29 (carcinoma
de cólon humano). Estas propriedades são favoráveis para potenciais aplicações
terapêuticas e biotecnológicas dessa proteína (SILVA et al., 2014). A lectina de B.
forficata é atualmente a única lectina de Bauhinia que apresenta propriedades
anticoagulantes e inibe a agregação de plaquetas (SILVA et al., 2012). Já a lectina
extraída das raízes secundárias de B. monandra (BmoRoL) possui potencial
termiticida e fungicida, podendo ser aplicada no controle de pragas agrícolas
(SOUZA et al., 2011).
2.6. Considerações sobre a espécie Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud.
O Brasil possui a maior diversidade biológica do mundo, contando com uma
rica flora, sendo o país com maior potencial para pesquisas com espécies vegetais.
Sua rica biodiversidade está distribuída em seis biomas diferentes (SOUZA;
FELFILI, 2006). O bioma Caatinga é o principal ecossistema do Nordeste brasileiro,
este, possui muitas espécies de plantas que apresentam interesse fitoterápico
(AGRA et al., 2008). Dentre elas, encontra-se a Bauhinia cheilantha (Bongard)
Steudel, espécie alvo deste estudo, típica desse bioma e conhecida popularmente
como mororó.
Essa espécie pertence à série Cansenia que é claramente um grupo definido
por apresentar inflorescência terminal áfila, chamada pseudo-racemo com brácteas
foliáceas, (bráctea floral e respectivas bractéolas), além de grãos de pólen do tipo 3(4-) colpados, ângulo-aperturados. Bauhinia cheilantha, por sua vez, é um complexo
de espécies que pode ser definido por apresentarem estípulas semilunares,
inflorescências parciais muitas vezes com três flores ou vestígios destas; pétalas
obovadas a lanceoladas com margens fimbriadas e glandulosas no dorso (Figura 2
A); coluna estaminal internamente com apêndice laciniados nos bordos, hirsuta
interna e externamente; anteras loceladas (VAZ; TOZZI, 2003).
São árvores silvestres que possuem de 3 a 5m de altura, de caule duro e
casca fibrosa (Figura 2 B). Suas folhas são bilobadas e lembra o rastro da pata de
bovinos (Figura 2 C). Ocorre, de preferência, em solos férteis e argilosos e em
comunidades arbóreo-arbustivas (CAMPANHA; ARAÚJO, 2010). Essa espécie
31
encontra-se distribuída em vários Estados do Nordeste, Minas Gerais, Mato Grosso
e Mato Grosso do Sul conforme mostra a Figura 3.
Bauhinia
cheilantha
tem
importância
econômica
diversificada,
sendo
exploradas pelo valor madeireiro e ornamental; as folhas e ramos novos são
forrageiros, excelentes para a alimentação dos rebanhos (CAMPANHA; ARAÚJO,
2010) É uma espécie bastante utilizada na produção de remédios tradicionais para o
tratamento de diabetes (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007).
Figura 2 – Foto da espécie Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel
FONTE: Autora
Figura 3 - Distribuição geográfica de B. cheilantha ( ) no Brasil.
Fonte: Adaptado de VAZ; TOZZI, 2003.
3. OBJETIVOS
33
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Isolar, purificar e caracterizar parcialmente a lectina de folhas de Bauhinia
cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma Caatinga, de modo a obter
informações relevantes a respeito das propriedades físico-químicas e atividade
biológica.
3.2. Específicos
3.2.1 Determinar a sua especificidade aos carboidratos;
3.2.2 Determinar as características físico-químicas em função dos parâmetros como
pH, temperatura e dependência de cátions divalentes;
3.2.3 Estimar a massa molecular aparente da lectina por SDS-PAGE;
3.2.4. Determinar a massa molecular da lectina por MS;
3.2.5 Avaliar sua atividade antimicrobiana.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
35
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Coleta do Material Vegetal
O material vegetal (folhas) foi coletado no município de Petrolina (9°23'53,1"S
40°29'13,9"W), no Estado de Pernambuco em outubro de 2014. A identificação
botânica foi realizada pelo Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho, sendo a exsicata
depositada no Herbário da UNIVASF (HVASF) da cidade de Petrolina com número
de tombo #2241.
4.2. Obtenção do Extrato Bruto (EB)
As folhas coletadas foram lavadas em água corrente e mantidas em
temperatura ambiente durante 48h. Após a retirada da umidade, as extrações foram
realizadas triturando-se as folhas em triturador com laminas com os tampões glicina
0,1 M pH 2,6, acetato de sódio 0,1M pH 5,0, fosfato de sódio 0,1M pH 6,5, Tris-HCl
0,1M pH 7,8 e borato de sódio 0,1M pH 10,0 na proporção de 1:10 (m/v) a fim de
identificar o meio extrator de melhor eficiência. Após trituração, as suspensões foram
colocadas sob agitação lenta por 1h à temperatura ambiente e em seguida foram
filtradas em gaze dupla. Aos filtrados foram adicionados PVPP 2% (m/v) e βmercaptoetanol 0,1% (v/v) sob agitação por 30min, posteriormente centrifugados a
10.000 g, 30 min, 4°C e filtrados em papel de filtro qualitativo. Os Extratos Brutos
(EB) obtidos foram utilizados para atividade hemaglutinante.
4.3. Precipitação com Sulfato de Amônio
A lectina da folha de Bauhinia cheilantha (BcL) foi extraída a partir de 100 g de
folhas frescas maceradas em 500 mL de tampão Tris- HCl 0,1M pH 7,8, utilizando o
mesmo procedimento descrito acima. O extrato bruto obtido foi fracionado com
sulfato de amônio a 90% de saturação. Após 12h à temperatura ambiente o
precipitado foi separado por centrifugação (10.000 g, 30 min), solubilizado em TrisHCl 50mM pH 7,8 e dialisado contra água, resultando na fração 0/90% (F0/90).
36
4.4. Eritrócitos
Para os ensaios de atividade hemaglutinante foram empregadas amostras de
sangue de coelho, caprino, bovino, equino e ovino coletadas no Setor de Produção
do Campus de Ciências Agrárias da UNIVASF.
Este estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética e Deontologia em
Estudos e Pesquisas da Universidade Federal do Vale do São Francisco, sob o
Protocolo nº 0002/210114.
Os sangues foram coletados através da veia jugular, exceto no coelho, que foi
na marginal da orelha. Em seguida, esses sangues foram transferidos para um tubo
contendo anticoagulante heparina 1µL.mL-1 de sangue coletado e lavados com NaCl
0,15 M por cinco vezes (3.000 rpm, 4ºC, 5 min.). O sobrenadante foi descartado e o
precipitado (papa de hemácias) foi utilizado para preparar uma suspensão de
hemácias a 2%.
4.5. Determinação da Atividade Hemaglutinante
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados através de diluições
seriadas em tubos de ensaio segundo o método de Moreira e Perrone (1977). Em
cada tubo foram adicionados 100 µL de solução de NaCl 0,15 M e 100 µL do extrato
bruto apenas no primeiro tubo, após a diluição seriada, adicionou-se o mesmo
volume de suspensão de hemácias 2%. O controle negativo continha volumes iguais
de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%. Após 30 min de incubação a 37ºC e
repouso por mais 30 min a temperatura ambiente, a atividade hemaglutinante foi
observada visualmente, sendo o título expresso em unidade de hemaglutinação
(UH.mL-1), que corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que apresente
nítida aglutinação.
4.6. Determinação da concentração de proteínas
37
A concentração de proteínas solúveis no extrato e fração proteica foi realizada
segundo o método de BRADFORD (1976) e como padrão foi utilizado albumina
sérica bovina (BSA).
4.7. Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares.
A especificidade de ligação da lectina a carboidrato foi determinada pelo ensaio
de inibição utilizando as seguintes soluções de açúcares (concentração inicial de
500 mM): D-galactose, D-lactose, D-manose, D-glucose, D-frutose, D-sacarose, Dlactulose, D-trealose e D-maltose. Inicialmente foi realizada uma diluição da BcL e
depois as soluções de açúcares foram preparadas em NaCl 0,15 M em diferentes
concentrações, por diluições seriadas. Volumes iguais (100 µL) da amostra e
soluções de açúcares foram previamente incubados por 30 min a 37ºC, em seguida,
acrescentado 100 µL de suspensão de eritrócitos de coelho a 2%. A inibição de
hemaglutinação foi avaliada visualmente após 1h à temperatura ambiente e a
concentração mínima necessária do açúcar para inibir a atividade hemaglutinante foi
determinada.
4.8. Purificação da BcL
A lectina de Bauhinia cheilantha (BcL) foi facilmente purificada em uma única
etapa. A F 0-90% foi submetida à cromatografia de afinidade em uma coluna de
galactomanana de Adenanthera pavonina L. reticulada com epicloridrina, preparada
no Laboratório de Desenvolvimento de Fármacos da Universidade de Fortaleza,
conforme metodologia de APPUKUTTAN (1977), e equilibrada com Tris- HCl 50mM
pH 7,8. A fração não retida (pico I) foi eluída com a solução de equilíbrio. Para a
eluição da fração retida (pico II) o tampão glicina 0,1M pH 2,6 em NaCl 0,15M foi
utilizado. A concentração de proteínas eluídas foi estimada por medida da
absorbância em 280 nm utilizando espectrofotômetro modelo UVmini-1240 . As
frações retidas que apresentavam leituras mais altas a 280nm foram reunidas e
dialisadas exaustivamente contra água destilada em temperatura ambiente.
Posteriormente, a amostra dialisada foi liofilizada (liofilizador modelo LS 3000).
38
4.9. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A pureza da proteína foi confirmada por eletroforese em SDS-PAGE seguindo
o método de LAEMMLI (1970). Para isso, utilizou-se 20 µg do pico retido (PII)
liofilizado oriundo da cromatografia de afinidade. A amostra foi dissolvida em 20 µL
do tampão de amostra com e sem β-mercaptoetanol, submetida à fervura por 5min e
em seguida aplicada a um gel com malha 15%, contendo marcador molecular
padrão (LMW Calibration Kit For SDS Electrophoresis).
4.10. Efeito da temperatura
O efeito do calor sobre a atividade hemaglutinante foi determinado através da
incubação da BcL em banho-maria por 30min no intervalo de 20 a 100 °C, com
incremento de 10 ºC. Após incubação, as amostras foram resfriadas em banho de
gelo e usadas para ensaios de hemaglutinação.
4.11. Efeito do pH
O efeito do pH na atividade hemaglutinante da proteína foi avaliado incubando
100 µL da BcL (1mg.mL-1) com 100 µL dos seguintes tampões: acetato de sódio 100
mM (pH 5,0), citrato de sódio 100 mM (pH 6,5), fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5),
Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) e borato de sódio 100 mM (pH 10,0) por 30 min a 37 ºC,,
em seguida adicionou-se a mesma quantidade de suspensão de eritrócitos 2%(v/v),
incubou-se novamente e os resultados foram observados macroscopicamente.
4.12. Efeito do EDTA e de Cátions divalentes sobre a Atividade Hemaglutinante
A dependência de cátions divalentes (Ca2+ e Mn2+) para a atividade
hemaglutinante da BcL foi determinada pelo método da dupla diluição seriada
usando EDTA como agente quelante, conforme PAJIC et al. (2002).
39
4.13. Avaliação de presença de glicídios constituintes
A presença de carboidratos neutros na lectina isolada foi determinada pelo
método de Dubois et al. (1956). Utilizou-se como padrão solução de D-glucose
(1µg.mL-1) e 100 µL da BcL (1mg.mL-1), com leitura em espectrofotômetro a 490 nm
modelo v-1100.
4.14. Atividade Antimicrobiana
4.14.1. Determinação de Concentração Inibitória Mínima (CIM) da BcL contra
microrganismos patógenos.
A CIM foi determinada pelo método de microdiluição em caldo de cultura
Brain Heart Infusion (BHI) de acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, 2009.
Para isso, utilizou-se microplacas com 96 poços de fundo redondo, estéreis e com
tampas apropriadas.
Culturas microbianas puras mantidas em ágar sob refrigeração, foram
repicadas para caldo infusão (caldo BHI) e incubadas a 37ºC até atingirem fase
exponencial de crescimento (4-6h). Após esse período, as culturas tiveram sua
densidade celular ajustada em meio BHI estéril, de modo a se obter uma turbidez
equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 × 10 8
UFC.mL-1 ). A suspensão obtida foi diluída 100 vezes, em solução salina 0,15M
estéril, resultando em uma cultura com aproximadamente 10 6 UFC.mL-1. Aos poços
da microplaca foram adicionados 100 μL de caldo BHI, 50 μL de BcL em diferentes
concentrações e por fim, 50 μL da suspensão microbiana. As microplacas foram
incubadas durante 24h em estufa bacteriológica a 37°C. Após esse período foi
realizada a inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias
em leitora de Elisa Bio-Tek a 620 nm.
A CIM é considerada a menor concentração da BcL capaz de inibir o
crescimento das cepas testadas, constatado pela ausência de turvação visível do
crescimento microbiano ou pelas leituras de absorbância quando a amostra por si só
gera turvação quando em contato com o meio.
40
4.15. Espectrometria de Massa
A lectina de folhas de Bauhinia cheilantha (BcL) foi analisada por
espectrometria de massas com o objetivo de verificar sua pureza e também
determinar sua massa molecular. Para esse fim, BcL oriunda do pico retido na
cromatografia de afinidade descrita anteriormente foi diluída em água contendo 0,1%
de ácido fórmico até uma concentração final de 1 mg.mL-1 e aquecida a 80oC por
15 min. Alíquota dessa diluição foi reduzida com 10 mM de Ditiotreitol, seguida de
uma reação de alquilação com 30 mM de iodoacetamida protegendo-se da luz.
Também foram utilizadas alíquotas de 5 µL da solução de BcL nativa.
Cinco microlitros da amostra de BcL reduzida e não reduzida foi inicialmente
aplicada em uma
–
USA) usando um gradiente de 5 a 80% de acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico
(v/v), com fluxo de 600 nL.min-1. Em todas as análises, o espectrômetro de massa
foi operado no modo ―V‖ com resolução de pelo menos 20.000, utilizando
nanoeletrospray como fonte de ionização operando no modo de íon positivo ESI (+).
A digitalização dos dados foi realizada em espectrômetro de massa Synapt
HDMS (Waters, Manchester – UK) acoplado ao sistema NanoUPLC-ESI programado
para alternar automaticamente entre MS de energia baixa (3 eV) e de energia de
colisão MAS (12 – 55 eV).
Esta tecnologia é utilizada para caracterizar tanto a porção N-terminal como a
C-terminal com igual probabilidade. Nesta metodologia, obtém-se um espectro de
massa de uma mistura de peptídeos digeridos na presença de tripsina. A mistura de
peptídeos obtidos foi analisada por espectrômetro de massa e as massas
monoisotópicas de cada peptídeo oriundo do MALDI-TOF foram submetidas à busca
na base de dados MASCOT (versão 2.1.03) (http://www.matrixscience.com),
software livre que permite a identificação por mapa de peptídeos (PMF).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
42
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Determinação da atividade Hemaglutinante (AH)
É bem documentado que a maior parte das lectinas isoladas é extraída de
sementes de leguminosas, sendo a extração proveniente de folhas ainda pouco
explorada. Desta forma, estudos foram realizados em extratos foliares com a
Bauhinia cheilantha para avaliar as propriedades físico-químicas e biológicas da sua
lectina.
Na tentativa de identificar a presença de lectina nas folhas de Bauhinia
cheilantha, observou-se que a melhor solução tampão de extração proteica foi o
Tris- HCl 0,1M pH 7,8, pois o EB preparado com esse tampão apresentou uma maior
atividade hemaglutinante (Tabela 1). Sendo, portanto utilizado nos demais
processos de purificação e caracterização da lectina. Esse resultado foi semelhante
àqueles obtidos para lectinas de B. pentandra (SILVA; HORTA; MOREIRA, 2001), B.
ungulata (SILVA et al., 2014) e B. variegata (PINTO et al., 2008).
Tabela 1- Atividade Hemaglutinante (AH) dos Extratos Brutos (EB) preparados com
tampões de diferentes valores de pH
EB/ Solução tampão de extração
proteica
*Título AH (U.H. mL-1)
Glicina 0,1 M pH 2,6
_
Acetato de sódio 0,1M pH 5,0
8
Fosfato de sódio 0,1M pH 6,5
32
Tris-HCl 0,1M pH 7,8
256
Borato de sódio 0,1M pH 10,0
_
*Título: definido como a última diluição da lectina capaz de aglutinar eritrócitos a 2%
O EB preparado com Tris-HCl 0,1M pH 7,8 foi testado em relação à
especificidade a diferentes eritrócitos. A atividade hemaglutinante mostrou que este
extrato aglutinou pobremente eritrócito bovino e foi incapaz de aglutinar hemácias de
caprino, equino e ovino, entretanto, aglutinou fortemente eritrócitos de coelho,
conforme mostra a Tabela 2.
43
Tabela 2 - Atividade Hemaglutinante (AH) do EB com diferentes eritrócitos.
Eritrócitos 2%
*Título AH (U.H. mL-1)
Coelho
256
Bovino
16
Caprino
_
Equino
_
Ovino
_
*Título: definido como a última diluição da lectina capaz de aglutinar eritrócitos a 2%
A Atividade hemaglutinante (AH) está relacionada à especificidade e afinidade
dos sítios de ligação das lectinas a carboidratos presentes na superfície de
eritrócitos determinadas, principalmente, por ligações de hidrogênio e interações
hidrofóbicas (SHARON; LIS, 2002).
5.2. Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares
Através da atividade hemaglutinante observou-se que BcL foi inibida por Dgalactose e D-lactulose, mas não pelos demais açúcares testados (Tabela 3).
Tabela 3- Inibição da Atividade Hemaglutinante da F0-90% de B. cheilantha por
carboidratos
Carboidrato
Concentração (mM)*
D-Galactose
0,976
Lactulose
1,953
D-Glucose
NI**
D-Lactose
NI
D-Maltose
NI
D-Manose
NI
D-Sacarose
NI
44
D-Trealose
NI
D-Frutose
NI
*Concentração mínima requerida para inibição da atividade hemaglutinante
**NI: Açúcar não inibidor a 500m M de concentração.
Esta especificidade de ligação a galactose é também uma característica das
lectinas isoladas a partir de B. variegata (PINTO et al., 2008), B. ungulata (SILVA et
al., 2014), B. bauhinioides (SILVA et al., 2011) e B. monandra (MACEDO et al.,
2007), já que a maioria das lectinas isoladas desse gênero são ligantes de galactose
e seus derivados. Lectinas que possuem especificidade para galactose não são
capazes de se ligar à manose ou glicose, nem manose/glicose ligam-se à galactose.
Esse dado corrobora com a discussão elaborada por Ambrosi e colaboradores
(2005).
Assim como as lectinas, alguns compostos como taninos, substâncias
catiônicas, alguns lipídios, carboidratos cognatos e cátions divalentes em altas
concentrações, também são capazes de aglutinar ou precipitar células (TRINDADE,
2005). Sendo assim, apenas a capacidade de promover aglutinação em células não
pode ser considerada um teste conclusivo de que há lectina em um determinado
vegetal, por isso é importante realizar o teste de Inibição da atividade
hemaglutinante por açúcares para confirmar se de fato é a lectina a responsável
pela aglutinação.
Peumans e Van Damme (1995), afirmaram que alguns critérios devem ser
levados em consideração para que uma proteína seja considerada uma lectina, um
desses critérios é ser uma proteína ou glicoproteína que são capazes de se ligar
especifica e reversivelmente a carboidratos sem alterar a estrutura dos mesmos.
Essa interação ocorre através de ligações de hidrogênio e interações de Van der
Waals entre os grupos hidroxilas e os resíduos de aminoácidos do sítio ativo da
lectina. Esse evento foi evidenciado através do ensaio de inibição no qual foram
utilizadas soluções de açúcares de concentração inicial 500 mM e uma suspensão
de eritrócitos de coelho 2% (v/v).
O teste de inibição por carboidratos foi considerado uma etapa muito
importante no processo de purificação e caracterização parcial da BcL, pois, esse
resultado conduziu todo o resto do processo.
45
5. 3. Purificação da BcL
5.3.1 Cromatografia de Afinidade
A cromatografia de afinidade é um método muito utilizado na purificação de
lectinas por ser técnica baseada na interação reversível entre a proteína e um
ligando específico acoplado a uma matriz cromatográfica pela mudança de pH ou
por eluição competitiva de uma solução de carboidrato.
Lectina de B. cheilantha foi facilmente purificada num único passo por
cromatografia de afinidade numa matriz de galactomanana de cadeia linear principal
constituída de D-manose com ramificações de galactose.
A amostra de lectina (F0-90%), quando submetida à cromatografia de
afinidade em coluna de galactomanana (Figura 4), apresentou dois picos
cromatográficos. O primeiro pico (PI), não adsorvido ao polímero, mostrou-se
destituído de atividade hemaglutinante, enquanto o segundo pico (PII), eluído com
glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M, apresentou a máxima atividade
hemaglutinante.
Figura 4. Purificação da lectina de B. cheilantha por cromatografia de afinidade em
galactomanana. A amostra foi aplicada a uma coluna de 10 mL, e as frações 4 mL (PI) e 2
mL (PII) foram recolhidas com fluxo constante de 0,5 mL.min-1.
A cromatografia de afinidade em coluna de galactomanana foi um método
bastante eficaz na purificação da BcL, pois esse processo permitiu a remoção de
46
outros compostos do material aplicado e a lectina foi eluída com alto grau de pureza.
O fator de purificação obtido foi 16, 92 conforme mostra a Tabela 4.
A formação do pico retido (PII) mostrou que a proteína interagiu de forma
reversível com as ramificações de galactose da matriz, confirmando ainda mais a
especificidade desta proteína por esse açúcar.
Essa matriz também foi utilizada para purificar lectinas ligantes de Dgalactose de sementes de Artocarpus incisa (CONSTANCIO, 2005; MONTEIRO,
1998; MOREIRA et al., 1998).
CRUZ, D. R. R. Isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma Caatinga.
47
Tabela 4. Purificação da lectina de Bauhinia cheilantha
Proteína (mg.mL-1)
Proteína total (mg)
AHa
AHTb
AHEc
Extrato Bruto
500
0,55
275,00
256
128.000
465,45
1
F 0-90
58
0,57
33,06
512
29.696
898,24
1,93
25
0,52
13,00
4.096
102.400
7.876,92
16,92
PII
(Galactomanana)
a
Hemaglutinação foi realizada com uma suspensão de eritrócito de coelho 2% (v/v).
Atividade hemaglutinante total = AH × volume (mL).
c
Atividade hemaglutinante específica = AH. Proteína-1 (mg.mL-1).
b
Fator de
Volume (mL)
Etapas
Purificação
48
5.3.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Essa técnica tem por base a mobilidade determinada por fatores de carga e
estrutura da biomolécula. O SDS é um detergente aniônico forte, que se liga aos
resíduos positivamente carregados das proteínas, conferindo às mesmas uma carga
final negativa e ocasionando a desnaturação.
BcL mostrou uma única banda em SDS-PAGE com uma massa molecular
aparente de aproximadamente 32,0 kDa (Figura 5), sob condições não redutoras
(Poço 2) e redutoras (Poço 3), indicando que a proteína nativa não é composta de
subunidades ligadas por pontes dissulfeto. A maioria das lectinas isoladas do gênero
Bauhinia exibem um perfil eletroforético com uma banda única de aproximadamente
30 kDa (SILVA; HORTA; MOREIRA, 2001; SILVA, et al., 2014; SOUZA et al., 2011).
Figura 5. Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida- SDS da lectina purificada de B.
cheilantha (32kDa). Poço 1: marcador molecular: Fosforilase b (97,0 kDa), albumina (66
kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa) inibidor de tripsina (20,1 kDa) αlactoalbumina (14,4 kDa). Poços 2 e 3 representam BcL (20 µg) aquecida a 100°C durante
10min minutos na ausência e na presença de β-mercaptoetanol, respectivamente.
49
5.4. Avaliação de presença de glicídios constituintes
Lectinas de leguminosas podem ser glicosiladas, exibindo uma ou duas
cadeias de carboidratos covalentemente ligado à cadeia lectínica (VAN DAMME
LANNOO; PEUMANS, 2008). Sendo assim, a BcL foi investigada quanto à presença
de carboidratos neutros em sua composição molecular.
Para uma solução de lectina purificada encerrando 1mg. mL -1 de proteína
(determinada por absorbância em 280 nm) foi encontrado 0,128 mg. mL-1 de
carboidrato, correspondendo a um teor de 12,8% de açúcar neutro. Diante disto, a
lectina foi considerada uma glicoproteína. Da mesma forma, lectinas de outras
espécies do gênero Bauhinia, como B. purpurea (IRIMURA; OSAWA, 1972), B.
monandra (COELHO; SILVA, 2000), B. ungulata (SILVA et al., 2014) e B. forficata
(SILVA et al., 2012), são também glicoproteínas. Em contraste, lectina da B.
bauhinioides não foi reativa para o ensaio do fenol-sulfúrico (SILVA et al., 2011).
5.5. Estabilidade da BcL frente a diferentes fatores
Muitos são os fatores que influenciam a atividade das lectinas, tais como,
tratamentos térmicos, pH e íons, e, por isso o controle da estabilidade de uma
proteína representa uma importante estratégia para manutenção de sua atividade
biológica. Diante disto, foi importante compreender quais condições estabiliza ou
desnaturam a BcL .
5.5.1. Efeito da temperatura
Através dos ensaios, verificou-se que a lectina da folha de B. cheilantha é
uma proteína termoestável (Figura 6) mantendo sua atividade hemaglutinante
mesmo após incubação por 30min a 60°C e completamente desnaturada em
temperaturas entre 65 e 100ºC durante 30 min. Isso acontece porque o aumento da
temperatura provoca um aumento na velocidade de vibração molecular e
consequentemente, as ligações que estabilizam a estrutura tridimensional da
proteína são rompidas, promovendo a sua desnaturação (LEHNINGER; NELSON;
COX, 2000).
50
Resultado semelhante foi observado na lectina de B. bauhinioides (SILVA et
al., 2011) e na lectina obtida a partir da raízes secundárias de B. monandra
(BmoRoL) (SOUZA et al., 2011). As lectinas de Bauhinia pentandra (SILVA; HORTA;
MOREIRA, 2001) e Bauhinia forficata (SILVA et al., 2012) mostraram-se mais
estáveis e mantiveram a sua atividade hemaglutinante após incubação, por 30 min.,
a 70 e 100°C, respectivamente.
Kawasgishi e Mori (1991) afirmaram que lectinas isoladas de diferentes fontes
apresentam estabilidade térmica variável, mas muitas delas perdem sua atividade
biológica quando são submetidas a temperaturas acima de 60°C. O efeito
hidrofóbico e a conformação entrópica são os possíveis fatores responsáveis pela
estabilidade das proteínas a uma determinada temperatura (PACE et al., 2004). Os
resultados dos estudos termodinâmicos de desnaturação de proteínas estão
fundamentados por interações das forças de Van der Walls e ligações de hidrogênio,
pois estas contribuem bastante para alteração na entalpia que atua diretamente no
comportamento das proteínas (LOLADZE; ERMOLENKO; MAKHATADZE, 2002).
Figura 6- Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da lectina de folhas de B.
cheilantha (BcL).
1200
1000
UH. mL-1
800
600
400
200
0
0
20
40
60
80
100
120
Temperatura °C
5.5.2. Efeito do pH na atividade hemaglutinante da lectina
Cada proteína possui um pH ideal para exercer sua atividade. Variações de
pH modificam a carga liquida das proteínas provocando repulsão eletrostática e
51
rompimento de ligações de hidrogênio que estabilizam a estrutura proteica, levando
assim à desnaturação e perda da atividade biológica (LEHNINGER; NELSON; COX,
2000).
Com o intuito de verificar a estabilidade da lectina de B. cheilantha, sua
atividade hemaglutinante foi testada frente a variações do pH. Através desse ensaio,
constatou-se que esta proteína é resistente a uma ampla faixa de pH, sendo que na
faixa entre 6,5 e 8,0 observou-se maiores títulos de hemaglutinação (Figura 7).
Portanto, essa faixa é considerada ótima para a atividade dessa lectina.
Experiências semelhantes mostraram que a atividade hemaglutinante das lectinas
de B. ungulata e B. bauhinioides teve seus maiores valores em pH 6,0-8,0 e pH 8,09,0, respectivamente (SILVA, et al., 2014.; SILVA et al., 2011).
Figura 7 - Efeito do pH sobre a
cheilantha (BcL)
atividade hemaglutinante da lectina de folhas de B.
600
500
UH. mL-1
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
pH
5.5.3. Efeito de cátions divalentes na atividade hemaglutinante da lectina
Segundo Silva e colaboradores (2014), a maioria das lectinas de leguminosas
depende de íons metálicos (Ca2+ e Mn2+) para exercer sua atividade hemaglutinante.
Estes íons são os responsáveis por estabilizar a ligação ao domínio de
reconhecimento de carboidrato (CRD) e fixar as posições dos resíduos de
aminoácidos que interagem com o carboidrato ligante.
Através dos ensaios observou-se que, a adição dos íons metálicos Ca2+ e
Mn2+ não afetaram a atividade hemaglutinante da lectina de B. cheilantha, mostrando
52
que, diferente da maioria da lectinas de leguminosas, não necessita de íons
metálicos para exercer sua atividade ou esses íons, se presentes na estrutura da
proteína, estão fortemente ligados à molécula. Esse resultado é semelhante aos
obtidos em outras espécies do mesmo gênero, como B. variegata candida (SILVA et
al., 2007) e B. bauhinioides (SILVA et al., 2011) que também não tiveram suas
atividades afetadas pelo EDTA.
5.6. Atividade Antimicrobiana
5.6.1. Determinação de Concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231,
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
e Escherichia coli ATCC 8739.
Através da determinação da CIM, observou-se que a BcL não inibiu o
crescimento das cepas P.aeruginosa, C.albicans, S.aureus, K.pneumoniae e E.coli,
possivelmente, os açúcares presentes na estrutura desses microrganismos não
estão expostos para o sítio ativo da lectina, ou até mesmo a ausência de atividade
pode ser devida à concentração adotada, a fatores ambientais ou somente ser
determinada em outras espécies de microrganismos que nesse estudo não foram
testados.
Apesar da BcL não ter apresentado atividade antimicrobiana, não significa
que ela é desprovida de outras atividades biológicas, pois a lectina de B. variegata
também não apresentou atividade antifúngica, mas possui atividade antiproliferativa
e atividade mitogênica (LIN; NG, 2008). Nascimento Neto e colaboradores (2011)
avaliaram o potencial de cura da lectina de B. variegata (nBVL) e sua isoforma
recombinante (rBVL-1) e concluíram que essa lectina pode ser utilizada no
tratamento de feridas cutâneas agudas. Já lectinas isoladas a partir das folhas de B.
monandra possuem atividade inseticida (MACEDO et al., 2007) e potencial
antioxidante (SISENANDO et al., 2009).
5.7. Espectrometria de Massa
53
Os resultados obtidos não foram conclusivos, pois não foi possível obter o
sequenciamento integral para todos os peptídeos. Todos os fragmentos,
provenientes da digestão foram introduzidos na base de dados MASCOT (versão
2.1.03), para comparação com sequências já descritas, e revelaram homologia, em
primeiro lugar, com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia simplicifolia (LESCAR et
al., 2002), de massa molecular 28351 Da, e também com uma hipotética proteína de
Phaseolus vulgaris (. A analise do MASCOT revelou homologia dos peptídeos
trípticos da BcL obtendo uma cobertura de sequência proteica de 5% (Figura 8).
Apesar de não ter conseguido uma alta homologia entre os peptídeos analisados,
esse estudo deve ser continuado já que se trata de uma proteína ligante de
carboidrato.
Figura 8- Sequência de aminoácidos de Griffonia simplicifolia. Em vermelho está o
peptídeo homólogo a lectina de BcL (p < 0,05).
6. RESUMO DOS RESULTADOS
55
6. RESUMO DOS RESULTADOS
Através do estudo realizado, foi possível isolar, purificar e caracterizar
parcialmente a lectina proveniente de folhas de Bauhinia cheilantha através de
cromatografia em coluna de galactomanana. Tal lectina não mostrou especificidade
para eritrócitos de caprino, equino e ovino, porém aglutinou pobremente eritrócitos
bovino e fortemente hemácias de coelho. Sua atividade hemaglutinante foi inibida
por D-galactose e D-lactulose.
A lectina purificada é uma glicoproteína que não depende de cátions
divalentes para exercer sua atividade hemaglutinante; é resistente a uma ampla
faixa de pH e termoestável mantendo sua atividade mesmo após 30min de
incubação a 60°C. Apresentou um perfil eletroforético com uma banda de
aproximadamente 32 kDa semelhante às lectinas de outras espécies do gênero
Bauhinia. O perfil dos peptídeos trípticos, obtidos na espectrometria de massa,
revelou homologia com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia simplicifolia de massa
molecular 28,351 kDa.
BcL não apresentou atividade antimicrobiana contra as cepas P.aeruginosa,
C.albicans, S.aureus, K.pneumoniae e E.coli. Apesar deste resultado, surge o
desafio de identificar se ela possui outro tipo de atividade biológica, já que a maioria
das espécies de bauhinia é dotada de potenciais atividades.
56
7. CONCLUSÃO
57
7. CONCLUSÃO
Esse estudo é de grade importância para espécies típicas do bioma Caatinga,
principalmente as do gênero Bauhinia, pois através dele foi possível isolar pela
primeira vez a lectina D-galactose ligante com massa molecular aparente de 32 KDa
das folhas de Bauhinia cheilantha, como também obter informações a respeito das
propriedades físico-químicas dessa proteína.
Outras perspectivas são realizar o seu sequenciamento e estudar a sua
estrutura tridimensional para que a partir daí seja possível entender o seu
mecanismo de ação. Sendo assim, este trabalho é fundamental para estudos futuros
desta espécie.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2007.
APÊNDICE
71
72
73
10.034 - ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA
LECTINA DA BAUHINIA CHEILANTHA (Bong.) Steud. NATIVA DO BIOMA
CAATINGA.
Cruz, D. R. R. , Moraes, L. M. A. , Bezerra, G. S. , Felix, W. P. ,
Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido – UNIVASF
Introdução:
Lectinas são proteínas que se ligam especificamente e reversivelmente a mono ou
oligossacarídeos, mas são destituídas de atividade catalítica e, em contraste, com
anticorpos, não são produtos de uma resposta imune. O gênero Bauhinia é muito
utilizado com fins medicinais e, para algumas espécies, são atribuídas propriedades
antifúngicas, antibacterianas, antiinflamatórias e antidiabética.
Objetivos:
Isolar, purificar e caracterizar parcialmente lectina da Bauhinia cheilantha (Bong.)
Steud., espécie nativa do Bioma Caatinga ainda não plenamente estudada na região
do Vale do Rio São Francisco.
Métodos:
protocolo nº 0002/210114 O material vegetal (folhas) de Bauhinia cheilantha foi
coletado na cidade de Petrolina-PE. O extrato bruto foi obtido após a maceração
mecânica de 48 g de folhas frescas em 200 mL de tampão Tris- HCl pH 8,0 com
PVP 2% (v/v). Deixou-se sob agitação por 30 min e filtrou- se em gaze dupla. A
seguir, centrifugou-se a 2.500 × g por 20 min a 4° C e descartou-se o resíduo,
obtendo assim o Extrato bruto, que foi usado nos ensaios de hemaglutinação. Para
os ensaios de atividade hemaglutinante (U.H.) foram empregadas amostras de
eritrócitos de coelho (Oryctolagus cuniculus), da raça Nova Zelândia, cor branca,
sexo masculino com 4 kg e 4 meses de idade. Para determinação da U.H. no extrato
bruto foram utilizadas soluções a 2% (v/v) de eritrócitos de coelho tratados e não
tratados enzimaticamente (pepsina e tripsina). Os ensaios foram realizados com
volumes iguais do extrato bruto, diluídos seriadamente com solução salina (NaCl
0,15M) com e sem a adição de Mn++ e Ca++), incubando-os por 30 min a 38°C e
74
deixado-os em repouso por mais 30 min a temperatura ambiente e a determinação
da U.H. foi observada macroscopicamente.
Resultados:
A ligação da lectina oriunda do extrato bruto das folhas de Bauhinia cheilantha aos
carboidratos da superfície dos eritrócitos de coelho, tratados e não tratados,
promoveu a formação de uma rede que foi visível a olho nu. Os resultados foram
positivos na presença e na ausência de íons Ca2+ e Mn2+.
Conclusão:
A capacidade de hemaglutinação verificada no extrato bruto aponta para a presença
de lectina nas folhas de Bauhinia cheilantha e que essa lectina é independente de
Ca2+ e Mn2+, e também do tratamento enzimático.
Apoio Financeiro:
FACEPE/CNPq/FABESB/CAPES/UNIVASF
75
XII Reunião Regional Nordeste da SBBq
Natal, RN, 01 a 03 de Dezembro de 2014
ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL LECTIN
FROM Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud LEAVES IN THE CITY OF PETROLINA –
PERNAMBUCO – BRAZIL.
Cruz, D. R. R.1; Felix, W. P.1; Negreiros, C. R. P.1; Bezerra, G. S.1; Jurema, I. C. F.1; Sousa,
F. D.2; Moreira, R. A.2; Moreira, A. C. O. M.2;
1
Laboratory of Biochemistry (CCA) – UNIVASF, Petrolina, PE. Center for Experimental
Biology (Nubex) – UNIFOR, Fortaleza, CE.
E.mail: [email protected]
Lectins, proteins or glycoproteins that reversible bind carbohydrates with distinct degrees of
selectivity, they are found in a variety of organisms (microorganisms, plants and animals)
being involved in numerous cellular processes. The Bauhinia genus is widely used for
medicinal purposes, and for some species, are attributeed antifungal, antibacterial, antiinflammatory and antidiabetic properties. In this study evaluated the presence of lectin from
Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud leaves, plant popular know with ―pata-de-vaca‖, native
species of the Caatinga.
Crude extract (1:10, w/v) in Tris-HCl 0.1M pH 7.8 buffer of leaves was obtained. The extract
was submitted to ammonium sulphate fractionation (F 0-90%), dialyse and hemaglutinating
assays (HA) with different types of erythrocytes (rabbit, bovine, sheep, goat and horse). The
selected fraction with leaves B. cheilatha lectin (BCL) was obtained in 50 mM Tris-HCl pH
7.8 buffer. Inhibition of hemagglutination: The following sugars were used to determine its
effect on the hemagglutination reaction: D-galactose, D-mannose, D-lactulose, D-glucose, Dmaltose, D-fructose and D- trehalose. The F 0-90% (NH4)2SO4 was then subjected to affinity
chromatography on Adenanthera pavonina cross-linked galactomannan, a matrix containing
terminal D-galactose. The purity degree was evaluated through polyacrylamide gel
electrophoresis (PAGE) to and native proteins or denatured.
BCL showed hemagglutinating high activity with rabbit and bovine erythrocytes and with
lower intensity sheep, goat and horse erythrocytes. Of the various sugars tested, the
hemagglutinating activity was partial inhibited by D-galactose, D-mannose and D-lactulose.
BCL was easily purified in a single step by affinity chromatography on A. pavonina crosslinked galactomannan column. The bound protein eluted with 0.1 M glycine pH 2.6 buffer.
The purity and the profile molecular weight of the lectin was determined by PAGE after
heating either in the presence or absence of the reducing agent -mercaptoethanol. BCL
appears to be composed of single polypeptide chain weighing approximately 32 kDa.
Keywords: lectin; affinity chromatography; Bauhinia cheilantha
Supported by: CAPES/CNPq, FACEPE; UNIFOR, UNIVASF.
77
Journal of the Brazilian Chemical Society
ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL
CHARACTERIZATION OF A LECTIN FROM BAUHINIA
CHEILANTHA (BONGARD) STEUDEL LEAVES, NATIVE OF
BIOME CAATINGA.
Journal:
Manuscript ID:
Manuscript Type:
Date Submitted by the Author:
Draft
Article
n/a
Complete List of Authors: Felix, Wagner; Universidade Federal do Vale do São Francisco, Laboratório
de Bioquímica
Keyword:
Biological and Pharmacological Activities, OTHERS, Polymers
Please, specify if the
submission is for a Regular Regular Issue
Issue or Special Issue:
https://mc04.manuscriptcentral.com/jbchs-scielo
ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION
OF A LECTIN FROM Bauhinia cheilantha (BONGARD) STEUDEL LEAVES,
NATIVE OF BIOME CAATINGA.
1
1*
1
2
2
CRUZ, D. R. R. ; FELIX, W. P. ; BEZERRA, G. S. ; SOUSA, F. D. ; MORENO, F. B. M. B. ;
2
2
2
LOBO, M. D. P. ; MOREIRA, R. A. ; MOREIRA, A. C. O. M.
1
2
Laboratory of Biochemistry (CCA) – UNIVASF, Petrolina, PE.
Center for Experimental Biology (Nubex) – UNIFOR, Fortaleza, CE.
*[email protected]
ABSTRACT
Lectins, proteins that reversible bind carbohydrates with distinct degrees of selectivity, they
are found in a variety of organisms being involved in cellular processes. In this work evaluated the
presence of lectin from Bauhinia cheilantha leaves. Extract in Tris-HCl 0.1M pH 7.8 buffer of
leaves were obtained and submitted to fractionation and hemaglutinating assays. The following
sugars were used to determine its effect on the hemagglutination reaction. The F 0-90% was then
subjected to affinity chromatography. The purity degree was evaluated through SDS-PAGE to and
native proteins or denatured. Of the various sugars tested, the hemagglutinating activity was partial
inhibited by D-galactose and D-lactulose. BcL was purified in a single step by affinity
chromatography. The bound protein eluted with 0.1 M glycine pH 2.6 buffer. The purity and the
profile molecular weight of the lectin were determined by PAGE to be composed of single
polypeptide chain weighing approximately 32 kDa.
Keywords: lectin; affinity chromatography; Bauhinia cheilantha.
INTRODUCTION
Lectins are proteins or glycoproteins of non-immune origin derived from plants, animals or
microorganisms that have specificity for terminal or subterminal carbohydrate residues. The main
characteristic of this class of proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine
with glycocomponents of the cell surface, as well as with cytoplasmatic and nuclear structures and
the extracellular matrix of cells and tissues from throughout the animal and plant kingdoms, down
to bacteria and viruses1.
The lectins represent a large group of plant proteins. They have been found in less than 500
species, which indicates that only a limited number of higher plants contain detectable levels of
lectins2. The concentration of lectins in seeds varies considerably (from 1 to 10% of the total seed
protein). In some species, values to 50% have been reported, whereas in others lectins are barely
detectable with techniques currently used3.
The use of metabolically active proteins in plant taxonomy is well established. The presence
of seed lectins in tribes, genera and species of the same family has been reported and high
homology has been found between lectins from taxonomically diverse sources, which makes these
proteins a suitable molecular tool for chemotaxonomy studies4.
Plants of the genus Bauhinia are widely distributed in the tropics and are important for
animal nutrition because of their high protein content. Some species also have been used in folk
medicine for the treatment of diabetes and as a diuretic.
Previous studies have reported the isolation and characterization of a lectin from Bauhinia
purpurea (BPA) and their seeds contain a typical legume lectin that is purified by affinity
chromatography on immobilized N-acetyl-D-galactosamine5. BPA is useful for detecting galactosecontaining glycoconjugates and mucin-type sugar chains, and can also be used as a marker for
Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease6. Lectins have also been reported from leaves of
Bauhinia monandra7.
The isolation and characterization of novel lectins reveal properties which are of practical
importance for different areas of biological research. Therefore, the objective of this work was to
isolate and characterize a lectin from Bauhinia cheilantha leaves.
EXPERIMENTAL
Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel leaves were collected from plants growing in the city
of Petrolina-PE (Brazil). Taxonomic identification was carried out at the herbarium Federal
University of San Francisco Valley (Univasf).
Red blood cells from rabbit, bovine, sheep, goat and horse were obtained from animals
reared at the Animal Production Section, Univasf.
The agglutination of red blood cells by fractions obtained during purification was estimated
as described before8. Serial two-fold dilutions of lectin were carried out in small glass tubes using
0.15 M NaCl and 0.25 mL of erythrocyte suspension was then added. The degree of agglutination
was monitored visually after incubation at 37 ºC for 30 min and a further 30 min at room
temperature. One hemagglutination unit (H.U.) was defined as the reciprocal of the highest dilution
still causing a visible agglutination. The specific activity was expressed as hemagglutination units
(HU. mg-1) and the minimum dose as the minimum amount of protein still promoting a visible
agglutination.
The protein concentration of the different fractions was measured according to Bradford 9,
using bovine serum albumine (BSA) as standard. The absorbance at 280 nm was used to estimate
the protein concentration in column eluates. The carbohydrate concentration of the different
fractions was measured according to Dubois10, using glucose as standard. The absorbance at 485 nm
was used to estimate the carbohydrate concentration.
Bauhinia cheilantha leaves were stirred with 0.1 M glycine-HCl pH 2.6, 0.1 M NaOAc pH
4.0, 0.1 M Fosfate pH 6.5, 0.1 M Tris-HCl pH 7.8 and 0.1M Na-borate buffer pH 10.0, all
containing 0.15 M NaCl. The suspensions were left at room temperature for 1 h then centrifuged at
13.400 g for 30 min at 4 ºC. The clear supernatants were used for determining the protein and
carbohydrate content and hemagglutinating activity.
Bauhinia cheilantha lectin was extracted by treating the leaves (500 g) with 0.1 M Tris-HCl
pH 7.8 containing PVPP at 2% (m/v) and β-mercaptoethanol 0,1% (v/v) at room temperature for 1 h
after centrifuging at 13.400  g for 30 min at 4 ºC. The clear supernatant was then precipitated by
addition of ammonium sulfate in the saturation levels 90% at room temperature overnight. The
precipitate was collected by centrifuging at 13.400  g for 30 min at 4 ºC and then dissolved in 0.1
M Tris-HCl pH 7.8.
The saline crude extracts were precipitated by (NH4)2SO4 (0-90% of saturation) and applied
to Adenanthera pavonina L. cross-linked galactomannans column equilibrated with Tris-HCl 50
mM pH 7,8 buffer. After elution of the non-retained fraction, the lectin was eluted with pH 2.6, 0.1
M Glycine-HCl buffer, containing 0.15 M NaCl. The clear supernatants were dialysed against water
and lyophilized.
The polyacrylamide gel electrophoresis was performed in 2 mm thick vertical slab gels,
according to the method of Laemmli11, using 3.95% and 12.5% stacking and running gels,
respectively. Samples were dissolved in 0.0625 M Tris-HCl pH 6.8, containing 2% SDS buffer and
1% β-mercaptoethanol then incubated at 100 ºC for 10 min. A few crystals of sucrose were
dissolved in the samples which were then applied to the gel. Electrophoresis was carried out at a
constant current of 20 mA for 3 h. The protein bands were visualized by staining the gel with
Coomassie Brilliant Blue-R 250. Estimations of the Mr of the lectin and fragments were based on
comparisons using LMW Calibration kit for SDS Electrophosis as a standard.
The carbohydrate-binding specificity of the lectin was estimated by the ability of a series of
single sugars to inhibit the hemagglutination of rabbit erythrocytes. Two-fold dilutions of sugars in
0.15 M NaCl were mixed with 0.25 mL of lectin solution at a concentration such that a two-fold
dilution would give the end point agglutination in the absence of inhibitor. The lowest concentration
of the sugar giving full inhibition was determined.
The purified lectin (1 mg) was dissolved and dialyzed dialysed exhaustively (48 h) against
0.2 M EDTA, followed by dialysis against 0.15 M NaCl. Hemagglutinating activity was recovered
by adding CaCl2 and MnCl2.
The heat stability of the hemagglutinating activity was determined by incubating the lectin at
different temperatures during different times and the residual activity determined.
Antibacterial activity of Bauhinia cheilantha lectin (BcL) was assayed against Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Escherichia
coli. All media were steam sterilized at 120°C for 20 min. To assay the inhibition of bacterial
growth, the tested bacteria were homogeneously seeded with a sterile hissope on to Petri dishes
containing 15 ml of the medium. Holes (7 mm in diameter) were aseptically bored into the agar
with a hollow punch and were filled up with 25 ml of each BcL at different concentrations (2
mg.mL-1; 1 mg.mL-1 and 0.1 mg.mL-1). The plates were examined after incubation at 37ºC for 24 h.
After this period visual inspection of bacterial growth and to read absorbance Bio-Tek ELISA
apparatus at 620 nm was performed. The determination of microorganisms in inoculum was
performed by colony counts on agar Plate-Count.
RESULTS AND DISCUSSION
Bauhinia cheilantha is a widespread plant, common in tropical and sub-tropical regions,
occurring in forests in northeastern Brazil. B. cheilantha belongs to the family Fabaceae, sub-family
Caesalpinioideae, tribe Cercidae, sub-tribe Cercidinae and genus Bauhinia. In Brazil, this species is
commonly called "mororó".
The influence of pH on the solubility of the proteins and hemagglutinating activity of B.
cheilantha was examined (Fig. 1). A maximum protein content was found at pH 6.0 until 8.0 and a
minimum content at pH 2.0, 4.0 and 10.0. The maximum hemagglutinating activity occurred at pH
7.8.
600
UH. ML -1
500
400
300
200
100
0
1
3
5
7
9
11
13
PH
Figure 01 – Influnce of pH on the hemmagglutinating activity of Bauhinia cheilantha lectin
(BcL).
The purification of B. cheilantha lectin is summarized in Table 1.
Table 1. Purification of the Bauhinia cheilantha lectin.
Volume
(mL)
Protein
-1
(mg.mL )
Total Protein
(mg)
Crude
Extract
500
0.55
275
F 0-90
58
0.57
33.06
Steps
AHT
AHE
Fold
Purification
256
128,000
465.45
1
512
29,696
898.24
1.93
a
AH
b
c
PII
25
0.52
13
4.096
102,400
7,876.92
a
Hemagglutinating activity was performed with red blood cells from rabbit 2% v/v).
Total hemagglutinating activity = AH × volume (mL).
c
-1
-1
Specific hemagglutinating activity = AH. Protein (mg.mL ).
16.92
b
The purified B. cheilantha lectin strongly agglutinated rabbit erythrocytes and weakly
bovine erythrocytes. Erythrocytes from sheep, goat and horse were not agglutinated.
The hemagglutinating activity of the B. cheilantha lectin was inhibited by D-galactose
(0,976 mM) and lactulose (1,953 mM) but was not inhibited by D-glucose, lactose, maltose, Dmannose, saccharose, D-fructose and trehalose a concentration of up to 500 mM. This
carbohydrate-binding specificity is also characteristic of the other lectin isolated from Bauhinia
genus5,7,12.
The hemagglutinating activity was not affected by the presence of Ca2+ and Mn2+ (1, 3, 5, 7
and 10 mM). This result is similar to those obtained in other species of the same genus as B.
variegata ‘candida’13 and B. bauhinioides14 which also did not have their activities affected by
EDTA.
The B. pentandra lectin was thermostable: hemagglutinating activity was retained even after
incubation at 60 ºC for 30 min. However, the activity was completely lost at higher temperatures
(65-100 ºC) even after incubation for just 30 min (data not shown). Similar results were observed in
the lectin B. bauhinioides14 and lectin obtained from the secondary roots of B. monandra15. Lectins
Bauhinia pentandra16 and Bauhinia forficata17 proved to be more stable and maintained their
hemagglutinating activity after incubation for 30 min at 70 to 100° C. respectively.
Polyacrylamide gel electrophoresis of the lectin, treated with SDS and β-mercaptoethanol
gave only one protein band with an apparent molecular mass of 32 kDa (Fig. 2). In the absence of βmercaptoethanol, the B. pentandra lectin also showed only one band.
Figure 2. Electrophoresis profile SDS polyacrylamide gel of the purified lectin B. cheilantha (32 kDa). Lane 1:
molecular markers: phosphorylase b (97.0 kDa), BSA (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (30.0 kDa),
trypsin inhibitor (20.1 kDa), α-lactalbumin (14, 4 kDa). Wells 2 e 3 represent BcL (20 µg) heated at 100° C for 10min
minutes in the absence and presence of β-mercaptoethanol, respectively.
Through the determining the CIM, it was observed that BcL not inhibit the growth of P.
aeruginosa, C. albicans, S. aureus, E. coli and K. pneumoniae strains. Possibly these strains are not
present in their carbohydrate capsules, cell walls or even the flagella that are specific for this lectin
and therefore it was not able to bind to cells and these sugars are present in the structure of the
microorganisms, are not exposed to the active site lectin, or even no activity can be adopted due to
concentration or environmental factors. Despite the BcL not presented antimicrobial activity, does
not mean it is devoid of other biological activities because the lectin B. variegata also showed no
antifungal activity, but has antiproliferative and mitogenic activity (LIN; NG, 2008). It has been
reported the healing potential of lectin Bauhinia variegate (nBVL) and its recombinant isoform
(rBVL-1) and concluded that this lectin can be used for treating acute wounds18. Already lectins
isolated from Bauhinia monandra leaves have insecticidal activity19 and antioxidant potential20.
The results obtained in this study were of great importance for the unpublished isolation of
the lectin from Bauhinia cheilantha leaves in which it was possible to obtain relevant information
about the physico-chemical properties of this protein. This work is essential for future studies of this
species.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), Universidade de Fortaleza (UNIFOR) and Fundação Universidade
Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF).
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isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas

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