Dokument_1. - OPUS Würzburg

Transcrição

Stimulation humaner Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten
Untersuchungen zur Wirkung Stickstoff-haltiger Bisphosphonate
und zu bakteriellen Phosphoantigenen
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Susanne Eckstein
aus Nürnberg
Würzburg 2004
Eingereicht am:..........................................
bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie
1. Gutachter: ..................................................
2. Gutachter: ..................................................
der Dissertation
1. Prüfer: .........................................................
2. Prüfer: .........................................................
3. Prüfer: .........................................................
des Öffentlichen Promotionskolloquiums
Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums: ..........................
Doktorurkunde ausgehändigt am: .....................
DANKSAGUNG
Die vorliegende Arbeit wurde von Juli 1999 bis Dezember 2002 am Lehrstuhl für
Lebensmittelchemie in Zusammenarbeit mit dem Immunbiologischen Labor der
Medizinischen Poliklinik der Universität Würzburg durchgeführt.
Herrn Prof. Dr. M. Wilhelm und Herrn Dr. M. Herderich danke ich herzlich für die
Überlassung des Themas, das entgegengebrachte Vertrauen, die wissenschaftliche Betreuung
und das stetige Interesse am Fortgang der Arbeit. Prof. Dr. P. Schreier gilt mein Dank für die
Möglichkeit, an seinem Lehrstuhl zu promovieren.
Bei allen Mitarbeitern des Immunolabors bedanke ich mich für die gute Zusammenarbeit, die
ständige Hilfsbereitschaft und für die Einarbeitung in immunologische Techniken. Mein
besonderer Dank gilt den Mitgliedern des Arbeitskreises Wilhelm. Der ständige
Meinungsaustausch hat wesentlich dazu beigetragen, dass mir die Arbeit sehr viel Freude
bereitet hat.
Allen jetzigen und früheren Kollegen am Lehrstuhl für Lebensmittelchemie danke ich für die
freundschaftliche Aufnahme und für die stetige Hilfsbereitschaft. Mein Dank für die
Einweisung und Unterstützung bei den HPLC-MS-Untersuchungen gebührt Dr. Markus
Herderich, Dr. Stefanie Diem, Dr. Dominique Kavvadias und Diana Kemmer. Für
Unterstützung bei Arbeiten im GC-Labor bedanke ich mich bei Dr. Bernhard Weckerle und
Frank Heckel.
Dr. J. Green von der Firma Novartis gilt mein Dank für die Bereitstellung zahlreicher
Bisphosphonate und für die unkomplizierte Zusammenarbeit.
Prof. Dr. J.-J. Fournié und seinen Mitarbeitern danke ich für die Zusammenarbeit bei den
Untersuchungen zu Phosphoantigenen aus Escherichia coli und für die Überlassung von
Bromhydrinpyrophosphat.
Für die Bereitschaft, Referenzsubstanzen zur Verfügung zu stellen, gebührt mein Dank Herrn
Prof. A. Bacher.
Bei allen Korrekturlesern möchte ich mich an dieser Stelle noch einmal herzlich für die
zahlreichen fachlichen und sprachlichen Verbesserungen bedanken.
Schließlich gilt mein Dank dem Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der
Universität Würzburg, das durch seine finanzielle Unterstützung diese Arbeit ermöglicht hat.
PUBLIKATIONSLISTE
Veröffentlichungen:
M. Wilhelm, V. Kunzmann, S. Eckstein, P. Reimer, F. Weissinger, T. Ruediger und H.-P.
Tony (2003). γδ T cells for imune therapy of patients with lymphoid malignancies. Blood,
102, 200-206.
J. Feurle, E. Espinosa, S. Eckstein, F. Pont, V. Kunzmann, M. Herderich, J.-J. Fournié und
M. Wilhelm (2002). Escherichia coli produces phosphoantigens acitvating human γδ T cells.
Journal of Biological Chemistry 277, 148-154.
Tagungsbeiträge:
S. Eckstein, J. Feurle, V. Kunzmann, M. Herderich, J.-J. Fournié, Martin Wilhelm: E. coli
contains a γδ T cell antigen identical to the mycobacterial 3-formyl-1-butyl pyrophosphate.
Jahreskongress DGI 2001.
S. Eckstein, J. Feurle, K. Kelm, V. Kunzmann, M. Herderich, M. Wilhelm: The ability of low
molecular mass extracts from Corynebacterium ammoniagenes to stimulate γδ T cells is
enhanced by oxidative stress. Jahreskongress DGI 2000.
V. Kunzmann, S. Eckstein, A. Lindner, H.-P. Tony und M. Wilhelm. (2002). Induction of
anti-lymphoma activity by pamidronate activated γδ T cells: Results from a clinical Phase I/II
trial. Blood 100 (suppl): 309b(#4776).
V. Kunzmann, K. Kelm, S. Eckstein, M. Wilhelm (2000). Phase I/II trial of pamidronate and
interleukin-2 for relapsed/refractory multiple myeloma and low-grade Non-Hodgkins
lymphoma. Blood 96 (suppl): 3169.
Inhalt
i
Inhalt
ZUSAMMENFASSUNG
SUMMARY
A EINLEITUNG ................................................................................... 1
B KENNTNISSTAND ........................................................................... 2
1
Die Stellung von γδ-T-Zellen im Immunsystem..........................................2
1.1
Überblick über das Immunsystem ......................................................................... 2
1.1.1
Angeborene Immunität ....................................................................................... 2
1.1.1.1 Alternativer Weg der Komplementaktivierung ........................................... 2
1.1.1.2 Phagozytose ................................................................................................. 3
1.1.1.3 Natürliche Killerzellen................................................................................. 3
1.1.2
Adaptive Immunität ............................................................................................ 4
1.2
Struktur des T-Zell-Rezeptors und Entwicklung der T-Zellen........................... 5
1.2.1
Der T-Zell-Rezeptorkomplex ............................................................................. 5
1.2.2
T-Zell-Rezeptorgene........................................................................................... 6
1.2.3
Struktur des T-Zell-Rezeptors ............................................................................ 7
1.2.4
Entwicklung der T-Lymphozyten....................................................................... 8
1.3
Die Antigenerkennung durch αβ-T-Lymphozyten............................................. 10
1.4
Effektorfunktionen von αβ-T-Zellen ................................................................... 11
1.4.1
Zytotoxische T-Zellen....................................................................................... 11
1.4.2
CD4-T-Zellen.................................................................................................... 12
1.5
Antigene für γδ-T-Lymphozyten .......................................................................... 13
1.5.1
Vγ9Vδ2-T-Zellen.............................................................................................. 13
1.5.1.1 Phosphoantigene ........................................................................................ 13
1.5.1.2 Stickstoff enthaltende Bisphosphonate als γδ-T-Zell-Stimulatoren .......... 22
1.5.1.3 Alkylamine ................................................................................................ 22
1.5.1.4 Proteine und zellgebundene Antigene ....................................................... 23
1.5.2
Mechanismus der Antigenerkennung durch Vγ9Vδ2-T-Zellen ....................... 24
1.5.3
Antigenerkennung durch weitere γδ-T-Zellen.................................................. 25
1.6
Effektorfunktionen von γδ-T-Zellen..................................................................... 26
1.7
Regulation der Immunantwort von γδ-T-Zellen ................................................. 28
1.8
Die Rolle der γδ-T-Zellen bei der Immunantwort .............................................. 28
1.8.1
Bakterielle Infektionen ..................................................................................... 28
1.8.2
Parasitäre Infektionen ....................................................................................... 30
1.8.3
Virale Infektionen ............................................................................................. 31
1.8.4
Anti-Tumor-Immunität ..................................................................................... 32
1.8.5
Weitere Funktionen von γδ-T-Lymphozyten.................................................... 33
ii
Inhalt
2
Die Isoprenoidbiosynthese als Quelle natürlicher Phosphoantigene......34
2.1
IPP-Biosynthese via Mevalonat............................................................................ 36
2.2
Biosynthese von IPP und DMAPP via 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat .. 37
2.2.1
Entdeckung einer MVA-unabhängigen Isoprenoidbiosynthese....................... 37
2.2.2
Gene, Enzyme und Zwischenprodukte............................................................. 38
2.3
Vorkommen des MVA- und des MEP-Wegs ...................................................... 44
2.4
Akkumulation von 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat durch
oxidativen Stress .................................................................................................... 45
3
Bisphosphonate als Stimulatoren von Vγ9Vδ2-T-Zellen .........................47
3.1
Mechanismus der antiresorptiven Wirkung von Bisphosphonaten.................. 48
3.1.1
Der Wirkmechanismus von Bisphosphonaten.................................................. 48
3.1.2
Wirkung auf andere Zellen des Knochenstoffwechsels ................................... 51
3.2
Anti-Tumor-Wirkung von Bisphosphonaten...................................................... 52
3.2.1
Inhibierung der Proliferation und Initiierung von Apoptose............................ 52
3.2.2
Hemmung der Tumorzell-Adhäsion, -Migration und –Invasion...................... 53
3.2.3
Einfluss auf die Sekretion von Wachstumsfaktoren......................................... 54
3.2.4
Inhibierung der Angiogenese ........................................................................... 54
3.2.5
In vivo Hemmung von Knochenmetastasen ..................................................... 54
3.2.6
Aktivierung von γδ-T-Zellen............................................................................ 54
3.2.7
Zusammenfassung der Anti-Tumor-Wirkung von Bisphosphonaten............... 55
4
Aufgabenstellung und Zielsetzung .............................................................56
C ERGEBNISSE UND DISKUSSION ....................................................57
1
Stimulation humaner Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Stickstoff enthaltende
Bisphosphonate ............................................................................................57
1.1
Messung der Stimulation von γδ-T-Zellen .......................................................... 57
1.1.1
Möglichkeiten zur Messung der Stimulation von T-Zellen ............................. 57
1.1.2
Prinzip der FACS-Analyse ............................................................................... 58
1.1.3
Messung der Stimulation von γδ-T-Zellen durch FACS-Analyse ................... 60
1.1.3.1 Messung von Aktivierungsmarkern auf γδ-T-Zellen ................................ 60
1.1.3.2 Messung der relativen Expansion von γδ-T-Zellen................................... 61
1.1.3.3 Allgemeine Bedingungen .......................................................................... 62
1.2
Stimulation von γδ-T-Zellen durch Phospho- und Aminoverbindungen ......... 63
1.2.1
Vergleich von Alkylphosphaten, Alkylphosphonaten und
1,1-Alkylenbisphosphonaten ............................................................................ 64
1.2.2
Vergleich von Amino-Verbindungen ............................................................... 65
1.2.3
Zusammenfassung ............................................................................................ 67
Inhalt
iii
1.3
Untersuchungen zur Stimulation von γδ-T-Zellen durch Zoledronat .............. 68
1.3.1
Stimulation von γδ-T-Zellen durch Bisphosphonate mit einem
stickstoffhaltigen Heterozyklus in der Seitenkette ........................................... 68
1.3.2
Vergleich des γδ-T-Zell-stimulatorischen Potentials etablierter
Bisphosphonate................................................................................................. 70
1.3.3
Zeitlicher Verlauf der Aktivierung ................................................................... 71
1.3.4
Proliferationshemmender Effekt von stickstoffhaltigen Bisphosphonaten ...... 75
1.3.5
1.4
Test verschiedener N-haltiger Bisphosphonate auf ihre Aktivität .................... 78
1.4.1
Screening .......................................................................................................... 78
1.4.2
Ermittlung der EC50-Werte ............................................................................... 86
1.4.3
Diskussion der ermittelten Aktivitäten ............................................................. 87
1.4.4
Vergleich der γδ-T-Zell-stimulierenden Wirkung von N-haltigen
Bisphosphonaten mit ihrem antiresorptiven Potential ...................................... 89
1.4.5
1.5
Präsentation von N-haltigen Bisphosphonaten ................................................... 93
1.5.1
Versuche zur Präsentation von Zoledronat....................................................... 93
1.5.1.1 Präsentation von Zoledronat durch THP-1 Zellen..................................... 93
1.5.1.2 Einfluss von Inkubationsdauer, Bisphospohonat-Konzentration und
Zellzahl ...................................................................................................... 94
1.5.1.3 Präsentation von Zoledronat durch unterschiedliche Zelllinien ................ 95
1.5.1.4 Präsentation von Zoledronat durch PBL.................................................... 95
1.5.1.5 Präsentation von Phosphoantigenen .......................................................... 97
1.5.1.6 Zusammenfassung ..................................................................................... 98
1.5.2
Versuche zum Mechanismus der Antigenpräsentation..................................... 99
1.5.2.1 Ko-Kultur................................................................................................... 99
1.5.2.2 Einfluss von Isoprenoidalkohlen und von alkalischer Phosphatase .......... 99
1.5.2.3 Saponin .................................................................................................... 101
1.5.2.4 Andauern des γδ-T-Zell-stimulierenden Potentials ................................. 102
1.5.2.5 Zusammenfassung ................................................................................... 103
2
Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen ......................................... 105
2.1
Antigene aus E. coli.............................................................................................. 105
2.1.1
Untersuchung der Bindungsfähigkeit an Lektine ........................................... 105
2.1.2
Massenspektrometrische Untersuchungen...................................................... 106
2.2
Versuche zu C. ammoniagenes ............................................................................ 110
2.2.1
Wirkung von Benzylviologen auf verschiedene Bakterien ............................ 110
2.2.2
Einfluss der Extraktionsmethode .................................................................... 111
2.2.3
Zeitverlauf der Benylviologen-abhängigen Produktion von γδ-T-ZellAntigenen........................................................................................................ 113
2.2.4
Einfluss anderer Stressoren auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität von
C. ammoniagenes............................................................................................ 114
2.2.5
Nachweis von 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat ....................... 115
2.2.6
Untersuchungen zur Art der γδ-T-Zell-stimulierenden Verbindungen und
Zusammenfassung .......................................................................................... 116
iv
Inhalt
D EXPERIMENTALTEIL .................................................................118
1
Material.......................................................................................................118
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
2
Geräte..........................................................................................................123
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
3
Chemikalien ......................................................................................................... 118
Sterile Röhrchen, Zellkulturgefäße und Pipetten............................................. 120
Medien und Puffer............................................................................................... 120
Zellen..................................................................................................................... 122
Bakterien .............................................................................................................. 122
Antikörper............................................................................................................ 123
Durchflusszytometer ........................................................................................... 123
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ................................................ 124
Hochleistungsflüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie
(HPLC-MS/MS) ................................................................................................... 124
Nanospray-Massenspektrometrie ...................................................................... 125
Headspace-GC ..................................................................................................... 125
Zentrifugen........................................................................................................... 126
Sonstige Geräte .................................................................................................... 126
Methoden ....................................................................................................127
3.1
Zellkultur.............................................................................................................. 127
3.1.1
Zählen von Zellen........................................................................................... 127
3.1.2
Kultur von PBL .............................................................................................. 127
3.1.3
Kultur von Zelllinien ...................................................................................... 127
3.2
Messung der Aktivierung und Proliferation von γδ-T-Zellen ......................... 127
3.2.1
Vorbereitung der zu testenden Verbindungen................................................ 127
3.2.2
Messung der Aktivierung von γδ-T-Zellen .................................................... 128
3.2.2.1 Messung des Anteils CD69-positiver γδ-T-Zellen.................................. 128
3.2.2.2 Messung des Anteils CD25-positiver γδ-T-Zellen.................................. 129
3.2.3
Messung der Proliferation von γδ-T-Zellen ................................................... 129
3.2.4
Messung der TNF-α-Sekretion von γδ-T-Zellen............................................ 129
3.3
Ermittlung der EC50-Werte für die Stimulation von γδ-T-Zellen durch
N-haltige Bisphsophonate und Phosphoantigene.............................................. 130
3.4
Versuche zur Charakterisierung der Stimulation von γδ-T-Zellen durch
N-haltige Bisphosphonate ................................................................................... 130
3.4.1
Bestimmung des Aktivierungsprofils ............................................................. 130
3.4.2
Einfluss von IL-2 auf die Aktivierung von γδ-T-Zellen................................. 130
3.4.3
Proliferationshemmender Effekt von N-haltigen Bisphosphonaten............... 130
3.5
Messung der Apoptose ........................................................................................ 131
3.5.1
Annexin V ...................................................................................................... 131
3.5.2
Apo2.7 ............................................................................................................ 131
3.6
Präsentationsexperimente................................................................................... 132
Inhalt
v
Entfernen der γδ-T-Zellen aus der PBL-Population mittels magnetischer
Zell-Separation..................................................................................................... 132
3.8
Gewinnung von Bakterienextrakten .................................................................. 133
3.7.1
Bakterienkultur ............................................................................................... 133
3.7.2
Zellaufschluss mittels Ultraschall................................................................... 133
3.7.3
Extraktion der Bakterienzellen mit Ethanol.................................................... 133
3.9
Bindung von bakteriellen Phosphoantigenen an Lektine ................................ 134
3.10 Hochleistungsflüssigchromatographie ............................................................... 134
3.11 Isopentenolbestimmung mittels Headspace-GC ............................................... 135
3.7
E LITERATURVERZEICHNIS ......................................................... 136
ANHANG
vi
Abkürzungsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
AI
AP
ATP
BrdU
BrHPP
BV
C. a.
CD
CDP
CDP-ME
CDP-MEP
CDR
CLO
CMV
CoA
CTP
DMAPP
DMNQ
DOX
DOXP
EBV
EC50
ED50
ELISA
ESI
ETI
FACS
FB-PP
FID
FITC
FOH
FPP
FPPS
FSC
GC
GGOH
GGPP
GPP
GTP
HIV
HLA
HMB-PP
HMG-CoA
HPLC
HSV-1
Aktivierungsindex
alkalische Phosphatase
Adenosintriphosphat
5-Brom-3’-desoxyuridin
Bromhydrinpyrophosphat
Benzylviologen
Corynebacterium ammoniagenes
cluster of differentiation
Cytidindiphosphat
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
complementarity determining region
Clodronat
Zytomegalievirus
Coenzym A
Cytidintriphosphat
Dimethylallylpyrophosphat
2,3-Dimethoxy-1,4-naphthoquinon
1-Desoxy-D-xylulose
1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat
Epstein-Barr-Virus
effective concentration 50
effective dosis 50
enzyme linked immunosorbent assay
Elektrosprayionisierung
Etidronat
fluorescence-activated cell sorting
3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat
Flammenionisationsdetektor
Fluoresceinisothiocyanat
Farnesol
Farnesylpyrophosphat
Farnesylpyrophosphat-Synthase
forward scatter (Vorwärts-Streulicht)
Gaschromatographie
Geranylgeraniol
Geranylgeranylpyrophosphat
Geranylpyrophosphat
Guanosintriphosphat
human immundeficiency virus
human leucocyte antigen
(E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-diphosphat
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
Hochleistungsflüssigchromatographie
Herpes simplex Virus Typ 1
Abkürzungsverzeichnis
IBA
IC50
IE
IFN-γ
IL
IPP
KIR
MEcPP
MEP
MHC
mRNA
MS
MS/MS
MVA
MVA-5-PP
n. d.
NADP
N-BP
NK-Zelle
ns
OD550
PAM
PBL
PE
PI
PMA
P-MVA
SCID
SRM
SSC
TNF-α
TPTX
TZR
UTP
ZOL
ZSF
vii
Ibandronat
inhibitory concentration 50
Internationale Einheit
Interferon-γ
Interleukin
Isopentenylpyrophosphat
killer inhibitory receptor
2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat
2-C-Methyl-D-eryhtritol-4-phosphat
major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
messenger RNA
Massenspektrometrie
Tandemmassenspektrometrie
Mevalonat
Mevalonsäure-5-diphosphat
nicht durchgeführt
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat
Stickstoff enthaltendes Bisphosphonat
Natürliche Killerzelle
nicht signifikant
Optische Dichte bei 550 nm
Pamidronat
periphere Blutlymphozyten
Phycoerythrin
Proliferationsindex
Phorbolmyristatacetat
Mevalonsäure-5-phosphat
severe combined immunodeficiency
selected-reaction-monitoring
sideward scatter (Seitwärts-Streulicht)
Tumornekrosefaktor-α
Thyroidea-Parathyroidea-ektomiert
T-Zell-Rezeptor
Uridintriphosphat
Zoledronat
Zerebrospinalflüssigkeit
Zusammenfassung
I
ZUSAMMENFASSUNG
In der vorliegenden Arbeit werden Studien zu verschiedenen Aspekten der Stimulation von
humanen Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten vorgestellt. Bisherige Untersuchungen lassen darauf
schließen, dass diese Zellpopulation an der Immunantwort gegenüber zahlreichen Bakterien,
Parasiten und Viren beteiligt ist. Darüber hinaus besitzen aktivierte Vγ9Vδ2-T-Zellen zytotoxisches Potential und zeigen in vitro lytische Aktivität gegen verschiedene Tumorzellen.
Eine gezielte Aktivierung und Expansion dieser Zellpopulation könnte also eine neue
Möglichkeit zur Immuntherapie bei Tumorerkrankungen darstellen. Zu den bisher bekannten
Vγ9Vδ2-T-Zell-stimulierenden Verbindungen gehören eine Anzahl niedermolekularer
phosphorylierter Substanzen (Phosphoantigene) sowie einige Aminobisphosphonate.
Bisphosphonate werden zur Behandlung überhöhter Knochenresorption eingesetzt. Sie
besitzen als gemeinsames Strukturmerkmal eine 1,1-Methylenbisphosphonsäure-Gruppe und
unterscheiden sich durch die Substituenten am Kohlenstoffatom. Wie unsere Arbeitsgruppe
zeigen konnte induziert das Aminobisphosphonat Pamidronat in vitro und in vivo die
Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Zellen (Kunzmann und Mitarbeiter, 1999; Kunzmann und
Mitarbeiter, 2000). Da es sich bei einigen Bisphosphonaten um zugelassene Medikamente
handelt, deren gute Verträglichkeit bekannt ist, bietet sich der Einsatz von γδ-T-Zellstimulierenden Bisphosphonaten zur in-vivo-Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten an.
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war daher die Charakterisierung der Erkennung von
Bisphosphonaten durch Vγ9Vδ2-T-Zellen.
Bisphosphonate als Stimulatoren von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten
Ausgehend von der Beobachtung, dass Aminobisphosphonate wie Pamidronat in Vγ9Vδ2-TZellen Effektorfunktionen und Proliferation induzieren können, während Bisphosphonate
ohne Stickstoff-Funktion, wie z. B. Etidronat, nicht aktiv sind, wurden verschiedene
Phosphonate auf ihre γδ-T-Zell-stimulierenden Eigenschaften untersucht. Weder die
Alkylmonophosphonate Ethyl- und Propylphosphonat noch 3-Aminopropylphosphonat
bewirkten eine Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten. Anscheinend ist also für die γδ-TZell-stimulierende Aktivität von Pamidronat und anderen Aminobisphosphonaten das
Vorhandensein sowohl der Methylenbisphosphonat-Gruppe als auch des Amino-Stickstoffs
entscheidend. Es wurden außerdem verschiedene Pamidronat-Derivate untersucht, die sich
durch Substituenten am Stickstoffatom unterscheiden. Die meisten dieser Verbindungen
konnten Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren, die Art der Substituenten hatte aber großen Einfluss
darauf, welche Konzentration des jeweiligen Bisphosphonats für eine γδ-T-Zell-Antwort nötig
war. Besonders negativ auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität wirkte sich aus, wenn das
Stickstoffatom Teil einer Säureamidbindung war. Das lässt darauf schließen, dass die
Gegenwart einer positiven Ladung (durch Protonierung des Stickstoffatoms) von Bedeutung
für die Bioaktivität dieser Verbindungen ist.
II
Zusammenfassung
Auch konnten wir erstmals zeigen, dass Bisphosphonate, wie z. B. Zoledronat, die anstelle
einer Aminogruppe einen stickstoffhaltigen Heteroaromaten enthalten, Vγ9Vδ2-T-Zellen
stimulieren. Untersuchungen zur zeit- und konzentrationsabhängigen Expression der
Aktivierungsmarker CD69 und CD25 auf γδ-T-Zellen ergaben für Zoledronat, das
Aminobisphosphonat Pamidronat und das Phosphoantigen Isopentenylpyrophosphat (IPP)
ähnliche Profile. Zoledronat bewirkte in Konzentrationen von 1 - 2 µmol/l die halbmaximale
Stimulation von γδ-T-Zellen; für IPP wurden Werte um 3 µmol/l ermittelt. Pamidronat
dagegen war mit einem EC50-Wert im Bereich von 8 µmol/l schwächer aktiv.
Beim Vergleich verschiedener Bisphosphonate mit stickstoffenthaltenden Heteroaromaten
(Fünfringe mit ein bis drei Stickstoffatomen) zeigte sich, dass sowohl die Position des
basischen Stickstoffatoms im Ring als auch Art und Position von Ringsubstituenten Einfluss
auf deren γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität haben (Abb. I zeigt dies am Beispiel
verschiedener (1,3-Thiazol-2-ylamino)methylenbisphosphonat-Derivate). Es ergaben sich
Hinweise, dass sich eine gesteigerte Neigung eine positive Ladung in der Seitenkette zu
tragen bei diesen Verbindungen genau wie bei Aminobisphosphonaten günstig auf das γδ-TZell-aktivierende Potential auswirkt.
O
O
H
N
N
S
O
H3C
OH
P
OH
P
OH
N
>
S
H3C
O
OH
O
N
P
S
H3C
O
4,4 µmol/l
O
OH
OH
OH
P
OH
P
OH
H
N
N
OH
OH
P
OH
P
S
>
O
91 µmol/l
OH
P
O
OH
OH
OH
CH3
4,4 µmol/l
H
N
H
N
H
N
N
>
OH
P
O
OH
O
OH
OH
8,0 µmol/l
H
N
N
≈
P
S
inaktiv
OH
>
P
S
Cl
O
OH
P
O
13 µmol/l
OH
OH
H3C
H
N
N
OH
P
P
S
O
OH
OH
OH
55 µmol/l
Abb. I: Einfluss von Art und Position von Ringsubstituenten auf das
γδ-T-Zell-stimulierende
Potential
verschiedener
(1,3-Thiazol-2-yl-amino)methylenbisphosphonat-Derivate; es sind jeweils die ermittelten EC50-Werte für die
γδ-T-Zell-Aktivierung angegeben.
In Gegenwart von Interleukin 2 (IL-2) induzierten Stickstoff enthaltende Bisphosphonate
(N-BPs) genau wie Phosphoantigene die Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten.
Allerdings hatten besonders die stärker aktiven Bisphosphonate in höheren Konzentrationen
gleichzeitig einen proliferationshemmenden Effekt. Die zytostatische Wirkung von N-haltigen
Bisphosphonaten ist an verschiedenen Tumorzelllinien demonstriert worden und beruht dort
wahrscheinlich auf der Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase (Green, 2000).
Zusammenfassung
III
Mechanismus der Bisphosphonat-vermittelten γδ-T-Zell-Aktivierung
Durch Behandlung mit Pamidronat wird die monozytäre Zelllinie THP-1 stimulierend für
Vγ9Vδ2-T-Zellen. In eigenen Versuchen wurde gezeigt, dass auch Zoledronat auf diese
Weise von THP-1 Zellen präsentiert werden kann. THP-1 Zellen stimulierten noch sechs Tage
nach Vorinkubation mit 100 µmol/l Zoledronat Vγ9Vδ2-T-Zellen; auch nach Wiedereinsetzen
des durch Zoledronat gehemmten Zellwachstums ließen sich γδ-T-Zellen durch „gepulste“
THP-1 Zellen aktivieren. Eine weitere monozytäre Zelllinie (U937) erlangte ebenfalls nach
Kontakt mit Zoledronat γδ-T-Zell-stimulierendes Potential – allerdings nur, wenn die U937
Zellen vorher mittels PMA aktiviert worden waren. Aber auch Zellen der erythroiden Zelllinie
K562 und der B-Zelllinie U266 konnten nach Vorinkubation mit Zoledronat Vγ9Vδ2-TZellen aktivieren, ebenso Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL). Dabei genügten bei den
PBL deutlich geringere Zoledronat-Konzentrationen um einen Effekt zu erzielen als bei den
untersuchten Zelllinien.
Es stellte sich die Frage, ob es sich bei der zellvermittelten Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Zellen
durch Zoledronat (und andere Stickstoff enthaltende Bisphosphonate) um eine Antigenpräsentation im klassischem Sinne handelt, d. h. ob Bisphosphonate im Kontext von Zelloberflächenmolekülen durch γδ-T-Lymphozyten erkannt werden. Für die indirekte
Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Zoledronat mittels THP-1 Zellen oder PBL war
Zell-Zell-Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und den γδ-T-Zellen Voraussetzung.
Die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die γδ-T-ZellAktivierung durch Zoledronat. Dies spricht dafür, dass Vγ9Vδ2-T-Zellen Oberflächenstrukturen auf anderen Zellen erkennen und dass freie Phosphoantigene bei der γδ-T-ZellStimulierung durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate keine Rolle spielen. Wurde die
Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat in Gegenwart von Saponin, einem
Detergenz das die Durchlässigkeit der Zellmembran reversibel erhöht, durchgeführt, reichten
deutlich niedrigere Konzentrationen des Bisphosphonats aus, um die THP-1 Zellen
stimulierend für γδ-T-Lymphozyten zu machen. Das ist ein Hinweis darauf, dass für die
Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Zoledronat (und andere Stickstoff enthaltende
Bisphosphonate) intrazelluläre Vorgänge in den „antigenpräsentierenden“ Zellen
verantwortlich sein könnten.
Beim Vergleich verschiedener N-BPs hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen und
ihrer antiresorptiven Potenz ergab sich eine erstaunlich gute Korrelation. Dies könnte darauf
hinweisen, dass beide Effekte durch den gleichen Mechanismus – die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase – zustande kommen. Bei verschiedenen Tumorzelllinien führt der
resultierende Mangel an Farnesyl- und Geranylgeranyldiphosphat zu Apoptose oder
Zytostase; diese Wirkungen N-haltiger Bisphosphonaten lassen sich durch Zugabe von
Farnesol oder Geranylgeraniol zumindest teilweise aufhaben. Dagegen verringerte die
Gegenwart der Isoprenoid-Alkohole während der Vorinkubation von THP-1 Zellen mit
Zoledronat deren γδ-T-Zell-stimulierendes Potential nicht, so dass vielleicht nicht die
Verarmung an längerkettigen Isoprenoiden sondern die Anreicherung von Vorläufern zu Veränderungen in den Zellen führt, die diese schließlich erkennbar für Vγ9Vδ2-T-Zellen machen.
IV
Zusammenfassung
Die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen zeigten, dass Vγ9Vδ2-T-Zellen durch eine
Vielzahl Stickstoff enthaltender Bisphosphonate stimuliert werden können. Es ergaben sich
einige Hinweise, dass dies indirekt über die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase
und der daraus resultierenden Akkumulation von Metaboliten der Isoprenoidbiosynthese in
„antigenpräsentierenden“ Zellen erfolgt. Dies könnte zu Veränderungen an der Zelloberfläche
führen, die von den γδ T Zellen erkannt werden. Neuere Arbeiten anderer Gruppen liefern
Ergebnisse, die diese Annahme stützen; ihre Bestätigung oder Widerlegung muss das Ziel
zukünftiger Forschung sein.
Bakterielle Phosphoantigene
Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen durchgeführt. Phosphoantigene sind niedermolekulare Verbindungen mit einer
Phosphat- oder Pyrophosphatgruppe, die Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren. Mikrobielle Metabolite
gehören zu den potentesten Phosphoantigenen. Mittels einer selektiven HPLC-MS/MSMethode gelang uns in einer E. coli-Probe der Nachweis eines Vγ9Vδ2-T-Zell-stimulierenden
Pyrophosphats mit der molaren Masse von 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat (FB-PP), einem
Phosphoantigen das in Mykobakterien gefunden worden war (Belmant und Mitarbeiter,
1999). Eine weitere Strukturaufklärung war aufgrund der äußerst geringen Konzentration des
Phosphoantigens nicht möglich. Später identifizierte eine andere Gruppe in gentechnisch
veränderten E. coli (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMB-PP), ein Isomer
von FB-PP, als Phosphoantigen (vgl. Abb. II) (Hintz und Mitarbeiter, 2001).
HO
OPP
Abb. II: (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat, ein Phosphoantigen aus E. coli.
Unsere Gruppe postulierte, das mikrobielle Phosphoantigene über den 2-C-Methylerythritol4-phosphat- (MEP) Weg der Isoprenoidbiosynthese gebildet werden (Jomaa und Mitarbeiter,
1999). 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) ist ein Zwischenprodukt dieses
mevalonat-unabhängigen Biosynthese-Wegs. Es wird in manchen Bakterien – z. B.
Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress verursacht durch Benzylviologen
(BV) akkumuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Extrakte aus C. ammoniagenes, die in
Gegenwart von BV kultiviert wurden, in einem höherem Maße Vγ9Vδ2-T-Zellen stimulieren
als Proben von Bakterien, die ohne BV-Zusatz wuchsen; MEcPP wirkte selbst nicht als
Phosphoantigen. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit
dem MEP-Weg assoziiert sind. Mit der Identifizierung von HMB-PP als Metabolit der
Mevalonat-unabhängigen Isopentenylpyrophosphat-Biosynthese wurde diese Hypothese
bestätigt (Hecht und Mitarbeiter, 2001).
Summary
V
SUMMARY
The present work focuses on different aspects of human Vγ9Vδ2 T lymphocyte stimulation.
Previous studies let to the conclusion that this cell population takes part in the immune
response to numerous bacteria, parasites and viruses. Moreover activated Vγ9Vδ2 T cells
have cytotoxic potential and are lytic to different tumour cells in vitro. Thus the specific
activation and expansion of this cell population could prove as a new mean in immunotherapy
of malignancies. Low molecular weight phosphorylated compounds (phosphoantigens) and
some aminobisphosphonates are amongst the Vγ9Vδ2 T cell stimulators known so far.
Bisphosphonates are used in the treatment of excessive bone resorption. They share a
common 1,1-methylene bisphosphonate group with different substituents at the carbon atom.
Our group could show that the aminobisphosphonate pamidronate induces Vγ9Vδ2 T cell
proliferation in vitro and in vivo (Kunzmann et al., 1999; Kunzmann et al., 2000).
Bisphosphonates present themselves as suitable candidates for the in vivo activation of
Vγ9Vδ2 T lymphocytes, since some of these compounds are already approved for medicinal
use and they are usually well tolerated. So a main focus of this work was the characterisation
of bisphosphonate recognition by Vγ9Vδ2 T cell.
Bisphosphonates as Vγ9Vδ2 T lymphocyte stimulators
Based on the observation that nitrogen containing bisphosphonates like pamidronate are able
to induce effector functions and proliferation in Vγ9Vδ2 T cells and that bisphosphonates
without the nitrogen function like etidronate are inactive, we studied the ability of different
phosphonates to stimulate γδ T cells. Neither the alkyl monophosphonates ethyl and propyl
phosphonate nor 3-aminopropylphosphonate were able to stimulate Vγ9Vδ2 T lymphocytes.
Apparently both the methylene bisphosphonate group and the amino group are crucial for the
Vγ9Vδ2 T cell stimulating ability of pamidronate and other aminobisphosphonates.
Additionally, we examined pamidronate derivates bearing different substituents at the
nitrogen atom. Most of these compounds activated Vγ9Vδ2 T cells. But the nature of the
substituent greatly influenced the bisphosphonate concentration necessary for γδ T cell
stimulation. When the nitrogen was part of an amide bond, there was a pronounced negative
effect on the Vγ9Vδ2 T cell stimulating capacity. It can be concluded that the bioactivity of
bisphosphonates depends on the presence of a positive charge (through protonation of the
nitrogen atom).
We also showed for the first time that bisphosphonates like zoledronic acid which contain a
heteroaromatic ring instead of an amino group stimulate Vγ9Vδ2 T cells. Studying the timeand concentration-dependent expression of the activation markers CD69 and CD25 on γδ T
cells we found similar profiles for zoledronic acid, the aminobisphosphonate pamidronate and
for the phosphoantigen isopentenyl pyrophosphate (IPP). The half maximal concentration for
stimulation of γδ T cells was 1 to 2 µmol/l for zoledronic acid and about 3 µmol/l for IPP.
Pamidronate with an EC50 of 8 µmol/l was less active.
VI
Summary
Comparing different bisphosphonates with nitrogen containing heteroaromatic side chains
(five membered rings containing one to three nitrogen atoms) we found that the position of
the basic nitrogen in the ring as well as the nature and position of ring substituents influenced
their γδ T cell stimulating activity (Figure I exemplifies that with varied derivates of 1,3thiazol-2-ylaminomethylene bisphosphonate). There was evidence that a higher tendency
towards a positive charge in the side chain had a positive effect on the Vγ9Vδ2 T cell
activating potential of these compounds, as we also found for aminobisphosphonates.
O
O
H
N
N
S
O
H3C
OH
P
OH
P
OH
N
>
OH
O
N
P
S
H3C
O
4,4 µmol/l
OH
OH
N
OH
P
OH
P
S
>
OH
OH
O
91 µmol/l
O
OH
H
N
OH
OH
CH3
OH
P
OH
P
O
O
OH
P
S
H3C
4,4 µmol/l
H
N
H
N
H
N
N
>
OH
P
O
OH
O
OH
OH
8,0 µmol/l
H
N
N
≈
P
S
inactive
OH
>
P
S
Cl
O
OH
P
O
13 µmol/l
OH
OH
H3C
H
N
N
OH
P
P
S
O
OH
OH
OH
55 µmol/l
Figure I: Influence of nature and position of ring-substituents on the γδ T cell stimulating
potential of various derivates of 1,3-thiazol-2-ylaminomethylene bisphosphonate;
the established EC50-values for γδ T cell activation are given.
Nitrogen containing bisphosphonates (NB-Ps) like phosphoantigens induce Vγ9Vδ2 T
lymphocyte proliferation when interleukin 2 (IL-2) is present. However, especially more
active bisphosphonates in higher concentrations simultaneously inhibited proliferation. The
cytostatic effect of N-containing bisphosphonates has been demonstrated with different tumor
cell lines and is in this case probably caused by inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase
(Green, 2000).
Summary
VII
Mechanism of the bisphosphonate-dependent γδ T cell activation
Pamidronate pulsed cells of the monocytic cell line THP-1 can stimulate Vγ9Vδ2 T cells. Our
own experiments showed that zoledronate can also be presented by THP-1 cells in this
manner. Six days after incubation with 100 µmol/l zoledronate, the THP-1 cells still
stimulated Vγ9Vδ2 T cells; zoledronate pulsed THP-1 cells activated γδ T cells even after the
cell growth that was inhibited by zoledronate resumed. The monocytic cell line U937 could be
pulsed with zoledronate only after PMA activation. Cells of the erythroide cell line K562 and
of the B cell line U266 also activated Vγ9Vδ2 T cells after incubation with zoledronate, as did
peripheral blood lymphocytes (PBL). There was a distinctly lower concentration of
zoledronate needed for PBL to become stimulatory as for the analyzed cell lines.
The question arised if the cell dependent activation of Vγ9Vδ2 T cells by zoledronate (and
other nitrogen containing bisphophonates) is classical antigen presentation, i. e. if γδ T
lymphocytes recognize bisphosphonates in the context of cell surface molecules. Cell-cellcontact between the presenting cells and the Vγ9Vδ2 T cells was necessary for the indirect
stimulation by zoledronate pulsed THP-1 cells or PBL. Alkaline phosphatase did not abolish
the γδ T cell activation by zoledronate. That points to the possibility that Vγ9Vδ2 T cells
recognize surface structures on other cells and that free phosphoantigens are not involved in
γδ T cell stimulation by nitrogen containing bisphosphonates. When THP-1 cells were
incubated with zoledronic acid in the presence of saponin, a detergent that reversibly
enhances the permeability of the cell membrane, the bisphosphonate concentration needed for
rendering THP-1 cells γδ T cell stimulating was clearly reduced. That indicated that
intracellular events caused by zoledronate (and other nitrogen containing bisphosphonates) in
the “antigen presenting cells” could result in their stimulating activity.
Comparing the γδ T cell stimulating activity of various N-BPs with their antiresorptive
potency produced an amazingly good correlation. This could indicate that both effects are
based on the same mechanism – the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase. In
different cell lines the resulting lack of farnesyl and geranylgeranyl diphosphate causes
apoptosis or cytostasis. These effects of N-containing bisphosphonate can be at least partly
averted by addition of farnesol or geranylgeraniol. In contrast to that the presence of these
isoprenoide alcohols during the incubation of THP-1 cells with zoledronate did not diminish
their γδ T cell stimulating potential. So maybe not the depletion of longer chain isoprenoids
but the accumulation of precursors results in changes that finally render the cells recognisable
by Vγ9Vδ2 T lymphocytes.
The experiments presented in this work show that Vγ9Vδ2 T cells are stimulated by a wide
variety of nitrogen containing bisphosphonates. Some of the results indicate that this
stimulation occurs indirectly by inhibition of the farnesyl pyrophosphate synthase and the
subsequent accumulation of metabolites of the isoprenoid synthesis in the “antigen
presenting” cells. This may lead to an alteration on the cell surface that is recognized by γδ T
cells. Recent work of other groups show results that back this assumption; it has to be the aim
of future studies to confirm or disproof it.
VIII
Summary
Bacterial phosphoantigens
Within the scope of this work we also conducted experiments concerning bacterial
phosphoantigens. Phosphoantigens are phosphorylated low molecular weight compounds
activating Vγ9Vδ2 T cells. Microbial metabolites are amongst the most potent
phosphoantigens. Using a selective HPLC-MS/MS method we detected in Escherichia coli a
Vγ9Vδ2 T cell stimulating pyrophosphate with the molecular mass of 3-Formyl-1-butyl
pyrophosphate (FB-PP), a phopsphoantigen found in mycobacteria (Belmant et al., 1999).
Due to the exceedingly low concentration of the phosphoantigen no further structure
determination was possible. Another group identified (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl
pyrophosphate (HMB-PP), an isomer of FB-PP, as phosphoantigen in genetically modified
E. coli (Fig. II) (Hintz et al., 2001).
HO
OPP
Figure II: (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate, a phosphoantigen in E. coli
Our group was first to postulate that microbial phosphoantigens are formed via the
2-C-Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway of isoprenoid biosyntheses (Jomaa et al.,
1999). 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) is an intermediate of this
mevalonate independent pathway. In some bacteria like Corynebacterium ammoniagenes this
compound is accumulated under conditions of oxidative stress caused by benzyl viologen
(BV). We showed that C. ammoniagenes extracts from bacteria cultivated in the presence of
BV had a higher Vγ9Vδ2 T cell stimulating capacity than from bacteria growing without
addition of BV. MEcPP itself was not a phosphoantigen. That was further evidence for the
association of bacterial phosphoantigens with the MEP-pathway. The identification of HMBPP as a metabolite of the mevalonate independent isopentenyl pyrophosphate biosynthesis
confirmed this hypotheses (Hecht et al., 2001).
1
A EINLEITUNG
T-Lymphozyten erkennen Antigene über Rezeptoren, die ähnlich wie Immunglobuline durch
somatische Rekombination gebildet werden. Während der molekularen Charakterisierung der
sogenannten α- und β-T-Zell-Rezeptorgene wurde ein weiteres Gen, das wie die
T-Zell-Rezeptorgene rearrangiert wird, entdeckt und als γ-Gen bezeichnet. In der Folge fand
man, dass einige T-Lymphozyten anstelle des konventionellen αβ-T-Zell-Rezeptors ein γδHeterodimer exprimieren (Brenner und Mitarbeiter, 1986; de Borst und Mitarbeiter, 1987;
Jitsukawa und Mitarbeiter, 1987; Band und Mitarbeiter, 1987).
Diese γδ-T-Lymphozyten scheinen phylogenetisch älter zu sein als αβ-T-Zellen (Richards
und Nelson, 2000). Sie wurden in allen bis heute untersuchten Wirbeltieren nachgewiesen.
Diese Konservierung spricht dafür, dass γδ-T-Zellen wichtige und nichtredundante
Funktionen erfüllen. In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Studien durchgeführt, die
eine Beteiligung von γδ-T-Lymphozyten in den verschiedensten Bereichen der Immunologie
– von der Abwehr von Infektionen durch Bakterien, Viren oder Parasiten, der
Tumorerkennung, der Immunregulation bis zu Allergien und Autoimmunerkrankungen –
zeigen. Die genaue Bedeutung der γδ-T-Zellen bleibt aber weiterhin unklar.
Eine besondere Untergruppe stellen die Vγ9Vδ2-T-Zellen der Menschen und Primaten dar.
Diese T-Zellen erkennen niedermolekulare, phosphorylierte Nicht-Protein-Antigene
(Phosphoantigene), die auch in zahlreichen Mikroorganismen vorkommen. Eine
entsprechende γδ-T-Zell-Population mit Reaktivität gegenüber Phosphoantigenen wurde bei
anderen Spezies bisher nicht nachgewiesen. Aktivierte Vγ9Vδ2-T-Zellen haben zytotoxisches
Potential und lysieren verschiedene Tumorzelllinien. Die in vitro oder in vivo Expansion
dieser Lymphozyten könnte ein neuer Ansatz zur Immuntherapie von Tumoren sein. Die
Charakterisierung der mikrobiellen Phosphoantigene war daher das Ziel intensiver Forschung.
Sie fand mit der Identifizierung des E. coli-Antigens (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyldiphosphat (Hintz und Mitarbeiter, 2001), eines als Metaboliten der Mevalonat-unabhängigen
Isoprenoidbiosynthese (Hecht und Mitarbeiter, 2001), ihr vorläufiges Ende.
Auch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate können Vγ9Vδ2-T-Zellen zur Proliferation
anregen. Der Mechanismus dieser Stimulation ist bisher noch wenig untersucht.
Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Stickstoff
enthaltende Bisphosphonate näher zu untersuchen. Dabei sollten durch den Test verschiedener
Bisphosphonate Hinweise zu den strukturellen Voraussetzungen für eine Wirksamkeit dieser
Verbindungen gefunden werden. Es galt außerdem, Erkenntnisse darüber zu gewinnen, auf
welchen Mechanismen die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Stickstoff enthaltende
Bisphosphonate beruht. Daneben sollten einige abschließende Versuche zu bakteriellen
Phosphoantigenen durchgeführt werden.
2
B Kenntnisstand
B KENNTNISSTAND
1
Die Stellung von γδ-T-Zellen im Immunsystem1
1.1
Überblick über das Immunsystem
Mit Immunsystem wird die Gesamtheit aller Verteidigungsmechanismen eines
Wirtsorganismus gegen Infektionserreger, d. h. gegen Bakterien, Viren, Parasiten und Pilze,
bezeichnet. Dabei kann man zwischen der unspezifischen angeborenen Immunität und der
antigenspezifischen erworbenen oder adaptiven Immunantwort unterscheiden. In beiden
Fällen können sowohl humorale als auch zelluläre Abwehrmechanismen zum Tragen
kommen.
1.1.1
Angeborene Immunität
Einen ersten Schutz gegen mögliche Krankheitserreger stellen die Epithelien der
Körperoberfläche dar. Können Pathogene diese Barriere nicht überqueren oder besiedeln,
kommt es zu keiner Infektion. Die Oberflächenepithelien wirken dabei nicht nur als
physisches Hindernis sondern es kommen auch chemische und mikrobiologische Faktoren
zum Tragen: So können zum Beispiel die Fettsäuren der Haut antibakteriell wirken oder die
normale Mikroorganismenflora kann mit pathogenen Mikroorganismen um Nährstoffe
konkurrieren. Überwindet ein Erreger diese erste Verteidigungslinie, so treten die
Mechanismen der nichtadaptiven Immunabwehr – Aktivierung des Komplementsystems,
Phagozytose, natürliche Killerzellen – in Aktion. Diese ist unspezifisch, kann dafür aber sehr
schnell – schon in den ersten Stunden der Infektion – reagieren.
1.1.1.1
Alternativer Weg der Komplementaktivierung
Das Komplementsystem besteht aus verschiedenen Plasmaproteinen. Eine Aktivierung dieses
Systems löst eine Kaskade von meist proteolytischen Reaktionen aus, von denen jede zur
Aktivierung der nächsten Komplementkomponente führt. Dabei entstehen aktive
Komponenten mit drei verschiedenen Effektorfunktionen: Es gibt Komplementkomponenten,
die kovalent an Bakterienoberflächen binden und diese so für Phagozyten zugänglich machen,
die Komplementrezeptoren tragen (sie opsonisieren die Bakterien); kleine Fragmente von
Komplementproteinen locken Phagozyten zum Infektionsherd und aktivieren sie und
schließlich schädigen die terminalen Komplementkomponenten bestimmte Bakterien durch
Porenbildung in deren Membran.
Beim alternativen Weg der Komplementaktivierung werden die Effektorfunktionen von
Komplement ausgelöst, wenn eine spontan aktivierte Komplementkomponente an die
Oberfläche eines Pathogens bindet. Der sogenannte klassische Weg der
Komplementaktivierung ist wahrscheinlich durch Hinzufügen einer spezifischen Erkennung
1
Immunologische Grundlagen nach Janeway und Travers (1997).
1. Stellung von γδ-T-Zellen im Immunsystem
3
aus dem ursprünglichen nichtadaptiven System entstanden: Hier wird die erste
Komplementkomponente durch Bindung an einen Antigen-Antikörper-Komplex aktiviert;
dieser klassische Weg ist also dem adaptiven Immunsystem zuzurechnen.
1.1.1.2
Phagozytose
Als Phagozytose bezeichnet man die Aufnahme von Partikeln, vor allem Bakterien, durch
Zellen. Bei den phagozytierenden Zellen handelt es sich meist um Makrophagen und
Neutrophile. Wird ein Bakterium von einem Phagozyten aufgenommen, befindet es sich
zunächst in einem Phagosom genannten Vesikel. Dieses verschmilzt mit einem Lysosom zum
Phagolysosom, wo die lysosomalen Enzyme den Erreger zerstören.
Phagozyten können verschiedene Bestandteile von Mikroorganismen erkennen. So besitzen
Makrophagen zum Beispiel den Mannoserezeptor und CD14, ein Protein das bakterielles
Lipopolysaccharid bindet. Darüber hinaus haben Phagozyten Rezeptoren für
Komplementproteine und sogenannte Fc-Rezeptoren, die an den Fc-Teil von Antikörpern
binden. Damit erkennen sie opsonisierte Pathogene – Pathogene, deren Oberfläche durch
gebundenes Komplement oder Antikörper verändert wurde.
Neben der Zerstörung von Mikroorganismen haben Phagozyten noch eine weitere wichtige
Aufgabe bei der Immunabwehr: Sie werden durch die Bindung von Erregern zur Freisetzung
verschiedener Zytokine angeregt. Diese haben eine Reihe von lokalen und systemischen
Effekten. Erstens verursachen sie Entzündungsreaktionen und locken damit weitere
Phagozyten und andere Immunzellen und –moleküle zum Ort der Infektion. Zweitens erhöhen
sie die Körpertemperatur, was einerseits das Wachstum einiger Mikroorganismen hemmt und
andererseits eine positive Wirkung auf die Immunantwort hat.
1.1.1.3
Natürliche Killerzellen
Die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) stellen neben den Phagozyten die zweite zelluläre
Komponente der angeborenen Immunität dar. Während durch das Zusammenwirken von
Komplementsystem und Phagozytose hauptsächlich extrazelluläre Pathogene bekämpft
werden können, dienen NK-Zellen der frühen Abwehr bestimmter intrazellulärer Erreger, wie
zum Beispiel Herpesviren und Listeria monocytogenes. NK-Zellen können empfindliche
Zielzellen abtöten, ohne dass sie vorher aktiviert werden müssen. In Gegenwart bestimmter
Zytokine, wie sie z. B. von Makrophagen gebildet werden, erhöht sich ihre Aktivität um ein
Vielfaches. Das Töten von Zellen wird durch einen Oberflächenrezeptor der NK-Zellen
vermittelt, der verschiedene Kohlenhydrat-Liganden erkennt, die auf sehr vielen Zellen
vorkommen. Damit nicht ungezielt körpereigene Zellen getötet werden, besitzen NK-Zellen
noch einen zweiten Typ von Rezeptoren: die killerhemmenden Rezeptoren (KIR; killer
inhibitory receptor). Diese binden an Proteine, die von den meisten Körperzellen exprimiert
werden, die sogenannten MHC-Klasse-I-Moleküle (vgl. Kap. B1.3). Erkennen die KIRs
MHC-I-Moleküle, so wird das zytotoxische Potential der NK-Zelle unterdrückt. Sind dagegen
durch eine Infektion die MHC-I-Moleküle verändert oder ist ihre Expression gehemmt, so
wird kein negatives Signal gesendet und die infizierte Zielzelle wird abgetötet.
4
1.1.2
B Kenntnisstand
Adaptive Immunität
Reicht die angeborene Immunität nicht aus, um eine Infektion zu bekämpfen, so kommen die
adaptiven Mechanismen der Immunabwehr zur Geltung. Dabei hilft die unspezifische Abwehr
nicht nur, den Erreger in Schach zu halten bis die adaptive Antwort einsetzt, sondern
beeinflusst auch die spezifischen Antworten auf verschiedene Weise.
Träger der adaptiven Immunabwehr sind die B- und T-Lymphozyten. Diese Immunzellen
besitzen antigenspezifische Rezeptoren. Vor einer Begegnung mit dem jeweils spezifischen
Antigen ist nur eine kleine Anzahl eines Zellklons mit dem entsprechenden Rezeptor
vorhanden. Daher erfolgt nach einer Infektion zunächst eine klonale Vermehrung der
antigenspezifischen Zellen und danach ihre Differenzierung zu Effektorzellen. Somit setzt die
adaptive Antwort erst nach einer gewissen Latenzzeit (vier bis neun Tage) ein. Zusätzlich zu
den Effektorzellen, welche die Immunreaktionen bewirken, werden auch sogenannte
Gedächtniszellen gebildet. Diese langlebigen Zellen stellen eine klonal expandierte
Population antigenspezifischer Lymphozyten dar. Im Falle einer erneuten Infektion mit dem
gleichen Erreger kommt es dadurch zu einer schnelleren und auch qualitativ besseren
adaptiven Immunreaktion.
Der erste Kontakt der naiven Lymphozyten mit ihrem Antigen erfolgt nicht am Ort der
Infektion, sondern in den peripheren lymphatischen Organen, z. B. den Lymphknoten.
Krankheitserreger werden vom Ort der Infektion mit der Lymphe abtransportiert und in den
lokalen Lymphknoten festgehalten. Dort werden sie von professionell antigenpräsentierenden
Zellen wie Makrophagen oder dendritischen Zellen aufgenommen und präsentiert. Einige
dieser Zellen nehmen das Antigen direkt an der Infektionsstelle auf und wandern dann
ebenfalls in den Lymphknoten. Naive T-Zellen zirkulieren ständig durch die Lymphknoten.
Treffen sie dabei auf eine antigenpräsentierende Zelle mit einem passenden Antigen, binden
sie an diese Zelle und beginnen zu proliferieren. Schließlich differenzieren sie zu
zytotoxischen T-Zellen, TH1-Zellen oder TH2-Zellen aus.
Zytotoxische T-Zellen und TH1-Zellen verlassen den Lymphknoten und wandern von den
Entzündungsreaktionen der angeborenen Immunabwehr angelockt an den Ort der Infektion.
Hier töten zytotoxische T-Lymphozyten ihre Zielzellen – virusinfizierte Zellen – ab.
TH1-Zellen sind wichtig für die Bekämpfung intrazellulärer Bakterien. Sie aktivieren am
Infektionsort Makrophagen und unterstützen so die Vernichtung der Erreger.
Die TH2-Zellen oder T-Helferzellen aktivieren antigenspezifische naive B-Lymphozyten, die
ebenfalls durch die Lymphknoten wandern. Diese vermehren sich daraufhin und
differenzieren schließlich zu Plasmazellen aus. Diese B-Effektorzellen sind die Vermittler der
adaptiven humoralen Immunität. Sie sezernieren Antikörper, die hochaffin für das jeweilige
Antigen sind. Durch Bindung der Antikörper an Toxine, Viren oder Bakterien können diese
neutralisiert werden. Weiterhin werden so opsonisierte Pathogene von Phagozyten erkannt
und zerstört. Außerdem löst die Bindung von Antikörper an Antigen den Initialschritt des
klassischen Wegs der Komplementaktivierung aus (vgl. Kapitel B1.1.1.1).
1.2
1.2.1
5
Struktur des T-Zell-Rezeptors und Entwicklung der T-Zellen
Der T-Zell-Rezeptorkomplex
Der T-Zell-Rezeptor (TZR) ist aus zwei Polypeptidketten aufgebaut, die miteinander über
eine Disulfidbrücke verbunden sind. Jede Kette besteht aus einer konstanten und einer
variablen Domäne sowie einer Transmembranregion. Die Antigenbindungsstelle wird dabei
von den variablen Regionen beider Polypeptidketten gebildet (vgl. Abb. 1).
Antigenbindungsstelle
variable Region (V)
konstante Region (C)
Gelenk
Transmembranregion
zytoplasmatischer Schwanz
Disulfidbrücke
α-Kette
γ-Kette
β-Kette
δ-Kette
Abb. 1: Schematische Darstellung des T-Zell-Rezeptors.
Es gibt zwei verschiedene Typen von T-Zell-Rezeptoren. Der eine besteht aus dem αβ-, der
andere aus dem γδ-Heterodimer. Dabei sind die αβ-T-Zellen die „klassischen“
T-Lymphozyten. Der größte Teil der zirkulierenden T-Zellen (ca. 90 – 99 %) gehört zu dieser
Klasse. Sie sind für die bekannten Effektorfunktionen der adaptiven Immunität
verantwortlich, die in Kapitel B1.4 dargestellt sind. Die γδ-T-Lymphozyten, die erst vor
wenigen Jahren entdeckt wurden, stellen in der Peripherie nur eine kleine Population dar.
Dagegen kommen sie in bestimmten Organen, wie z. B. den Epithelien, sehr zahlreich vor.
Über ihre Bedeutung ist bisher noch wenig bekannt. Strukturell sind sich die Rezeptoren
beider T-Zell-Populationen sehr ähnlich.
Die zytoplasmatischen Domänen des T-Zell-Rezeptors sind zu klein, um ein Signal an das
Zellinnere übertragen zu können. Daher ist der Rezeptor stabil mit einem Komplex aus
verschiedenen Proteinen, dem sogenannten CD3-Komplex, an der Zelloberfläche verbunden.
Wird ein Antigen erkannt, so wird durch die Phosphorylierung bestimmter Bereiche in den
zytoplasmatischen Regionen der CD3-Proteine eine Signalkaskade gestartet.
6
B Kenntnisstand
Die αβ-T-Zellen brauchen zur Antigenerkennung zusätzlich zum T-Zell-Rezeptor:CD3Komplex noch einen sogenannten Korezeptor. Es handelt sich dabei um die
Zelloberflächenproteine CD4 und CD8, wobei jedes für eine bestimmte Gruppe von
αβ-T-Zellen charakteristisch ist: TH1- und TH2-Zellen exprimieren CD4, die zytotoxischen
T-Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein von CD8 aus. γδ-T-Zellen besitzen meist
keines der beiden Moleküle.
1.2.2
T-Zell-Rezeptorgene
T-Zellen können eine sehr große Vielfalt von Antigenen erkennen. Dafür ist eine
entsprechend hohe Anzahl verschiedener Rezeptoren notwendig. Existierte für jeden dieser
Rezeptoren ein eigenes Gen, so wäre dementsprechend eine große Zahl unterschiedlicher
Gene nötig. Tatsächlich werden aber die T-Zell-Rezeptorgene aus einer begrenzten Anzahl
von Gensegmenten durch somatische Rekombination gebildet. Die konstante Domäne der
Rezeptorketten wird durch die C-Region codiert; für die β- und γ-Kette existieren jeweils
zwei C-Segmente. Die variable Domäne der α- und γ-Kette wird von zwei verschiedenen
DNA-Abschnitten codiert, dem V-Segment (variable) und dem J-Segment (joining). Die βund δ-Kettengene besitzen zusätzlich noch D-Segmente (diversity) (vgl. Abb. 2).
α-Kette
Vα/δ
x 56
β-Kette
Jα x 61
Dδ x 3 Jδ x 4
Cδ
Vδ3
δ-Kette
Cα
Vβ
Vγ
x 67
x 15
Cβ1
Dβ1 Jβ x 6
Jγ x 3
Cγ1
Dβ2
Jβ x 7
Jγ x 2
Cβ2
Cγ2
γ-Kette
Abb. 2: T-Zell-Rezeptorgene.
IMGT, the international ImMunoGeneTics database: http://imgt.cines.fr
Eine strukturelle Besonderheit weist der T-Zell-Rezeptor δ-Locus auf. Er liegt nämlich
vollständig innerhalb des Locus für die α-Kette. Die Vδ-Segmente sind zwischen den
Vα-Segmenten eingestreut; einige können sowohl Bestandteil des α-Kettengens als auch des
δ-Kettengens werden. Ein Vδ-Segment befindet sich in umgekehrter Leserichtung am 3’-Ende
des Cδ-Gensegments.
7
Im Zuge der Entwicklung von Lymphozyten-Vorläufer zu reifen T-Zellen im Thymus findet
eine Umordnung der Rezeptorkettengene statt. In der α- und der δ-Kette wird ein V-Segment
mit einem J-Segment verknüpft. Bei der β- und γ-Kette erfolgen zwei Rekombinationen,
wodurch die codierende VDJ-Sequenz entsteht. Die umgeordnete DNA wird anschließend
transkribiert. Durch Spleißen wird der nichtcodierende Bereich zwischen dem J- und
C-Segment entfernt. So entsteht die mRNA, die schließlich in eine Polypeptidkette des
T-Zell-Rezeptors übersetzt wird.
Alleine durch die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten von V(D)J-Gensegmenten
sowie durch die Paarung aller möglichen α- bzw. δ-Ketten mit allen möglichen β- bzw.
γ-Ketten würde eine sehr hohe Zahl verschiedener T-Zell-Rezeptoren entstehen
(kombinatorische Vielfalt). Allerdings werden nicht alle theoretisch möglichen
Kombinationen gefunden. Es gibt aber noch weitere Mechanismen, die erheblich zur Vielfalt
des Repertoires beitragen. Die sogenannte junktionale Diversität entsteht durch
Ungenauigkeiten beim Verknüpfen der V- und J- bzw. V-, D- und J-Segmente. Durch
Deletion und Hinzufügen von Nukleotiden in den Verbindungstücken dieser Gensegmente
können die umgelagerten Gene nicht in der Keimbahn codierte Basenpaare an den
Berührungsstellen zwischen den V-, (D-) und J-Segmenten besitzen. Besonders bei den
γδ-T-Zellen wird die Rezeptorvielfalt noch dadurch erhöht, dass bis zu drei D-Segmente in
das δ-Kettengen eingebaut werden können (Hayday, 2000).
Obwohl die γδ-T-Zell-Rezeptorgene erheblich weniger V- und J-Segmente besitzen als die
Gene für die α- und β-Ketten können aufgrund höherer junktionaler Vielfalt theoretisch sogar
mehr unterschiedliche γδ- als αβ-T-Zell-Rezeptoren gebildet werden (McVay und Carding,
1999). Allerdings erscheint das beobachtete γδ-T-Zellrepertoire wenig divers. So wird die
Vδ2-Kette fast ausschließlich mit der Vγ9-Kette koexprimiert. Die Vγ9Vδ2-T-Zellen stellen
den Hauptteil (50 – 98 %) der γδ-T-Lymphozyten im peripheren Blut Erwachsener dar. In
anderen Organen, besonders in den Epithelien, überwiegen Vδ1-T-Zellen. Hier kommen
verschiedene Vγ-Ketten (außer Vγ9) vor. Die dritte häufiger vorkommende
γδ-T-Zellpopulation hat eine Vδ3-Rezeptorkette. Die Produkte der anderen fünf funktionellen
Vδ-Gene werden nur selten auf der Zelloberfläche exprimiert.
1.2.3
Struktur des T-Zell-Rezeptors
Die Struktur des αβ-T-Zell-Rezeptor-Heterodimers ist relativ gut dokumentiert (Garcia und
Mitarbeiter, 1999). Der dreidimensionale Aufbau des γδ-T-Zell-Rezeptors konnte vor kurzer
Zeit durch Röntgenstrukturanalyse einer Vδ3-Kette (Li und Mitarbeiter, 1998) und eines
Vγ9Vδ2-Heterodimers (Allison und Mitarbeiter, 2001) direkt ermittelt werden. Die Struktur
des γδ-T-Zell-Rezeptors ähnelt sowohl dem αβ-T-Zell-Rezeptor als auch den FabFragmenten von Antigenen; es zeigen sich aber auch charakteristische Unterschiede (Allison
und Garboczi, 2001; Wilson und Stanfield, 2001).
8
B Kenntnisstand
Der eigentliche antigenbindende Bereich der Rezeptoren umfasst nicht die gesamte variable
Domäne, sondern wird durch die sogenannten komplementaritätsbestimmenden Regionen
(complementarity determining region, CDR) gebildet. Das sind je drei Aminosäuresequenzen
pro Rezeptorkette, die Schleifen am Rand von β-Faltblättern (der strukturellen Basis) bilden
und in der gefalteten Form des Proteins nebeneinander liegen. CDR1 und CDR2 werden
innerhalb der V-Gensegmente der Keimbahn codiert, am CDR3 sind dagegen auch D- und
J-Segmente beteiligt. CDR3 weist daher eine besonders hohe Variabilität auf. Es liegt im
Zentrum der Antigenbindungsstelle, während die weniger variablen CDR1- und
CDR2-Schleifen die Peripherie bilden.
1.2.4
Entwicklung der T-Lymphozyten
B- und T-Lymphozyten entstehen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen, die sich
im Knochenmark aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen entwickeln. Die B-Zellen
differenzieren im Knochenmark. T-Zellen wandern dagegen in einem sehr frühen Stadium in
den Thymus und reifen dort heran. Die T-Zellproduktion im Thymus ist vor der Pubertät am
stärksten, dann beginnt der Thymus zu schrumpfen. Erwachsene bilden nur noch in geringem
Umfang neue T-Zellen; die T-Zellimmunität bleibt auch nach einer Thymektomie erhalten.
Die verschiedenen Stadien der T-Zellreifung lassen sich anhand von Oberflächenmolekülen
unterscheiden (vgl. Abb. 3). Bei den Vorläuferzellen aus dem Knochenmark sind die
Rezeptorgene noch nicht umgeordnet und es fehlen die meisten für T-Zellen
charakteristischen Oberflächenmoleküle. Im Laufe der Zeit exprimieren die T-Zellvorläufer
CD44 und später auch CD25. Die CD44+CD25+-Zellen beginnen mit der Umlagerung des
β-Kettengens.2 Dadurch werden sie zu CD44niedrigCD25+-Zellen. Sind die Gene für die
β-Kette produktiv umarrangiert, werden sie transkribiert und die β-Kette erscheint gepaart mit
einer konstanten prä-α-Kette (pTα) auf der Zelloberfläche. Dies führt zum Verlust von CD25,
zum Abbruch der Umlagerung der β-Kette, der Expression von CD4 und CD8 und zur
Proliferation der Zelle. Ab hier spricht man wegen des gemeinsamen Auftretens der beiden
Korezeptormoleküle von doppelt positiven Zellen; bei den vorhergehenden Stadien spricht
man von doppelt negativen Zellen. Nach Ende der Proliferationsphase beginnt die
Umordnung der α-Kette. Dadurch entstehen doppelt positive Zellen, die das αβ-Heterodimer
auf der Zelloberfläche tragen. Bevor diese Zellen endgültig zu reifen T-Lymphozyten werden,
die dann nur noch CD4 oder CD8 exprimieren (einfach positive Zellen), müssen sie noch eine
positive und eine negative Selektion überstehen.
2
Auch die γ- und δ-Ketten werden jetzt umarrangiert.
9
αβ-T-Zellen erkennen Peptidantigene, die durch spezialisierte Oberflächenmoleküle, die
MHC-Moleküle, präsentiert werden (vgl. Kap. B1.3). Daher können nur solche Zellen einen
Beitrag zur Immunabwehr leisten, die körpereigene MHC-Moleküle erkennen. Bei der
positiven Selektion erhalten die Zellen ein überlebenswichtiges Signal, deren αβ-T-ZellRezeptor an ein MHC-Molekül binden kann (Selbst-MHC-Restriktion). Alle anderen
Vorläuferzellen gehen zugrunde. Die negative Selektion verhindert, dass T-Zellen
körpereigene Peptide erkennen, die ebenfalls durch MHC-Moleküle präsentiert werden
(Induktion von Selbst-Toleranz). Hier erhalten Zellen, die Selbst-MHC:Selbst-PeptidKomplexe erkennen, ein Signal, das sie in die Apoptose treibt.
UMORDNUNG DER β-KETTE
UMORDNUNG DER γ- und δ-KETTE
doppelt negative
Zellen
CD44+
CD25-
CD44niedrig
CD25+
CD44+
CD25+
CD44niedrig
CD25pTαβ CD3niedrig
PROLIFERATION
UMORDNUNG
DER α-KETTE
γδ CD3+
doppelt positive
Zellen
CD4+8+
SELEKTION αβ CD3niedrig
CD4+8+
pTαβ CD3niedrig
einfach positive
Zellen
Apoptose
CD4+
αβ CD3+
CD8+
αβ CD3+
Abb. 3: Entwicklung der T-Lymphozyten im Thymus; Erläuterungen im Text.
γδ-T-Zellen entwickeln sich im Thymus aus den gleichen Vorläufern wie die αβ-T-Zellen.
Sie unterliegen aber keiner Selektion. Die meisten γδ-T-Zellen entstehen aus CD44+CD25+und CD44niedrigCD25+-Vorläufern (Berg und Kang, 2001). Es ist noch nicht geklärt, durch
welche Mechanismen die Entwicklung der gemeinsamen Vorläuferzellen in Richtung der αβoder γδ-T-Zelllinie festgelegt wird und in welchem Stadium der Reifung das geschieht. Eine
Übersicht zum aktuellen Stand der Forschung findet sich bei MacDonald und Mitarbeitern
(2001).
10
1.3
B Kenntnisstand
Die Antigenerkennung durch αβ-T-Lymphozyten
αβ-T-Zellen erkennen Peptidantigene, die auf der Zelloberfläche anderer Zellen präsentiert
werden. Diese antigenpräsentierenden Zellen können Pathogene oder deren Produkte aus der
extrazellulären Flüssigkeit aufnehmen oder Proteine intrazellulärer Pathogene verarbeiten.
Die komplexen Erreger oder Proteine werden zu kurzen Peptidketten abgebaut (Antigenverarbeitung), binden dann an dafür spezialisierte Glykoproteine, die MHC-Moleküle3, und
werden von diesen an die Zelloberfläche transportiert (Antigenpräsentation). Die MHCMoleküle bestehen aus zwei Polypeptidketten, die sich zu vier Domänen falten. Zwei der
Domänen bilden einen Spalt an der Oberfläche des Moleküls; hier wird das Peptid gebunden.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II. Die
verschiedenen Klassen nehmen Peptide aus unterschiedlichen Zellkompartimenten auf. MHCKlasse-I-Moleküle präsentieren Antigene von Erregern, die sich im Zytosol aufhalten. Dabei
handelt es sich um Viren und bestimmte Bakterien wie z. B. Listerien. Der Peptid:MHCI-Komplex wird von den zytotoxischen CD8-T-Zellen erkannt, welche dann die befallene
Zelle abtöten. Da alle kernhaltigen Zellen von Viren infiziert werden können, exprimieren die
meisten Körperzellen MHC-I. MHC-II dagegen findet sich hauptsächlich auf professionell
antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen und B-Zellen.
Viele Bakterien und einige Parasiten wachsen in Vesikeln (Endosomen und Phagosomen) von
Zellen, besonders von Makrophagen. Peptide, die von derartigen pathogenen Organismen
stammen, werden von MHC-Klasse-II-Molekülen aufgenommen und an der Zelloberfläche
ausgestellt. Auch B-Zellen präsentieren Antigene durch MHC-II-Moleküle. Erkennen
B-Lymphozyten extrazelluläre Pathogene oder Toxine mit ihrem Antigenrezeptor, können sie
diese internalisieren und in angesäuerten Vesikeln zu Peptiden abbauen. CD4-T-Zellen
erkennen Peptide im Kontext von MHC-Klasse-II. TH2-Zellen aktivieren daraufhin
Makrophagen, damit diese intravesikuläre Bakterien und Parasiten abtöten können.
TH1-Zellen dagegen aktivieren B-Zellen und damit eine humorale Immunantwort gegen
Bakterien und Toxine.
Es gibt noch eine weitere Klasse von Antigenen, die an MHC-II-Moleküle binden. Die
sogenannten Superantigene sind bakterielle Toxine, wie z. B. das StaphylokokkenEnterotoxin oder das Toxischer-Schock-Syndrom-Toxin-I. Superantigene werden nicht
verarbeitet und im peptidbindenden Spalt des MHC-Moleküls präsentiert. Vielmehr binden
sie an die äußere Oberfläche sowohl des MHC-II-Moleküls als auch des T-Zell-Rezeptors.
Dadurch können 2 – 20 % aller T-Zellen (hauptsächlich CD4-T-Zellen) aktiviert werden. Es
kommt zu einer massiven Zytokinproduktion. Die Zytokine zeigen systemische Toxizität und
hemmen die adaptive Immunantwort. Beide Effekte tragen zur mikrobiellen Pathogenität bei.
3
MHC steht für Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex), ein Gencluster, in dem
die MHC-Moleküle codiert werden. Der MHC ist polygen und hochpolymorph. Die einzelnen Gene beim
Menschen heißen HLA-A, -B und –C (Klasse-I) und HLA-DP, -DQ und –DR (Klassse-II)
(HLA: human leucocyte antigen).
11
CD1-Moleküle sind ebenfalls antigenpräsentierende Proteine.4 Ihre Struktur ähnelt den MHCMolekülen, allerdings werden sie außerhalb des MHC codiert. Die antigenbindende Region
der CD1-Moleküle wird fast ausschließlich von hydrophoben Aminosäuren gebildet.
Dementsprechend fand man, dass CD1-Moleküle keine Peptide, sondern hochkonservierte
Lipide und Glykolipide aus der Zellwand intrazellulärer Bakterien präsentieren.
CD1-Moleküle werden hauptsächlich auf professionell antigenpräsentierenden Zellen
exprimiert und von zytotoxischen T-Zellen erkannt. Es wird spekuliert, dass CD1-restringierte
T-Zellen besonders bei der Bekämpfung von Pathogenen eine Rolle spielen, die einer MHCvermittelten Antigenpräsentation entgehen.
1.4
1.4.1
Effektorfunktionen von αβ-T-Zellen
Zytotoxische T-Zellen
Die Hauptfunktion der CD8-T-Zellen ist das Töten virusinfizierter Zellen. Nachdem eine
zytotoxische T-Zelle ihr Antigen erkannt hat, induziert sie bei der Zielzelle Apoptose, den
programmierten Zelltod. Bei der Apoptose werden Zellen durch die Wirkung zelleigener
Enzyme zerstört. Deswegen spricht man auch vom „zellulären Suizid“. Eine wichtige Rolle
spielen dabei die Caspasen, eine Familie intrazellulärer Cystein-Proteasen. In Folge der
Aktivierung der Caspase-Kaskade kommt es zu Veränderungen in der Plasma- und
Mitochondrienmembran, zur Fraktionierung der genomischen DNA, zur Kondensation von
Zytoplasma und Kern und schließlich zur Aufspaltung der Zelle in membranumhüllte
Fragmente („apoptotic bodies“), die rasch phagozytiert werden. Enzyme, die bei der Apoptose
induziert werden, können auch zytosolische Krankheitserreger zerstören.
CD8-T-Zellen induzieren Apoptose vor allem durch die Freisetzung bestimmter Zytotoxine.
Diese Perforine und Granzyme sind in lytischen Granula gespeichert und werden nach der
Bindung des T-Zell-Rezeptors an sein Antigen gezielt an der Kontaktstelle zur Zielzelle
freigesetzt. Die Perforine bauen sich in die Membran der Zielzelle ein und bilden Poren.
Durch diese können die Granzyme – Serinproteinasen – eindringen und eine Enzymkaskade
aktivieren, die zur Apoptose führt. Eine einzelne CD8-T-Zelle kann so nacheinander viele
Zielzellen vernichten. Eine untergeordnete Rolle bei der Wirkung von CD8-T-Zellen spielt
die Aktivierung von Fas (CD95), ein Rezeptor, der auf vielen unterschiedlichen Zellen
vorkommt. Zytotoxische T-Zellen exprimieren den Fas-Liganden (CD95L) in ihren
Membranen. Binden zytotoxische T-Zellen über diesen Liganden an den CD95-Rezeptor,
wird in der Zielzelle Apoptose induziert.
Zytotoxische CD8-T-Zellen produzieren auch Zytokine, besonders Interferon-γ (IFN-γ).
IFN-γ inhibiert direkt die virale Replikation und induziert eine gesteigerte Expression von
MHC-I-Molekülen auf Zielzellen. Außerdem aktiviert es Makrophagen und lockt sie zu den
Infektionsherden. Das ist ein wichtiges Element bei der Bekämpfung zytosolischer Parasiten.
4
Eine Übersicht über die CD1-Moleküle findet sich bei Sugita (2000) und Jayawardena-Wolf (2001).
12
1.4.2
B Kenntnisstand
CD4-T-Zellen
Die beiden Arten von CD4-T-Zellen, TH1- und TH2-Zellen, lassen sich nicht anhand von
Oberflächenmolekülen unterscheiden, sondern nur durch ihre unterschiedlichen Funktionen
und damit auch anhand der Zytokine, die sie produzieren. Charakteristisch für eine
TH1-Antwort ist IFN-γ, das wichtigste TH2-Zytokin ist Interleukin-4 (IL-4). Diese beiden
Zytokine spielen bei der Aktivierung von Makrophagen bzw. B-Zellen durch TH1- bzw.
TH2-Zellen eine Rolle.
TH1-Zellen aktivieren Makrophagen, indem sie IFN-γ freisetzen und gleichzeitig den
CD40-Liganden (CD40L) auf der Zelloberfläche exprimieren. Makrophagen besitzen mit dem
IFN-γ-Rezeptor und mit CD40 Rezeptoren für beide Proteine. Durch die Bindung von CD40L
werden Makrophagen sensibilisiert und können danach effektiv von IFN-γ aktiviert werden.
Aktivierte Makrophagen können aufgenommene Erreger wirkungsvoller zerstören. Vor allem
werden sie befähigt, Pathogene zu vernichten, die in Vesikeln nichtaktivierter Makrophagen
überleben können5. Zusätzlich setzen aktivierte Makrophagen toxische Mediatoren wie
Sauerstoffradikale, Stickstoffoxid und antimikrobielle Peptide frei, die gegen extrazelluläre
Pathogene wirken. Außerdem verändern sich aktivierte Makrophagen so, dass ihre
Immunantwort verstärkt wird.
TH1-Zellen haben neben der Makrophagenaktivierung auch noch weitere Funktionen. Sie
exprimieren Fas-Ligand und können Apoptose in chronisch infizierten Makrophagen
induzieren, welche die Fähigkeit verloren haben, intrazelluläre Bakterien zu zerstören.
Außerdem setzen sie weitere Zytokine frei, welche die Differenzierung von Makrophagen im
Knochenmark induzieren und diese an den Infektionsort locken.
Naive B-Zellen werden über einen ähnlichen Mechanismus wie Makrophagen aktiviert. Sie
benötigen ebenfalls zwei Signale. Das erste Signal ist die Bindung von CD40L auf
TH2-Zellen durch CD40 der B-Zellen. Als zweites Signal setzt die TH2-Zelle IL-4 frei.
Daraufhin beginnen die B-Zellen zu proliferieren und differenzieren schließlich zu
antikörpersezernierenden Plasmazellen aus. Auch die späteren Stadien der Aktivierung von
B-Zellen werden von TH2-Zellen durch die Produktion zweier weiterer Zytokine – IL-5 und
IL-6 – beeinflusst.
Wie die Differenzierung von CD4-T-Zellen in TH1- und TH2-Zellen gesteuert wird, ist nicht
genau bekannt. Eine Rolle spielt dabei, welche Zytokine in den frühen Phasen einer Infektion
gebildet werden. Art und Menge der antigenen Peptide können ebenfalls die funktionelle
Differenzierung der CD4-T-Lymphozyten beeinflussen. Die beiden Untergruppen der
CD4-T-Zellen beeinflussen sich auch gegenseitig. So hemmt das von TH2-Zellen produzierte
Zytokin TGF-β das Wachstum von TH1-Zellen. Umgekehrt setzen TH1-Zellen IFN-γ frei, das
die Proliferation von TH2-Zellen verhindert.
5
Mykobakterien z. B. persistieren in Phagosomen, indem sie ihre Verschmelzung mit Lysosomen inhibieren.
1.5
13
Antigene für γδ-T-Lymphozyten
Im Gegensatz zu αβ-T-Zellen, die überwiegend Peptidantigene erkennen, sind die Antigene,
die von γδ-T-Zellen erkannt werden, äußerst divers: So können nichtklassische MHCProteine, nicht näher charakterisierte Liganden auf verschiedenen Tumorzellen, mikrobielle
Proteine, aber auch Phosphate aus dem Isoprenoidstoffwechsel eine T-Zell-Rezeptorabhängige Stimulation von γδ-T-Lymphozyten auslösen. Die Antigenerkennung unterscheidet
sich fundamental von der der αβ-T-Zellen, da weder Antigenprozessierung noch MHCRestriktion eine Rolle spielen. Es ist auch nicht geklärt, ob antigenpräsentierende Moleküle
für γδ-T-Zellen existieren.
1.5.1
Vγ9Vδ2-T-Zellen
1.5.1.1
Phosphoantigene
Bakterielle und parasitäre Phosphoantigene
Die Mehrzahl der humanen γδ-T-Lymphozyten im Blut und in den peripheren lymphatischen
Organen besitzt einen Vγ9Vδ2-T-Zell-Rezeptor. Diese Vγ9Vδ2-T-Zellen scheinen in vivo bei
mykobakteriellen Infektionen aktiviert zu werden. So fanden Modlin und Mitarbeiter (1989),
dass sich bei Patienten mit Lepra (Mycobacterium leprae) γδ-T-Zellen in pathogenhaltigen
Hautläsionen anreichern. Untersuchungen von Pfeffer und Mitarbeitern (1992) zeigten, dass
Vγ9Vδ2-T-Zellen durch niedermolekulare (< 3 kDa) Protease-resistente Bestandteile
mykobakterieller Lysate zur Proliferation angeregt werden. Die Gruppe von Kaufmann
schließlich konnte nachweisen, dass Behandlung mit alkalischer Phosphatase die Aktivität
von mykobakteriellen Extrakten zerstört (Schoel und Mitarbeiter, 1994). Vγ9Vδ2-T-Zellen
erkennen also kleine Nichtprotein-Moleküle aus Mykobakterien, die eine essentielle
Phosphatgruppe besitzen. Diese Verbindungen werden daher Phosphoantigene genannt.
In der folgenden Zeit wurde versucht, die mykobakteriellen Phosphoantigene zu
identifizieren. Tanaka und Mitarbeitern (1995) gelang es mit Isopentenylpyrophosphat (IPP)
die erste γδ-T-Zell-reaktive Verbindung aus M. smegmatis zu charakterisieren. Daneben
fanden sie noch ein weiteres Phosphoantigen mit einem Molekulargewicht von 276 amu,
dessen Struktur aber nicht aufgeklärt werden konnte. Die Gruppe zeigte weiterhin, dass nicht
nur IPP selbst, sondern auch das isomere Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) und die
längerkettigen Isoprenoide Geranylpyrophosphat (GPP), Farnesylpyrophosphat (FPP) und
Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) γδ-T-Zellen aktivieren können. Allerdings scheint es
unwahrscheinlich, dass es sich bei diesen Prenylpyrophosphaten um die spezifischen
Antigene handelt, die für die stimulatorische Kapazität von Mykobakterien (und anderen
Pathogenen) verantwortlich sind. Zum einen handelt es sich um ubiquitär vorkommende
Substanzen, sie müssten also als Autoantigene wirken. Zum anderen sind die
Prenylpyrophosphate erst im mikromolaren Konzentrationsbereich wirksam.
14
B Kenntnisstand
IPP aktiviert etwa ab einer Konzentration von 1 µmol/l Vγ9Vδ2-T-Zellen, DMAPP und GPP
ab ca. 10 µmol/l, FPP und GGPP erst in Konzentrationen um 100 µmol/l (Morita und
Mitarbeiter, 2001 und eigene Untersuchungen). Bakterielle Rohextrakte, z. B. aus
Mycobacterium tuberculosis, die noch in Verdünnungen um den Faktor 200 stimulatorische
Aktivität aufweisen, müssten demnach Prenylpyrophosphate im millimolaren Bereich
enthalten. Das ist physiologisch unwahrscheinlich und konnte von unserer Arbeitsgruppe mit
Hilfe quantitativer Isopentenolbestimmung ausgeschlossen werden (Feurle, 1999).
Die Gruppe von Fournié isolierte aus Lysaten von M. tuberculosis und M. fortuitum vier
phosphorylierte Verbindungen, genannt TUBAg1 – TUBAg4, die Vγ9Vδ2-T-Zellen
aktivieren (Constant und Mitarbeiter, 1994); TUBAg2 hat wie die von Tanaka und
Mitarbeitern gefundene unbekannte Substanz ein relative Molekülmasse von 276 amu.
TUBAg3 und TUBAg4 sind Nukleotidkonjugate der Form Thymidintriphosphat-X bzw.
Uridintriphosphat-X (Poquet und Mitarbeiter, 1996). Der gemeinsame Rest X wird als
3-Formyl-1-butyl-Rest beschrieben, 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat als das Phosphoantigen
TUBAg1 (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Die zur Identifizierung von TUBAg1
präsentierten kernresonanzspektrometrischen Daten sind allerdings unvollständig und nicht
schlüssig.6 Auch eine Bestätigung durch chemische Synthese steht noch aus.
Neben den Mykobakterien können noch verschiedene andere Mikroorganismen in vitro
Vγ9Vδ2-T-Zellen stimulieren (vgl. Tab. 1). Bei der Untersuchung verschiedener Bakterien in
unserem Labor zeigte sich kein Zusammenhang zwischen Gram-Färbung, Pathogenität oder
IPP-Gehalt und γδ-T-Zell-stimulatorischer Aktivität (Jomaa und Mitarbeiter, 1999a). Dagegen
aktivierten alle Spezies (unter anderem E. coli), die ihre Isoprenoide über den 2-C-MethylD-erythrol-4-phosphat-Weg (MEP-Weg) synthetisieren, Vγ9Vδ2-T-Zellen, während die
untersuchten Mevalonat-abhängigen Bakterien keine Aktivität aufwiesen. Der MEP-Weg ist
ein von Mevalonat (MVA) unabhängiger Biosyntheseweg für IPP und DMAPP, der sehr
verbreitet in Eubakterien, aber auch in den Chloroplasten von Pflanzen und in den
Apicoplasten von Plasmodium falciparum (Jomaa und Mitarbeiter, 1999b) vorkommt. In
allen höheren Organismen scheint alleine der MVA-Weg der Isoprenoidbiosynthese
vorhanden zu sein (vgl. Kap. B2.3).
Um die Hypothese zu untermauern, dass das Vorkommen von Phosphoantigenen auf dem
Vorhandensein des MEP-Wegs in den betroffenen Mikroorganismen beruht, wurden in
unserer Arbeitsgruppe die ersten Fütterungsversuche mit 1-Desoxy-D-xylulose durchgeführt.
Dieser Desoxyzucker wird von E. coli durch das Enzym D-Xylulokinase in 1-DesoxyD-xylulose-5-phosphat (DOXP) überführt (Wungsintaweekul und Mitarbeiter, 2001) und in
Isoprenoide eingebaut (Putra und Mitarbeiter, 1998). Der Zusatz von 1-Desoxy-D-xylulose
zum Kulturmedium führt zu einer Steigerung der Aktivität von E. coli-Proben gegenüber
γδ-T-Zellen (Jomaa und Mitarbeiter, 1999a).
6
Ausführliche Diskussion bei Feurle (1999, S. 15).
15
Da DOXP aber nicht alleine Bestandteil des MEP-Wegs ist, sondern auch einen Vorläufer
von Thiamin und Pyridoxal darstellt (Spenser und White, 1997; Cane und Mitarbeiter, 1998),
ist diese Beobachtung kein eindeutiger Beweis für eine Bildung der Phosphoantigene über
den MEP-Weg. Deshalb wurde in einem weiteren Versuch die 1-Desoxy-D-xylulose5-phosphat-Reduktoisomerase durch einen spezifischen Inhibitor, das Antibiotikum
Fosmidomycin, gehemmt. Dieses Enzym katalysiert die Reaktion von DOXP zu MEP.
E. coli, die in Gegenwart von 20 µg/ml Fosmidomycin wachsen, zeigen keine Bioaktivität
(Feurle und Mitarbeiter, 2002). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse, dass an der
Biosynthese der Phosphoantigene in E. coli zumindest die erste Reaktion des MEP-Wegs
beteiligt ist. DOXP und MEP selbst haben keine Vγ9Vδ2-T-Zell-stimulierende Aktivität.
Mit der weiteren Aufklärung des MEP-Wegs (vgl. Kap. B2.2.2) konnten diese auf
biochemischen Studien basierenden Ergebnisse durch Gen-Targeting-Experimente bestätigt
und erweitert werden. So wurden durch Einfügen der Gene des MVA-Wegs E. coli-Mutanten
erzeugt, die exogenes Mevalonat zur IPP-Synthese verwerten können (Campos und
Mitarbeiter, 2001). E. coli Stämme, bei denen zusätzlich das Gen für die DOXPReduktoisomerase (dxr) ausgeknockt ist, überleben dank der MVA-abhängigen IPPBiosynthese, zeigen aber in Übereinstimmung mit der Inhibition dieses Enzyms durch
Fosmidomycin keine Aktivität gegen Vγ9Vδ2-T-Zellen. Die Produkte der Gene gcpE und
lytB7 katalysieren spätere Schritte der IPP-Biosynthese in E. coli. Ihre Deletion hat
gegensätzliche Auswirkungen: ∆gcpE-Mutanten weisen keine biologische Aktivität auf;
dagegen sind lytB-defiziente E. coli bis zu 100mal aktiver als die unveränderten Bakterien
(Eberl und Mitarbeiter, 2002). Eine γδ-T-Zell-stimulierende Verbindung konnte aus den
∆lytB-Mutanten isoliert und als (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-diphosphat (HMB-PP)
identifiziert werden (Hintz und Mitarbeiter, 2001). Die Gruppe von Bacher und Rohdich
zeigte dann, dass diese Verbindung tatsächlich ein Zwischenprodukt der MEP-abhängigen
Biosynthese von IPP und DMAPP ist (Hecht und Mitarbeiter, 2001) und dass auch durch
chemische Synthese gewonnenes HMB-PP γδ-T-Zell-stimulierende Kapazität aufweist
(Adam und Mitarbeiter, 2002).
Somit ist abschließend gezeigt, dass ein Phosphoantigen aus E. coli ein Metabolit des MEPStoffwechselwegs ist und es sich dabei um die Verbindung (E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphat handelt. Diese hat, ebenso wie das mykobakterielle Phosphoantigen
TUBAg1, ein Molekulargewicht von 262 amu. Da Mykobakterien ihre Isoprenoide ebenfalls
über den MEP-Weg synthetisieren, ist es sehr wahrscheinlich, dass TUBAg1 mit der
Verbindung aus E. coli identisch ist, auch wenn dem mykobakteriellen Antigen die isomere
Struktur 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat (FB-PP) zugeschrieben wurde. Die γδ-T-Zellaktiven Nukleotidkonjugate von TUBAg1 sind wahrscheinlich Nebenprodukte des MEPWegs in Mykobakterien. Ob sie auch eine biologische Rolle für das Bakterium spielen, ist
unbekannt. In E. coli konnten solche Nukleotid-Antigene nicht nachgewiesen werden (Feurle,
1999).
7
Jetzt umbenannt in ispG (gcpE) und ispH (lytB).
16
B Kenntnisstand
Tab. 1: Korrelation der γδ-T-Zell-stimulierenden Eigenschaften von Bakterien und Parasiten
mit dem Vorkommen des MEP- oder MVA-Wegs der Isoprenoidbiosynthese
Spezies1
MEPWeg2
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium sp.
++
+
neg.
Escherichia coli
Yersinia enterocolitica
Pseudomonas aeruginosa
Stenotrophomonas maltophilia
Francisella tularensis
Agrobacterium tumefaciens
Campylobacter jejuni
Micrococcus luteus
Listeria monocytogenes
Streptomyces griseus
Streptomyces noursei
Plasmodium falciparum
Toxoplasma gondii
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes Gruppe A
Steptococcus agalactiae Gruppe B
Streptococcus Gruppe C
Streptococcus sanguis
Streptococcus mutans
Enterococcus faecalis Gruppe D
Enterococcus faecium Gruppe D
Streptococcus Gruppe F
Myxococcus fulvus
Lactobacillus casei
Lactobacillus plantarum
++
neg.
1
MVAWeg2
k. D.
neg.
++
k. D.
k. D.
+
++
+
neg.
k. D.
+
+*
k. D.
*
+
k. D.
(+)
(+)
+
+
k. D.
k. D.
k. D.
(+)
(+)
+
+
+
k. D.
+
+
+
Vγ9Vδ2-TZellReaktivität3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+
+
+
-
Literatur zur
γδ-T-ZellStimulation
[1, 2, 3, 4, 5]
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[15]
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[15]
[11]
[11]
[11]
In Bakterien, die durch Fettdruck hervorgehoben sind, wurden Phosphoantigene nachgewiesen.
++/neg.: Gene im vollständig sequenzierten Genom nachgewiesen bzw. nicht nachgewiesen (Rohdich und
Mitarbeiter, 2001b); +: Hinweise auf das Vorkommen des MEP- bzw. MVA-Wegs durch Nachweis von Genen
im teilweise sequenzierten Genom (Boucher und Doolittle, 2000; Rohdich und Mitarbeiter, 1999; Lichtenthaler
und Mitarbeiter, 2000; Wilding und Mitarbeiter, 2000), durch Einbaustudien mit markierten Vorläufern,
zusammengefasst bei Boucher (2000) und Rohmer (1999), oder durch Nachweis von Enzymaktivität (Wiesner
und Mitarbeiter, 2000; Rohdich und Mitarbeiter, 2001a; Horbach und Mitarbeiter, 1993); (+): Nachweis von ein
oder zwei Genen des MEP-Wegs8; k. D.: keine Daten; *Streptomyces sp. nutzen den MEP-Weg oder den MVAWeg, einige auch beide Wege gleichzeitig.
3
+: Stimulation von γδ-T-Zellen in vitro; –: keine Stimulation von γδ-T-Zellen in vitro; +/-: widersprüchliche
Ergebnisse.
[1] (Holoshitz und Mitarbeiter, 1989); [2] (Kabelitz und Mitarbeiter, 1990); [3] (de Libero und Mitarbeiter,
1991); [4] (Hacker und Mitarbeiter, 1992); [5] (Constant und Mitarbeiter, 1995); [6] (Wilhelm und Tony, 1994);
[7] (Kersten und Mitarbeiter, 1996); [8] (Hermann und Mitarbeiter, 1992); [9] (Young und Mitarbeiter, 1997);
[10] (Poquet und Mitarbeiter, 1998) ; [11] (Jomaa und Mitarbeiter, 1999a); [12] (van Rhijn und Mitarbeiter,
2003) [13] (Munk und Mitarbeiter, 1990); [14] (Abo und Mitarbeiter, 1990); [15] (Bender und Kabelitz, 1992);
[16] (Nishida und Mitarbeiter, 1998); [17] (Guo und Mitarbeiter, 1995); [18] (Munk und Mitarbeiter, 1996); [19]
(Jouen-Beades und Mitarbeiter, 1997); [20] (Goerlich und Mitarbeiter, 1991); [21] (Goodier und Mitarbeiter,
1992); [22] (Behr und Mitarbeiter, 1996); [23] (Subauste und Mitarbeiter, 1995).
2
17
Sowohl in Mykobakterien als auch in E. coli wurde unter anderem in unserer Arbeitsgruppe
eine weitere phosphathaltige Verbindung detektiert, die bei chromatographischen Trennungen
mit der γδ-T-Zell-stimulierenden Aktivität ko-eluiert. Aufgrund der Molekülmasse von
276 amu könnte es sich um ein längerkettiges Homolog von TUBAg1/HMB-PP (Mr 262)
handeln. Aufgrund des Produktionenspektrums wurde die Verbindung allerdings als
Monophosphat, möglicherweise als 1-Phosphoaldonsäure, charakterisiert (Feurle, 1999).
Allerdings zeigen Phosphoaldonsäuren keine Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen. Die Bedeutung
des Phosphats Mr 276 bleibt also weiter unklar. Es kann sich um ein Phosphoantigen
unbekannter Struktur handeln oder um eine nichtaktive Verbindung, eventuell eine
1-Phosphoaldonsäure, die mit der Bioaktivität ko-eluiert.
Bis jetzt wurden nur Phosphoantigene aus Mykobakterien und E. coli näher charakterisiert.
Allerdings gelang auch in Micrococcus luteus, Corynebacterium ammoniagenes,
Streptomyces noursei, Streptomyces griseus, Agrobacterium tumefaciens (Jomaa und
Mitarbeiter, 1999a; Feurle, 1999), Pseudomonas aeroginosa (Julia und Mitarbeiter, 1998),
Francisella tularensis (Poquet und Mitarbeiter, 1998) und Plasmodium falciparum (Behr und
Mitarbeiter, 1996) der Nachweis von γδ-T-Zell-aktiven Phosphoverbindungen. In vielen
dieser Mikroorganismen wurde der MEP-Weg der Isoprenoidbiosynthese nachgewiesen (vgl.
Tab. 1). Die Vermutung liegt nahe, dass der MEP-Weg auch in diesen Mikroorganismen eine
Quelle von Phosphoantigenen darstellt. Eine Isolierung der Phosphoantigene gestaltet sich
aber schwierig, da sie anscheinend in nur sehr geringen Konzentrationen vorliegen und
lebende Zellen zudem eine Vielzahl phosphathaltiger Metabolite enthalten. Weitere
Organismen, die auf ihre γδ-T-Zell-stimulierenden Eigenschaften untersucht worden sind,
sind mit Angaben zur Art der Isoprenoidbiosynthese – soweit bekannt – ebenfalls in Tab. 1
aufgeführt. Bisher ist kein Bakterium bekannt, das nicht in der Lage ist, Vγ9Vδ2-T-Zellen zu
aktivieren, obwohl es über den MEP-Weg verfügt. Bei den gram-positiven Kokken ergibt sich
ein uneinheitliches Bild. Ältere Berichte, dass S. aureus und S. pyogenes eine Aktivierung von
γδ-T-Zellen auslösen (Munk und Mitarbeiter, 1990; Abo und Mitarbeiter, 1990; Bender und
Kabelitz, 1992), konnten in späteren Untersuchungen nicht bestätigt werden (Wilhelm und
Tony, 1994). Für gram-positive Kokken ist der MVA-Weg essentiell (Wilding und
Mitarbeiter, 2000); ob die bei einigen Stämmen gefundenen Gene8 für Enzyme des MEPWegs eine Rolle spielen, ist unbekannt (vgl. auch Kap. B2.3). Nach den vorliegenden Daten
kann nicht ausgeschlossen werden, dass manche Staphylo- und Streptokokken ebenfalls
Phosphoantigene produzieren. Allerdings könnten sowohl bei den Kokken als auch bei
anderen aktiven Mikroorganismen noch unbekannte Antigene oder indirekte Wirkungen über
andere Zellen für die beobachtete Aktivierung der γδ-T-Lymphozyten verantwortlich sein.
Zum Beispiel produzieren L. monocytogenes Proteine (vgl. Kap. B1.5.1.4) und Alkylamine
(vgl. Kap. B1.5.1.3), die γδ-T-Zell-stimulatorisches Potential aufweisen.
8
In keinem Fall wurden bisher die Schlüsselenzyme DOXP-Synthase oder –Reduktoisomerase gefunden.
18
B Kenntnisstand
Weitere Phosphoantigene
Neben den mikrobiellen Phosphoantigenen hat eine Vielzahl weiterer natürlich
vorkommender und synthetischer Phosphoverbindungen Vγ9Vδ2-T-Zell-stimulatorische
Aktivität. Die aktiven Phospho- und Pyrophosphomonoester sind mit ihrem Aktivitätsbereich
(nach Espinosa und Mitarbeiter, 2001) in den Tabellen 2 bis 4 aufgeführt. Auch
Nukleotidtriphosphat-Konjugate wie z. B. γ-Isopentenyl-UTP oder γ-Ethyl-ATP (und auch die
mykobakteriellen Nukleotid-Konjugate TUBAg 3 und TUBAg 4) sind γδ-T-Zell-reaktiv; im
Vergleich zum entsprechenden Pyrophosphat ändert sich die Aktivität durch Einführung des
Nukleotidmonophosphats nicht wesentlich (Tanaka und Mitarbeiter, 1995; Morita und
Mitarbeiter, 2001).
Tab. 2:
Phosphoantigene - Monophosphate
Verbindung
EC50 [µmol/l]
(Bereich)*
Literatur
Alkylphosphate
Methylphosphat
Ethylphosphat
n-Propylphosphat
iso-Propylphosphat
sec-Butylphosphat
> 10000
100 – 500
1000 – 5000
1000 – 5000
5000 – 10000
(Morita und Mitarbeiter, 2001)
(Tanaka und Mitarbeiter, 1994)
Alkenylphosphate
Allylphosphat
Crotylphosphat
500 – 1000
100 – 500
Prenylphosphate
Isopentenylphosphat
Dimethylallylphosphat
500 - 1000
10 - 50
Weitere Phosphate
Glycerinsäure-3-phosphat
2,3-Diphosphoglycerinsäure
Ribose-1-phosphat
Xylose-1-phosphat
100 - 500
500 - 2000
500 - 2000
500 - 2000
(Bürk und Mitarbeiter, 1995)
*(nach Espinosa und Mitarbeiter, 2001).
Tab. 3:
19
Phosphoantigene – Pyrophosphate mittlerer Aktivität
Verbindung
EC50 [µmol/l]
(Bereich)*
Literatur
10 – 20
1–5
10 – 20
100 – 500
5 – 10
5 – 10
1–5
5 – 10
50 – 100
100 – 500
100 – 500
10 – 100
10 – 100
10 – 100
10 – 100
10 – 100
(Belmant und Mitarbeiter, 1999)
1 – 10
Alkyldiphosphate
Methylpyrophosphat
Ethylpyrophosphat
n-Propylpyrophosphat
n-Butylpyrophosphat
Alkenylpyrophosphate
Allylpyrophosphat
Crotylpyrophosphat
Prenylpyrophosphate
Isopentenylpyrophosphat
Dimethylallylpyrophosphat
Geranylpyrophosphat
Geranylgeranylpyrophosphat
Weitere Pyrophosphate
Butan-2-onylpyrophosphat
Butan-3-onylpyrophosphat
Pentan-3-onylpyrophosphat
Pentan-4-onylpyrophosphat
2-Methylbutan-3-onylpyrophosphat
3,4-Dihydroxy-3-methylbutylpyrophosphat
*(nach Espinosa und Mitarbeiter, 2001)
Tab. 4:
Phosphoantigene – stark aktive Pyrophosphate
Verbindung
3,4-Epoxy-3-methylbutylpyrophosphat
TUBAg1
(E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat
4-Chlor-3-hydroxy-3-methylbutylpyrophosphat+
4-Brom-3-hydroxy-3-methylbutylpyrophosphat+
3-Hydroxy-4-iod-3-methylbutylpyrophosphat+
EC50 [µmol/l]
(Bereich)*
0,01 – 0,10
Literatur
0,005 – 0,010
~ 0,0005#
(Hintz und Mitarbeiter, 2001)
0,05 – 0,10
0,005 – 0,020
0,0005 – 0,003
*(nach Espinosa und Mitarbeiter, 2001); #geschätzter Wert; +diese Verbindungen werden auch als Chlor-, Bromund Iodhydrinpyrophosphat bezeichnet.
20
B Kenntnisstand
γδ-T-Zellen zeichnen sich durch eine hohe Substrattoleranz aus, da so unterschiedliche
Verbindungen wie Farnesylpyrophosphat und Glycerinsäure-3-phosphat im gleichen
Konzentrationsbereich wirksam sind. Vergleicht man die unsubstituierten Phosphoantigene,
die in Tab. 2 und Tab. 3 dargestellt sind, lassen sich folgende Regeln ableiten:
1. Pyrophosphate sind aktiver als die entsprechenden Monophosphate.
2. Kurzkettige Alkylverbindungen sind aktiver.
3. Doppelbindungen wirken sich günstig auf die Aktivität aus.
Die Pyrophosphomonoester mit einer Carbonylgruppe im Molekül scheinen eine
Zwischenstellung zwischen Alkyl- und Alkenylpyrophosphaten einzunehmen (vgl. Tab. 2).
Butan-2- und Butan-3-onylpyrophosphat sind aktiver als Butylpyrophosphat, aber weniger
aktiv als Crotylpyrophosphat.
Das aus E. coli isolierte Phosphoantigen HMB-PP unterscheidet sich von DMAPP nur durch
die Hydroxylgruppe an Position 4 (vgl. Abb. 4); trotzdem benötigt man eine tausendfach
höhere Konzentration an DMAPP, um die gleiche γδ-T-Zell-Antwort hervorzurufen wie mit
HMB-PP. Die gesättigte Verbindung Isoamylpyrophosphat ist überhaupt nicht aktiv (Morita
und
Mitarbeiter,
2001).
Ein
Dihydroxy-Derivat
davon,
3-Methyl3,4-butandiol-1-yl-pyrophosphat, das mit HMB-PP die Hydroxylgruppe am C-Atom 4
gemeinsam hat, ist wiederum in den gleichen Konzentrationen wie DMAPP wirksam. Wird
diese Hydroxylgruppe durch ein Halogenatom ersetzt, entstehen Verbindungen, die in
nanomolaren Konzentrationen Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren. Die Aktivität dieser
Halohydrinverbindungen nimmt in der Reihenfolge Chlor-, Brom-, Iod- zu.
OPP
keine Aktivität
Isoamyl-PP
HO
OPP
DMAPP
HO
mittlere Aktivität
OPP
3,4-Dihydroxy-3-methylbutyl-PP
HO
HO
OPP
HMB-PP
Br
große Aktivität
OPP
4-Brom-3-hydroxy-3-methyl-3-butyl-PP
Abb. 4: Beispiele für Phosphoantigene verschiedener Stärke.
21
Die Gruppe von Fournié hat die Hypothese aufgestellt, dass die chemische Reaktivität
entscheidend für die Aktivität von Phosphoantigenen ist, wenn zusätzlich bestimmte
strukturelle Voraussetzungen erfüllt sind (Belmant und Mitarbeiter, 2000). Eine Reaktion der
Phosphoantigene mit Molekülen an Zelloberflächen – ob daraus nun lösliche oder
zellgebundene Verbindungen resultieren – könnte erklären, warum für die Aktivierung von
Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Phosphoverbindungen Zellkontakt notwendig ist, obwohl keine
Antigenprozessierung in der Zelle oder Antigenpräsentation über ein bekanntes Molekül
stattfindet. Obwohl diese These für die starken Phosphoantigene recht schlüssig ist, kann sie
doch nicht alle beobachteten Aktivitätsunterschiede erklären. In wie weit chemische
Reaktionen von Phosphoantigenen in vitro und vor allem auch in vivo wirklich eine Rolle
spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
Gossman und Oldfield (2002) haben die Struktur-Wirkungsbeziehungen für die Aktivierung
von γδ-T-Zellen durch Phosphoantigene mit Hilfe computerchemischer Berechnungen
untersucht. Zur Voraussage der Aktivität wurden die experimentellen Daten von 36
Phosphoantigenen herangezogen (fast alle der in Tabelle 2 bis 4 aufgeführten Verbindungen
und acht weitere Phosphoantigene). Die berechneten und experimentell gefundenen
EC50-Werte zeigen eine hohe Korrelation. Das erstellte Modell fordert für eine hohe
Antigenaktivität vier Komponenten: zwei negativ ionisierbare Gruppen (z. B. die Phosphate
der Pyrophosphat-Gruppen), einen Wasserstoffbrücken-Donor (z. B. die OH-Gruppe in
HMB-PP) und eine hydrophobe Gruppe (z. B. die Methylgruppe von HMB-PP oder das
Bromatom von Bromhydrin). Es erklärt viele Aktivitätsunterschiede der bekannten
Phosphoantigene, nicht aber den positiven Einfluss einer Doppelbindung. So werden in den
Modellrechnungen zum Beispiel für Propylphosphat und Allylphosphat gleiche Aktivitäten
vorhergesagt, Propyl- und Butylpyrophosphat werden gar nicht berücksichtigt, wohl aber
Allyl- und Crotylpyrophosphat.
22
1.5.1.2
B Kenntnisstand
Stickstoff enthaltende Bisphosphonate als γδ-T-Zell-Stimulatoren
Bisphosphonate werden klinisch vor allem zur Behandlung Tumor-induzierter Knochenerkrankungen wie Osteolyse und Hyperkalzämie eingesetzt. Gemeinsames Strukturmerkmal
dieser Bisphosphonate ist die Methylenbisphosphonatgruppe, die am C-Atom mit
unterschiedlichen Seitenketten substituiert ist. Sie stellen nicht hydrolysierbare Analoga von
Pyrophosphaten dar und zeigen somit strukturelle Ähnlichkeit zu den Phosphoantigenen. Bei
der Suche nach weiteren Verbindungen, die eine Aktivierung von γδ-T-Zellen bewirken
können, zeigte unsere Arbeitsgruppe erstmals, dass die Aminobisphosphonate Pamidronat,
Alendronat und Ibandronat (vgl. Kap. B3 und Abb. 10) das selektive Auswachsen von
Vγ9Vδ2-T-Zellen aus Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) induzieren (Kunzmann und
Mitarbeiter, 1999). Durch Pamidronat aktivierte γδ-T-Zellen produzieren Zytokine (z. B.
IFN-γ) und zeigen spezifische Zytotoxizität gegen Lymphom- und Myelomzelllinien
(Kunzmann und Mitarbeiter, 2000). Auch Risedronat (Das und Mitarbeiter, 2001) und
Zoledronat (eigene Untersuchungen), Bisphosphonate mit einem stickstoffhaltigen
Heteroaromaten, aktivieren Vγ9Vδ2-T-Zellen. Die stickstoff-freien Bisphosphonate Etidronat
und Clodronat dagegen sind inaktiv.
Stickstoffhaltige Bisphosphonate sind neben den Phosphoantigenen eine zweite Klasse von
Verbindungen, die selektiv Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren. Sie sind in mikromolaren
Konzentrationen wirksam. Auch in vivo können N-haltige Bisphosphonate eine Vermehrung
von γδ-T-Zellen bewirken, wie durch Untersuchung des T-Zell-Repertoires von Patienten, die
mit Pamidronat behandelt worden waren, gezeigt wurde (Kunzmann und Mitarbeiter, 1999).
Da eine Reihe dieser Verbindungen bereits zum Einsatz beim Menschen zugelassen ist, sind
sie besonders attraktive Agenzien zur gezielten Hervorrufung einer Vγ9Vδ2-T-Zell-Antwort
bei verschiedenen Krankheiten. Aus diesem Grund war es ein Ziel dieser Arbeit, weitere
Bisphosphonate auf ihre Aktivität gegenüber γδ-T-Lymphozyten zu testen und die
strukturellen Voraussetzungen für eine Erkennung durch diese T-Zellen zu untersuchen.
1.5.1.3
Alkylamine
Bukowski und Mitarbeiter (1999) berichten, dass Alkylamine Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren
können. Dabei sind primäre Amine mit einer geraden oder verzweigten Seitenkette aus zwei
bis fünf Kohlenstoffatomen ohne weitere Substituenten wirksam. Solche Alkylamine werden
von verschiedenen humanpathogenen Erregern, wie z. B. Listeria monocytogenes und
Yersinia enterocolitica, produziert. Kulturüberstände von Proteus morganii enthalten
millimolare Mengen an Isobutylamin und Isoamylamin und induzieren Proliferation und
Zytokinproduktion von Vγ9Vδ2-T-Zellen. Als Bestätigung einer Alkylamin-induzierten
Antigenaktivität dient die Inkubation mit alkalischer Phosphatase, durch die in Gegensatz zu
den Phosphoantigenen die T-Zellaktivierung nicht inhibiert wird. Alkylamine aus Mikroorganismen oder auch aus Nahrungsmitteln könnten also neben den bakteriellen Phosphoantigenen eine zweite Gruppe natürlich vorkommender Vγ9Vδ2-T-Zell-Liganden darstellen.
23
Ihre Relevanz in vivo ist allerdings fraglich, da Alkylamine in vitro erst in relativ hohen
Konzentrationen (0,5 – 30 mmol/l) eine γδ-T-Zell-Antwort auslösen.
1.5.1.4
Proteine und zellgebundene Antigene
Für Vγ9Vδ2-T-Zellen ist bis heute kein vollständig charakterisiertes Proteinantigen
beschrieben. Berichte, dass das mykobakterielle Hitzeschockprotein HSP65 als γδ-T-ZellAntigen wirkt (Haregewoin und Mitarbeiter, 1989; Holoshitz und Mitarbeiter, 1989), ließen
sich in späteren Untersuchungen nicht bestätigen (Kabelitz und Mitarbeiter, 1990). Die
Gruppe von Boom isolierte aus M. tuberculosis H37Ra eine 10 kDa γδ-T-Zell-stimulierende
Fraktion, deren Aktivität durch Behandlung mit Proteasen vermindert wird (Boom und
Mitarbeiter, 1994). Später wurde gezeigt, dass diese Fraktion die mykobakteriellen
Phosphoantigene TUBAg 1 und TUBAg 3 enthält, die mit den Protein-Bestandteilen
assoziiert vorliegen (Boom, 1999). Auch für L. monocytogenes ist eine γδ-T-Zell-Antwort in
Gegenwart Protease-sensitiver Komponenten beschrieben (Munk und Mitarbeiter, 1996).
Frühe Arbeiten zur Antigenerkennung von γδ-T-Lymphozyten ergaben, dass sich
Vγ9Vδ2-T-Zellen durch zwei B-Zell-Tumorlinien – die Burkitt Lymphomlinie Daudi (Fisch
und Mitarbeiter, 1990) und die Myelomlinie RPMI 8226 (Selin und Mitarbeiter, 1992) – zur
Proliferation anregen lassen. Dabei expandieren die gleichen γδ-T-Zell-Klone, die auch durch
mykobakterielle Extrakte stimuliert werden. Kürzlich wurden mit dem Non-HodkinLymphom DEAU und der Hodkin-Linie L-428 zwei weitere B-Zelllinien beschrieben, die ein
Auswachsen von γδ-T-Zellen bewirken (Sicard und Mitarbeiter, 2001).
Wahrscheinlich verfügen sehr viele B-Lymphomlinien über das Potential, Vγ9Vδ2-T-Zellen
zu aktivieren (Fisch und Mitarbeiter, 1997). Allerdings besitzen die meisten Vγ9Vδ2-TLymphozyten inhibitorische Rezeptoren (KIRs), wie sie auch auf NK-Zellen vorkommen
(vgl. B1.1.1.3). Diese verhindern, dass MHC-I-positive Zelllinien eine γδ-T-Zell-Antwort
auslösen (Rothenfusser und Mitarbeiter, 2002). Die γδ-T-Zell-stimulierenden Liganden auf
den Tumorzellen sind bis heute noch nicht identifiziert worden. In einer aktuellen
Veröffentlichung zeigen Gober und Mitarbeiter einen Zusammenhang zwischen der
Isoprenoid-Biosynthese und dem γδ-T-Zell-stimulierenden Potential von Tumorzellen auf
(2003). So verlieren Daudi-Zellen durch Behandlung mit Substanzen, welche die Aktivität der
HMG-CoA-Reduktase (ein Schlüsselenzym des Mevalonsäure-Wegs, vgl. Kap. B2.1)
hemmen bzw. zu einer Verminderten Expression des Enzyms führen, ihre Fähigkeit, γδ-TLymphozyten zu aktivieren. Umgekehrt haben Daudi-Zellen, in denen HMG-CoA-Reduktase
überexprimiert wird, ein erhöhtes γδ-T-Zell-stimulatorisches Potential. Die Autoren
spekulieren, dass humane Vγ9Vδ2-T-Zellen auf diese Weise Zellen erkennen, deren
Mevalonsäure-Metabolismus nicht der Norm entspricht. Besonders interessant ist dieser
Befund, weil er möglicherweise eine gemeinsame Erklärung für das γδ-T-Zell-stimulatorische
Potential von Tumorzellen und von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten liefert (vgl. Kap.
C1.5.2.5).
24
1.5.2
B Kenntnisstand
Mechanismus der Antigenerkennung durch Vγ9Vδ2-T-Zellen
Für keines der in Kapitel B1.5.1 aufgeführten γδ-T-Zell-Antigene ist bis heute die Bindung an
den T-Zell-Rezeptor gezeigt worden. Es fehlt daher der endgültige Beweis, dass diese
Antigene durch den γδ-TZR erkannt werden. Allerdings lässt sich die Reaktivität gegen
Phosphoantigene, N-haltige Bisphosphonate, Alkylamine und Daudi-Zellen durch Gentransfer
eines Vγ9Vδ2-T-Zell-Rezeptors auf eine ursprünglich TZR-negative Empfängerlinie (Jurkat)
übertragen (Tanaka und Mitarbeiter, 1995; Das und Mitarbeiter, 2001; Bukowski und
Mitarbeiter, 1999; Bukowski und Mitarbeiter, 1995). Die Transduktion eines humanen
Vγ9Vδ2-T-Zell-Rezeptors zusammen mit dem kostimulatorischen Rezeptor CD289 in eine
TZR-negative Mauszelllinie führt ebenfalls zu Klonen, die sich durch Phosphoantigene oder
N-BPs stimulieren lassen (Herrmann, persönliche Mitteilung). Bukowski und Mitarbeiter
konnten zeigen, dass die Erkennung von Phosphoantigenen sowohl die Verwendung eines
bestimmten Jγ-Segments (JγP) in der Vγ9-Kette als auch die Verwendung der Vδ2-Kette
voraussetzt (Bukowski und Mitarbeiter, 1998). Die Mutation eines einzigen Lysin-Rests im
JγP-Segment hebt die Reaktivität eines Vγ9Vδ2-T-Zell-Klons gegenüber Ethylpyrophosphat,
Isobutylamin und Pamidronat auf (Miyagawa und Mitarbeiter, 2001a). Zusammengenommen
demonstrieren diese Ergebnisse, dass an der Erkennung der verschiedenen NichtpeptidAntigene der Vγ9Vδ2-T-Zell-Rezeptor beteiligt ist.
Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass die klassischen Wege der
Antigenprozessierung und –präsentation für γδ-T-Zellen keine Rolle spielen (Morita und
Mitarbeiter, 1995). Sowohl Vγ9Vδ2-T-Zellen als auch humane Vδ1-T-Zellen und murine γδT-Zellen erkennen ihre Antigene unabhängig von MHC- oder CD1-Molekülen; ob andere
antigenpräsentierende Moleküle beteiligt sind, ist unbekannt.
Phosphoantigene können Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten in Abwesenheit zusätzlicher „Bystander“Zellen stimulieren; allerdings ist ein direkter Zell-Zell-Kontakt – zumindest der γδ-T-Zellen
untereinander – notwendig. Die Zugabe von antigenpräsentierenden Zellen (z. B.
Makrophagen oder PBL) verstärkt jedoch die γδ-T-Zell-Antwort auf Phosphoantigene.
Während Morita und Mitarbeiter (1995) zeigten, dass sich Monoethylphosphat (vgl. Tab. 2)
und Phosphoantigene aus mykobakteriellen Extrakten nicht stabil mit der Oberfläche
antigenpräsentierender Zellen (unter anderem PBL) assoziieren, konnten zwei andere
Gruppen Makrophagen bzw. verschiedene Tumorzellen durch Behandlung mit
Bromhydrinpyrophosphat (vgl. Tab. 4) bzw. Ethylpyrophosphat (vgl. Tab. 3) stimulierend für
γδ-T-Zellen machen (Rojas und Mitarbeiter, 2002; Kato und Mitarbeiter, 2001).
9
CD28 ist ein kostimulierender Rezeptor auf T-Zellen; naive αβ-T-Zellen benötigen für die Aktivierung, die
schließlich zur klonalen Expansion führt (vgl. Kap. B1.1.2), neben dem spezifischen Signal (Bindung des TZR
an den Peptid:MHC-Komplex) ein unabhängiges kostimulierendes Signal; dieses erfolgt durch Bindung von
CD28 an kostimulierende Moleküle auf den antigenpräsentierenden Zellen.
25
Diese unterschiedlichen Ergebnisse lassen sich wahrscheinlich durch die Stärke und
Konzentration der eingesetzten Phosphoantigene erklären: Ethylphosphat ist etwa 100mal
schwächer aktiv als Ethylpyrophosphat, beide Verbindungen wurden aber im selben
Konzentrationsbereich verwendet (2,5 mmol/l bzw. 1 mmol/l). Das nochmals um einen Faktor
100 aktivere Bromhydrinpyrophosphat lässt sich ab einer Konzentration von 10 µmol/l auf
Makrophagen „pulsen“; die γδ-T-Zell-Antwort (gemessen als IFN-γ-Produktion) ist allerdings
vergleichsweise schwach. In eigenen Versuchen gelang der Nachweis einer Aktivierung von
γδ-T-Zellen (gemessen als CD69- bzw. CD25-Expression) durch mit 10 µmol/l
Bromhydrinpyrophosphat vorinkubierte PBL oder THP-1 Zellen nicht (vgl. Kap. C1.5.1.5).
Ob Phosphoantigene auch in vivo für die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen verantwortlich
sind, ist unbekannt. Allerdings aktivieren in vitro nicht nur freie Phosphoantigene, sondern
z. B. auch mit Mykobakterien infizierte Monozyten diese T-Zell-Population (Balaji und
Boom, 1998). Behandelt man Monozyten mit Proteinantigenen aus M. tuberculosis H37Ra
(vgl. Kap. B1.5.1.4), so stimulieren sie anschließend ebenfalls Vγ9Vδ2-T-Zellen, unabhängig
davon, ob die lösliche Proteinfraktion verwendet wird oder ob vorher eine Kopplung an
Latex-Beads erfolgt. Die Autoren stellen aufgrund dieser Ergebnisse die Hypothese auf, dass
mykobakterielle Phosphoantigene mit einem Trägermolekül assoziiert sind, welches nach
Aufnahme und Prozessierung durch eine antigenpräsentierende Zelle das Phosphoantigen
stabil an der Zelloberfläche bindet (Balaji und Boom, 1998).
N-haltige Bisphosphonate können im Gegensatz zu Phosphoantigenen Vγ9Vδ2-TLymphozyten in PBL nach Entfernen der adhärenten Zellen (hauptsächlich Monozyten) nicht
aktivieren (Miyagawa und Mitarbeiter, 2001b). Antigenpräsentierende Zellen (Zellen der
monozytären Linie, verschiedene Tumorzellen) werden durch Vorbehandlung mit geringeren
Konzentrationen an N-BPs als an Phosphoantigenen vergleichbarer Aktivität stimulierend für
γδ-T-Lymphozyten (Kato und Mitarbeiter, 2001 und eigene Versuche). Es ist unklar, ob diese
Unterschiede verschiedene Mechanismen der Stimulation von γδ-T-Zellen durch
Phosphoantigene und N-BPs widerspiegeln.
1.5.3
Antigenerkennung durch weitere γδ-T-Zellen
Die Antigenerkennung humaner γδ-T-Zell-Populationen, die andere Rezeptoren als den
Vγ9Vδ2-TZR besitzen, ist weniger gut untersucht. Man kennt Vδ1-positive T-Zell-Klone, die
ein CD1-Molekül (vgl. Kap. B1.3) – CD1c – erkennen (Spada und Mitarbeiter, 2000). Dabei
dient CD1c nicht als präsentierendes Molekül für ein Fremd-Lipid oder –Glykolipid;
eventuell werden aber körpereigene Lipidantigene präsentiert. Die Bedeutung dieser
Reaktivität ist noch unklar; die meisten Vδ1-T-Lymphozyten sind in Epithelien lokalisiert, wo
sie kaum in Kontakt mit CD1c kommen dürften, das hauptsächlich von professionell
antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird (Ferranini und Mitarbeiter, 2002).
26
B Kenntnisstand
Vδ1-T-Zellen werden auch von weiteren MHC-I-ähnlichen Molekülen – MICA und MICB10
– aktiviert (Groh und Mitarbeiter, 1999). Dabei handelt es sich um stressinduzierte Antigene,
die von Dünndarmepithelzellen und verschiedenen Tumorzellen (z. B. von Lungen-, Nierenoder Dickdarmkarzinomen) exprimiert werden. Obwohl die zytotoxische Wirkung der Vδ1-TLymphozyten auf diese Tumorzellen TZR-vermittelt ist, konnte eine direkte Wechselwirkung
zwischen MICA und/oder MICB und dem γδ-TZR nicht gezeigt werden. Vielmehr wurde als
Rezeptor für MICA der ursprünglich auf NK-Zellen gefundene Rezeptor NKG2D identifiziert
(Bauer und Mitarbeiter, 1999). NKG2D ist ein aktivierender Rezeptor, der außer auf NKZellen auch sehr verbreitet auf zytotoxischen αβ-T-Zellen, Vδ1-T-Zellen und auf Vγ9Vδ2-TZellen vorkommt.
Im murinen System gibt es keine den humanen Vγ9Vδ2-T-Zellen entsprechende
Lymphozyten-Population. Für Maus-γδ-T-Zellen ist die Erkennung von MHC-II-Molekülen,
nichtklassischen MHC-I-Molekülen und Hitzeschockproteinen beschrieben (vgl. Chien und
Hampl, 2000; Hayday, 2000). Dabei unterscheidet sich der Mechanismus der
Antigenerkennung genau wie bei humanen γδ-T-Zellen von dem der αβ-T-Lymphozyten. Es
ist keine Antigenprozessierung oder –präsentation nötig, vielmehr werden die Proteine direkt
erkannt, ähnlich der Interaktion von Antikörpern mit Proteinantigenen.
1.6
Effektorfunktionen von γδ-T-Zellen
γδ-T-Lymphozyten reagieren auf Aktivierung im Prinzip ähnliche wie αβ-T-Zellen: sie
exprimieren charakteristische Oberflächenmoleküle, produzieren Zytokine und erlangen
zytotoxisches Potential. Murine γδ-T-Zellen zeigen wie CD4-positive αβ-T-Zellen abhängig
vom stimulierenden Pathogen entweder eine TH1- oder TH2-Antwort: Bei einer Infektion mit
intrazellulären Bakteriem lässt sich hauptsächlich IFN-γ nachweisen, bei Infektion mit
extrazellulären Parasiten wird dagegen vornehmlich IL-4 produziert (Ferrick und Mitarbeiter,
1995). Humane Vγ9Vδ2-T-Zellen produzieren nach Stimulation mit Phosphoantigenen, Nhaltigen Bisphosphonaten, Alkylaminen oder Daudi-Zellen vor allem TH1-Zytokine (IFN-γ,
TNF-α) (Tsukaguchi und Mitarbeiter, 1999; Kunzmann und Mitarbeiter, 2000; Wang und
Mitarbeiter, 2001a; Wesch und Mitarbeiter, 2001). Erfolgt die Stimulation aber in Gegenwart
von IL-4 und anti-IL-12-Antikörpern, also unter TH2-Priming-Bedingungen, so wird durch
IPP oder Daudi-Zellen die Produktion von IL-4 induziert, während die Bildung von IFN-γ und
TNF-α kaum mehr nachzuweisen ist (Wesch und Mitarbeiter, 2001). Die bei αβ-T-Zellen
beobachtete TH1/TH2-Dichotomie scheint also auch bei Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten zu
existieren.
10
MICA und MICB werden im Gegensatz zu den CD1-Molekülen innerhalb des MHC-codiert.
27
Die Freisetzung von IFN-γ und TNF-α erfolgt in vitro sehr schnell, d. h. innerhalb von zwei
Stunden nach Kontakt der Vγ9Vδ2-T-Zellen mit einer stimulierenden Verbindung (Wang und
Mitarbeiter, 2001a). Zusammen mit der Tatsache, dass bakterielle Antigene die gesamte
Vγ9Vδ2-T-Zell-Population (bis zu 5 % aller T-Zellen) stimulieren können, könnte dies bei
einer Infektion zu einer schneller einsetzenden und stärkeren Produktion von IFN-γ und TNFα führen, als es durch Peptid-spezifische αβ-T-Zellen möglich wäre (Kabelitz und
Mitarbeiter, 1999).
Aktivierte γδ-T-Zellen besitzen zusätzlich ein hohes zytotoxisches Potential.
Vγ9Vδ2-T-Zellen zeigen lytische Aktivität gegen eine Reihe von hämatopoetischen Tumoren,
z. B. gegen die Burkit-Lymphomlinie Daudi und die Erythroleukämielinie K562. Während
die Erkennung von Daudi-Zellen TZR-abhängig ist, lässt sich die Lyse von K562-Zellen
durch anti-γδ-TZR-Antikörper nicht blockieren (Poccia und Mitarbeiter, 1997). Entsprechend
induzieren Daudi-Zellen in Vγ9Vδ2-T-Zellen die Produktion von Zytokinen, die Expression
von Aktivierungsmarkern und eine proliferative Antwort (vgl. Kap. B1.5.1.4); dagegen lösen
K562-Zellen keine dieser T-Zell-Antworten aus. Das bedeutet, dass zytotoxische
Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten ihre Zielzellen über zwei verschiedene Mechanismen erkennen
können: durch einen TZR-abhängigen und einen TZR-unabhängigen, wahrscheinlich
NK-Zell-ähnlichen, Mechanismus.
28
1.7
B Kenntnisstand
Regulation der Immunantwort von γδ-T-Zellen
Praktisch alle Vγ9Vδ2-T-Zellen exprimieren inhibitorische Rezeptoren (KIRs, vgl. Kap.
B1.1.1.3), wie man sie auch auf natürlichen Killerzellen findet (Battistini und Mitarbeiter,
1997; Fisch und Mitarbeiter, 1997; Halary und Mitarbeiter, 1997). Die KIRs auf den
zytotoxischen Zellen erkennen spezifisch verschiedene MHC-I-Allele; durch die Interaktion
des Rezeptors mit seinem Liganden auf einer Zielzelle wird ein negatives Signal übermittelt
und das zytotoxische Potential der Effektorzelle wird unterdrückt. Daudi-Zellen haben einen
Gendefekt und exprimieren keine MHC-I-Moleküle. Erzeugt man durch Gentransfer DaudiKlone, die MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche tragen, können diese das lytische
Potential von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten hemmen (Rothenfusser und Mitarbeiter, 2002).
Scheinbar beeinflussen die KIRs auch die Antwort auf Stimulation durch Phosphoantigene:
bei KIR-positiven Vγ9Vδ2-T-Zell-Klonen verschiebt sich die Dosis-Wirkungs-Kurve; eine
halbmaximale Antwort erfordert eine bis zu zehnmal höhere Antigenkonzentrationen als bei
KIR-negativen Klonen. In Gegenwart von Antikörpern gegen KIR oder MHC-I erhöht sich
die Aktivität der KIR-positiven Klone auf das Niveau der KIR-negativen (Halary und
Mitarbeiter, 1997; Carena und Mitarbeiter, 1997). Neben den inhibitorischen exprimieren
γδ-T-Zellen auch aktivierende Rezeptoren, z. B. NKG2D (vgl. Kap. B1.5.3). Vor kurzem
wurde gezeigt, dass die Stimulation dieses Rezeptors die Antwort von Vγ9Vδ2-T-Zellen auf
Phosphoantigene verstärken kann. Zusammenfassend kann man sagen, dass die
Immunantwort von γδ-T-Zellen wahrscheinlich durch das Zusammenspiel verschiedener
Mechanismen reguliert wird: Die Zellen können aktivierende Signale durch den T-ZellRezeptor und/oder andere aktivierende Rezeptoren erhalten; durch die KIRs werden
inhibierende Signale übermittelt; schließlich beeinflusst sicher auch das Zytokinmilieu die
Antwort der γδ-T-Zellen. Als Beispiel sei nur genannt, dass Vγ9Vδ2-T-Zellen zur
Proliferation auf IL-2 angewiesen sind, das von anderen Zellen produziert wird.
1.8
1.8.1
Die Rolle der γδ-T-Zellen bei der Immunantwort
Bakterielle Infektionen
Wie in Kapitel B1.5.1.1 ausführlich dargelegt, werden Vγ9Vδ2-T-Zellen in vitro durch
Präparationen zahlreicher grampositiver und gramnegativer Bakterien zur Proliferation
angeregt. In vielen Veröffentlichungen wird auch in vivo eine Aktivierung und Proliferation
von γδ-T-Lymphozyten nach bakteriellen Infektionen beschrieben, unter anderem durch
Brucella melitensis, Francisella tularensis, Listeria monocytogenes, Coxiella burnetti
(zusammengefasst bei Kabelitz und Mitarbeiter, 1999), Ehrlichia sp. (Caldwell und
Mitarbeiter, 1995) und Legionella micdadei (Kroca und Mitarbeiter, 2001). Am besten
untersucht ist die Situation bei mykobakteriellen Infektionen.
29
Im Blut mancher Tuberkulose-Patienten ist ein erhöhter Anteil an γδ-T-Zellen festzustellen
(Ito und Mitarbeiter, 1992; Balbi und Mitarbeiter, 1993), in anderen dagegen zeigt sich kein
Unterschied zu gesunden Personen (Barnes und Mitarbeiter, 1992). Li und Mitarbeiter (1996)
fanden eine signifikante Reduktion der Vγ9Vδ2-T-Zellen bei Patienten mit aktiver
Tuberkulose. Diese widersprüchlichen Ergebnisse sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Patienten in unterschiedlichen Stadien der Krankheit untersucht wurden. Ueta
und Mitarbeiter (1994) konnten im Blut gesunder Personen, die häufig Kontakt mit
Tuberkulose-Patienten hatten, eine Verdopplung des Anteils an γδ-T-Zellen im peripheren
Blut sowie die Expression von Aktivierungsmarkern feststellen.
Dieli und Mitarbeiter untersuchten Kinder mit mykobakteriellen Infektionen. Hier ist die
Wahrscheinlichkeit groß, dass eine Primärinfektion vorliegt. Kinder mit tuberkulöser
Meningitis haben in der Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF) einen erhöhten Anteil an Vγ9Vδ2-TZellen, in der Kontrollgruppe von Patienten mit nichtinfektiösen neurologischen
Erkrankungen sind dagegen Vδ1-T-Zellen die vorherrschende Population in der ZSF (Dieli
und Mitarbeiter, 1999). Im Blut der Meningitis-Patienten wurde keine Veränderung der TZell-Populationen beobachtet. Der Anteil von Vγ9Vδ2-T-Zellen im Blut von Kindern mit
Tuberkulose oder von Kindern, die eine positive Tuberkulinreaktion zeigen, ist im Vergleich
zu gleichaltrigen Kindern mit einem negativen Tuberkulintest nicht erhöht. Allerdings lassen
sich die Vγ9Vδ2-T-Zellen der ersten beiden Gruppen in Gegenwart von IL-2 durch
verschiedene Phosphoantigene zur Proliferation anregen, während die Vγ9Vδ2-T-Zellen der
Vergleichsgruppe nicht expandieren (Dieli und Mitarbeiter, 2000).
Behr-Prest und Mitarbeiter (1999) untersuchten die Expression von verschiedenen
Oberflächenmolekülen auf den γδ-T-Zellen von Tuberkulosepatienten. Sie stellten fest, dass
die γδ-T-Zellen der Patienten im Gegensatz zu den αβ-T-Zellen einen Phänotyp aufweisen,
der für hochaktivierte Zellen charakteristisch ist: Die Expression von ICAM-1, VLA-4,
MHC-II und Fas ist erhöht, L-Selektin ist dagegen herunterreguliert. ICAM-1, VLA-4 und
L-Selektin sind Adhäsionsmoleküle, die bei der Wanderung aktivierter Leukozyten in
entzündete Gewebe eine Rolle spielen. Dabei wird zuerst über L-Selektin eine schwache
Bindung an Gefäßendothelzellen vermittelt, der dann eine stärkere Bindung mittels Integrine
folgt. Im Anschluss kommt es zur Diapedese, d. h. zum Durchdringen der Gefäßwand.
Während dieses Vorgangs kommt es zum Verlust von L-Selektin und zur verstärkten
Expression von ICAM-1 und VLA-4 auf T-Zellen. Die γδ-T-Zellen der TuberkulosePatienten stellen also eine Population dar, die zur Migration ins Gewebe aktiviert ist.
Die oben genannten Befunde, dass Vγ9Vδ2-T-Zellen bei verschiedenen bakteriellen
Infektionen aktiviert werden und expandieren, stellen deutliche Hinweise auf eine Beteiligung
an der Immunantwort dar; jedoch ist durch Untersuchungen am Menschen schwer zu
beurteilen, welche Rolle die γδ-T-Lymphozyten tatsächlich spielen. Maus-Modelle bieten die
Möglichkeit, gezielt die Auswirkung des Fehlens von verschiedenen Zellpopulationen auf
Immunreaktionen zu untersuchen. Auch zur Funktion von γδ-T-Zellen gibt es eine Vielzahl
von Untersuchungen. Allerdings lassen sich diese Ergebnisse nur schwer auf den Menschen
übertragen, da Mäusen eine Phosphoantigen-reaktive γδ-T-Zell-Population fehlt.
30
B Kenntnisstand
Die Verwendung von SCID11-Mäusen, die mit humanen Lymphozyten (PBL) rekonstruiert
werden (hu-SCID-Maus), ermöglicht die in vivo Untersuchung der antibakteriellen Aktivität
von humanen γδ-T-Zellen (Wang und Mitarbeiter, 2001b). Wang und Mitarbeiter verglichen
die Folgen einer Infektion mit Escherichia coli oder Morganella morganii in SCID-Mäusen,
in die vor der Infektion entweder komplette PBL oder Vγ9Vδ2-T-Zell-depletierte PBL
transplantiert worden waren. Sie fanden, dass Mäuse, die humane Vγ9Vδ2-T-Zellen
enthielten, eine verringerte Bakterienlast und eine höhere Überlebensrate aufwiesen als
Mäuse, die PBL ohne Vγ9Vδ2-T-Zellen erhalten hatten. Die Injektion des N-haltigen
Bisphosphonats Pamidronat verbesserte den Zustand von mit M. morganii infizierten huSCID-Mäusen und führte zu einer Reduktion der Bakterienlast in Tieren, die mit E. coli oder
S. aureus infiziert waren. Vγ9Vδ2-T-Zellen scheinen also einen Beitrag zur Infektionsabwehr
leisten zu können.
1.8.2
Parasitäre Infektionen
Der Malariaerreger Plasmodium falciparum produziert Phosphoantigene, die mit den
mykobakteriellen TUBAgs eng verwandt sind (Behr und Mitarbeiter, 1996). Präparationen
aus P. falciparum induzieren in vitro die Aktivierung und Proliferation von Vγ9Vδ2-TLymphozyten (Elloso und Mitarbeiter, 1998). Zudem können humane γδ-T-Zell-Klone die
Replikation von P. falciparum verhindern, wahrscheinlich durch direkten Kontakt mit
extrazellulären Merozoiten12 (Elloso und Mitarbeiter, 1994). Es gibt Berichte, dass bei
Primärinfektionen mit P. falciparum die akuten Phasen der Krankheit mit einer
langandauernden Erhöhung des Vγ9Vδ2-T-Zell-Anteils im Blut verbunden sind (Roussilhon
und Mitarbeiter, 1994; Ho und Mitarbeiter, 1994). Im Gegensatz dazu findet man bei MalariaPatienten aus Gebieten, wo diese Krankheit endemisch vorkommt, einen relativen Anstieg der
Vδ1-T-Zell-Population im Blut (Worku und Mitarbeiter, 1997).
Hviid und Mitarbeiter (2001) berichten, dass es bei afrikanischen Malaria-Patienten im Alter
zwischen drei und zehn Jahren ein bis zwei Tage nach Beginn einer anti-Malaria-Therapie zu
einem kurzzeitigem Anstieg sowohl der Absolutzahl als auch des relativen Anteils von Vδ1T-Zellen kommt. Diese Zellen zeigen einen aktivierten Phänotyp (Expression von CD69 und
HLA-DR), aber keine Anzeichen einer Antigen-abhängigen Expansion (weder bevorzugte
Verwendung einer bestimmten Vγ-Kette noch Dominanz einer CDR3-Länge). Die Autoren
vermuten, dass es durch die Malaria-Infektion zur Proliferation von Vδ1-T-Zellen in
Geweben kommt, aus denen sie nach Therapiebeginn in Folge des Abklingens von
Entzündungsreaktionen freigesetzt werden.
11
SCID = „severe combined immunodeficiency“; bei SCID-Mäusen können weder Antikörper- noch T-ZellAntworten ausgelöst werden.
12
Merozoiten stellen ein Entwicklungsstadium der Malariaplasmodien dar; sie gelangen nach Zerstörung von
befallenen Erythrozyten ins Blutplasma und dringen in neue Erythrozyten ein.
31
Auch bei Infektionen durch weitere Protozoen scheinen γδ-T-Lymphozyten von Bedeutung zu
sein. Patienten mit angeborener oder erworbener Toxoplasmose zeigen einen gesteigerten
Anteil von Vγ9Vδ2-T-Zellen im peripheren Blut (Hara und Mitarbeiter, 1996; Scalise und
Mitarbeiter, 1992). Während Vγ9Vδ2-T-Zellen sowohl seronegativer als auch seropositiver
gesunder Personen durch mit Toxoplasma gondii infizierte PBL zur Proliferation angeregt
werden, ist bei Patienten mit angeborener Toxoplasmose zunächst die gesamte T-ZellPopulation anerg (Hara und Mitarbeiter, 1996). Im fünften Lebensmonat lassen sich die
T-Zellen der Patienten durch ein Mitogen (anti-CD3-Antikörper) stimulieren. Bei Patienten,
die älter als ein Jahr sind, ist die Reaktivität der Vγ9Vδ2-T-Zellen gegen mit T. gondii
infizierte Zellen wieder hergestellt, die T. gondii-spezifischen αβ-T-Lymphozyten sind
dagegen noch anerg (Subauste und Mitarbeiter, 1995).
1.8.3
Virale Infektionen
Vγ9Vδ2-T-Zellen könnten bei der Bekämpfung einer HIV-Infektion eine Rolle spielen. Sie
werden in vitro von HIV-infizierten Zellen zur Proliferation angeregt, zeigen zytotoxische
Aktivität gegen die virusinfizierten Zellen und können durch die Produktion inhibitorischer
β-Chemokine die Virusreplikation unterdrücken (Gougeon und Mitarbeiter, 2002). In den
Anfangsstadien der Infektion tragen sie so vielleicht zur Eindämmung der Virusausbreitung
bei. Im Verlauf einer HIV-Infektion nimmt die Zahl der Vγ9Vδ2-T-Zellen jedoch ab.
Eventuell führt die chronische Aktivierung der Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten zu Apoptose
(activation induced cell death) oder Anergie der γδ-T-Zellen. Eventuell führt auch die
abnehmende Zahl an CD4-T-Zellen zu einer Hemmung der Proliferation von Vγ9Vδ2-TZellen. In fortgeschrittenen Stadien der HIV-Infektion wird in vitro eine stark reduzierte
Antwort von γδ-T-Zellen auf M. tuberculosis oder Phosphoantigene beobachtet. In vielen
Fällen kann die Reaktivität durch Zugabe von IL-2 wieder hergestellt werden, was vermuten
lässt, dass ungenügende Aktivität von Mykobakterien-reaktiven CD4-T-Zellen der Grund für
die Abschwächung der γδ-T-Zellantwort ist (Kabelitz und Wesch, 2001). Heute verfügbare
hochaktive antiretrovirale Therapien führen zu einem Sinken der Viruslast und einer Zunahme
naiver CD4-T-Zellen; dabei wird auch die Reaktivität der Vγ9Vδ2-T-Zelle wieder hergestellt
(Martini und Mitarbeiter, 2000).
Bei einer HIV-Infektion nimmt nicht nur die Anzahl der Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten ab, es
erhöht sich gleichzeitig auch die Absolutzahl an Vδ1-T-Lymphozyten im Blut (Gougeon und
Mitarbeiter, 2002). Dadurch kehrt sich schon kurz nach der Infektion mit dem Virus das
Verhältnis von Vδ2- und Vδ1-positiven T-Zellen um. Der Anstieg der Vδ1-T-Zellen beruht
nicht auf klonaler Expansion Antigen-stimulierter γδ-T-Zellen. Möglicherweise induziert ein
Vδ1-selektiver Ligand die polyklonale Expansion der Vδ1-T-Zellen im peripheren Blut; dabei
könnte die Reaktivität Vδ1-positiver Zellen gegenüber chronisch aktivierten B-Zellen eine
Rolle spielen (Hyjek und Mitarbeiter, 1997). Vielleicht wandern auch Vδ1-T-Lymphozyten
aus epithelialen Geweben in die Peripherie (Kabelitz und Wesch, 2001).
32
B Kenntnisstand
Vδ1-Klone von HIV-positiven Individuen zeigen zytotoxische Aktivität und produzieren
große Mengen der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α. Inwieweit Vδ1-TZellen aber an der Immunantwort bei einer HIV-Infektion beteiligt sind, ist noch weitgehend
unklar.
Die Rolle humaner γδ-T-Zellen bei Virusinfektionen ist, mit Ausnahme der HIV-Infektion,
wenig untersucht. Bukowski und Mitarbeiter (1994) zeigen, dass im Blut HSV-1seropositiver13 Personen der Anteil an Vγ9Vδ2-T-Zellen vergrößert ist. Auch bei Patienten
mit akuter Epstein-Barr-Virus-Infektion (EBV) lässt sich ein erhöhter Anteil an Vγ9Vδ2-TZellen im Blut nachweisen (de Paoli und Mitarbeiter, 1990). In Patienten, die sich nach einer
Nierentransplantation mit dem Zytomegalievirus (CMV) infizieren, kommt es zu einer wahrscheinlich Antigen-spezifischen - Expansion von Vδ1- und Vδ3-positiven T-Zellen
(Dechanét und Mitarbeiter, 1999). Im Gegensatz zu den Vγ9Vδ2-T-Zellen zeigen die Vδ1und Vδ3-T-Zellen der CMV-infizierten Patienten in vitro eine proliferative Antwort auf
Lysate von CMV-infizierten Fibroblasten.
1.8.4
Anti-Tumor-Immunität
Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten besitzen ein hohes zytotoxisches Potential, das durch die Expression
von inhibitorischen Rezeptoren (KIRs) kontrolliert wird. Sie werden in vitro von DaudiZellen und anderen B-Zell-Lymphomlinien aktiviert und zeigen ihnen gegenüber lytische
Aktivität (Sicard und Mitarbeiter, 2001). Möglicherweise wirken sie auch in vivo als
Effektoren gegen Tumorzellen, die sich durch erhöhte Expression eines γδ-TZR-Liganden
und/oder durch Veränderungen der MHC-Klasse-I-Moleküle (Reduktion der Expression oder
Änderung der Konformation) auszeichnen (Fisch und Mitarbeiter, 2000). Die Möglichkeit,
Vγ9Vδ2-T-Zellen entweder in vitro (z. B. durch ein Phosphoantigen) oder in vivo (z. B. durch
Pamidronat, vgl. Kunzmann und Mitarbeiter, 2000) zu aktivieren und zu expandieren, lässt
sich möglicherweise in Zukunft gezielt zur Bekämpfung von Tumoren, insbesondere
hämatopoetischer Tumore, einsetzen, die einer Lyse durch γδ-T-Lymphozyten zugänglich
sind. Interessanterweise werden verschiedene Tumorzelllinien, die normalerweise keine Ziele
von zytotoxischen Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten darstellen (z. B. Blasenkrebs-, Nierenkrebs-,
Lungenkrebs-, Melanom- oder Osteosarkomzellen), durch Vorbehandlung mit dem
Aminobisphosphonat Pamidronat empfindlich für eine γδ-T-Zell-vermittelte Lyse (Kato und
Mitarbeiter, 2001).
Auch Vδ1-positive T-Zellen könnten eine Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore spielen.
Vδ1-T-Lymphozyten infiltrieren verschiedene solide Tumore (z. B. Lungentumore) und
zeigen in vitro Anti-Tumor-Aktivität (Ferranini und Mitarbeiter, 2002). Dabei erkennen sie
die MHC-I-ähnlichen Moleküle MICA oder MICB (vgl. Kap. B1.5.3), die von vielen
Tumorzellen exprimiert werden (Groh und Mitarbeiter, 1999).
13
HSV-1: Herpes simplex Virus Typ 1.
1.8.5
33
Weitere Funktionen von γδ-T-Lymphozyten
In fast allen Bereichen der Immunologie wird über eine Beteiligung von γδ-T-Zellen
spekuliert. Wie bereits besprochen, scheinen γδ-T-Zellen bei der Immunantwort gegen
verschiedene Infektionen eine Rolle zu spielen und es gibt Hinweise, dass sie sowohl zur
schützenden Immunität beitragen als auch immunregulatorische Funktionen haben können
(Carding und Egan, 2000). Auch an Immunreaktionen, die bei verschiedenen
Autoimmunerkrankungen und Allergien auftreten, sollen γδ-T-Zellen beteiligt sein
(Holoshitz, 1999; Yin und Craft, 2000). Für Vδ1-T-Zellen wurde sogar eine regulatorische
Funktionen für Epithelzellen des Dünndarms vorgeschlagen (Miller und Mitarbeiter, 2000).
Doch trotz zahlreicher experimenteller Hinweise konnte die Bedeutung der γδ-T-Zellen
innerhalb des Immunsystems noch in keinem Fall vollständig aufgeklärt werden.
34
2
B Kenntnisstand
Die Isoprenoidbiosynthese als Quelle natürlicher
Phosphoantigene
Die Isoprenoide sind eine äußerst vielfältige Gruppe von Naturstoffen. Zu ihnen gehören
Aromastoffe wie Geraniol und Linalool, Retinol (Vitamin A), die Carotinoide, Cholesterin,
Steroid-Hormone wie Testosteron oder Progesteron. All diese Verbindungen entstehen aus
den Metaboliten Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP).
Dabei katalysieren Polyprenyldiphosphat-Synthasen (Prenyltransferasen) die Kondensation
von IPP mit DMAPP oder mit Polyprenyldiphosphaten zu Geranyl-, Farnesyl- und schließlich
Geranylgeranylpyrophosphat (vgl. Abb. 5). Aus diesen Verbindungen gehen durch weitere
Biosyntheseschritte die unterschiedlichen Isoprenoide hervor.
H
H
O PP
PP
H
O PP
DMAPP
H
O PP
PP
O PP
IPP
GPP
FPP
IPP
Abb. 5: Bildung von GPP und FPP durch die Farnesylpyrophosphat-Synthase
Verschiedene Metaboliten des Isoprenoidstoffwechsels aktivieren in vitro Vγ9Vδ2-T-Zellen
(vgl. Kap. B1.5). IPP wurde als erstes natürlich vorkommendes Phosphoantigen aus
Mykobakterien isoliert. Deutlich schwächer aktiv sind DMAPP, GPP und FPP. Allerdings ist
es zweifelhaft, dass solche ubiquitär verbreiteten Verbindung eine spezifische Immunreaktion
auslösen. Zudem liegt IPP in verschiedenen γδ-T-Zell-stimulierenden Bakterien in zu
geringen Konzentrationen vor, um für die beobachtete T-Zellantwort verantwortlich zu sein.
Schließlich gelang es mit 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-pyrophosphat (HMB-PP) ein
hochaktives Phosphoantigen aus E. coli zu charakterisieren. HMB-PP ist ebenfalls ein
Metabolit der Isoprenoidbiosynthese, kommt allerdings in menschlichen (und tierischen)
Zellen nicht vor.
Seit den grundlegenden Arbeiten von Bloch, Lynen, Cornforth und ihren jeweiligen
Mitarbeitern (vgl. Übersichtsartikel: Bochar und Mitarbeiter, 1999) an Hefe- und Leberzellen
wurde jahrzehntelang angenommen, dass der universelle Isoprenoid-Vorläufer IPP in allen
Organismen über den Mevalonat- (MVA-)Weg gebildet wird (vgl. Abb. 6 A). In der letzten
Zeit fanden die Gruppen von Rohmer und Arigoni bei Einbaustudien mit 13C-markierter
Glucose unabhängig voneinander, dass die in bakteriellen und pflanzlichen Isoprenoiden
auftretenden Isotopenmuster nicht in Einklang mit der Biosynthese über Mevalonsäure
(MVA) stehen. In der Folge wurden von mehreren Gruppen die Biosyntheseschritte eines
MVA-unabhängigen Wegs zu IPP aufgeklärt (vgl. Abb. 6 B).
2 Isoprenoidbiosynthese als Quelle von Phoshpoantigenen
O
O
B
A
35
O
O
O
SCoA
H
+
H
O
-
[7]
CO2
2 x Acetyl-CoA
Pyruvat
+ Gly3P
OH
O
SCoA
P
HO
O
+
NADPH + H
CoAS
H
DOXP
O
P
MEP
[8]
NADP
O
HO
SCoA
Acetyl-CoA +
Acetoacetyl-CoA
P
OH
O
O
O
HO
[1]
OH
CTP
[9]
O
HO
HMG-CoA
OOC
2 NADPH + H
PPi
HO
SCoA
HO
-
O
ATP
HO
OH
P
N
OH OH
NH2
N
P
O
O
P
O-
OH
O
O-
O
N
2 ADP
[11]
HO
MVA-5-PP
O
O
O
P
[5]
O
OH
O PP
[12]
HMB-PP
O PP
OH
[13]
(
O PP
MEcPP
P O
O-
OH
H2O
[6]
DMAPP
CDPME2P
O O
PP
ATP
IPP
OH OH
O
CMP
OOC
ADP + Pi
CO2
O
CDP-ME
[10]
O
O
HO
O
O-
O
[3, 4]
-
ADP
O
HO
O
P
O
O
2 NADP
MVA
P
OH
[2]
OOC
N
O
O
O
+
2 ATP
NH2
O PP
[6]
)
O PP
IPP +
DMAPP
Abb. 6: Biosynthese von IPP und DMAPP über A: Mevalonat und B: DOXP
[1] HMG-CoA-Synthase; [2] HMG-CoA-Reduktase; [3] MVA-Kinase; [4] Phospho-MVA-Kinase;
[5] MVA-5-PP-Decarboxylase; [6] IPP-Isomerase; [7] DOXP-Synthase; [8] DOXPReduktoisomerase; [9] CDP-ME-Synthase; [10] CDP-ME-Kinase; [11] MEcPP-Synthase;
[12] MEcPP-Reduktase; [13] HMB-PP-Reduktase.
36
2.1
B Kenntnisstand
IPP-Biosynthese via Mevalonat
Die Reaktionen und Enzyme, die für die Bildung von IPP aus Acetat über den
Schlüsselmetaboliten Mevalonat verantwortlich sind, sind gut untersucht und werden in vielen
Übersichtsartikeln und Lehrbüchern beschrieben14 (vgl. auch Abb. 6 A).
Die IPP-Biosynthese über den Mevalonat-Weg geht von Essigsäure aus, die energiereich an
Coenzym A gebunden ist (Acetyl-CoA, „aktivierte Essigsäure“). Acetyl-CoA ist eines der
wichtigsten Intermediate im Stoffwechsel; es entsteht zum Beispiel durch Glykolyse aus
Glucose, beim Abbau mancher Aminosäuren oder bei der β-Oxidation von Fettsäuren;
Acetyl-CoA kann wiederum zum Aufbau von Fettsäuren verwendet werden, im Citratzyklus
der Energiegewinnung dienen oder als Baustein für die Isoprenoid-Biosynthese Verwendung
finden. Dabei treten zwei Moleküle Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA zusammen, und ein
drittes wird durch die 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase) als
Verzweigung ankondensiert. HMG-CoA wird unter Verbrauch von zwei Äquivalenten
NADPH zur Mevalonsäure (MVA) reduziert. HMG-CoA-Reduktase ist in vielen Lebewesen
ein wichtiges regulatorisches Enzym des Isoprenoid-Stoffwechsels; eine Gruppe von HMGCoA-Reduktase-Hemmern – die Statine – wird beim Menschen erfolgreich zur Kontrolle des
Cholesterin-Metabolismus eingesetzt. Die Analyse von Aminosäuresequenzen der HMGCoA-Reduktasen verschiedener Spezies ergab, dass zwei unterschiedliche Klassen des
Enzyms existieren. Während Klasse I HMG-Co-Reduktasen in allen Eukaryoten, vielen
Archaebakterien und in einigen Streptomyceten (Takagi und Mitarbeiter, 2000b) auftreten,
findet sich das Klasse II Enzym in manchen Eubakterien, z.B. in Staphylococcus aureus
(Dewick, 2002).
MVA wird nachfolgend durch zwei Kinasen, Mevalonat-Kinase (MVA-Kinase) und
Phosphomevalonat-Kinase
(Phospho-MVA-Kinase)
zu
Mevalonsäure-5-diphosphat
(MVA-5-PP) phosphoryliert. Die MVA-5-PP-Decarboxylase katalysiert in einer ATPabhängigen Reaktion die Bildung von IPP. Wahrscheinlich wird MVA-5-PP intermediär in
3-Position phosphoryliert. IPP steht über die IPP-Isomerase im Gleichgewicht mit DMAPP.
Aus diesen beiden C5-Einheiten entstehen in der Folge die verschiedenen Isoprenoide (vgl.
Abb. 5).
14
Einen aktuellen Übersichtsartikel bietet zum Beispiel Dewick (2002).
2.2
2.2.1
37
Biosynthese von IPP und DMAPP via 2-C-Methyl-D-erythritol-4phosphat15
Entdeckung einer MVA-unabhängigen Isoprenoidbiosynthese16
Rohmer und Mitarbeiter untersuchten die Biosynthese von Hopanoiden, einer Gruppe von
pentazyklischen Triterpenen, die in Bakterien vorkommen. Durch Einbaustudien mit 13Cmarkiertem Acetat sollte die Herkunft einer polyhydroxylierten Seitenkette, die die
Hauptvertreter dieser Stoffklasse auszeichnet, aufgeklärt werden. Dabei fiel auf, dass das
Markierungsmuster der Isopreneinheiten nicht mit dem zu erwartendem Muster
übereinstimmte. Wird an C-1 markiertes Acetyl-CoA über den Mevalonat-Weg in IPP
eingebaut, müssten sich die Markierungen dort in Position 1 und 3 wiederfinden. Bei
Verwendung von [2-13C]-Acetat sollten die C-Atome 2, 4 und 5 von IPP markiert sein.
Tatsächlich fanden sich aber im ersten Fall Markierungen, die dem C-4 von IPP entsprechen,
im zweiten Fall tauchten die Markierungen an allen Positionen auf (vgl. Abb. 7).
B
A
O PP
(a)
O PP
(b)
O PP
O PP
(a)
(b)
Abb. 7: Markierungsmuster von IPP nach Verfütterung von
A: [1-13C]-Acetat B: [2-13C]-Acetat;
(a) Erwartete Muster bei Synthese über MVA; (b) gefundene Muster.
Beim Versuch, eine Erklärung für diese ungewöhnlichen Markierungsmuster zu finden, setzte
man immer noch die IPP-Biosynthese über den Mevalonat-Weg voraus. Erst nach Einbauexperimenten mit 13C-markierter Glucose, mit deren Hilfe man die Herkunft der C-Atome im
IPP klären konnte, wurde ersichtlich, dass ein zweiter Weg der Isoprenoidbiosynthese
existiert.
Bei Studien mit Zymomonas mobilis in Gegenwart von 13C-markierter Glucose fand man, dass
die C-Atome 3 und 5 von IPP aus einer C2-Einheit stammen, die durch Decarboxylierung von
Pyruvat17 gebildet wird. Sie entsprechen den Atomen C-2 und C-3 oder C-5 und C-6 der
Glucose. Die drei übrigen IPP-Kohlenstoffatome (C-1, C-2 und C-4) stammen von jeweils
einem C-Atom der Glucose (C-6, C-5 und C-4) (vgl. Abb. 8). Diese drei Kohlenstoffatome
könnten entweder durch zwei unterschiedliche Prekursor-Moleküle eingeführt werden oder
aber von einer einzelnen C3-Einheit, in welche die C2-Einheit eingeschoben wird. Eine
Analyse der 13C-NMR-Spektren markierter Verbindungen zeigte, dass es bei den
Kohlenstoffatomen, die den C-Atomen 1, 2 und 4 von IPP entsprechen, zu
Signalaufspaltungen mit für 13C-13C-Kopplungen typischen Kopplungskonstanten kommt.
15
Aktuelle Übersichtsartikel bieten Rohmer (2003), Rohdich (2003a) und Kuzuyama (2003).
Eine Übersicht über die Entdeckung des Nicht-Mevalonat-Wegs findet sich bei Rohmer (1999).
17
Z. mobilis baut Glucose über den Entner-Doudoroff-Weg zu Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat ab.
16
38
B Kenntnisstand
Somit sind diese drei 13C-Atome gleichzeitig in einer Isopreneinheit vorhanden und müssen
daher aus einem C3-Fragment stammen, wahrscheinlich aus Glycerinaldehyd-3-phosphat
(Gly3P).
1 COOH
1 COOH
OH
2
HO
3
2
OH
3 C H3
O
Pyruvat
4
OH
5
OH
6 CH 2 OH
Glucose
3/6
2/5
SCoA
4 CHO
5
OH
4 COOH
5
6
2/5
5
4
O PP
IPP
OH
6 CH 2 O
6 CH 3
Gly3P
Pyruvat
P
Acetyl-CoA
3/6
Abb. 8: Abbau von Glucose17 und Herkunft der C-Atome von IPP in Z. mobilis
Die Ziffern 1 – 6 bezeichnen die ursprüngliche Position der C-Atome in der Glucose.
Spätere Fütterungsversuche mit Pyruvat und Glycerin belegten, dass Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat die ersten Vorläufer bei der Mevalonat-unabhängigen Terpenbiosynthese
sind. Eine Kondensationsreaktion dieser beiden Verbindungen mit Decarboxylierung des
Pyruvats (ähnlich einer Transketolase-Reaktion) würde ein 1-Desoxypentulosephosphat ergeben. Tatsächlich gibt es ein in Bakterien, Hefen und niederen Pilzen weit verbreitetes
Enzym, das die Bildung von D-1-Desoxyxylulose-5-phosphat (DOXP) aus Pyruvat und
Glycerinaldehyd-3-phosphat katalysiert (Yokota und Sasajima, 1984; Yokota und Sasajima,
1986). Die Gruppe von Arigoni konnte zeigen, dass D-1-Desoxyxylulose (DOX) effektiv in
Ubiquinone von E. coli eingebaut wird (Broers, 1994). Damit war der erste Beweis erbracht,
dass D-1-Desoxyxylulose, wahrscheinlich in der Form des 5-Phosphats, ein Vorläufer der C5Isopreneinheiten ist.
2.2.2
Gene, Enzyme und Zwischenprodukte
Die Reaktionsfolge des MEP-Wegs ist in Abb. 6 B dargestellt. Sie wurde in den letzten Jahren
durch Arbeiten in E. coli aufgeklärt und durch Untersuchungen an anderen Bakterien und
Pflanzen bestätigt. Eine Übersicht über die bis heute charakterisierten E. coli-Enzyme bietet
Tab. 5. Die Ausgangsverbindungen Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat stammen aus
dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel und werden durch Glykolyse oder über den EntnerDoudoroff-Weg gebildet. Sie kondensieren unter CO2-Abspaltung in einer Thiaminabhängigen Reaktion zu D-1-Desoxyxylulose-5-phosphat. Die Suche nach Genen mit
Sequenzhomologien zu Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatdecarboxylase und Transketolase
führte zu einem unbekanntes Gen in E. coli, das Teil des selben Operons wie das Gen ispA ist,
welches für die Farnesylpyrophosphat-Synthase codiert (Sprenger und Mitarbeiter, 1997; Lois
und Mitarbeiter, 1998). Das spricht für eine funktionelle Verwandtschaft der Genprodukte.
Tatsächlich katalysiert das Produkt des jetzt als dxs (1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatSynthase) bezeichneten Gens die Bildung von DOXP aus Pyruvat und Glycerinaldehyd-3phosphat.
39
DOXP ist nicht nur Vorläufer von IPP und DMAPP sondern wird auch für die Biosynthese
von Thiamin und Pyridoxal benötigt (Spenser und White, 1997; Cane und Mitarbeiter, 1998).
Daher ist die Bildung des verzweigten Intermediats 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat die
erste Reaktion, die eindeutig zur Bildung von Isoprenoiden führt. Das Auftreten von MEP
wurde von Rohmer postuliert und durch Einbau der nicht phosphorylierten Verbindung in
E. coli bestätigt. Als Reaktionsmechanismus wurde die Umlagerung von DOXP zu 2-CMethyl-D-erythrose-4-phosphat und anschließende Reduktion zu MEP vorgeschlagen, eine
ähnliche Reaktion wird bei der Biosynthese von Valin, Leucin und Isoleucin von der
Ketolsäure-Reduktoisomerase katalysiert (vgl. Abb. 9).
H
A
O
O
O
OH
O
P
HO
OH
O
H
OH
O
P
P
HO
HO
H
B
O
R O
COOH
O
HO
R
OH
COOH
HO
R
COOH
R = Me, Et
Abb. 9:
Reaktionen, die von Reduktoisomerasen katalysiert werden.
A: Reduktive Umlagerung von DOXP zu MEP; die vermutete Zwischenverbindung
2-C-Methylerythrose-4-phosphat konnte nicht isoliert werden.
C-Atome, die über Pyruvat eingeführt werden; # C-Atome, die über
Glycerinaldehyd-3-phosphat eingeführt werden.
B: Reduktive Umlagerung von 2-Aceto-α-hydroxysäuren durch KetolsäureReduktoisomerase (kommt bei der Biosynthese von Valin, Leucin und Isoleucin
vor) (nach Koppisch und Mitarbeiter, 2002).
Seto und Mitarbeiter identifizierten das E. coli-Gen ispC, das auf exogenes
2-C-Methylerythritol angewiesene Mutanten komplementiert (Takahashi und Mitarbeiter,
1998). Das rekombinante Protein (ein Homotetramer mit einem Molekulargewicht von
150 kDa) katalysiert die intramolekulare Isomerisierung und Reduktion von DOXP zu MEP.
Dabei benötigt die 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase zweiwertige
Kationen wie Mn2+, Mg2+ oder Co2+ sowie NADPH als Kofaktoren. Die Bindung der
Substrate erfolgt in geordneter Weise, DOXP bindet vor NADPH (Koppisch und Mitarbeiter,
2002). Wahrscheinlich ist damit auch eine Konformationsänderung des Enzyms verbunden,
da sich ein für die Affinität zu DOXP essentieller Histidin-Rest (Kuzuyama und Mitarbeiter,
2000c) im apo-Enzym weit entfernt von der Substrat-Bindungs-Stelle befindet (Reuter und
Mitarbeiter, 2002). Der Reaktionsmechanismus ist noch nicht vollständig aufgeklärt.
40
B Kenntnisstand
Das vermutete Zwischenprodukt 2-C-Methyl-D-erythrose-4-phosphat (vgl. Abb. 9A) konnte
nicht isoliert werden (Koppisch und Mitarbeiter, 2002); allerdings kann die DOXPReduktoisomerase das synthetisch hergestellte Aldehyd zu MEP reduzieren (Hoeffler und
Mitarbeiter, 2002).
Tab. 5:
Übersicht über Gene und Enzyme des MEP-Wegs in E. coli
Gen (alte
Bezeichnung)
dxs
Enzym
Literatur
ispC
(dxy; yaeM)
DOXPReduktoisomerase
3
3
(Takahashi und Mitarbeiter, 1998)
(Koppisch und Mitarbeiter, 2002)
(Reuter und Mitarbeiter, 2002)
(Hoeffler und Mitarbeiter, 2002)
ispD
(ygP)
CDP-ME-Synthase
3
3
(Rohdich und Mitarbeiter, 1999)
(Kuzuyama und Mitarbeiter, 2000a)
(Richard und Mitarbeiter, 2001)
ispE
(ychB)
CDP-ME-Kinase
3
ispF
(ygB)
MEcPP-Synthase
3
ispG
(GcpE)
MEcPP-Reduktase
3
(Hecht und Mitarbeiter, 2001)
(Rohdich und Mitarbeiter, 2003b)
ispH
(lytB)
HMB-PP-Reduktase
3
(Adam und Mitarbeiter, 2002)
(Rohdich und Mitarbeiter, 2003b)
(Wolff und Mitarbeiter, 2003)
Eigenschaften Struktur
DOXP-Synthase
3
(Sprenger und Mitarbeiter, 1997)
(Lois und Mitarbeiter, 1998)
(Lüttgen und Mitarbeiter, 2000)
(Kuzuyama und Mitarbeiter, 2000b)
3
(Herz und Mitarbeiter, 2000)
(Takagi und Mitarbeiter, 2000a)
(Kemp und Mitarbeiter, 2002)
(Richard und Mitarbeiter, 2002)
(Steinbacher und Mitarbeiter, 2002)
Aufgeführt sind die aktuellen und in Klammern die früheren Bezeichnungen der Gene des MEP-Wegs in E. coli,
die zugehörigen Enzyme und die relevanten Literaturstellen. E. coli-Enzyme, die isoliert und charakterisiert
wurden (Eigenschaften) bzw. deren Kristallstruktur ermittelt wurde (Struktur) sind mit einem 3 gekennzeichnet.
41
Als nächstes wird MEP in drei Schritten zu einem zyklischen Diphosphat umgewandelt.
Zuerst wird ein Cytidylphosphat-Rest von CTP auf die Phosphatgruppe von MEP übertragen
und die 2-Hydroxy-Gruppe des entstandenen 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritols
(CDP-ME) wird phosphoryliert. 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
(CDP-MEP) geht schließlich durch Ringschluss und Abspaltung von CMP in 2-C-Methyl-Derythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) über. Diese Verbindung ist schon länger bekannt, da
sie in einigen Bakterien – z.B. in Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress
akkumuliert wird (Ostrovsky und Mitarbeiter, 1992b; Ostrovsky und Mitarbeiter, 1998).
Diese Biosyntheseschritte wurden parallel von zwei Gruppen aufgeklärt. Eisenreich und
Mitarbeiter fanden durch Umsetzungen mit Enzymfraktionen aus E. coli, dass MEP zu CDPME umgesetzt wird (Rohdich und Mitarbeiter, 1999). Eine Datenbanksuche mit der Sequenz
einer CDP-Transferase resultierte in einer relativ großen Zahl ähnlicher Gene von
verschiedenen Organismen. Das Vorkommen dieser homologen Gene (ispD) korreliert mit
dem Auftreten des MEP-Wegs. Auch zwei weitere Gene, ispE und ispF, zeigen diese
Verteilung (Lüttgen und Mitarbeiter, 2000; Herz und Mitarbeiter, 2000). Die Genprodukte
von ispD, ispE und ispF katalysieren sukzessiv die Bildung von MEcPP aus MEP. Die
Gruppe von Seto transformierte E. coli mit Genen für MVA-Kinase, Phospho-MVA-Kinase
und MVA-5-PP-Decarboxylase aus Streptomyces sp. CL190 (Takagi und Mitarbeiter, 2000b).
Die so veränderten E. coli können exogenes MVA zur IPP-Synthese nutzen. Ausgehend
davon wurden Mutanten generiert, die auf die Zugabe von MVA zum Medium angewiesen
sind und schließlich Gene kloniert, die diesen Defekt ausgleichen. Die exprimierten Proteine
wurden mit MEP bzw. CDP-ME und CDP-MEP umgesetzt und die Struktur der
Reaktionsprodukte wurde ermittelt (Kuzuyama und Mitarbeiter, 2000a; Kuzuyama und
Mitarbeiter, 2000b; Takagi und Mitarbeiter, 2000a).
4-Diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol-Synthase ist ein Homodimer mit einer Masse von
26 kDa (Rohdich und Mitarbeiter, 1999). Das Enzym ist in Gegenwart der zweiwertigen
Kationen Mg2+, Mn2+ oder Co2+ aktiv. Neben CTP wird auch GTP umgesetzt, allerdings nur
mit sehr geringer Aktivität. Das ispE-Protein (4-Diphosphocytidyl-2-C-methylerythritolKinase) aus Pfefferminze (Mentha x piperita) und E. coli wurde von Lange und Croteau
schon 1999 als Kinase identifiziert. Sie zeigten, dass das partiell aufgereinigte Enzym in
Gegenwart von Mg2+ und ATP die Phosphorylierung von Isopentenylphosphat zu IPP
katalysiert. Allerdings sind die Umsetzungsraten extrem niedrig; diese Reaktion spielt also
wahrscheinlich in vivo keine Rolle. 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat-Synthase ist
ein Zn2+-haltiges Homotrimer (Molekulargewicht ist 51 kDa), das Mg2+ als Kofaktor benötigt
(Kemp und Mitarbeiter, 2002; Steinbacher und Mitarbeiter, 2002).
Die Gene für die letzten beiden Schritte der IPP/DMAPP-Biosynthese über den MEP-Weg
wurden ebenfalls durch vergleichende Genom-Analyse aufgefunden (Cunningham und
Mitarbeiter, 2000). Die Beteiligung der ispG- und ispH-Proteine an der Terpenbiosynthese
konnte durch Gen-Deletions-/Gen-Komplementierungs-Experimente nachgewiesen werden
(Altincicek und Mitarbeiter, 2001b; Altincicek und Mitarbeiter, 2001a).
42
B Kenntnisstand
Die Gruppe von Eisenreich überexprimierte xylB, ispC, ispD, ispE, ispF und ispG in E. coli
und identifizierte das aus MEcPP gebildete Produkt als 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4pyrophosphat (HMB-PP) (Hecht und Mitarbeiter, 2001). Eberl und Mitarbeiter isolierten die
gleiche Verbindung aus E. coli-Mutanten mit defektem ispH-Gen und zeigten ihre
Wirksamkeit als Phosphoantigen für γδ-T-Zellen (vgl. Kap. A1.5.1.1) (Eberl und Mitarbeiter,
2002). E. coli, die ispH zusammen mit xylB und ispCDEFG überexprimieren, bilden IPP und
DMAPP im Verhältnis 5 : 1 (Rohdich und Mitarbeiter, 2002). Bei der MVA-abhängigen
Biosynthese wird DMAPP aus IPP gebildet. E. coli besitzt zwar eine IPP-Isomerase, aber das
codierende Gen (idi) ist nicht essentiell (Hahn und Mitarbeiter, 1999). Eine weitere
Möglichkeit, IPP in DMAPP umzuwandeln, existiert in E. coli nicht (Rodríguez-Concepción
und Mitarbeiter, 2000). Das bedeutet, dass sich der MEP-Weg spaltet und IPP und DMAPP
unabhängig voneinander entstehen. Die HMB-PP-Reduktase katalysiert dabei die Bildung
von IPP und DMAPP aus HMB-PP.
Die Reduktasen ispG und ispH weisen sehr starke funktionelle Ähnlichkeit auf. Die
aufgereinigten rekombinanten Enzyme sind inaktiv; in Gegenwart von Rohproteinextrakten
aus E. coli lässt sich die Reaktivität allerdings wieder herstellen (Rohdich und Mitarbeiter,
2003b; Adam und Mitarbeiter, 2002). Dies deutet darauf hin, dass Hilfsproteine den Transport
von Redoxäquivalenten katalysieren. Auch die Gegenwart eines reduzierenden Systems –
z. B. Flavodoxin/Flavodoxinreduktase/NADPH oder photoreduziertes Deazaflavin – genügt
zur Aktivierung der Proteine. Durch welches System in vivo Elektronen bereitgestellt werden,
ist noch nicht bekannt. Beide Enzyme besitzen je drei hochkonservierte Cystein-Reste und
enthalten [4Fe-4S]2+-Cluster als prosthetische Gruppen (Hecht und Mitarbeiter, 2001;
Seemann und Mitarbeiter, 2002; Wolff und Mitarbeiter, 2003). Die vorliegenden Daten
deuten darauf hin, dass die beiden Reduktasen jeweils zwei einzelne Elektronen von externen
Quellen aufnehmen und schrittweise auf das jeweilige Substrat übertragen; dabei treten
wahrscheinlich radikalische Intermediate auf. MEcPP-Reduktase hat ein Molekulargewicht
von 40 kDa (Rohdich und Mitarbeiter, 2003b). HMB-PP-Reduktase ist ein Dimer mit einem
Molekulargewicht von 72 kDa (Wolff und Mitarbeiter, 2003).
43
Außer aus E. coli sind inzwischen noch aus weiteren Bakterien, aus Pflanzen und auch aus
P. falciparum Enzyme des MEP-Wegs charakterisiert worden. Eine Übersicht darüber,
welche rekombinanten Enzyme aus verschiedenen Bakterien sowie aus P. falciparum und
Arabidopsis thaliana bis jetzt erzeugt wurden, bietet Tab. 6. Sie weisen relativ hohe
Sequenzhomologien mit den E. coli-Enzymen auf; die pflanzlichen Enzyme zeichnen sich
durch N-terminale Plastid-Targeting-Sequenzen aus.
Tab. 6:
Übersicht über die rekombinanten Enzyme des MEP-Wegs aus verschiedenen
Bakterien, P. falciparum und Arabidopsis thaliana
Enzym
Spezies
Literatur
DOXP-Synthase
Mycobacterium tuberculosis
Pseudomonas aeroginosa
Rhodobacter capsulatus
Streptomyces coelicolor
Streptomyces sp. CL190
Synechococcus leopoliensis
Arabidopsis thaliana
(Bailey und Mitarbeiter, 2002)
(Altincicek und Mitarbeiter, 2000)
(Eubanks und Poulter, 2003)
(Cane und Mitarbeiter, 2001)
(Kuzuyama und Mitarbeiter, 2000c)
(Miller und Mitarbeiter, 1999)
(Estévez und Mitarbeiter, 2000)
DOXP-Reduktoisomerase
Pseudomonas aeroginosa
Synechococcus leopoliensis
Zymomonas mobilis
(Grolle und Mitarbeiter, 2000)
(Wiesner und Mitarbeiter, 2000)
(Schwender und Mitarbeiter, 1999)
CDP-ME-Synthase
MEcPP-Synthase
Thermus thermophilus
(Kollas und Mitarbeiter, 2002)
(Kishida und Mitarbeiter, 2003)
MEcPP-Reduktase
Aquifex aeolicus
(Querol und Mitarbeiter, 2002)
44
2.3
B Kenntnisstand
Vorkommen des MVA- und des MEP-Wegs
Alle Eukaryoten verfügen über die Enzyme des MVA-Wegs. Pflanzen besitzen daneben die
Möglichkeit, Isoprenoide über MEP zu synthetisieren. Allerdings finden sich die Enzyme der
beiden Biosynthesewege in unterschiedlichen Kompartimenten: Die MVA-abhängige Bildung
von IPP findet im Zytosol statt, der MEP-Weg ist in den Plastiden lokalisiert. Ein gewisser
Austausch von Metaboliten scheint zwar möglich zu sein, findet aber nur in geringem
Umfang statt (Eisenreich und Mitarbeiter, 2001). Der zytosolischen Isoprenbiosynthese
entstammen vor allem Sterole, Sesquiterpene und Ubiquinone, in den Plastiden werden
Hemiterpene, Monoterpene, Diterpene, Carotinoide und Plastoquinone gebildet
(Lichtenthaler, 2000). Grünalgen (Chlorophyta) synthetisieren auch Sterole über MEP und
scheinen den zytosolischen MVA-Weg ganz verloren zu haben (Schwender und Mitarbeiter,
2001). Auch eukaryotische Einzeller, die Plastiden enthalten, verfügen über die Enzyme des
MEP-Wegs, z. B. die Alge Chlamydomonas reinhardtii (Lichtenthaler und Mitarbeiter, 2000).
Im Protozoon P. falciparum wurden ebenfalls Gene des MEP-Wegs gefunden und die
Funktionalität einiger Enzyme nachgewiesen (vgl. Tab. 6). Plasmodien besitzen den
Chloroplasten ähnliche Organellen, die Apicoplasten (Wilson, 2002). DOXPReduktoisomerase und MEcPP-Synthase aus P. falciparum weisen typische ApicoplastTargeting-Sequenzen auf. Es wird angenommen, dass die Plastiden der Plasmodien genauso
wie die der Pflanzen aus Endosymbionten hervorgegangen sind und deren Gene – darunter
auch die der MVA-unabhängigen Isoprenoidbiosynthese – in das Genom des
Wirtsorganismus integriert wurden. Zu den Apicomplexeae gehören noch weitere Parasiten,
zum Beispiel auch Toxoplasmen. T. gondii aktiviert ebenso wie P. falciparum spezifisch
humane Vγ9Vδ2-T-Zellen (vgl. Kap. B1.5.1.1). Eventuell ist die Reaktivität beider Parasiten
auf das Vorhandensein des MEP-Wegs zurückzuführen, der in E. coli und anderen Bakterien
die Quelle für Phosphoantigene darstellt.
Bei den prokaryotischen Organismen besitzen die Archaebakterien nur den MVA-Weg der
Isoprenbiosynthese, die photosynthetischen Cyanobakterien verfügen ausschließlich über den
MEP-Weg. Auch der größte Teil der Eubakterien scheint Isoprenoide über MEP zu bilden
(vgl. auch Tab. 1). Bis heute wurde das Genom von 27 Bakterien vollständig sequenziert, und
nur in einer einzigen Art, Borrelia burgdorferi, die Gene des MVA-Wegs nachgewiesen.
Auch sonst sind nur für wenige Bakterien Hinweise bekannt, dass sie Isoprenoide über MVA
bilden, so z. B. für Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum und Myxococcus fulvus
(Boucher und Doolittle, 2000).
Eine Ausnahme stellen die grampositiven Kokken dar zu denen unter anderem
Staphylococcus aureus und die Strepto- und Enterokokken gehören. Für diese Bakterien ist
der MVA-Weg essentiell (Wilding und Mitarbeiter, 2000a). Phylogenetische Analysen
zeigen, dass HMG-CoA-Synthase, MVA-Kinase, P-MVA-Kinase und MVA-5-PPDecarboxylase in grampositiven Kokken näher mit den eukaryotischen Enzymen als mit
denen der Archaebakterien verwandt sind. Wahrscheinlich haben sie diese Gene durch
lateralen Gentransfer erhalten. Die HMG-CoA-Reduktase der grampositiven Kokken ist ein
Klasse II Enzym (vgl. Kap. B2.1) (Wilding und Mitarbeiter, 2000b).
45
Auch ein Bakterium, das Mevalonat als Kohlenstoffquelle nutzen kann – Pseudomonas
mevalonii – hat eine HMG-CoA-Klasse-II-Reduktase. Es wird spekuliert, dass die Vorläufer
der grampositiven Kokken zuerst die HMG-CoA-Reduktase für den Mevalonat-Katabolismus
genutzt haben und später die restlichen Gene für eine IPP-Synthese über Mevalonsäure
erworben haben. Zusätzlich zu den Genen des MVA-Wegs findet man im unvollständig
sequenzierten Genom von S. aureus, S. mutans, S. pyogenes und S. pneumoniae Gene für MECDP-Synthase und/oder ME-CDP-Kinase und bei E. faecalis zusätzlich noch MEcPPSynthase (Boucher und Doolittle, 2000). Gene für DOXP-Synthase oder –Reduktoisomerase
wurden aber in keinem Fall gefunden. Ob und wofür diese Bakterien die Enzyme des MEPWegs nutzen ist unbekannt.
Die grampositiven Streptomyceten besitzen zum großen Teil ausschließlich den MEP-Weg
für die IPP/DMAPP-Synthese (Orihara und Mitarbeiter, 1998). Allerdings gibt es einige
Streptomyces- und auch andere Aktinomyces-Arten, welche über die kompletten Gene beider
Isoprenoid-Stoffwechselwege verfügen (Boucher und Doolittle, 2000). Es konnte gezeigt
werden, dass S. aeriouvifer CL 190 und Actinoplanes sp. zu Beginn der exponentiellen
Wachstumsphase den MEP-Weg zur Synthese von Menaquinon nutzen und in der stationären
Phase sekundäre Metabolite über den MVA-Weg synthetisieren (Seto und Mitarbeiter, 1996;
Seto und Mitarbeiter, 1998). Insgesamt ist die IPP-Biosynthese bei Eubakterien recht
komplex.
2.4
Akkumulation von 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat
durch oxidativen Stress
2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat, ein Zwischenprodukt des MEP-Wegs der
Isoprenoidbiosynthese, wurde schon 1992 aus Kulturen von Corynebacterium ammoniagenes
und Micrococcus luteus isoliert, die oxidativem Stress ausgesetzt waren (Ostrovsky und
Mitarbeiter, 1992a; Ostrovsky und Mitarbeiter, 1993). Die Bakterien akkumulieren MEcPP
(bis zu 50 mmol/l) in Gegenwart verschiedener Redox-Mediatoren, wie z. B. Benzylviologen,
Paraquat oder Menadion (Ostrovsky und Mitarbeiter, 1994). Diese Chemikalien können die
Zytoplasmamembran von Bakterien passieren und durch „Redox-Cycling“ intrazellulär
reaktive Sauerstoffspezies erzeugen; man spricht hier auch von „innerem oxidiativen Stress“,
im Gegensatz zu „äußerem oxidativen Stress“, bei dem reaktive Sauerstoffspezies außerhalb
der Zelle wirken (Jones und Mitarbeiter, 1976; Sliwa und Mitarbeiter, 1991; Ogrel und
Mitarbeiter, 1996). Benzylviologen induziert auch in weiteren Bakterien die Akkumulation
von MEcPP, unter anderem in Mycobacterium smegmatis, M. phlei, Xanthomonas campestris,
Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas putida und verschiedenen RhodococcusSpezies (Ostrovsky und Mitarbeiter, 1992b; Ostrovsky und Mitarbeiter, 1994; Ostrovsky und
Mitarbeiter, 1998).
46
B Kenntnisstand
All diese Bakterien zeigen in Gegenwart von bis zu 50 µg/ml Benzylviologen normales
Wachstum. Dagegen wird das Wachstum von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und
E. coli durch Benzylviologen in der gleichen Konzentration fast völlig gehemmt; eine
Akkumulation von MEcPP lässt sich in diesen Mikroorganismen nicht nachweisen
(Ostrovsky und Mitarbeiter, 1992b). Daher nahmen die Autoren zunächst an, dass MEcPP
eine Rolle bei der Stressantwort spielt. Allerdings nimmt mit der Zunahme von MEcPP
gleichzeitig der Gehalt an Carotinoiden, Ubiquinonen und Menaquinonen in den Bakterien ab
(Lysak und Mitarbeiter, 1999). Daher diskutieren die Autoren dieser Veröffentlichung die
Möglichkeit, dass sich MEcPP aufgrund einer Hemmung des Isoprenoid-Stoffwechsels
ansammelt.
Möglicherweise
spiegelt
die
MEcPP-Akkumulation
auch
einen
Regulationsmechanismus in den betroffenen Bakterien wieder: Falls der oxidative Stress zu
einer verminderten Aktivität von Enzymen des MEP-Wegs führt – eventuell besonders von
solchen, die auf Reduktionsäquivalente angewiesen sind – könnte dies durch eine höhere
Konzentration an Substraten zumindest teilweise ausgeglichen werden. Da dadurch auch die
für das Wachstum notwendige Synthese von Isoprenoiden für Membranen möglich würde,
könnte dies auch erklären, warum Bakterienwachstum und MEcPP-Akkumulation in
Gegenwart von Redox-Mediatoren korrelieren. Es bleibt die Frage offen, wodurch in
manchen Bakterien die Stress-Toleranz und die Akkumulation von MEcPP ausgelöst werden.
Da auch sehr viele humanpathogene Bakterien Isoprenoide über den MEP-Weg synthetisieren
und daher potentiell in der Lage sind, dieselbe Stress-Antwort zu zeigen wie
C. ammoniagenes und andere Mikroorganismen, könnte die Akkumulation von MEcPP auch
in vivo bei bakteriellen Infektionen auftreten, z. B. unter oxidativen Bedingungen, wie sie von
Makrophagen erzeugt werden. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, das γδ-T-Zellstimulierende Potential von Bakterien nach Benzylviologen induziertem oxidativem Stress
näher zu charakterisieren.
3. Bisphosphonate als γδ-T-Zell-Stimulatoren
3
47
Bisphosphonate als Stimulatoren von Vγ9Vδ2-T-Zellen
Derivate der Methylendiphosphonsäure, die im Rahmen dieser Arbeit als Vγ9Vδ2-T-Zellstimulierende Substanzen getestet wurden, werden unter der Bezeichnung Bisphosphonate18
in der klinischen Routine als Inhibitoren der Knochenresorption eingesetzt. Die allgemeine
Struktur ist in Abb. 10 dargestellt. Der Rest R1 ist oft eine Hydroxylgruppe, die Seitenkette R2
ist entscheidend für die Aktivität der Verbindung. Die erste Generation von Bisphosphonaten
(Clodronat, Etidronat, Tiludronat) wurde zum Teil vor 30 Jahren in die klinische Praxis
eingeführt. Die später entwickelten Stickstoff enthaltenden Bisphosphonate (N-BP) sind
erheblich wirksamer. Die Aktivität steigt von den einfachen Aminobisphosphonaten
(Pamidronat, Alendronat, Neridronat) über die am Stickstoff substituierten
Aminobisphosphonate (Olpadronat, Ibandronat, Incadronat) zu den Bisphosphonaten mit
basischen Heterozyklen (Risedronat, Zoledronat, Minodronat) an.
OH R1 OH
O
P
C
OH
P
OH
R2
O
Clodronat
Etidronat
Tiludronat
Pamidronat
Alendronat
Neridronat
Olpadronat
Ibandronat
Incadronat
Risedronat
Zoledronat
Minodronat
R1
ClHOHHOHOHOHOHOHHOHOHO-
R2
ClMethyl(4-Chlorphenyl)thio2-Aminoethyl3-Aminopropyl5-Aminopentyl2-(Dimethylamino)ethyl2-[Methyl(pentyl)amino]ethylCycloheptylamino(3-Pyridinyl)methyl(1-Imidazolyl)methyl(3-Imidazo[1,2-α]pyridinyl)methyl-
Abb. 10: Struktur einiger Bisphosphonate, die zum Einsatz am Menschen zugelassen sind
oder die sich in der klinischen Entwicklung befinden (Russel und Rogers, 1999).
Anfangs wurden Bisphosphonate als Analoga anorganischer Pyrophosphate eingesetzt. Man
hatte erkannt, dass Pyro- und Polyphosphate die Präzipitation von Calciumphosphat und
damit das Verkalken von Geweben verhindern können (Russel und Mitarbeiter, 1999).
Allerdings werden Pyrophosphate in vivo leicht hydrolysiert. Ersetzt man das zentrale
Sauerstoffatom durch ein Kohlenstoffatom, so dass eine P-C-P-Bindung entsteht, gelangt man
zu Verbindungen, die nicht der enzymatischen Hydrolyse unterliegen. Diese Bisphosphonate
haben ebenso wie Pyrophosphate die Fähigkeit, in vitro die Bildung und das Auflösen von
Hydroxylapatitkristallen (3 Ca3[PO4]2·CaOH2) zu verhindern. Ihre eigentliche Bedeutung
erlangten die Bisphosphonate aber durch die Entdeckung, dass diese Stoffklasse in vivo die
Knochenresorption hemmen kann.
18
Die Bezeichnung „Bisphosphonat“ wird in dieser Arbeit durchgängig verwendet, unabhängig davon, ob ein
Salz oder die Säure vorliegt. In Strukturformeln werden immer nicht dissoziierte Verbindungen dargestellt.
48
B Kenntnisstand
Es gibt eine Reihe von Krankheiten, die mit einem überhöhten Knochenabbau verbunden
sind. Bisphosphonate werden heute erfolgreich bei Osteoporose und vor allem bei Tumorbedingten Skelettkomplikationen eingesetzt. Während man anfangs noch annahm, dass die
Wirkung von Bisphosphonaten auf ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften beruht, weiß
man heute, dass Bisphosphonate auch biochemische Reaktionen beeinflussen.
3.1
Mechanismus der antiresorptiven Wirkung von
Bisphosphonaten
Die Knochensubstanz besteht im Wesentlichen aus einer Kollagen-Matrix, in die
Hydroxylapatit eingelagert ist. Der fertige Knochen stellt aber kein statisches Gebilde dar.
Osteoklasten, „Knochenfresszellen“, bauen enzymatisch und endozytotisch Knochengewebe
ab. Gegenspieler sind die Osteoblasten oder „Knochenmutterzellen“, die für die
Mineralisation des Knochens zuständig sind. Die Aktivität der beiden Zellarten ist hormonell
reguliert, ihr Zusammenspiel trägt zur Calcium-Homöostase bei. Eine erhöhte
Knochenresorption kann durch Zunahme der Osteoklasten-Aktivität und/oder Hemmung der
Osteoblasten bedingt sein. Bei post-menopausaler Osteoporose sind wahrscheinlich
hormonelle Veränderungen ein auslösender Faktor. Tumorzellen produzieren eine Vielzahl
löslicher Faktoren, die direkt oder indirekt Osteoklasten stimulieren. Gleichzeitig kann die
Aktivität der Osteoblasten supprimiert werden.
Bisphosphonate beeinflussen die Osteoklasten-vermittelte Knochenresorption auf
verschiedene Weise. Besonders wichtig sind die direkten Wechselwirkungen mit
resorbierenden Osteoklasten. Diese nehmen durch Endozytose hohe Mengen an
Bisphosphonaten auf, die wegen ihrer Calcium-Affinität im Knochen angereichert werden.
Dadurch kommt es zu einer Verringerung der Zahl funktionsfähiger Osteoklasten und zu einer
Inhibierung der Knochenresorption.
3.1.1
Der Wirkmechanismus von Bisphosphonaten
Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von Bisphosphonaten und Pyrophosphaten ist es
wahrscheinlich, dass Bisphosphonate in der Zelle biochemische Prozesse beeinflussen
können, an denen pyrophosphathaltige Verbindungen beteiligt sind. Tatsächlich konnte man
bis heute zwei Mechanismen finden, nach denen unterschiedliche Bisphosphonate in den
Zellstoffwechsel eingreifen. Endpunkt ist in beiden Fällen die Apoptose. Die nicht Stickstoff
enthaltenden Bisphosphonate Clodronat, Etidronat und Tiludronat werden in vitro zu
toxischen ATP-Analogen metabolisiert (Rogers und Mitarbeiter, 1994; Auriola und
Mitarbeiter, 1997). Die resultierenden Verbindungen enthalten statt der β- und γPhosphatgruppe des ATP die „P-C-P“-Struktur der Bisphosphonate. Eine Akkumulierung
dieser nicht hydrolysierbaren ATP-Analoga führt schließlich zum Tod der Zelle.
49
Eine mögliche Erklärung für die toxische Wirkung der Bisphosphonat-Metaboliten ist ihre
Fähigkeit, die mitochondriale ADP/ATP-Translokase zu hemmen, was den Zusammenbruch
des Membranpotentials der Mitochondrien und letztendlich die Initiierung von Apoptose zur
Folge hat (Lehenkari und Mitarbeiter, 2002).
Stickstoff enthaltende Bisphosphonate, wie zum Beispiel die Aminoverbindungen Alendronat
und Ibandronat, aber auch Substanzen mit einem heterozyklischen Ring wie Risedronat und
Zoledronat, greifen in den Isoprenoid-Stoffwechsel der Zelle ein. Es ist gezeigt worden, dass
diese Bisphosphonate den Einbau von 14C-markierter Mevalonsäure in die PrenylSeitenketten von Proteinen hemmen (Luckman und Mitarbeiter, 1998). Die Prenylierung
(Übertragung einer Farnesyl- oder Geranylgeranylgruppe auf einen Cystein-Rest) ist eine
posttranslatorische Modifikation, die besonders für monomere G-Proteine wie Ras, Rho, Rac
und Rab wichtig ist. Diese GTPasen sind Signalproteine, die sehr viele Zellfunktionen
regulieren. In Osteoklasten haben sie unter anderem Bedeutung für den Umbau des
Zytoskeletts, die Endozytose und den vesikulären Transport. Die Isoprenoid-Seitenkette dient
zur Verankerung in Membranen und ist entscheidend für die Funktion der Proteine. Eine
Inhibierung der Protein-Prenylierung durch N-haltige Bisphosphonate beeinflusst also
wahrscheinlich sehr stark die Funktion von Osteoklasten. Die Synthese anderer Isoprenoide,
wie z. B. Cholesterin, scheint für Osteoklasten eine untergeordnete Rolle zu spielen, da sich
3
H-markiertes Mevalonsäure-Lacton bei diesen ausgereiften Zellen zum allergrößten Teil in
Proteinen wieder findet (Bergstrom und Mitarbeiter, 2000). Die Effekte, die N-BPs auf
Osteoklasten haben, beruhen also wahrscheinlich überwiegend auf der Inhibierung der
Protein-Prenylierung. Fisher und Mitarbeiter konnten zeigen, dass Geranylgeraniol, aber nicht
Farnesol19, die hemmende Wirkung von Alendronat auf die Knochenresorption aufheben
kann, obwohl sowohl Protein-Farnesylierung als auch –Geranylgeranylierung gehemmt
werden (Fisher und Mitarbeiter, 1999). Geranylgeranylierte Proteine spielen also
offensichtlich eine wichtigere Rolle für die Osteoklastenfunktion als farnesylierte Proteine.
Als molekulares Ziel der N-BPs kommen im Prinzip alle Enzyme der Isoprenoidbiosynthese
in Frage, die Diphosphate als Substrate akzeptieren. Verschiedene Gruppen zeigten parallel,
dass N-haltige Bisphosphonate die Farnesylpyrophosphat-Synthase hemmen. Bei Versuchen
mit Enzympräparationen aus Rinderhirn konnte gezeigt werden, dass Pamidronat, Olpadronat,
Ibandronat und Risedronat keinen Einfluss auf die Aktivität von GGPP-Synthase oder
Geranylgeranyl-Transferase haben, aber entweder die IPP/DMAPP-Isomerase oder die FPPSynthase hemmen (van Beek und Mitarbeiter, 1999a). Einbauversuche mit 14C-markiertem
IPP bewiesen, dass nicht die IPP-Isomerase von diesen Bisphosphonaten gehemmt wird (van
Beek und Mitarbeiter, 1999b). Ähnliche Experimente mit Homogenaten aus Rattenleberzellen
ergaben, dass Alendronat die FPP-Synthase inhibiert (Keller und Fliesler, 1999). Zu den
selben Ergebnissen kam eine andere Gruppe, die mit aufgereinigten Enzymen aus Leberzellen
arbeitete (Bergstrom und Mitarbeiter, 2000).
19
Exogenes Farnesol und Geranylgeraniol werden als Isoprenoid-Seitenketten in Proteine eingebaut. Farnesol
kann auch zur Cholesterinsynthese verwendet werden. Ein Einbau in Dolichole, Ubiquinone oder in eine
Geranylgeranyl-Gruppe findet nicht statt (Crick und Mitarbeiter, 1997).
50
B Kenntnisstand
Sie zeigte darüber hinaus, dass Alendronat in Osteoklasten den Einbau 3H-markierter
Mevalonsäure sowohl in Prenyl-Seitenketten von Proteinen, als auch in andere Isoprenoide
hemmt. Das spricht dafür, dass auch in Osteoklasten die FPP-Synthase Ziel der N-BPs ist.
Versuche mit zellfreien Lysaten und mit rekombinanter FPP-Synthase zeigten eine gute
Korrelation der in vitro-Aktivität der sieben untersuchten N-BPs mit ihrer antiresorptiven
Wirksamkeit in vivo (Dunford und Mitarbeiter, 2001).
IPP-Isomerase
Dimethylallyl-PP
N-BP
'
N-BP
Isopentenyl-PP
FPP-Synthase
N-BP
Geranyl-PP
Cholesterin
SqualenSynthase
Squalen
FPP-Synthase
Farnesyl-PP
GGPP-Synthase
farnesylierte Proteine
FarnesylTransferase
Geranylgeranyl-PP
geranylgeranylierte Proteine
GeranylgeranylTransferase
Abb. 11: Biosyntheseweg von Isopentenylpyrophosphat zu Farnesylpyrophosphat,
Geranylgeranylpyrophosphat und Cholesterin und Inhibierung durch N-haltige
Bisphosphonate
Durch Molecular-Modelling und quantenchemische Berechnungen wurde gezeigt, dass N-BPs
als Analoga kationischer Überganszustände der Prenyldiphosphate wirken können (Martin
und Mitarbeiter, 1999). Die beiden Phosphonat-Gruppen lassen sich gut in die DiphosphatBindungsstelle der Farnesylpyrophosphat-Synthase einpassen, die geladene Ammonium-,
Pyridinium- oder Imidazolium-Gruppe lässt sich mit dem positiv geladenen Zentrum des
GPP-Überganszustands zur Deckung bringen. Dieses Modell liefert auch eine Erklärung für
die Aktivitätsunterschiede der Bisphosphonate. So ist die räumliche Abweichung zwischen
Alendronat und GPP kleiner als zwischen Pamidronat und GPP, entsprechend ist Alendronat
aktiver als Pamidronat. Olpadronat und Ibandronat verdanken ihre höhere Aktivität gegenüber
Pamidronat den stärkeren van der Waals-Wechselwirkungen. Die besonders aktiven
heteroaromatischen Bisphosphonate haben mit den Übergangszuständen der
Prenyldiphosphate das sp2-hybridisierte Kation gemeinsam.
51
Bisphosphonate induzieren in Osteoklasten und auch in verschiedenen anderen Zellen
Apoptose (Russel und Mitarbeiter, 1999). Auch die apoptotische Wirkung der N-BPs ist eine
Folge der Hemmung von Enzymen der Isoprenoidbiosynthese: Die Isoprenoid-Alkohole
Farnesol und Geranylgeraniol können die Bisphosphonat-induzierte Apoptose in J774-Zellen
(eine Maus-Makrophagen-Linie) verhindern (Benford und Mitarbeiter, 1999). Eine neuere
Studie zeigt jedoch, dass der Tod von Osteoklasten nicht Voraussetzung für die Hemmung der
Knochenresorption durch N-BPs ist (Halasy-Nagy und Mitarbeiter, 2001). So sind in einem in
vitro-Modell die IC50-Werte von Alendronat und Risedronat für die Inhibierung der
Knochenresorption durch Osteoklasten etwa zehnmal niedriger als die EC50-Werte für den
Verlust von Osteoklasten. Außerdem beeinflusst die Zugabe eines Caspase-Inhibitors nicht
die Knochenresorption, obwohl die Zahl der Osteoklasten im Gegensatz zur Kontrolle, der
nur N-BPs zugesetzt werden, nicht abnimmt. In Gegenwart des stickstoffreien
Bisphosphonats Etidronat verhindert der Caspase-Inhibitor nicht nur die Apoptose der
Osteoklasten, sondern hebt gleichzeitig die inhibierende Wirkung auf die Knochenresorption
auf.
Neben der FPP-Synthase werden von einzelnen N-BPs auch noch weitere Enzyme gehemmt.
Für Alendronat und die nicht Stickstoff enthaltenden Bisphosphonate Etidronat und
Tiludronat ist eine Inhibierung der Protein-Tyrosin-Phosphatase beschrieben (Russel und
Mitarbeiter, 1999). Ibandronat und Incadronat hemmen die Squalensynthase (Amin und
Mitarbeiter, 1992; Amin und Mitarbeiter, 1996). Thompson und Mitarbeiter (2002)
beschreiben ein N-BP (1-Hydroxy-2-(2-aminophenyl)-ethylen-1,1-bisphosphonat), das neben
der FPP-Synthase auch die IPP-Isomerase hemmt.
Das momentane Bild der direkten Wirkung von Bisphosphonaten auf Osteoklasten stellt sich
also folgendermaßen dar: Nicht Stickstoff enthaltende Bisphosphonate werden zu ATPAnaloga metabolisiert, die zur Apoptose der Osteoklasten führen. Der Zelltod der
Osteoklasten ist der Hauptgrund für die antiresorptive Wirksamkeit dieser Bisphosphonate.
N-haltige Bisphosphonate hemmen die Farnesylpyrophosphat-Synthase und dadurch auch die
Protein-Prenylierung. Durch das Fehlen geranylgeranylierter G-Proteine werden wichtige
zelluläre Funktionen, vor allem der vesikuläre Transport der Osteoklasten (Alakangas und
Mitarbeiter, 2002), gestört, was eine Inhibierung der Knochenresorption zur Folge hat. Die
Osteoklasten-Apoptose ist nur ein sekundärer Effekt.
3.1.2
Wirkung auf andere Zellen des Knochenstoffwechsels
Neben den oben aufgeführten direkten Wechselwirkungen von Bisphosphonaten mit
Osteoklasten sind auch Effekte beschrieben, die auf die Einwirkung von Bisphosphonaten auf
andere Zellen, z. B. auf Osteoklasten-Vorläufer oder auf Osteoblasten, beruhen. Zum Teil gibt
es Hinweise, dass auch hier eine Beeinflussung des Isoprenoid-Stoffwechsels eine Rolle
spielt. Insgesamt ist aber das Bild noch sehr unvollständig und manche Ergebnisse auch
widersprüchlich.
52
B Kenntnisstand
Es wurde gezeigt, dass Bisphosphonate Osteoblasten dazu stimulieren, einen Osteoklasteninhibierenden Faktor zu produzieren; dieser unterdrückt die Fusion von Vorläuferzellen zu
reifen Osteoklasten (Russel und Mitarbeiter, 1999). Auch direkte Wirkung von
Bisphosphonaten auf Osteoklasten-Vorläufer soll in vitro die Bildung reifer Osteoklasten
hemmen (Russel und Rogers, 1999). Van Beek und Mitarbeiter (2002) demonstrierten, dass
verschiedene Bisphosphonate direkt auf frühe Osteoklasten-Vorläufer an der
Knochenoberfläche wirken. Die resultierende Hemmung der Knochenresorption ließ sich
durch Zugabe von Geranylgeraniol aufheben; dies deutet darauf hin, dass Stickstoff
enthaltende Bisphosphonate auch in Osteoklasten-Vorläufern in den Isoprenoid-Stoffwechsel
eingreifen. In einem anderen Experiment inhibieren Pamidronat und Zoledronat mit EC50Werten von ca. 40 µmol/l die Proliferation fötaler Osteoblasten, induzieren aber gleichzeitig
ihre Differenzierung zu reiferen Zellen. Als Folge davon wird durch Pamidronat auch die
Knochenbildung erhöht (Reinholz und Mitarbeiter, 2000).
Im Gegensatz zur pro-apoptotischen Wirkung von Bisphosphonaten auf Osteoklasten und
andere Zellen gibt es auch Versuche, die konträre Resultate bringen. So verhindern
Bisphosphonate in nanomolarer Konzentration die Apoptose von Osteoblasten und
Osteozyten20 (Plotkin und Mitarbeiter, 1999). In mikromolaren Konzentrationen, in denen sie
in Osteoklasten Apoptose induzieren, verlieren sie diese Wirkung.
3.2
Anti-Tumor-Wirkung von Bisphosphonaten
Bisphosphonate kommen heute sehr oft bei Tumor-induzierten Knochenerkrankungen zum
Einsatz. Es wird diskutiert, ob auch eine direkte Wirkung auf Tumorzellen stattfindet.
3.2.1
Inhibierung der Proliferation und Initiierung von Apoptose
Studien mit verschiedenen Tumorzelllinien zeigen, dass N-BPs (z. B. Pamidronat, Incadronat
und Zoledronat) zeit- und konzentrationsabhängig das Tumorzellwachstum hemmen und
Apoptose induzieren (Green, 2000). Zugabe von Farnesol und Geranylgeraniol hebt den
apoptotischen Effekt vollkommen und den zytostatischen Effekt teilweise auf. Das zeigt, dass
auch für die Anti-Tumor-Wirkung der Stickstoff enthaltenden Bisphosphonate der Eingriff in
die Isoprenoidbiosynthese eine Rolle spielt. Im Folgenden werden einige neuere Ergebnisse
beispielhaft vorgestellt.
20
Osteozyten sind ruhende, in die Knochensubstanz eingeschlossene Osteoblasten.
53
Takahashi und Mitarbeiter untersuchten die Wirkung von Pamidronat, Incadronat und
Minodronat auf drei verschiedene Myelomzelllinien (Takahashi und Mitarbeiter, 2001). Die
N-BPs inhibieren ab Konzentrationen von 50 bis 500 µmol/l das Wachstum aller Zelllinien,
die verschieden empfindlich sind. Apoptose ist erst bei höheren Konzentrationen nachweisbar
als der zytostatische Effekt. Dies könnte darauf hinweisen, dass neben der Apoptose noch
andere Mechanismen für den wachstumshemmenden Effekt der N-BPs verantwortlich sind. In
diesem System ist Minodronat das aktivste der untersuchten N-BPs.
In einem ähnlichen Versuch wurde die Wirkung von Zoledronat auf zwei Brustkrebszelllinien
getestet (Jagdev und Mitarbeiter, 2001). Bei einer Zoledronat-Konzentration von 10 bzw.
100 µmol/l nimmt die Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle signifikant ab und der Anteil
apoptotischer Zellen nimmt deutlich zu. Zugabe von Geranylgeraniol, aber nicht von
Farnesol, wirkt der Zoledronat-induzierten Apoptose entgegen.
Auch das Wachstum von Prostatakrebszellen wird von N-BPs gehemmt (Lee und Mitarbeiter,
2001). Zoledronat ist ab Konzentrationen von 10 µmol/l, Pamidronat ab 25 µmol/l wirksam.
In diesem System wirkt Zoledronat vor allem zytostatisch, ein großer Teil der Zellen bleibt in
der G0/G1- oder S-Phase stehen und selbst in Konzentrationen von 100 µmol/l ist kaum
Zelltod zu beobachten. Pamidronat scheint in niedrigeren Konzentrationen ebenfalls
zytostatisch zu wirken und in höheren Konzentrationen Apoptose zu induzieren.
3.2.2
Hemmung der Tumorzell-Adhäsion, -Migration und –Invasion
Die Bildung von Metastasen setzt voraus, dass sich Zellen von einem primären Tumor
ablösen, in Blut- oder Lymphgefäße wandern und schließlich mit dem Zielgewebe
interagieren. Verschiedene Bisphosphonate inhibieren die Adhäsion von Brust- und
Prostatakrebszellen an mineralisierte und nichtmineralisierte extrazelluläre Matrix (Boissier
und Mitarbeiter, 1997). Auch die Migrationsfähigkeit einer Prostatatumorzelllinie lässt sich
durch Behandlung mit Alendronat und Clodronat blockieren (Virtanen und Mitarbeiter,
2002). Zugabe von Farnesol oder Geranylgeraniol hebt die von Alendronat verursachte
Hemmung auf, in Gegenwart von Clodronat hat sie keine Wirkung. Anscheinend trägt ein
Eingriff in den Isoprenoid-Stoffwechsel zum migrationshemmenden Effekt von Alendronat
bei. Adhäsion und Migration sind Voraussetzungen für eine Invasion von Tumorzellen durch
die extrazelluläre Matrix. Durch in vitro Invasions-Assays konnte die hemmende Wirkung der
Bisphosphonate bestätigt werden (Boissier und Mitarbeiter, 2000). Interessanterweise
inhibiert das N-BP Alendronat schon in extrem niedrigen Konzentrationen von 1 pmol/l die
Invasion einer Tumorzelllinie (Virtanen und Mitarbeiter, 2002). Eine Reduktion der Zellzahl
tritt erst bei Konzentrationen von 100 µmol/l auf.
54
3.2.3
B Kenntnisstand
Einfluss auf die Sekretion von Wachstumsfaktoren
Tumorzellen finden im Knochengewebe eine ideale Umgebung vor. Durch die Aktivität von
Osteoklasten werden im Knochen gebundene Wachstumsfaktoren freigesetzt, die sich günstig
auf die Tumorzellproliferation auswirken. Zusätzlich produzieren Tumorzellen ihrerseits
Mediatoren, die direkt oder indirekt Osteoklasten stimulieren, was durch die erhöhte
Knochenresorption zur Freisetzung von noch mehr Wachstumsfaktoren führt. Durch die
Inhibierung von Osteoklasten können Bisphosphonate die lokale Konzentration an
Wachstumsfaktoren senken und dadurch diesen selbsterhaltenden Kreislauf unterbrechen
(Green und Mitarbeiter, 1994).
3.2.4
Inhibierung der Angiogenese
Angiogenese ist die Neubildung von Blutgefäßen. Sie ist entscheidend für das Wachstum und
Überleben von Metastasen. Zoledronat inhibiert die durch verschiedene Wachstumsfaktoren
induzierte Proliferation von Endothelzellen in vitro und die Angiogenese in einem
Mausmodell (Green und Mitarbeiter, 1994). Incadronat verhindert in einem anderen System
die DNA-Neusynthese und Röhrenbildung stimulierter Endothelzellen (Okamoto und
Mitarbeiter, 2002). Die anti-angiogenetische Wirkung von Incadronat lässt sich durch
Farnesol, aber nicht durch Geranylgeraniol aufheben.
3.2.5
In vivo Hemmung von Knochenmetastasen
Im Tierversuch mit verschiedenen Bisphosphonaten beobachtet man oft neben einer
Reduktion der osteolytischen Knochenläsionen auch eine Reduzierung der Größe und Zahl
von Knochenmetastasen (Green, 2000). Hiraga und Mitarbeiter konnten in vivo eine erhöhte
Zahl von apoptotischen Brusttumorzellen in Ibandronat-behandelten Mäusen gegenüber
unbehandelten Tieren feststellen (Okamoto und Mitarbeiter, 2002). Dabei spielt
wahrscheinlich die Reduktion von Wachstumsfaktoren durch die verminderte
Osteoklastentätigkeit eine Rolle (vgl. B3.2.3). Ob aber in vivo eine direkte Wirkung von
Bisphosphonaten auf Tumorzellen stattfindet, ist ungeklärt.
3.2.6
Aktivierung von γδ-T-Zellen
Stickstoff-haltige Bisphosphonate aktivieren in vitro und in vivo Vγ9Vδ2-T-Zellen. Diese
zytotoxischen Effektorzellen erkennen und lysieren verschiedene B-Lymphomzelllinien
(Sicard und Mitarbeiter, 2001). In Kulturen mononukleärer Knochenmarkszellen von
Patienten mit multiplem Myelom induziert Pamidronat die Vγ9Vδ2-T-Zell-vermittelte
Reduktion von Plasmazellen (Kunzmann und Mitarbeiter, 2000). Tumorzelllinien, die nicht
γδ-T-Zell-empfindlich sind, werden nach Inkubation mit Pamidronat anfällig für die
zytotoxische Aktivität der Vγ9Vδ2-T-Zellen (Kato und Mitarbeiter, 2001). Eine Aktivierung
von γδ-T-Zellen könnte also zur Anti-Tumor-Wirkung von Bisphosphonaten beitragen.
3.2.7
55
Zusammenfassung der Anti-Tumor-Wirkung von Bisphosphonaten
Bisphosphonate, besonders die Stickstoff enthaltenden Verbindungen, haben in vitro eine
starke antiproliferative Wirkung auf maligne Zellen. Auch Prozesse, die für die
Metastasierung wichtig sind, werden gehemmt. Allerdings sind für die meisten Vorgänge
Bisphosphonat-Konzentrationen größer 10 µmol/l notwendig, die im Serum kaum erreicht
werden. Manche Bisphosphonate zeigen in Kombination mit bestimmten Chemotherapeutika
einen synergistischen Effekt (Jagdev und Mitarbeiter, 2001), so dass auch bei niedrigeren
Konzentrationen eine Wirkung auftreten könnte. Da sich Bisphosphonate selektiv in den
Knochen anreichern, sind Knochenmetastasen die wahrscheinlichsten Ziele einer AntiTumor-Wirkung. Tatsächlich lässt sich im Tiermodell eine Reduktion von
Knochenmetastasen beobachten. Allerdings wurde bis jetzt noch keine längere
Überlebensdauer festgestellt.
Klinische Studien zur Wirksamkeit von Bisphosphonaten (die gegen Tumor-induzierte
Skelettkomplikationen eingesetzt wurden) konnten beim Menschen die Reduzierung von
Knochenmetastasen nicht belegen. Auch auf die Überlebensdauer zeigte sich kein positiver
Effekt. Aber die Forschung steht hier am Anfang, und erst groß angelegte Studien mit den
neueren, wirksameren Bisphosphonaten wie Zoledronat, Risedronat oder Minodronat werden
zeigen, ob eine Behandlung mit diesen Substanzen zu einer Reduzierung der Tumorlast
beitragen kann. Der Einsatz von Bisphosphonaten zur Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Zellen
zeigt ganz neue Perspektiven auf, da hier die Wirkung nicht auf Knochenmetastasen
beschränkt bleiben muss. Eine Pilotstudie unserer Arbeitsgruppe zum Einsatz von
Pamidronat/IL-2 bei Patienten mit Non-Hodkin-Lymphom und Multiplem Myelom zeigte
vielversprechende Ergebnisse: Bei fünf von neun behandelten Patienten kam es in vivo zu
einer Zunahme der Vγ9Vδ2-T-Zell-Population; bei drei dieser Patienten ließ sich in der Folge
eine partielle Remission beobachten (Wilhelm und Mitarbeiter, 2003).
56
B Kenntnisstand
4
Aufgabenstellung und Zielsetzung
Humane Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten sind an der Immunantwort gegen diverse Bakterien,
Parasiten und Viren beteiligt. Daneben haben sie zytotoxisches Potential und wirken lytisch
auf verschiedene Tumorzellen. Die Aktivierung und Vermehrung dieser Zellpopulation
könnte einen neuen Ansatz zur Immuntherapie vor allem hämapoetischer Tumore darstellen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen unter
verschiedenen Gesichtspunkten genauer zu untersuchen.
•
Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass neben den bekannten
Phosphoantigenen (niedermolekulare Verbindungen mit einer Phosphat- oder
Pyrophosphatgruppe) auch Aminobisphosphonate γδ-T-Zell-stimulierendes Potential
aufweisen. Durch den Test verschiedener Phosphonate im γδ-T-Zell-StimulierungsAssay sollte geprüft werden, welche Strukturelemente essentiell für die Aktivität
dieser Verbindungen gegenüber Vγ9Vδ2-T-Zellen sind.
•
Die bisherigen Untersuchungen zur Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten durch
Bisphosphonate beschränkten sich auf die als Medikamente etablierten Substanzen.
Ein Screening verschiedener Stickstoff enthaltender Bisphosphonate in γδ-T-ZellStimulierungs-Assays sollte daher Hinweise zu den strukturellen Voraussetzungen für
eine Wirksamkeit dieser Verbindungen liefern und so eventuell zum Auffinden
aktiverer Bisphosphonate als den bis heute bekannten führen.
•
Die Mechanismen der Antigenerkennung und Aktivierung der γδ-T-Zellen durch die
verschiedenen stimulierenden Verbindungen sind noch wenig bekannt. Es gilt
lediglich als gesichert, dass der γδ-T-Zell-Rezeptor beteiligt ist. Für Pamidronat wurde
darüber hinaus gezeigt, dass eine monozytäre Zelllinie – THP-1 – durch Kontakt mit
dem Aminobisphosphonat stimulierend für Vγ9Vδ2-T-Zellen wird. Verschiedene
Versuche sollten daher weitere Details zum Mechanismus der Stimulation von γδ-TZellen durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate liefern.
•
In einer vorausgehenden Arbeit in unserem Labor waren bakterielle Phosphoantigene
isolieret und zu charakterisiert worden. Dabei wurde auch der Zusammenhang
zwischen dem Vorkommen der Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosynthese und
der γδ-T-Zell-stimulierenden Aktivität von Bakterien etabliert. Es galt einige
ergänzende und abschließende Versuche zur Identität der bakteriellen
Phosphoantigene durchzuführen.
1 Stimulation von γδ-T-Zellen durch N-haltige Bisphosphonate
57
C ERGEBNISSE UND DISKUSSION
1
1.1
Stimulation humaner Vγ9Vδ2-T-Zellen durch
Stickstoff enthaltende Bisphosphonate
Messung der Stimulation von γδ-T-Zellen
Im Rahmen dieser Arbeit galt es zunächst, zuverlässige Messverfahren zum spezifischen
Nachweis der Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen zu etablieren. Dabei sollte nicht mit
Vγ9Vδ2-T-Zell-Klonen gearbeitet werden, sondern mit gemischten LymphozytenPopulationen (PBL), einem heterogenen Testsystem, das mehr den physiologischen
Verhältnissen entspricht.
1.1.1
Möglichkeiten zur Messung der Stimulation von T-Zellen
Die Aktivierung von T-Lymphozyten führt zur Zellproliferation und/oder zur Induktion von
Effektorfunktionen. Beides kann zum Nachweis einer T-Zell-Stimulation genutzt werden.
Eine etablierte Methode für die Messung von Proliferation ist die Bestimmung der DNASynthese. Sich teilende Zellen bauen dabei markierte Nukleotide, die dem Zellkulturmedium
zugesetzt werden, in ihre DNA ein. Es kommen 3H-Thymidin oder 5-Brom-3’-desoxyuridin
(BrdU) zum Einsatz, die Menge des eingebauten Markers wird über Messung der
Radioaktivität bzw. über ELISA-Methoden bestimmt. Bei zytotoxischen T-Zellen kann
alternativ deren Aktivierung durch die Fähigkeit, Zielzellen abzutöten, nachgewiesen werden.
Lebende Zellen nehmen radioaktives Natriumchromat (Na251CrO4) auf, geben es aber spontan
nicht mehr ab. Werden 51Cr-markierte Zellen getötet, kann man die Radioaktivität des
freigesetzten Natriumchromats im Überstand messen. Ein Zytotoxizitäts-Test, der auf
radioaktive Isotope verzichtet, ist der Nachweis von Lactatdehydrogenase. Dieses
zytoplasmatische Enzym wird bei Beschädigung der Plasmamembran freigesetzt und in der
Folge lässt sich die Enzymaktivität im Zellüberstand durch eine Farbreaktion nachweisen. Die
Aktivierung von T-Lymphozyten hat oft die Produktion von Zytokinen wie IL-2, IFN-γ oder
TNF-α zur Folge. Zytokine lassen sich mit Hilfe biologischer Systeme nachweisen, indem sie
das Wachstum empfindlicher Zelllinien fördern oder auch hemmen; oft werden auch
spezifische ELISA-Tests zum Nachweis von Zytokinen eingesetzt.
All diese Methoden lassen sich im Prinzip auch zum Nachweis der Stimulation von
γδ-T-Lymphozyten nutzen. Beim Einsatz von γδ-T-Zelllinien oder -klonen treten hier auch
keine Schwierigkeiten auf. Die Verwendung einer gemischten Lymphozytenpopulation (PBL)
bringt allerdings Probleme mit sich: Erstens kann die zu messende Antwort wegen des
geringen Anteils an γδ-T-Lymphozyten in PBL-Kulturen sehr schwach ausfallen und daher
schwer nachzuweisen sein. Zweitens ist bei einem positiven Ergebnis nicht klar, welche
Zellpopulationen tatsächlich proliferieren, zytotoxisch wirken oder Zytokine produzieren.
58
C Ergebnisse und Diskussion
Die Verwendung durchflusszytometrischer Methoden bringt demgegenüber den Vorteil, dass
sich die Messergebnisse bestimmten Zellpopulationen zuordnen lassen. Im Rahme dieser
Arbeit wurde daher die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen in PBL-Kulturen mittels FACSAnalyse (Fluorescence-Activated Cell Sorting) gemessen.
1.1.2
Prinzip der FACS-Analyse
A
Antikörper mit
Fluorophor
Zelle
B
grüne Fluoreszenz
rote Fluoreszenz
Seitwärtsstreuung (Granularität)
488 nm
LASER
Vorwärtsstreuung (Größe)
Intensität der roten Fluoreszenz
C
Intensität der grünen Fluoreszenz
Abb. 12: Schematische Darstellung der FACS-Analyse eines Zellgemisches.
A: Färben der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern.
B: Messung des gestreuten und emittierten Lichts.
C: Zweidimensionale Darstellung des Ergebnisses der Fluoreszenz-Messung.
59
relative Intensität des
Seitwärtsstreulichts (SSC);
proportional zur Zellgranularität
Die FACS-Analyse ist eine durchflusszytometrische Methode, mit deren Hilfe sich Zellen
aufgrund ihrer Größe, Granularität und der exprimierten Zelloberflächenproteine unterscheiden lassen. Vor der eigentlichen Analyse werden bestimmte Subpopulationen eines Zellgemischs mit Fluoreszenzfarbstoffen, die an monoklonale Antikörper gegen charakteristische
Oberflächenantigene gekoppelt sind, markiert (vgl. Abb. 12 A). Die Zellen werden in Puffer
aufgenommen und durch eine Kapillare in das FACS-Gerät gesaugt. In dem entstehenden
Flüssigkeitsstrahl passieren die Zellen einzeln einen Laserstrahl. Das Laserlicht wird an den
Zellen gestreut und die Farbstoffmoleküle, die über Antikörper an die Zellen gebunden sind,
werden zur Fluoreszenz angeregt (vgl. Abb. 12 B). Das gestreute und emittierte Licht wird
mit Hilfe von Photodetektoren gemessen. Auf diese Weise erhält man für jede einzelne Zelle
Informationen über ihre Größe (Vorwärtsstreuung – FSC), Granularität (Seitwärtsstreuung –
SSC) und die Bindung der markierten Antikörper (Fluoreszenz). Die Messergebnisse werden
entweder eindimensional als Histogramme – Intensität gegen Zellzahl – oder zweidimensional
in so genannten Dot-Plots dargestellt (vgl. Abb. 12 C). In Abb. 13 ist beispielhaft gezeigt, wie
sich verschiedene Zellpopulationen im FSC/SSC-Plot abgrenzen lassen.
tote Zellen;
Zelltrümmer
U937
Lymphozyten
relative Intensität des Vorwärtsstreulichts (FSC);
proportional zur Zelloberfläche (Zellgröße)
Abb. 13: Differenzierung unterschiedlicher Zellen im FSC/SSC-Plot.
Durchflusszytometrische Identifizierung von Lymphozyten und U937-Zellen (vgl. Kap. C1.5.1.3)
mittels FACS-Analyse.
Bei der Auswertung einer FACS-Analyse können wie in Abb. 13 gezeigt im FSC/SSC-Plot
bestimmte Zellpopulationen ausgewählt und deren Fluoreszenz gezielt betrachtet werden. Auf
diese Weise können auch tote Zellen, die unspezifisch Antikörper binden und so eine korrekte
Auswertung erschweren, ausgeschlossen werden.
Zur „Markierung“ der Zellen stehen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe zur Auswahl.
Wichtig ist, dass sie sich bei der Wellenlänge des verwendeten Lasers anregen lassen (bei
einem Argon-Laser z. B. bei 488 nm) und dass ihre Emissionswellenlängen getrennt
gemessen werden können. In dieser Arbeit wurden Fluoresceinisothiocyanat (FITC;
λE = 525 nm) und Phycoerythrin (PE; λE = 575 nm) eingesetzt. Außer zur Charakterisierung
von Zelloberflächenmolekülen lässt sich die FACS-Analyse auch noch für zahlreiche andere
Experimente einsetzen. Als Beispiel seien hier die Detektion toter Zellen mit Hilfe des DNAbindenden Farbstoffs Propidiumiodid, der Nachweis apoptotischer Zellen durch FITCmarkiertes Annexin V oder die Zytokin-Analyse auf Einzelzell-Ebene mit Hilfe intrazellulärer
Färbetechniken genannt.
60
1.1.3
Messung der Stimulation von γδ-T-Zellen durch FACS-Analyse
Die FACS-Analyse bietet gegenüber anderen Methoden den Vorteil, dass sich durch
Verwendung der entsprechenden Antikörper die Messergebnisse bestimmten
Zellpopulationen zuordnen lassen. Einige der in Kapitel C1.1.1 genannten Verfahren sind
modifiziert auch bei der Durchflusszytometrie anzuwenden, z. B. der BrdU-Assay oder, wie
schon erwähnt, der Zytokin-Nachweis. Weniger aufwendig ist die Messung von
Aktivierungsmarkern oder die Bestimmung der relativen Expansion von γδ-T-Zellen.
1.1.3.1
Messung von Aktivierungsmarkern auf γδ-T-Zellen
Nach einer Aktivierung ändert sich die Expression von Oberflächenproteinen auf Zellen. Sehr
frühe Aktivierungsmarker auf T-Zellen sind CD69, ein Molekül unbekannter Funktion, und
CD25, die α-Kette des IL-2-Rezeptors. Die Expression dieser Oberflächenmoleküle wurde in
dieser Arbeit zur Messung der Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Zellen in PBL-Kulturen
eingesetzt. Nach einer Inkubationszeit von einem Tag (CD69) bzw. von zwei bis drei Tagen
(CD25) (vgl. auch Kap. C1.3.3) erfolgte die FACS-Analyse mit Hilfe von PE-gekoppelten
Antikörpern gegen CD69 bzw. CD25 und FITC-gefärbten pan-γδ-Antikörpern (vgl. Abb. 14
A bzw. B). γδ-T-Zellen zeigten FITC-Fluoreszenz und sind in Abb. 14 in den rechten oberen
und unteren Quadranten dargestellt. Aktivierte γδ-T-Zellen binden zusätzlich Antikörper
gegen CD69 bzw. CD25 und wiesen daher eine Doppelfluoreszenz auf. Sie sind im rechten
oberen Quadranten von Abb. 14 A bzw. B lokalisiert. Als Ergebnis wird der Anteil von
aktivierten (CD69-positiven oder CD25-positiven) γδ-T-Zellen an allen γδ-T-Zellen
angegeben.
Es ist bekannt, dass Phosphoantigene und Stickstoff enthaltende Bisphosphonate alleine
Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten aktivieren. In einzelnen Versuchen wurde dies durch Verwendung
von Antikörpern gegen Vγ9 bzw. Vδ2 überprüft; da sich aber keine Abweichungen ergaben,
wurde generell der pan-γδ-Antikörper verwendet.
Zur Messung der Aktivierung von γδ-T-Zellen waren sowohl der CD69/γδ- als auch der
CD25/γδ-Assay geeignet. Der Vorteil der Aktivierungsassays im Vergleich zum
Proliferationsassay (vgl. Kap. C1.1.3.2) war die kürzere Inkubationsdauer und die größere
Robustheit gegenüber zellschädigenden Einflüssen (vgl. Kap. C1.3.4). Die Bestimmung von
CD25/γδ ließ sich auch in Gegenwart von IL-2 (100 Internationale Einheiten (IE)/ml)
durchführen, während hier bei CD69/γδ schon in der Negativkontrolle recht hohe Werte
auftraten. Daher wurde der CD25/γδ-Assay sehr oft verwendet, wenn parallel die Proliferation
der γδ-T-Zellen in IL-2-haltigem Medium gemessen wurde. Das gewährleistete gleichmäßige
Bedingungen für jede Einzelbestimmung. Die Messung von CD69/γδ erwies sich dagegen
besonders bei den Versuchen zur Antigenpräsentation als nützlich, da sich durch die kurze
Inkubationsdauer die Proliferation der als antigenpräsentierende Zellen zum Einsatz
kommenden Tumorzelllinien in Grenzen hielt. Durch das starke Wachstum einiger der
verwendeten Zelllinien ließen sich schon nach zwei bis drei Tagen Inkubation die γδ-T-Zellen
nur noch schlecht nachweisen (vgl. Kap. C1.5.1).
B
pan-γδ-FITC
oben links
oben rechts
unten links
unten rechts
C
25,80 %
2,40 %
70,45 %
1,35 %
64,0 % CD69+-γδ-T-Zellen
CD3-PE
CD25-PE
CD69-PE
A
61
pan-γδ-FITC
pan-γδ-FITC
Anteil der Zellen pro Quadrant
9,17 %
1,42 %
88,53 %
0,88 %
61,9 % CD25+-γδ-T-Zellen
19,84 %
66,84 %
13,02 %
0,30 %
77,1 % γδ-TZR+-T-Zellen (CD3+)
Abb. 14: Durchflusszytometrische Messung der Stimulation von γδ-T-Lymphozyten durch
Isopentenylpyrophosphat (IPP) 20 µmol/l.
A: Expression des Aktivierungsmarkers CD69 nach einem Tag Inkubation.
B: Expression des Aktivierungsmarkers CD25 nach zwei Tagen Inkubation.
C: Relative Zunahme der TZR-γδ+-Zellen an den Gesamt-T-Zellen (CD3+) nach
sieben Tagen Inkubation.
1.1.3.2
Messung der relativen Expansion von γδ-T-Zellen
Die Aktivierung von γδ-T-Zellen führt in Anwesenheit von IL-2 zur Proliferation. Mit Hilfe
von PE-markierten Antikörpern gegen CD3, einem mit dem T-Zell-Rezeptor assoziierten
Protein, und pan-γδ-FITC-Antikörpern lässt sich durchflusszytometrisch der Anteil der
γδ-T-Zellen (Doppelfluoreszenz, rechter oberer Quadrant) an allen T-Zellen (PE-Fluoreszenz,
rechter und linker oberer Quadrant) bestimmen (vgl. Abb. 14 C).
Eine Erhöhung dieses Anteils nach einer Inkubationszeit von sieben bis zehn Tagen war ein
deutlicher Hinweis auf die Proliferation der γδ-T-Lymphozyten. Durch Bestimmung der
Zellzahl in der Kultur konnte die Absolutzahl der γδ-T-Zellen berechnet und das Ergebnis so
bestätigt werden.
Ein Vorteil des γδ/CD3-Assays gegenüber den Aktivierungsassays besteht darin, dass bis zu
70 % der aufgenommenen Zellen in die Auswertung eingehen, da alle T-Zellen gefärbt
werden und die Proliferation der γδ-T-Lymphozyten zusätzlich die Zellzahl erhöht. Dadurch
lässt sich besonders in Grenzfällen leichter entscheiden, ob eine Stimulation der γδ-T-Zellen
vorliegt.
62
1.1.3.3
Allgemeine Bedingungen
Da die inter-individuellen Unterschiede bei γδ-T-Zell-Antworten sehr groß sind, wurden die
meisten Versuche mit den kryokonservierten PBL eines einzigen Normalspenders
durchgeführt. Wichtige Ergebnisse wurden durch Experimente mit frisch gewonnenen PBL
anderer Normalspender bestätigt. Oft wurden zwei Assays parallel durchgeführt (CD25/γδ
und γδ/CD3 oder CD69/γδ und CD25/γδ).
Die gemessenen Werte (% CD69- bzw. CD25-positive γδ-T-Zellen bzw. % γδ-TZR-positive
T-Zellen) verschiedener γδ-T-Zell-Stimulationsassays konnten sich stark unterscheiden.
Beispielsweise bewirkte die Stimulation mit 20 µmol/l IPP nach einer Inkubationszeit von
drei Tagen einen Anteil von 87,7 ± 2,1 %21 CD25-positiven γδ-T-Zellen, in einem anderen
Versuch wurde ein Wert von 47,7 ± 3,9 %21 gemessen. Deswegen war es wichtig, bei jeder
Messung Positiv- und Negativkontrollen mitzuführen. Dabei wurde standardmäßig
Isopentenylpyrophosphat (IPP, 1) in drei Konzentrationen (20 µmol/l, 2 µmol/l, 200 nmol/l)
als Positivkontrolle verwendet, als Negativkontrolle diente das Kulturmedium ohne weitere
Zusätze. Die Einzelwerte einer Messreihe wurden immer als Mehrfachbestimmungen
angesetzt, meist Doppel- oder Dreifachbestimmungen.
21
Mittelwert aus drei Bestimmungen ± Standardabweichung.
1.2
63
Stimulation von γδ-T-Zellen durch Phospho- und
Aminoverbindungen
Die Aktivierung von γδ-T-Lymphozyten durch Phosphoantigene – verschiedene organische
Mono- und Diphosphate – ist inzwischen relativ gut untersucht (vgl. Kap. B1.5.1.1). Als man
herausfand, dass auch das Aminobisphosphonat Pamidronat 2 ein relativ starker γδ-T-ZellStimulator ist, wurde dies zunächst mit der strukturellen Ähnlichkeit der Diphosphat- und der
Methylenbisphosphonat-Gruppe (vgl. Abb. 15) begründet (Kunzmann und Mitarbeiter, 2000).
HO
O
P
HO
OH
P
O
OH
H2C
P
HO
O
OH
P
O
HO
Diphosphat
OH
O
Methylenbisphosphonat
Abb. 15: Strukturelle Ähnlichkeit der Diphosphat- und Methylenbisphosphonat-Gruppe.
Allerdings bewirken die Nichtaminobisphosphonate Etidronat 3 und Clodronat 4 keine
Stimulation von γδ-T-Zellen. Dagegen zeigen verschiedene Alkylamine Aktivität gegen
Vγ9Vδ2-T-Zellklone (Bukowski und Mitarbeiter, 1999). Das wirft die Frage auf, ob die
Aminogruppe entscheidend für die Wirksamkeit von Pamidronat 2 ist. Um die strukturellen
Voraussetzungen für eine Erkennung von Phosphonaten durch γδ-T-Lymphozyten zu
untersuchen, wurden in dieser Arbeit verschiedene Phospho- und Aminoverbindungen im γδT-Zell-Aktivierungs- und Proliferationsassay getestet (vgl. Tab. 7 und Abb. 16 - 17).
Tab. 7:
γδ-T-Zell-stimulierendes
Aminoverbindungen
Verbindung
Nr.
5
6
3
7
8
9
10
2
Bezeichnung
Ethylphosphonat
Propylphosphonat
Ethylenbisphosphonat
(Etidronat)
2-Butylamin
2-Aminoethylphosphat
3-Aminopropylphosphat
3-Aminopropanol
Pamidronat
Potential
verschiedener
eingesetzte
Konzentrationen [mmol/l]
0,05; 0,25; 0,5; 5; 25
0,05; 0,25; 0,5; 5; 25
0,01; 0,1; 1; 10
0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 10
0,05; 0,1; 0,5; 1; 10
0,05; 0,1; 0,5; 1; 10
0,05; 0,1; 0,5; 1; 10
0,00001 - 1
Phospho-
und
Aktivierung
CD25/γδ
Proliferation
γδ/CD3
—
—
—
—
—
—
ab 1 mmol/l
—
—
—
ab ca. 1 µmol/l
bei 750 µmol/l
—
—
—
ab ca. 0,5 µmol/l
Die untersuchten Verbindungen wurden in den aufgeführten Konzentrationen mit PBL inkubiert und die
Aktivierung bzw. Proliferation der γδ-T-Zellen mittels FACS-Analyse bestimmt. Es sind die Konzentrationen
angegeben, ab denen eine Stimulation der γδ-T-Zellen zu beobachten war; — : keine γδ-T-Zell-Stimulation.
a
Die Daten zu Pamidronat wurden aus der unter C1.3.2 beschriebenen Titration gewonnen.
64
Die Ergebnisse sollten mit Literaturdaten verglichen werden. Die veröffentlichten Daten zu
Alkyl- und Alkenyl(di)phosphaten wurden meist an Vγ9Vδ2-T-Zellklonen ermittelt. Dabei
wurde die Proliferation dieser Klone mittels Einbau von 3H-Thymidin gemessen. In den
eigenen Versuchen dagegen wurde die Aktivierung oder Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Zellen
in der Gesamtpopulation mononucleärer Zellen des peripheren Blutes (PBL) mittels FACSAnalyse bestimmt. Trotz dieses unterschiedlichen Ansatzes sind die erhaltenen Werte
vergleichbar, wie Tab. 8 am Beispiel von IPP und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP, 11)
zeigt.
Tab. 8:
Vergleich der EC50-Werte22 von IPP und DMAPP, ermittelt durch unterschiedliche
Methoden
EC50 [µmol/l]
IPP
DMAPP
Vγ9Vδ2-T-Zellklon
3
10
PBL
3
13
Die Stimulation von γδ-T-Zellen durch die Phosphoantigene IPP und DMAPP wurde durch die proliferative
Antwort von T-Zellklonen (Vγ9Vδ2-T-Zellklon; linke Spalte) (Tanaka und Mitarbeiter, 1995) oder in eigenen
Versuchen durch die relative Expansion von γδ-T-Zellen (γδ/CD3-Assay; vgl. Tab. 10) in einer PBL-Population
ermittelt (rechte Spalte).
1.2.1
Vergleich von Alkylphosphaten, Alkylphosphonaten und
1,1-Alkylenbisphosphonaten
Geradkettige und verzweigte Alkylphosphate mit einem bis vier Kohlenstoffatomen wirken
als Phosphoantigene (vgl. Kap. B1.5.1.1). Die aktivste Verbindung aus dieser Gruppe ist das
Ethylphosphat mit einem EC50 von ca. 200 µmol/l. Die kürzer- und längerkettigen Analoga
Methyl- und n-Propylphosphat sind mit EC50-Werten von 20000 µmol/l und 3300 µmol/l nur
sehr schwach aktiv. Die entsprechenden Diphosphat-Verbindungen dagegen rufen schon bei
2 µmol/l (Ethyl-), 14 µmol/l (Methyl-) und 20 µmol/l (n-Propyldiphosphat) eine
halbmaximale proliferative Antwort von Vγ9Vδ2-T-Zellklonen hervor (Morita und
Mitarbeiter, 2001). Im Gegensatz dazu bewirkte weder Ethyl- 5 oder Propylphosphonat 6
noch das Bisphosphonat Etidronat 3 eine Aktivierung oder Proliferation von γδ-T-Zellen (vgl.
Tab. 7 und Abb. 16).
22
EC50 = effective concentration 50
Stimulator-Konzentration, bei der die halbmaximale γδ-T-Zell-Antwort erreicht wird.
H3C
65
O
O
OH
P
O
P
O
H3C
HO
O
P
Methyldiphosphat 14 µmol/l
OH
HO
H3C
P
H3C
OH
HO
P
P
OH
OH
O
n-Propylphosphat 3,3 mmol/l
P
OH
P
OH
OH
O
Ethylenbisphosphonat
(Etidronat, 3)
O
Propylphosphonat 6
HO
P
OH
OH
HO
O
O
P
OH
O
H3C
HO
H3C
Ethyldiphosphat 2 µmol/l
HO
O
OH
P
O
Ethylphosphat 230 µmol/l H3C
H3C
P
O
Ethylphosphonat 5
HO
O
OH
O
O
HO
O
P
H3C
O
Methylphosphat 20 mmol/l
O
OH
O
HO
O
n-Propyldiphosphat 20 µmol/l
Abb. 16: Vergleich der Strukturen inaktiver Phosphonate (5 und 6) und
Bisphosphonate (3) (vgl. Tab. 7) mit den entsprechenden γδ-T-Zell-aktivierenden
Alkylmono- und -diphosphaten; angegeben sind die EC50-Werte für Proliferation
von Vγ9Vδ2-T-Zellklonen nach Morita und Mitarbeiter (2001).
1.2.2
Vergleich von Amino-Verbindungen
Tanaka und Mitarbeiter (1994) untersuchten die Auswirkung von Modifikationen an
Position 2 von Ethylphosphat auf die biologische Aktivität. Die entsprechende Hydroxylbzw. Carboxylverbindung zeigen gegenüber der Ausgangsverbindung eine 100 bis 200fach
schwächere Aktivität; 2-Aminoethylphosphat 8 ist nicht gegen Vγ9Vδ2-T-Zellklone aktiv.
Diese Verbindung wurde in einem Ansatz mit PBL auf ihre Fähigkeit getestet, γδ-T-Zellen zu
aktivieren oder zur Proliferation anzuregen. Auch in der höchsten von uns eingesetzten
Konzentration – 10 mmol/l – konnte keine Stimulation der γδ-T-Zellen beobachtet werden.
Ebenso inaktiv zeigten sich 3-Aminopropylphosphonat 9 und der Alkohol 3-Aminopropanol
10 (vgl. Tab. 7 und Abb. 17 B).
66
A
H2N
B
CH3
Ethylamin*
O
H2N
O
P
OH
HO
2-Aminoetyhlphosphat 8*#
O
CH3
H2N
H2N
P
OH
HO
3-Aminopropylphosphonat 9#
n-Propylamin*
H2N
CH3
H2N
OH
H3C
3-Aminopropanol 10#
2-Butylamin 7*#
C
HO
O
P
H2N
OH
OH
P
HO
OH
O
3-Amino-1-hydroxypropylenbisphosphonat#
(Pamidronat, 2)
Abb. 17: Verschiedene Amino-Verbindungen.
A: Beispiele für γδ-T-Zell-aktive Alkylamine.
B: Nichtaktive Amino-Verbindungen.
C: Pamidronat.
*
(Morita und Mitarbeiter, 2001); #eigene Versuche, vgl. Tab. 7.
Dagegen fanden Bukowski und Mitarbeiter (1999), dass Vγ9Vδ2-T-Zellen Alkylamine mit
gerader oder verzweigter Seitenkette aus zwei bis fünf Kohlenstoffatomen und einer primären
Aminogruppe erkennen (vgl. Abb. 17 A). Für diese Verbindungen sind keine EC50-Werte
veröffentlicht. Alle aktiven Alkylamine verursachen aber in einer Konzentration von
400 µmol/l die Expansion von γδ-T-Zellen in einer PBL-Population. In eigenen Versuchen
mit 2-Butylamin 7 konnte dieser Wert nicht erreicht werden: erst ab 750 µmol/l war eine
Proliferation von γδ-T-Zellen nachweisbar, eine Aktivierung (CD25-Expression) sogar erst ab
1 mmol/l (vgl. Tab. 7).
Da aber alle Testsubstanzen auch in deutlich höheren Konzentrationen eingesetzt wurden, ist
es unwahrscheinlich, dass Verbindungen von uns falsch negativ eingestuft wurden, selbst
wenn das verwendete System für bestimmte Substanzen weniger sensitiv sein sollte.
Das Aminobisphosphonat Pamidronat 2 ist im Vergleich zu den Alkylaminen ein sehr starker
γδ-T-Zell-Stimulator; mit einem EC50 von 8 µmol/l (vgl. Kap. C1.3.2) liegt es im Bereich der
stark aktiven Diphosphate (vgl. Abb. 17 C).
1.2.3
67
Zusammenfassung
Während auf den ersten Blick die stimulierende Aktivität von Aminobisphosphonaten –
insbesondere von Pamidronat – auf Vγ9Vδ2-T-Zellen leicht durch ihre strukturelle
Ähnlichkeit zu den Alkyldiphosphaten erklärbar scheint, gibt es auch Beobachtungen, die mit
dieser Erklärung nicht im Einklang stehen. So sind die Alkylmonophosphate zwar sehr viel
schwächer aktiv als die entsprechenden Diphosphate, trotzdem ist eine Stimulation von
γδ-T-Zellen eindeutig nachweisbar. Im Gegensatz dazu war 3-Aminopropylphosphonat, das
dem Pamidronat entsprechende Monophosphonat, inaktiv. Auch konnten unsubstituierte
Alkylphosphonate und –bisphosphonate, wie zum Beispiel Etidronat, im Unterschied zu ihren
Phosphat- und Diphosphat-Analoga γδ-T-Zellen nicht zur Proliferation anregen. Die
Einführung einer Amino-Gruppe zerstört die Aktivität von Ethylphosphat, dagegen ist
Ethylamin aktiv.
Aus den bisherigen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die stimulierende Aktivität von
Verbindungen, die Phosphonat-Gruppen enthalten, das Vorhandensein zweier PhosphonatGruppen und einer Aminogruppe im Molekül voraussetzt.
68
1.3
1.3.1
Untersuchungen zur Stimulation von γδ-T-Zellen durch
Zoledronat
Stimulation von γδ-T-Zellen durch Bisphosphonate mit einem
stickstoffhaltigen Heterozyklus in der Seitenkette
Bisphosphonate mit einem Imidazolring (Zoledronat, 12) oder Pyridinring (Risedronat, 13) in
der Seitenkette werden als besonders wirksame Medikamente gegen überhöhte
Knochenresorption eingesetzt. Genau wie bei den Aminobisphosphonaten beobachtet man
auch hier bei der ersten Gabe in manchen Fällen eine Akut-Phase-Reaktion mit Fieber (Adami
und Zamberlan, 1996). Bei Patienten, die erstmals mit Pamidronat behandelt werden,
korreliert das Auftreten von Fieber mit einem Anstieg des Anteils der
Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten im peripheren Blut (Kunzmann und Mitarbeiter, 1999). Die
stickstoff-freien Bisphosphonate Clodronat und Etidronat, die nicht stimulierend auf
γδ-T-Zellen wirken, rufen kein Fieber hervor. Um zu überprüfen, ob auch Bisphosphonate mit
einem stickstoffhaltigen Heterozyklus in der Seitenkette die Fähigkeit besitzen
Vγ9Vδ2-T-Zellen zu stimulieren, wurden Zoledronat und Risedronat in Gegenwart von IL-2
mit PBL inkubiert. Nach zwei bzw. sieben Tagen wurde der Anteil der aktivierten
γδ-T-Zellen bzw. die relative Expansion der γδ-T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt.
Wie Abb. 18 beispielhaft zeigt, stimulierte Zoledronat konzentrationsabhängig die CD25Expression (Aktivierung) und das Auswachsen von γδ-T-Zellen. Bei Risedronat ergab sich
ein ähnliches Bild. Bei einer Konzentration von 700 nmol/l Risedronat ließ sich ein
Auswachsen der γδ-T-Lymphozyten beobachten, bei 200 nmol/l lag der γδ-T-Zell-Anteil im
Bereich der Negativkontrolle. CD25-Expression war bei einer Risedronat-Konzentration von
0,7 µmol/l nachweisbar, eine deutliche Aktivierung zeigte sich erst bei 7 µmol/l (vgl. Abb.
19).
Während unserer Arbeiten bestätigte eine andere Forschungsgruppe, dass Risedronat γδ-TZellen aktivieren kann (Das und Mitarbeiter, 2001). Allerdings konnte schon bei einer
Risedronat-Konzentration von 20 nmol/l ein messbares Ansteigen des γδ-T-Zell-Anteils in
einer PBL-Population beobachtet werden, ein Wert der deutlich unter der von uns ermittelten
minimal wirksamen Konzentration lag. Ob diese Unterschiede auf unterschiedliche
Testsysteme oder Darreichungsformen von Risedronat23 zurückzuführen sind konnte nicht
geklärt werden.
23
Actonel® Filmtabletten, 250 mg: 5 mg Natrium-Risedronat; sonstige Inhaltsstoffe: Lactose, Farbstoffe.
10 µmol/l
0,1 µmol/l Zoledronat
52,9 %
35,2 %
9,1 %1
48,6 %
44,6 %
16,3 %2
CD25-PE
A
1 µmol/l
69
CD3-PE
B
pan-γδ-FITC
Abb. 18: Durchflusszytometrische Messung der Stimulation von γδ-T-Zellen durch
Zoledronat in verschiedenen Konzentrationen.
A: Aktivierung (CD25/γδ);
B: Proliferation (γδ/CD3).
Gezeigt ist ein Ergebnis einer Doppelbestimmung. Es ist jeweils der Anteil CD25-positiver γδ-TZellen (A) bzw. γδ-TZR-positiver CD3-Zellen (B) angegeben [%].
1
Negativkontrolle: 8,4 % CD25-positive γδ-T-Zellen (Mittelwert einer Vierfachbestimmung).
2
Negativkontrolle: 9,7 % γδ-TZR-positive CD3-Zellen (Mittelwert einer Vierfachbestimmung).
**
70
**
**
60
50
**
40
*
+
+
+
CD25 [% pan-γδ ] bzw. pan-γδ [% CD3 ]
80
30
ns
ns
ns
ns
+
20
10
0
70
7
0,7 0,07 0,007
Aktivierung (CD25/γδ)
0 µmol/l
70
7
0,7
0,2 0,07
0 µmol/l
Proliferation (γδ/CD3)
Abb. 19: Stimulation von γδ-T-Zellen durch Risedronat in verschiedenen Konzentrationen.
Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardfehler, n = 2; **P < 0,01; *P < 0,05 kennzeichnen Werte,
die sich signifikant von der Negativkontrolle (0 µmol/l Risedronat) unterscheiden; ns: Unterschiede
sind nicht signifikant (ANOVA).
70
Bei der FACS-Analyse misst man das Verhältnis verschiedener Zellarten zueinander. Um zu
bestätigen, dass durch Zoledronat tatsächlich eine Proliferation der γδ-T-Zellen stattfindet,
wurden in einem Aliquot der Zellsuspension nach Ende der Inkubationszeit die lebenden
Zellen gezählt, der Rest zur durchflusszytometrischen Analyse verwendet. So lässt sich die
Absolutzahl an γδ-T-Zellen errechnen. Zoledronat-Konzentrationen von 2 – 4 µmol/l führten
in verschiedenen Versuchen nach sieben Tagen Kultur mit PBL zu einer 5 – 10fachen
Vermehrung der γδ-T-Zellen gegenüber von Kontrollen, die mit Medium und IL-2 alleine
inkubiert wurden. Tabelle 9 zeigt beispielhaft das Ergebnis einer Doppelbestimmung.
Tab. 9: Proliferation von γδ-T-Zellen durch Zoledronat
Zoledronat 2 µmol/l
Negativkontrolle
1.3.2
Gesamtzellzahl
(gezählt)
Zahl der γδ-T-Zellen
7,5 x 105
6,9 x 105
5,7 x 105
4,4 x 105
2,48 x 105
2,10 x 105
0,45 x 105
0,32 x 105
Anteil der γδ-TZRpositiven an den CD3positiven Zellen
57,0 %
52,4 %
17,0 %
15,6 %
Vergleich des γδ-T-Zell-stimulatorischen Potentials etablierter
Bisphosphonate
PBL wurden in Gegenwart von IL-2 mit verschiedenen Konzentrationen der
Aminobisphosphonate Pamidronat und Ibandronat sowie mit Zoledronat und Risedronat und
als Vergleich mit IPP und DMAPP für drei bzw. sieben Tage inkubiert und die Aktivierung
(Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen) bzw. Proliferation (Anteil der γδ-TZR-positiven an
den CD3-positiven Zellen) durchflusszytometrisch bestimmt. Durch Auftragen der erhaltenen
Werte gegen den Logarithmus der Bisphosphonat-Konzentrationen ergab sich ein für viele
Dosis-Wirkungs-Beziehungen typischer sigmoider Kurvenverlauf (vgl. Abb. 20).
Aktivierungsindex
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
10
-3
10
-2
10
-1
10 0
10 1
10
2
10
3
Abb. 20: Titrationskurve γδ-T-Zell-Aktivierung durch Pamidronat (▲) und Zoledronat (■).
Der Aktivierungsindex (vgl. Kap. C1.4.1) wurde aus dem Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen
errechnet.
71
Die Bisphosphonat-Konzentration, die nötig war, um eine halbmaximale γδ-T-Zell-Antwort
hervorzurufen (der EC50-Wert), diente als Maß des γδ-T-Zell-stimulatorischen Potentials. Die
EC50-Werte für die Aktivierung von Zoledronat 12 lagen in drei voneinander unabhängigen
Versuchen bei 0,9 µmol/l, 1,2 µmol/l und 1,7 µmol/l (im Mittel 1,3 µmol/l), für Pamidronat 2
wurde ein EC50-Wert von 8,2 µmol/l erhalten (vgl. Tab.10). Man benötigt also etwa die
sechsfache Pamidronat-Konzentration, um die gleiche γδ-T-Zell-Antwort hervorzurufen wie
mit Zoledronat. Risedronat 1324, Ibandronat 14 und das Phosphoantigen
Isopentenylpyrophosphat 1 zeigten vergleichbare Aktivität mit Zoledronat 12, das
Phosphoantigen Dimethylallylpyrophosphat 11 war schwächer aktiv.
Tab. 10: γδ-T-Zell-stimulatorisches
Phosphoantigene
Verbindung
Nr.
12 (Versuch 1)
12 (Versuch 2)
12 (Versuch 3)
13
14
1 (Versuch 1)
1 (Versuch 2)
2
11
EC50 [µmol/l]
CD25 CD3
0,9
n. d.
1,2
0,8
1,7
1,7
2,1
1,5
2,6
n. d.
2,7
1,8
3,4
3,3
8,2
5,2
12,8
12,5
Potential
verschiedener
Bisphosphonate
und
Vertrauensintervall 95 %
R2
CD25
CD3
CD25 CD3
0,4 – 1,7
n. d.
0,867 n. d.
0,7 – 2,0
0,6– 11
0,897 0,901
1,1 – 2,6
1,3 – 2,1 0,943 0,907
1,3 – 3,4
0,6 – 3,3 0,977 0,931
1,4 – 4,8
n. d.
0,907 n. d.
1,6 – 4,7
1,0 – 3,2 0,958 0,929
2,7 – 4,3
2,5 – 4,3 0,976 0,959
5,8 – 11,5
2,5 – 11,1 0,968 0,959
7,2 – 22,8
7,7 – 20,0 0,935 0,961
Das Bestimmtheitsmaß R2 ist ein Maß für die Güte der Anpassung der Kurve an die experimentell ermittelten
Daten. Statistische Auswertung: vgl. Anhang.
1.3.3
Zeitlicher Verlauf der Aktivierung
Während zur Proliferation von γδ-T-Zellen neben einem stimulierenden Liganden auch
externes IL-2 zugesetzt werden muss, zeigen unsere Daten, dass CD69 und CD25 auch durch
die bloße Gegenwart eines Antigens an der Zelloberfläche exprimiert werden. CD69 ist ein
sehr früher Aktivierungsmarker und bei maximaler Stimulation schon nach einer
Inkubationszeit von 24 Stunden auf einem großen Teil der Vγ9Vδ2-T-Zellen nachzuweisen.
CD25 dagegen erscheint erst nach zwei Tagen Kultur auf der Zelloberfläche. Wie Abb. 21
zeigt, wies Zoledronat das schon für Phosphoantigene und Pamidronat beschriebenen
Aktivierungsprofil auf (Kunzmann und Mitarbeiter, 2000). Dabei riefen die beiden
Bisphosphonate in unterschiedlichen Konzentrationen eine vergleichbare γδ-T-Zell-Antwort
hervor, in Übereinstimmung mit dem unterschiedlichen Potential dieser beiden Verbindungen
(vgl. Kap. C1.3.2).
24
vgl. aber Kapitel C1.3.1.
72
A
100
ZOL 4 µmol/l
PAM 40 µmol/l
IPP 2 µmol/l
IPP 0,2 µmol/l
Negativkontrolle
90
CD69+ [% pan-γδ+]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
50
60
70
80
Zeit [h]
B
100
90
CD25+ [% pan-γδ+]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
Zeit [h]
Abb. 21: IL-2-unabhängige γδ-T-Zell-Aktivierung durch Zoledronat (ZOL), Pamidronat
(PAM) oder IPP.
A: CD69-Expression;
B: CD25-Expression.
Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler; bei den letzten beiden Zeitpunkten des
γδ/CD69-Assays nur Einzelbestimmungen (gestrichelte Linie).
Wie am Beispiel von IPP gezeigt wird, ergab sich beim Einsatz einer γδ-T-Zellstimulierenden Verbindung in geringeren Konzentrationen prinzipiell der gleiche
Kurvenverlauf für die CD69- uns die CD25-Exression, nur die Endpunkte lagen niedriger
(vgl. Abb. 21 A).
In Gegenwart von 100 IE/ml IL-2 verkürzte sich die Zeit bis zum Auftreten der
Aktivierungsmarker nicht. Allerdings waren generell höhere Werte messbar, und auch in den
Negativkontrollen (PBL mit Medium und IL-2) nahm der Anteil der aktivierten γδ-T-Zellen
zu (vgl. Abb. 22 A). Nach einer Kulturzeit von vier Tagen war bereits eine deutliche
Vermehrung der γδ-T-Zellen zu beobachten, nach fünf Tagen begann der Anteil der CD25positiven γδ-T-Lymphozyten wieder abzunehmen. Am siebten Tag hatten alle γδ-T-Zellen
CD25 herunterreguliert (vgl. Abb. 22 C).
A
CD25+ [% pan-γδ+]
60
73
ohne IL-2
100 IE/ml IL-2
**
50
**
40
30
20
10
0
ZOL 10 µmol/l
ZOL 1 µmol/l
Negativkontrolle
ZOL/IPP Zugabe nach
CD25+ [% pan-γδ+]
B
0h
24 h
48 h
***
70
60
50
***
40
30
20
10
0
ZOL 4 µmol/l
C
IPP 2 µmol/l
Tag 4
11 % γδ-T-Zellen
Zellzahl
93 % CD25+
M1
Negativkontrolle
Tag 5
18 % γδ-T-Zellen
67 % CD25+
M1
Tag 7
27 % γδ-T-Zellen
4,2 % CD25+
M1
relative Fluoreszenzintensität
(CD25-PE)
Abb. 22: Einfluss von IL-2 auf die Expression von CD25.
A: Vergleich der CD25-Antwort von γδ-T-Zellen in Gegenwart (100 IE/ml IL-2)
und Abwesenheit (ohne IL-2) von IL-2.
Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler; **Werte mit und ohne IL-2
unterscheiden sich signifikant, P < 0,01 (ANOVA).
B: Einfluss einer Vorinkubation mit 100 IE/ml IL-2 auf die γδ-T-Zell-Aktivierung
durch Zoledronat (ZOL) und IPP.
Vorinkubationszeit: 0 h, 24 h bzw. 48 h; FACS-Analyse 24 h nach Zugabe von ZOL/IPP.
Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler; ***Werte unterscheiden sich
signifikant von der zugehörigen Negativkontrolle, P < 0,001 (ANOVA).
C: Proliferation und CD25-Expression von γδ-T-Zellen nach Stimulation mit
10 µmol/l Zoledronat in Gegenwart von 100 IE/ml IL-2; es ist jeweils der Anteil
der γδ-T-Zellen an den CD3-positiven Lymphozyten (% γδ-T-Zellen) und der
Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen (% CD25+) angegeben.
74
IL-2 alleine führte nicht zu einer nennenswerten Proliferation der γδ-T-Lymphozyten, jedoch
wurden die Zellen durch das Zytokin in geringem Umfang aktiviert (vgl. Tab. 11). Auf
Vγ9Vδ2-T-Zellen, die 24 oder 48 Stunden mit 100 IE/ml IL-2 vorinkubiert wurden, ließ sich
schon einen Tag nach Zugabe von Zoledronat oder IPP CD25 nachweisen (vgl. Abb. 22 B).
Auch auf anderen Zellen wurde durch Kultur das Auftreten von CD69 und CD25 induziert.
Der Anteil an aktivierten Zellen war in Gegenwart von IL-2 generell erhöht. Die
durchschnittlichen Werte sind in Tab. 11 aufgeführt. Sie waren unabhängig von der
Anwesenheit N-haltiger Bisphosphonate oder Phosphoantigene, daher wurde auch auf eine
weitere Differenzierung der CD69- und CD25-positiven Zellen verzichtet. Grundsätzlich
findet man CD69 auf aktivierten T- und B-Zellen, aktivierten Makrophagen und NK-Zellen.
CD25 wird von aktivierten T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert.
Tab. 11: Anteil der CD69- und CD25-positiven Zellen an lebenden PBL (ohne γδ-TZRpositive) und an γδ-TZR-positiven Zellen
Aufgetaute PBL
PBL
γδ
Kultur ohne IL-2
PBL
γδ
Kultur mit 100 IE/ml IL-2
PBL
γδ
CD69
10 %
5%
15 – 20 %
10 %
bis 40 %
bis 40 %
CD25
1%
1%
3%
(5 – 6 %)*
3%
5 – 10 %
5 – 15 %
Angegeben ist der durchschnittliche Anteil von CD69-positiven und CD25-positiven Zellen an den lebenden
Lymphozyten ohne die γδ-T-Zellen (PBL) und der Anteil der CD69-positiven und CD25-positiven
γδ-T-Lymphozyten (γδ), gemessen sofort nach Auftauen der PBL oder nach einem (CD69) bzw. zwei (CD25)
Tagen Kultur in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-2. * In Abwesenheit von IL-2 ließ sich in Kulturen, in
denen die γδ-T-Zellen stimuliert wurden, ein erhöhter Anteil anderer CD25-positiver Zellen messen. Dies ist
wahrscheinlich auf die Produktion von Zytokinen durch die aktivierten γδ-T-Zellen zurückzuführen.
1.3.4
75
Proliferationshemmender Effekt von stickstoffhaltigen
Bisphosphonaten
Wie in Kap. C1.3.1 dargelegt, induzierten verschiedene Stickstoff enthaltende
Bisphosphonate konzentrationsabhängig die Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten.
Allerdings ging der Anteil der γδ-T-Zellen bei höheren Bisphosphonat-Konzentrationen
wieder zurück oder es war gar keine Zunahme der Zellzahl festzustellen. Dabei wirkte
Zoledronat in Konzentrationen größer 10 µmol/l und Pamidronat in Konzentrationen
größer 40 µmol/l proliferationshemmend. Ein Einfluss auf die CD25-Expression war bei
diesen Konzentrationen nicht zu bemerken. Wie Abb. 23 zeigt, proliferierten die γδ-T-Zellen
jedoch, wenn Zoledronat nach einem Tag Inkubation durch Waschen wieder aus der PBLKultur entfernt wurde.
A
B
70
50
pan-γδ [% CD3 ]
+
50
40
30
+
CD25+ [% pan-γδ+]
60
60
20
***
**
40
30
20
10
10
0
0
40 µmol/l
Zoledronat
2 µmol/l
Zoledronat
Negativkontrolle
PBL ohne Waschen
40 µmol/l
Zoledronat
2 µmol/l
Zoledronat
Negativkontrolle
PBL, nach 1 d Waschen
Abb. 23: Stimulation von γδ-T-Zellen durch Zoledronat: Vergleich von Kulturen, aus denen
nach einem Tag Inkubation das Bisphosphonat durch Waschen der Zellen entfernt
wurde (PBL, nach 1 d Waschen) mit PBL, die bis zum Ende der Inkubationszeit in
Kontakt mit Zoledronat standen (PBL ohne Waschen).
A: Messung der Aktivierung (CD25/γδ);
B: Messung der Proliferation (γδ/CD3).
Dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardfehler; *** P < 0,001; ** P <
0,01 kennzeichnen Werte, die sich nach Waschen signifikant unterscheiden (ANOVA).
γδ-T-Zellen werden durch hohe Konzentrationen an Zoledronat oder Pamidronat also
aktiviert, proliferieren aber nicht. Ein bekannter Effekt von N-BPs in Konzentrationen ab
10 bis 100 µmol/l (je nach untersuchter Verbindung) ist die Induktion von Apoptose und/oder
Zytostase in verschiedenen Tumorzelllinien (vgl. Kap. B3.2.1). Wir untersuchten daher die
apoptotische Wirkung von Zoledronat und Pamidronat auf PBL. Nach Behandlung mit
40 µmol/l Zoledronat oder 100 µmol/l Pamidronat ließ sich in PBL-Kulturen mittels Annexinoder Apo-Assay (vgl. Kap. D3.5) innerhalb von 48 Stunden kein Anstieg von apoptotischen
Zellen nachweisen. Allerdings war der Anteil an toten Zellen (Propidiumiodid-Färbung, vgl.
Kap. D3.5.1) nach siebentägiger Inkubation mit 40 µmol/l Zoledronat (30 ± 5 %) oder
100 µmol/l Pamidronat (25 ± 5 %) deutlich höher als in Kulturen, die mit Medium und IL-2
alleine inkubiert wurden (15 ± 2,5 %). 100 µmol/l Clodronat führten dagegen nicht zu einem
Anstieg der toten Zellen (15 ± 2,5 % tote Zellen).
76
Viele Wirkungen von N-BPs auf Zellen – insbesondere die Apoptose bei Makrophagen und
Tumorzellen sowie der Funktionsverlust von Osteoklasten – lassen sich durch die Zugabe der
Isoprenoid-Alkohole Farnesol 15 und/oder Geranylgeraniol 16 verringern oder aufheben (vgl.
Kap. B3). Auf die Aktivierung oder Proliferation von γδ-T-Zellen durch Pamidronat oder
Zoledronat hatte die Zugabe von 50 und 100 µmol/l Farnesol oder Geranylgeraniol keine
Auswirkung (vgl. Abb. 24).
B
35
70
30
60
25
50
pan-γδ+ [% CD3+]
CD25+ [% pan-γδ+]
A
20
15
10
5
40
30
20
10
0
0
PAM 40 µmol/l
ZOL 40 µmol/l
ZOL 4 µmol/l
Negativkontrolle
PAM 40 µmol/l
ZOL 40 µmol/l
ZOL 4 µmol/l
Negativkontrolle
+ EtOH
+ 50 µmol/l FOH
+ 50 µmol/l GGOH
Abb. 24: Wirkung von Farnesol (FOH) und Geranylgeraniol (GGOH) auf die Stimulation
von γδ-T-Zellen durch Pamidronat (PAM) und Zoledronat (ZOL).
A: Aktivierung (CD25/γδ);
B: Proliferation (γδ/CD3).
Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler; n = 2. Durch die Isoprenoidalkohole änderte sich die
Stimulation der γδ-T-Zellen nicht signifikant (p > 0,05; ANOVA).
(Die Verwendung von je 100 µmol/l der Isoprenoidalkohole führte zum gleichen Ergebnis.)
1.3.5
77
Zusammenfassung
Wir konnten zeigen, dass die Bisphosphonate Zoledronat und Risedronat, die sich durch
Stickstoff enthaltende Heteroaromaten in der Seitenkette auszeichnen, ebenso wie
Aminobisphosphonate und Phosphoantigene die Fähigkeit besitzen, selektiv
Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten zu stimulieren. Das Imidazol-Derivat Zoledronat war dabei aktiver
als die Aminobisphosphonate Pamidronat und Ibandronat. Bezüglich der Expression von
Aktivierungsmarkern ergab sich für Zoledronat, Pamidronat und das Phosphoantigen IPP
sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig ein ähnliches Profil. Dagegen riefen Zoledronat
und Pamidronat besonders in höheren Konzentrationen eine geringere proliferative γδ-T-ZellAntwort als IPP hervor, ab einer gewissen Bisphosphonat-Konzentration fand überhaupt keine
γδ-T-Zell-Proliferation mehr statt. Dabei war keine gesteigerte Apoptose in den PBLKulturen nachzuweisen, und auch die allgemeine Toxizität der eingesetzten Verbindungen
schien gering. Farnesol oder Geranylgeraniol konnten den antiproliferativen Effekt der N-BPs
nicht aufheben.
Anscheinend treten bei der Wechselwirkung von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten mit
γδ-T-Zellen zwei konträre Effekte auf: Einerseits aktivieren N-BPs Vγ9Vδ2-T-Zellen und
regen sie zur Proliferation an, andererseits üben sie einen proliferationshemmenden Einfluss
aus, der bei steigenden Konzentrationen zu überwiegen beginnt. Dieser zytostatische Effekt
könnte auf der Eigenschaft von Bisphosphonaten beruhen, Calcium-Ionen komplex zu binden
und sie so den Zellen zu entziehen. Allerdings liegt Calcium im Kulturmedium in einem
hohen molaren Überschuss verglichen mit den eingesetzten Zoledronat-Konzentrationen vor.
Außerdem scheint die anti-proliferative Wirksamkeit von N-BPs mit ihrer Aktivität
gegenüber γδ-T-Lymphozyten zu korrelieren (vgl. Kap. C1.4.4). Es ist daher
unwahrscheinlich, dass stickstoffhaltige Bisphosphonate die Proliferation von γδ-T-Zellen via
Calciumbindung inhibieren.
In anderen Zellen wirken N-BPs über die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase (vgl.
Kap. B3.1.1). Dieser Mechanismus ist auch für die Vγ9Vδ2-T-Zellen nicht ausgeschlossen.
Zwar internalisieren T-Lymphozyten nur sehr geringe Mengen der polaren Bisphosphonate
(Green, J.; persönliche Mitteilung), aber N-BPs inhibieren Farnesylpyrophosphat-Synthase
mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich (Dunford und Mitarbeiter, 2001). Da im
Kulturmedium um eine Größeneinheit höhere Bisphosphonat-Konzentrationen vorliegen, ist
es nicht ausgeschlossen, dass für eine Inhibierung der Farneslypyrophosphat-Synthase
ausreichende Mengen in die Zellen gelangen. Der fehlende Effekt von Farnesol und
Geranylgeraniol auf die Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Zellen ist kein ausreichender Beweis
dafür, dass die Blockierung der Isoprenoidbiosynthese keine Rolle spielt. In anderen
Systemen konnten die Isoprenoidalkohole die zytostatische Wirkung von N-BPs nur zum Teil
aufheben.
78
1.4
Test verschiedener N-haltiger Bisphosphonate auf ihre Aktivität
1.4.1
Screening
Um den Einfluss der Struktur von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten auf die Stimulation von γδ-T-Zellen zu untersuchen, wurden 36 verschiedene N-BPs (vgl. Abb. 25 und 26)
zunächst in einem Screening auf ihre Fähigkeit hin geprüft, γδ-T-Zellen zu aktivieren und zur
Proliferation anzuregen. Als Maß für die Aktivierung diente dabei die Hochregulation von
CD25 auf γδ-T-Zellen nach zwei Tagen Inkubation mit der Testsubstanz. Proliferation wurde
nach sieben Tagen Inkubation in Gegenwart von IL-2 als Anteil der γδ-T-Zellen an allen
CD3-positiven Zellen (= alle T-Zellen) gemessen. Die Bisphosphonate wurden in den Konzentrationen 1 mmol/l, 100, 10 und 1 µmol/l eingesetzt. Um die Ergebnisse der verschiedenen
Versuchsansätze vergleichen zu können, wurden jeweils Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt und daraus ein Aktivierungs- (AI) bzw. Proliferationsindex (PI) berechnet:
AI =
Aktivierung [Bisphosphonat ] − Aktivierung [Negativkontrolle]
Aktivierung [Positivkontrolle] − Aktivierung [Negativkontrolle]
Aktivierung: Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen an allen γδ-T-Zellen [%]
Negativkontrolle: nur Medium (17 ± 5 % CD25-positive γδ-T-Zellen)
Positivkontrolle: 2 µmol/l IPP (61 ± 4 % CD25-positive γδ-T-Zellen)
PI =
Proliferation [Bisphosphonat ] − Proliferation [Negativkontrolle]
Proliferation [Positivkontrolle] − Proliferation [Negativkontrolle]
Proliferation: Anteil der γδ-T-Zellen an allen CD3-positiven Zellen [%]
Negativkontrolle: nur Medium (16 ± 4 % γδ-TZR-positive CD3-positive Zellen)
Positivkontrolle: 0,2 µmol/l IPP (61 ± 6 % γδ-TZR-positive CD3-poistive Zellen)
Die Einteilung in starke, mittelstarke und schwache γδ-T-Zell-Stimulatoren erfolgte nach dem
Ausmaß der Antwort im Aktivierungsassay; als Grenzwert für eine deutliche Aktivierung
diente dabei ein AI von 0,325: Bisphosphonate, die in einer Konzentration von 10 µmol/l26
einen AI größer als 0,3 aufwiesen, wurden als starke γδ-T-Zell-Stimulatoren bewertet (Abb.
27 A). Als Bisphosphonate mittlerer Aktivität wurden diejenigen Substanzen eingeteilt, die
erst in der nächsten Konzentrationsstufe (100 µmol/l) diesen Wert überschritten (Abb. 28 A).
Bisphosphonate, die nur in der jeweils höchsten eingesetzten Konzentration zu einer sichtbaren Aktivierung von γδ-T-Zellen führten, wurden als schwache Stimulatoren eingestuft
(Abb. 29 A). Bei den N-BPs 29, 32, 34 und 50 war der AI auch bei einer Konzentration von
1 mmol/l kleiner als 0,3; eine Aussage, ob es sich um äußerst schwache γδ-T-ZellStimulatoren handelt, war nicht eindeutig zu treffen. Die N-BPs 17, 43, 45 und 49 konnten
auch in einer Konzentration von 1 mmol/l keine Aktivierung von γδ-T-Zellen hervorrufen und
wurden daher als Nichtstimulatoren bewertet.
25
26
Ein Aktivierungsindex von 0,3 entsprach 26 – 33 % CD25-positive γδ-T-Zellen.
Bei 1 µmol/l erreichte keines der untersuchten N-BPs einen AI von 0,3.
79
F
O
OH
P
H2N
2++
H3C
O
OH
P
P
F
P
18++
O
H
N
OH
P
OH
P
O
19+
O
H
N
OH
P
20(+)
H3C
O
OH
P
H
N
OH
P
O
O
21(+)
OH
P
O
CH3
OH
OH
P
N
P
O
22(+)
OH
O
N
OH
P
P
24(+)
O
OH
P
N
OH
OH
O
CH3
OH
OH
O
O
23++
O
OH
P
OH
OH
OH
O
CH3
OH
OH
OH
S
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
P
OH
OH
O
H3C
OH
OH
O
H
N
O
17-
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
H
N
H3C
OH
P
OH
P
O
O
H
N
OH
OH
OH
O
OH
P
OH
O
25++
OH
OH
CH3
O
O
CH3
N
Cl
OH
P
O
OH
O
OH
P
N
OH
O
P
26++
O
P
27++
OH
P
N
OH
OH
O
OH
P
N
P
28(+)
CH3
OH
OH
O
N
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
P
OH
29(+)/-
O
OH
OH
O
O
N
OH
OH
P
30+
O
OH
P
O
N
Cl
OH
P
OH
31++
O
OH
OH
CH3
O
OH
P
N
OH
H3C
H3C
O
OH
P
N
P
O
P
OH
OH
Abb. 25: Pamidronat (2) und andere Aminobisphosphonate.
OH
OH
OH
H3C
32(+)/-
OH
OH
CH3
++
OH
P
33+
O
OH
OH
stark aktive N-BPs; + mittelstark aktive N-BPs; (+) schwach aktive N-BPs; - inaktive N-BPs;
grenzwertige Aktivität.
(+)/-
80
O
O
OH
P
N
P
O
12++
O
N
OH
P
N
OH
O
34(+)/-
OH
OH
OH
N
P
N
OH
O
O
35+
OH
OH
OH
P
OH
OH
P
N
OH
P
O
OH
N
OH
N
OH
P
OH
OH
N
P
N
H
O
36+
O
H
N
N
OH
CH3
37++
P
O
38++
O
OH
H
N
N
O
OH
P
H
N
N
H3C
O
H3C
OH
OH
P
S
OH
OH
OH
O
OH
P
S
P
N
OH
OH
P
S
OH
39++
OH
P
O
40+
O
H
N
N
OH
P
P
O
41++
P
OH
P
OH
H
N
N
OH
H3C
OH
P
O
O
OH
OH
OH
OH
CH3
OH
OH
P
S
S
S
Cl
H
N
N
OH
OH
OH
O
O
OH
42+
43-
H3C
O
N
N
O
OH
P
OH
H
N
N
OH
P
O
OH
H
N
N
OH
P
OH
N
P
S
O
44(+)
O
CH3
N
N
OH
P
S
O
45-
OH
P
N
OH
OH
O
CH3
O
N
P
S
46+
O
OH
P
OH
H3C
OH
OH
O
OH
P
N
OH
OH
OH
H2N
P
O
47++
O
H3C
OH
P
OH
48++
OH
P
CH3
OH
50(+)/-
P
O
OH
OH
51+
P
O
CH3
OH
OH
CH3
49-
OH
P
N
H3C
P
OH
OH
O
+
N
H3C
O
O
O
OH
H3C
OH
OH
OH
P
N
OH
OH
OH
52(+)
O
Abb. 26: Zoledronat (12) und andere Bisphosphonate mit Stickstoff enthaltenden
Heteroaromaten in der Seitenkette (34 – 46); Aminomethylenbisphosphonate (38 –
50); Bisphosphonat mit Ammonium-Struktur in der Seitenkette (51); Ersatz einer
Phosphonat- durch eine Carboxylgruppe (52).
++
stark aktive N-BPs; + mittelstark aktive N-BPs; (+) schwach aktive N-BPs; - inaktive N-BPs;
grenzwertige Aktivität.
(+)/-
81
A
1,2
Aktivierungsindex
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
18
23
25
26
27
31
37
38
39
41
100 µmol/l
10 µmol/l
47
48
B
1
Proliferationsindex
0,8
0,6
0,4
0,2
0
18
23
25
26
27
31
37
38
39
41
10 µmol/l
1 µmol/l
47
48
Abb. 27: Stimulation von γδ-T-Zellen durch N-haltige Bisphosphonate starker Aktivität.
A: Aktivierung;
B: Proliferation.
82
A
1,2
Aktivierungsindex
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
19
28
30
33
35
36
40
42
100 µmol/l
10 µmol/l
46
51
B
1
Proliferationsindex
0,8
0,6
0,4
0,2
0
19
28
30
33
35
36
40
42
10 µmol/l
1 µmol/l
46
51
Abb. 28: Stimulation von γδ-T-Zellen durch N-haltige Bisphosphonate mittlerer Aktivität.
A: Aktivierung;
B: Proliferation.
83
A
1,2
Aktivierungsindex
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
20
21
22
24
29*
32*
34*
44
1 mmol/l
100 µmol/l
50*
52
B
Proliferationsindex
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
20
21
22
24
29*
32*
34*
44
100 µmol/l
10 µmol/l
50*
52
Abb. 29: Stimulation von γδ-T-Zellen durch N-haltige Bisphosphonate schwacher Aktivität.
A: Aktivierung;
B: Proliferation.
*
Die gemessene Aktivität dieser Verbindungen ist grenzwertig.
84
Vergleicht man die Ergebnisse der Aktivierungs- und Proliferationsassays, so stimmen diese
für die starken N-BPs gut überein (vgl. Abb. 27): Alle N-BPs, die in einer Konzentration von
10 µmol/l eine deutliche Aktivierung von γδ-T-Zellen bewirkten, führten in der gleichen
Konzentration zu einer starken (PI > 0,6) Proliferation und/oder in einer Konzentration von
1 µmol/l zu einer deutlichen (PI > 0,3) Proliferation. Es bestätigte sich, dass die Messung der
Proliferation empfindlicher ist als die Messung der aktivierten γδ-T-Zellen nach zwei Tagen
Inkubationszeit: Während sieben der zwölf starken N-BPs schon in einer Konzentration von
1 µmol/l die Proliferation von γδ-T-Zellen bewirkten, reichte diese Konzentration in keinem
Fall für eine deutliche Aktivierung aus. Allerdings zeigten manche der untersuchten
Substanzen zytotoxische und/oder proliferationshemmende Effekte, die sich besonders nach
sieben Tagen Kultur auswirkten. Daher nahm der Anteil an γδ-T-Zellen bei höheren
Bisphosphonat-Konzentration oft wieder ab (vgl. z. B. N-BPs 23, 27, 38 in Abb. 27 B).
Bei den mittelstarken N-BPs ergab sich ein entsprechendes Bild (vgl. Abb. 28): 10 µmol/l des
jeweiligen N-BPs reichten noch nicht aus, um einen AI größer 0,3 zu erzielen; dagegen
führten acht der zehn mittelstarken N-BPs in der gleichen Konzentration zu einer Proliferation
von γδ-T-Zellen. Anders dagegen bei den schwach aktiven N-BPs (vgl. Abb. 29): Von diesen
bewirkte alleine N-BP 44 in einer Konzentration von 100 µmol/l eine starke Proliferation der
γδ-T-Lymphozyten. Bei drei weiteren errechnete sich ein PI ≈ 0,3. Eine Messung der
Proliferation bei Substanz-Konzentrationen von 1 mmol/l erwies sich als nicht sinnvoll, weil
hier bei fast allen untersuchten N-BPs negative Wirkungen auf die Zellen auftraten.
Um die hemmende Wirkung mancher Bisphosphonate auf die Proliferation von γδ-T-Zellen
zu untersuchen, wurden PBL mit je 100 µmol/l der Testsubstanzen und 2 µmol/l IPP koinkubiert. Nach sieben Tagen wurde durch FACS-Messung der Anteil an γδ-T-Zellen
bestimmt. Das Ergebnis in Abb. 30 bezieht sich auf eine Positivkontrolle mit 2 µmol/l IPP;
der Wert der Negativkontrolle (PBL ohne Antigen-Zugabe) wurde abgezogen. Ein
Proliferationsindex (PI) von 1 bedeutet also, dass der gleiche Wert wie ohne Zusatz des
Bisphosphonats erreicht wurde; ein PI von 0 zeigt, dass keine Proliferation stattgefunden hat.
In manchen Fällen war nicht nur eine Suppression der Proliferation von γδ-T-Zellen zu
beobachten, sondern eine toxische Wirkung auf alle Zellen (Zunahme der toten Zellen;
sichtbar im FSC/SSC-Plot bei der FACS-Analyse; vgl. Kap. C1.1.1). Bisphosphonate, die zu
einer deutlichen Reduktion vitaler Zellen führten, sind in Abb. 30 durch ein Kreuz
gekennzeichnet.
Alle Bisphosphonate, die eine starke bis mittelstarke Aktivierung und Proliferation von γδ-TZellen bewirkten, zeigten gleichzeitig in der Konzentration von 100 µmol/l eine Hemmung
der Proliferation (vgl. Abb. 30 A und B). Diese Hemmung war bei den starken γδ-T-ZellStimulatoren deutlicher ausgeprägt; fünf dieser Substanzen wirkten darüber hinaus
zytotoxisch. Von den elf schwach aktiven Bisphosphonaten hemmten nur zwei die durch IPP
hervorgerufene Proliferation (vgl. Abb. 30 C): N-BP 29 unterdrückte das Auswachsen der
γδ-T-Lymphozyten völlig, N-BP 24 bewirkte eine geringfügige Hemmung.
85
Die untersuchten Bisphosphonate inhibierten in einer Konzentration von 100 µmol/l nicht die
Aktivierung von γδ-T-Zellen durch IPP, gemessen als Anteil CD25-positiver γδ-T-Zellen. Der
Grund für die Proliferationshemmung ist also nicht eine antagonistische Wirkung, wie sie für
einige Methylenbisphosphonate beschrieben wurde (Espinosa und Mitarbeiter, 2001).
Vielmehr spielen wohl spezifische proliferationshemmende Effekte und unspezifische
Zytotoxizität der untersuchten Substanzen eine Rolle (vgl. auch Kap. C1.3.4).
Proliferationsindex
A
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
+
0,1
+
+
+
+
26
27
31
37
0
18
B
23
25
38
39
41
47
48
1
Proliferationsindex
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
+
0,1
0
19
C
28
30
33
35
36
40
42
46
51
1
Proliferationsindex
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
20
21
22
24
29*
32*
34*
44
50*
52
17
43
45
49
Abb. 30: Hemmung der Proliferation von γδ-T-Zellen durch die untersuchten N-haltigen
Bisphosphonate.
A: starke γδ-T-Zell-Stimulatoren;
B: mittelstarke γδ-T-Zell-Stimulatoren;
C: schwache γδ-T-Zell-Stimulatoren (links) und Nichtstimulatoren (rechts).
Je 100 µmol/l eines N-BPs wurden mit PBL in Gegenwart von 2 µmol/l IPP und 100 IE/ml IL-2
inkubiert; +: Zahl toter Zellen deutlich erhöht.
86
1.4.2
Ermittlung der EC50-Werte
Zur weiteren Abstufung der Stärke der γδ-T-Zell-Stimulatoren wurden Aktivierung und
Proliferation über einen Konzentrationsbereich von 0,01 µmol/l bis 100 µmol/l gemessen und
aus den Dosis-Wirkungs-Kurven die Konzentrationen bei halbmaximaler Aktivität (EC50Werte) bestimmt (vgl. Tab. 12). Solch eine Quantifizierung war nur für die potentesten
Bisphosphonate sinnvoll. Diese zeigten einen typischen konzentrationsabhängigen Verlauf:
keine Wirkung bei niedrigen Substanzmengen, dann ein steiler Anstieg und anschließend eine
asymptotische Annäherung an die maximale Wirkung. Trug man die Konzentrationen der NBPs logarithmisch gegen die Wirkung (Stimulation von γδ-T-Zellen) auf, so ergab sich eine
sigmoide Kurve (vgl. Abb. 20).
Die schwächer aktiven N-haltigen Bisphosphonate dagegen bewirkten oft nur einen geringen
Anstieg der γδ-T-Zell-Antwort. Durch den flachen Verlauf der Dosis-Wirkungskurve sinkt
die Genauigkeit des EC50-Wertes. Zudem würde die maximale Wirkung erst bei
Konzentrationen größer als 100 µmol/l, bei denen schon schädliche Effekte auf die Zellen
auftreten, erreicht. Auch der in dieser Hinsicht robustere Aktivierungsassay (CD25/γδ) stößt
hier an seine Grenzen, da in diesem Konzentrationsbereich der γδ-TZR oft in größerem
Umfang herunterreguliert wird und somit eine Quantifizierung der CD25-positiven γδ-TZellen unmöglich wird. Diese Probleme lassen sich bei den starken N-BPs dadurch beheben,
dass man mittels einer Positivkontrolle, wie z. B. IPP, den Maximalwert für die Aktivierung
bzw. Proliferation bestimmt. Für schwächer aktive N-BPs dagegen ist die Annahme, dass
dieser Maximalwert erreicht werden kann, nicht zulässig.
Tab. 12: EC50-Werte für die aktivsten N-haltigen Bisphosphonate
N-BP
12
48
37
39
23
38
2
41
27
31
18
25
26
40
42
EC50 [µmol/l]
1,7
(1,7)
2,4
(2,5)
3,7
(2,3)
4,4
(3,0)
5,2
(4,0)
8,0
(5,8)
8,2
(6,7)
13
(14)
14
(15)
17
(19)
17
(17)
18
(24)
27
(28)
30
(55)
72
(91)
Vertrauensbereich 95 %
1,1 – 2,6
(1,2 – 2,3)
1,6 – 3,6
(1,9 – 3,4)
2,5 – 5,4
(1,5 – 3,4)
3,2 – 6,0
(2,2 – 4,1)
3,9 – 6,9
(3,2 – 5,1)
5,6 – 11
(4,3 – 7,8)
5,8 – 11
(5,0 – 9,0)
9,1 – 19
(12 – 18)
7,7 – 27
(11 – 21)
11 – 27
(15 – 24)
10 – 29
(13 – 21)
10 – 34
(19 – 33)
16 – 44
(23 – 34)
19 – 46
(46 – 64)
34 – 150
(76 – 109)
R2
0,943
0,946
0,950
0,964
0,974
0,961
0,968
0,958
0,940
0,937
0,932
0,905
0,946
0,960
0,926
(0,943)
(0,945)
(0,918)
(0,946)
(0,966)
(0,948)
(0,962)
(0,957)
(0,939)
(0,936)
(0,932)
(0,898)
(0,946)
(0,946)
(0,925)
Die Werte in Klammern wurden korrigiert, indem die Maximalwerte entsprechend des Wertes der
Positivkontrolle (5 µg/ml IPP) konstant gesetzt wurden. Statistische Auswertung: vgl. Anhang.
Das Bestimmtheitsmaß R2 ist ein Maß für die Güte der Anpassung der Kurve an die experimentell ermittelten
Daten.
87
In Tabelle 12 sind die EC50-Werte aufgeführt, die mittels CD25/γδ-Assay erhalten wurden.
Zusätzlich wurden auch korrigierte Werte – durch Konstansetzen des oberen Grenzwertes
ermittelt – angegeben. Besonders bei den mittelstark stimulatorischen N-BPs 40 und 42
ändern sich die Werte sehr stark durch diese Korrektur, da das Plateau der Kurve nicht durch
Messwerte definiert ist. Der γδ/CD3-Assay eignete sich weniger gut für die Titration der NBPs, da bei vielen Verbindungen keine Maximalwerte erhalten wurden (vgl. Abb. 27 B) und
damit eine Auswertung erschwert war.
1.4.3
Diskussion der ermittelten Aktivitäten
Die N-BPs 17 bis 33 (vgl. Abb. 25) sind Abkömmlinge von Pamidronat 2, d. h. es handelt
sich um 3-Amino-1-hydroxy-1,1-propylenbisphosphonate. Das Stickstoffatom trägt zusätzlich
einen (N-BP 17 – 22) bzw. zwei (N-BP 23 – 27) Substituenten oder liegt in einem
aliphatischen Ring (N-BP 28 – 33) gebunden vor. Die aktivste Verbindung aus dieser Reihe
war N-BP 23. Es handelt sich um ein tertiäres Amin, eine Seitenkette ist eine Methylgruppe,
der zweite Rest ist die stark lipophile 5-Phenylpentyl-Gruppe. Im Gegensatz dazu war
N-BP 17, das mit einem 4,4-Bis(4-fluorophenyl)butyl-Rest eine sehr sperrige Seitengruppe
besitzt, völlig inaktiv.
Wie die N-BPs 20 bis 22 zeigen, führte eine Carbonyl- bzw. Sulfonylgruppe in Nachbarschaft
zum Stickstoffatom zu nur schwach aktiven Verbindungen. Da Stickstoffatome in SäureamidBindungen verglichen mit Stickstoffatomen in Aminongruppen deutlich höhere pKB-Werte
aufweisen, deutet dies darauf hin, dass das Vorliegen des Stickstoffs in protonierter Form,
also das Vorkommen eines kationischen Zentrums im Molekül, von Bedeutung für eine hohe
Aktivität der N-BPs ist.
Die N-BPs 19 und 24 mit einer Etherbindung in β-Stellung zum Stickstoffatom zeigten im
Vergleich zu den Verbindungen 18 und 25, in denen ein Sauerstoffatom in gleicher Position
in einem Ring gebunden vorliegt (2,3-Dihydro-1-benzofuran bei N-BP 18 bzw. 2,3-Dihydro1,4-benzodioxin bei N-BP 25), eine verringerte Aktivität. Insbesondere N-BP 19 mit einer
polaren Hydroxylgruppe in der Seitenkette war nur schwach aktiv. N-BP 25 und 26
unterscheiden sich durch ein an den Benzolring gebundenes Chloratom; dies wirkte sich
praktisch nicht auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität der Substanzen aus. Verbindung 27
war ebenfalls sehr aktiv; hier liegt die Etherbindung in γ-Stellung zum Stickstoffatom vor.
Zudem ist der zweite Substituent am Stickstoff eine Propylgruppe.
Die untersuchten N-BPs, in denen ein zyklisches Amin vorliegt, zeigten meist mittelstarke bis
schwache Aktivität (vgl. Verbindungen 28, 30, 32, 33). Eine Ausnahme bildete das stark
aktive N-BP 31. Hier liegt im Unterschied zu N-BP 28 und 30 kein Piperidin- sondern ein
Pyrrol-Ring vor. Außerdem ist der lipophile Substituent eine Chlorphenylgruppe im
Gegensatz zur Phenyl- (N-BP 28) bzw. Methoxyphenylgruppe (N-BP 30). Das
Piperazinderivat 29 zeigte kaum Aktivität.
88
Das Vorhandensein einer Aminogruppe ist nicht unbedingt Voraussetzung für die Aktivität
von Bisphosphonaten gegenüber γδ-T-Zellen. Wie das Beispiel des sehr potenten Zoledronats
zeigte, kann das essentielle basische Stickstoffatom auch in einem heteroaromatischen
Ringsystem – in diesem Fall dem Imidazolring – gebunden sein (vgl. Kap. C1.3.1). Im
strukturisomeren Pyrazol ist die Basizität gegenüber Imidazol verringert. Damit
übereinstimmend war bei dem N-BP 34 (vgl. Abb. 26) mit einer Pyrazolylseitengruppe die
Aktivität im Vergleich zu Zoledronat stark verringert. Das ist wiederum ein Hinweis, dass ein
kationisches Zentrum im Molekül (protoniertes Stickstoffatom) wichtig für die γδ-T-Zellstimulierende Aktivität von Bisphosphonaten ist. Das Triazolylderivat 35 wies mittlere Stärke
auf. Die N-BPs 36 und 37 besitzen wie Zoledronat einen Imidazolring, allerdings ist die
Verknüpfungsstelle des Rings variiert. Das 2-Imidazolylderivat 36 war deutlich schwächer
aktiv während die 4-Imidazolylverbindung 37 mit einem EC50-Wert von 3,7 µmol/l im
Bereich von Zoledronat lag. Bei dieser Verbindung hat das basische Stickstoffatom die
gleiche Position in Relation zur Ringverknüpfungsstelle wie im Zoledronat.
Die Verbindungen 38 bis 46 sind Aminomethylenbisphosphonate mit Thiazol- bzw.
Thiadiazolsubstituenten. (1,3-Thiazol-2-ylamino)methylenbisphosphonat (N-BP 38) war ein
starker γδ-T-Zell-Stimulator. Eine Methylgruppe an Position 5 des Thiazolrings erhöhte die
Aktivität noch (N-BP 39). Dagegen führte ein Methylsubstituent an Position 4 zu einer
Schwächung der Wirksamkeit (N-BP 40). Die 5-Chlor-thiazolylverbindung 41 hatte etwa
dieselbe Stärke wie die unsubstituierte Ausgangsverbindung 38. Substituenten am Ring mit
großem Raumbedarf, wie die Isopropyl- (N-BP 42) und Phenylgruppe (N-BP 43), sowie eine
Butylgruppe am Aminostickstoff (N-BP 44), führten zu einem Aktivitätsverlust. Dies ist ein
Hinweis darauf, dass das γδ-T-Zell-stimulierende Potential von N-BPs auch an bestimmte
sterische Voraussetzungen gebunden ist. Das Thiadiazolderivat 45 besaß keine Aktivität
wogegen das Isomer 46 zu den mittelstarken N-BPs zählte.
Die Aminomethylenbisphosphonat-Derivate 38, 39 und 41 gehörten zu den aktivsten der
untersuchten Verbindungen. Aminomethylenbisphosphonat (N-BP 49) selbst dagegen war
inaktiv, die Dimethylamino-Verbindung 50 zeigte nur äußerst schwache Aktivität. Diese
Aktivitätsunterschiede könnten damit erklärt werden, dass N-BP 49 und 50 eine zu geringe
Molekülgröße für eine effektive γδ-T-Zell-Stimulation aufweisen. Allerdings besitzt
Pamidronat, das zu den starken γδ-T-Zell-Stimulatoren gehört, mit der 2-Aminoethyl-Gruppe
einen strukturisomeren Rest zur Seitenkette von N-BP 50. Eine weitere
Erklärungsmöglichkeit liegt in dem zusätzlichen Stickstoffatom, das durch den
Heteroaromaten ins Molekül eingeführt wird. Dies ist wie im Pamidronat über drei Bindungen
mit der Methylenbisphosphonat-Gruppe verknüpft. Allerdings ist dies auch bei der ImidazolVerbindung N-BP 36 der Fall; trotzdem zeigten die Verbindungen 36 und 38 einen
erheblichen Aktivitätsunterschied. Möglicherweise lassen sich die 2-AminoimidazolylVerbindungen leichter protonieren, da durch die amidin-artige Struktur eine Delokalisierung
der positiven Ladung im Molekül erfolgen kann (vgl. Abb. 31). Tatsächlich wurde für die
entsprechende 2-Aminopyridyl-Verbindung eine planare Konformation nachgewiesen, die auf
eine sp2-Hybridisierung des Amino-Stickstoffs hinweist (Szabo und Mitarbeiter, 2002).
H
H
+
N
O
OH
P
N
P
S
O
OH
OH
OH
H
H
O
N
OH
P
+
N
P
S
O
OH
H
N
H
+
O
N
OH
OH
OH
P
P
O
OH
89
H
N
H
O
N
P
OH
OH
OH
P
+
O
OH
OH
OH
Abb. 31: Mesomere Grenzstrukturen von 2-Amino-1,3-thiazolyl-methylenbisphosphonat und
2-Aminopyridyl-methylenbisphosphonat (protonierte Form).
Sanders und Mitarbeiter (2004) untersuchten unter anderem die γδ-T-Zell-stimulierende
Aktivität von 2-Aminopyridyl-methylenbisphosphonat (vgl. Abb. 31) und einiger seiner
Derivate und fanden dabei ähnliche Werte wie sie in dieser Arbeit für die 2-Amino-1,3thiazolyl-Verbindungen gemessen wurden. Die Ausgangsverbindung hat einen EC50-Wert von
7,4 µmol/l (N-BP 38: 8,0 µmol/l). Eine Methylgruppe an Position 3 des Benzolrings senkt den
EC50-Wert auf 4,3 µmol/l (N-BP 39: 4,4 µmol/l), an Position 6 und 4 führt sie zur Erhöhung
des EC50 auf 12 bzw. 13 µmol/l (N-BP 40: 30 µmol/l).
Auch die Amidin-Verbindungen 47 und 48 zeigten eine sehr starke Aktivität. Dies bestätigt,
dass neben Aminen und stickstoffhaltigen Heteroaromaten auch Amidin-Strukturen in der
Seitenkette von Bisphosphonaten zu wirksamen γδ-T-Zell-Stimulatoren führen können.
1.4.4
Vergleich der γδ-T-Zell-stimulierenden Wirkung von N-haltigen
Bisphosphonaten mit ihrem antiresorptiven Potential
Bisphosphonate werden vor allem als Medikamente gegen tumorinduzierte Hyperkalzämie
und Osteolyse eingesetzt. Die N-haltigen Bisphosphonate wirken dabei über die Hemmung
der Farnesylpyrophosphat-Synthase auf Osteoklasten ein (vgl. Kap. B3.1.1). Die Aktivität der
etablierten Bisphosphonate steigt in der Reihenfolge CLO, ETI (inaktiv) < PAM < IBA <
ZOL an (Dunford und Mitarbeiter, 2001). Vergleicht man die Fähigkeit dieser Substanzen,
γδ-T-Zellen zu stimulieren, ergibt sich interessanterweise genau die gleiche Abfolge: Die
Bisphosphonate Clodronat und Etidronat, die kein Stickstoffatom besitzen, sind gegenüber
γδ-T-Zellen inaktiv. Ibandronat mit einem tertiären Amin in der Seitenkette ist ein besserer
γδ-T-Zell-Stimulator als Pamidronat, dessen Seitenkette ein primäres Amin enthält
(Kunzmann und Mitarbeiter, 2000). Zoledronat mit seinem Imidazolyl-Substituenten
schließlich ist die aktivste Verbindung in dieser Reihe.
Für die oben untersuchten N-BPs sind leider keine Daten zur Hemmung der
Farnesylpyrophosphat-Synthase veröffentlicht. Allerdings sind Untersuchungen zum Einfluss
auf die Knochenresorption vorhanden. Wie Dunford (2000) zeigen konnte, korreliert die
Fähigkeit von N-BPs, die Knochenresorption zu hemmen, mit ihrer Fähigkeit zur Hemmung
der Farnesylpyrophosphat-Synthase.
90
Ein in-vivo-Modell zur Messung der Hemmung der Knochenresorption durch N-BPs ist die
Thyroidea-Parathyroidea-ektomierte (TPTX) Ratte, in der durch Vitamin-D3 eine vermehrte
Knochenresorption und damit auch eine Hyperkalzämie hervorgerufen wird (Green und
Mitarbeiter, 1994). Im Folgenden wird die Aktivität verschiedener N-BPs in diesem System
ihrer Wirkung auf γδ-T-Zellen gegenübergestellt. Dabei wurden N-BPs mit und ohne
Hydroxylgruppe am C1-Atom getrennt betrachtet. Diese Hydroxylgruppe kann als dritter
Ligand bei der Bindung an die Knochensubstanz wirken und so erheblich zur antiresorptiven
Potenz des N-BPs beitragen.
Bei den N-BPs ohne Hydroxylgruppe, zu denen Daten zur Hemmung der Knochenresorption
vorhanden sind, handelt es sich um die Thiazolverbindungen 38 bis 44, das Imidazol-Derivat
37, die Thiadiazolverbindung 46 und N-BP 48 mit einer Amidin-Gruppe im Molekül. Hier
ergab sich eine sehr gute Korrelation hinsichtlich der Wirksamkeit auf die Hemmung der
Knochenresorption und auf die Stimulation von γδ-T-Zellen (vgl. Tab. 13). Insbesondere ist
festzustellen, dass sich N-BPs mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen, wie die N-BPs
37, 39 und 48, in beiden Systemen in ihrer Stärke untereinander kaum unterscheiden.
Dagegen haben auch kleine Änderungen in der Molekülstruktur parallele Auswirkungen: Eine
Methylgruppe in Position 4 bzw. 5 des Imidazolrings (N-BP 40 bzw. 39) bewirkt im
Vergleich zur unsubstituierten Verbindung 38 eine Verringerung bzw. Erhöhung sowohl der
antiresorptiven Aktivität als auch der Aktivität gegen γδ-T-Zellen.
Tab. 13: N-BPs ohne Hydroxylgruppe:
Vergleich der antiresorptiven Potenz und der Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen.
N-BP
39
48
37
38
41
40
42
46
44
43
ED50
Ratte
[µg/kg]
1,5
1,7
2
5
20
100
200
400
900
inaktiv
Aktivität gegen
γδ-T-Zellen
++
++
++
++
++
+
+
+
(+)
-
EC50γδ [µmol/l]
4,3
2,2
3,7
8
14
57*
95*
Die antiresorptive Potenz (ED50Ratte [µg/kg]) wurde im TPTX-Assay gemessen (Widler und Mitarbeiter, 2002
und Green J.; persönliche Mitteilung); die Aktivität gegen γδ-T-Zellen wurde durch das Screening der N-BPs im
Aktivierungs- und Proliferationsassay (vgl. Kapitel C.1.4.1) und die Titration der stark aktiven Verbindungen
(vgl. Kapitel C1.4.2) bestimmt; ++stark aktive N-BPs; +mittelstark aktive N-BPs; (+)schwach aktive N-BPs;
inaktive N-BPs; EC50γδ [µmol/l] vgl. Tab. 1; *korrigierte Werte, vgl. Tab. 12.
In Tab. 14 sind die Aktivitäten der 1-Hydroxy-N-BPs einander gegenübergestellt. Vergleicht
man die Ergebnisse des TPTX-Assays mit dem γδ-T-Zell-Screening, so ergibt sich wieder
eine recht gute Übereinstimmung. Bei den EC50-Werten für die γδ-T-Zell-Aktivierung ist eine
Aussage schwierig zu treffen, da sich die gemessenen Werte für N-BP 25, 31, 18, 26 und 27
nicht signifikant unterscheiden (vgl. Anhang).
91
Tab. 14: 1-Hydroxy-N-BPs:
Vergleich der antiresorptiven Potenz und der Aktivität gegen γδ-T-Zellen.
N-BP
25
21
31
18
26
27
28
30
19
51
35
22
33
20
29
ED50
Ratte
[µg/kg]
1,8
2
3,5
5
9,3
10
11
25
40
150
600
> 600
800
> 1000
inaktiv
Aktivität gegen
γδ-T-Zellen
++
++
++
++
++
++
+
+
+
+
+
(+)
+
(+)
(+)/-
EC50γδ[µmol/l]
24
5,2
18
19
27
16
Legende: vgl. Tab. 13.
1.4.5
Zusammenfassung
Von den im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Verbindungen mit einer oder zwei
Phosphonat-Gruppen zeigten alleine die Stickstoff enthaltenden geminalen Bisphosphonate
(N-BPs) γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität.27 Auch in der Literatur ist keine Stimulation von
γδ-T-Zellen durch andere Phosphonate als N-BPs beschrieben. Das weist darauf hin, dass das
gleichzeitige Vorhandensein einer Methylenbisphosphonat-Gruppe und eines Stickstoffatoms
die strukturellen Voraussetzungen für diese Substanzgruppe bilden, um als γδ-T-ZellStimulatoren zu wirken. Die Möglichkeit, eine positive Ladung in der Seitenkette zu tragen
(durch Protonierung des Stickstoffatoms) scheint für die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität der
N-BPs eine wichtige Rolle zu spielen. Auch die Position des Stickstoffatoms im Molekül, die
Molekülgröße sowie die Art und Position von Seitenketten haben offensichtlich Einfluss auf
die Wirksamkeit von N-BPs als γδ-T-Zell-Stimulatoren. Die gewonnenen Daten reichen
allerdings nicht aus, um die sterischen Anforderungen an γδ-T-Zell-stimulierende N-BPs
abzuleiten.
27
Mit Ausnahme der schwach aktiven Verbindung N-BP 52 (vgl. Abb. 28), bei der eine Phosphonat-Gruppe
durch eine Carboxylgruppe ersetzt ist.
92
Interessanterweise scheint die antiresorptive Potenz der untersuchten N-BPs mit ihrer
Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen weitgehend parallel zu gehen. Die auftretenden Unterschiede
sind angesichts der völlig verschiedenen Untersuchungsmethoden (TPTX-Assay und γδ-TZell-Aktivierungsassay) eher gering. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass
N-BPs nicht, wie für Phosphoantigene angenommen, direkt als γδ-T-Zell-Liganden wirken,
sondern dass die Stimulation von Vγ9Vδ2-T-Zellen genauso wie die antiresorptive Wirkung
auf der Eigenschaft der N-BPs beruht, die Farnesylpyrophosphat-Synthase zu hemmen (vgl.
auch Kap. C1.5.1).
In einem aktuellen Artikel veröffentlichen Sanders und Mitarbeiter (2004) Ergebnisse, die gut
mit unseren Schlussfolgerungen übereinstimmen. Sie untersuchten die γδ-T-Zellstimulierende Aktivität von 48 verschiedenen Bisphosphonaten mittels Messung der TNF-αProduktion von γδ-T-Zellklonen und führten auf Grundlage dieser Daten Modellrechnungen
zur Vorhersage der γδ-T-Zell-stimulierenden Kapazität von Bisphosphonaten durch. Die
experimentellen Ergebnisse weisen eine starke Korrelation mit den berechneten Werten auf.
Nach dem Modell ist das Vorhandensein von zwei negativ ionisierbarer Gruppen (die
Phosphonat-Gruppen), einer hydrophobe Gruppe sowie eines positiv geladenen Zentrums
(protoniertes Stickstoffatom) entscheidend für die Aktivität gegenüber γδ-T-Lymphozyten
und schon kleine Änderungen in der Struktur der Seitenkette können einen großen Einfluss
auf die stimulatorische Kapazität haben.
Eine ähnliche Studie wurde schon früher für die Aktivierung von γδ-T-Zellen durch
Phosphoantigene durchgeführt (Gossmann und Mitarbeiter, 2002). Allerdings unterscheidet
sich das gefundene Modell von dem für die Stimulation durch Bisphosphonate: statt einer
positiven Gruppe wird ein Wasserstoffbrücken-Donor gefordert. Das spricht dafür, dass
Phosphoantigene und N-BPs unterschiedliche Angriffspunkte bei der Aktivierung von γδ-TLymphozyten haben (Sanders, 2004). Im Gegensatz dazu sind sich die Modelle für die
Stimulation von γδ-T-Zellen und die Inhibierung von Farnesylpyrophosphat-Synthase durch
Bisphosphonate sehr ähnlich (Dunford, 2001). Außerdem finden Sanders und Mitarbeiter
(2004) eine gute Korrelation zwischen den experimentell ermittelten Werten für die
Hemmung der FPPS und die Aktivierung von γδ-T-Zellen durch die von ihnen untersuchten
Bisphosphonate. Dies deutet wie unsere Daten darauf hin, dass N-BPs γδ-T-Zellen indirekt
durch die Inhibierung der FPPS stimulieren könnten.
Sollte dies der Fall sein, so könnte entweder die Hemmung der FPPS der γδ-T-Zellen selbst
oder die Inhibierung der FPPS von „Bystander“-Zellen ausschlaggebend sein. Um den
Mechanismus der Aktivierung von Vγ9Vδ2-T-Lymphozyten durch N-BPs näher zu
untersuchen, wurden Versuche zur Rolle von „präsentierenden28“ Zellen durchgeführt.
1. Stimulation von γδ-T-Zellen durch N-haltige Bisphosphonate
1.5
93
Präsentation28 von N-haltigen Bisphosphonaten
Die ersten Verbindungen, die als Liganden für Vγ9Vδ2-T-Zellen charakterisiert wurden,
waren die Phosphoantigene. Bei Untersuchungen zur Identifizierung präsentierender
Elemente für diese Verbindungen fand man, dass im Gegensatz zu den klassischen T-ZellAntigenen keine antigen-präsentierenden Zellen für die Aktivierung von γδ-T-Lymphozyten
durch Phosphoantigene nötig waren. Im Gegensatz dazu beschreiben Miyagawa und
Mitarbeiter (2001), dass Pamidronat γδ-T-Zellen nur in Gegenwart von monozytären Zellen
stimuliert und dass die myelomonozytäre Zelllinie THP-1 durch Inkubation mit Pamidronat
γδ-T-Zell-aktivierendes Potential erlangt. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden
Versuche zur Präsentation Zoledronat als Modell-Bisphosphonat durchgeführt.
1.5.1
1.5.1.1
Versuche zur Präsentation von Zoledronat
Präsentation von Zoledronat durch THP-1 Zellen
Die Gruppe von Miyagawa zeigte, dass für ein „Pulsen“ von THP-1 Zellen mit Pamidronat
wesentlich höhere Konzentrationen nötig sind, als für die direkte Stimulation von γδ-TZellen. THP-1 Zellen, die mit 100 µmol/l und 1 mmol/l Pamidronat vorinkubiert wurden,
konnten in ihren Versuchen γδ-T-Zellen zur Produktion von INF-γ anregen (Miyagawa und
Mitarbeiter, 2001). In den eigenen Experimenten wurden THP-1 Zellen mit 100 µmol/l
Pamidronat oder 100 µmol/l Zoledronat versetzt. Als Inkubationszeit wurden vier Stunden
gewählt, da Vorversuche gezeigt hatten, dass diese Kontaktzeit für eine direkten Stimulation
von γδ-T-Zellen ausreichte. Danach wurden die THP-1 Zellen dreimal gewaschen und
anschließend im Verhältnis 1 : 2 mit PBL gemischt. Nach weiteren 24 bzw. 48 Stunden
Kultur wurde der Anteil an aktivierten γδ-T-Lymphozyten durchflusszytometrisch bestimmt.
Während unbehandelte THP-1 Zellen keine Aktivierung bewirkten, stieg der Anteil an CD69bzw. CD25-positiven γδ-T-Zellen in Gegenwart der mit Bisphosphonaten vorinkubierten
monozytären Zellen deutlich an. Die Ergebnisse von zwei typischen Experimenten sind in
Tabelle 15 zusammengefasst.
Tab. 15: Aktivierung und Proliferation von γδ-T-Zellen durch mit 100 µmol/l Zoledronat
oder Pamidronat vorbehandelte THP-1 Zellen.
CD69+ [% pan-γδ+]
Mittelwert ± s (n = 2)
Zoledronat
75,6 ± 6,22*
Pamidronat
n.d.
Negativkontrolle 31,9 ± 5,52
CD25+ [% pan-γδ+]
55,0 ± 4,94**
55,7 ± 5,26**
4,7 ± 1,82
pan-γδ+ [% CD3+]
69,9 ± 1,26***
n. d.
9,0 ± 3,03
Die Werte für Zoledronat und Pamidronat unterscheiden sich signifikant von denen der Negativkontrolle (KoKultur unbehandelter THP-1 Zellen und PBL); *P < 0,05; **P < 0,01; ***P <0,001 (t-Test bzw. ANOVA).
28
In Anlehnung zur klassischen Antigenpräsentation wird im Folgenden von „Präsentation“ und
„präsentierenden Zellen“ gesprochen, obwohl die Zell-vermittelte Stimulation von Vγ9Vδ2-T –Zellen auf
anderen Mechanismen beruhen kann.
94
Normalerweise ließ sich die Proliferation von γδ-T-Lymphozyten in Gegenwart
teilungsfähiger Tumorzellen nicht beobachten, da diese sich sehr schnell vermehren und
andere Zellen „überwuchern“. Mischte man allerdings THP-1 Zellen, die mit 100 µmol/l
Zoledronat vorbehandelte worden waren, mit PBL so ließ sich nach sieben Tagen Ko-Kultur
das Auswachsen von Vγ9Vδ2-T-Zellen durch FACS-Analyse nachweisen (vgl. Tab. 15). Das
kann damit erklärt werden, dass THP-1 Zellen eine relativ geringe Teilungsrate haben und
ihre Proliferation zusätzlich durch 100 µmol/l Zoledronat stark gehemmt wurde.
1.5.1.2
Einfluss von Inkubationsdauer, Bisphospohonat-Konzentration und Zellzahl
Um zu prüfen, wie lange der Kontakt zwischen Zoledronat und THP-1 Zellen für ein „Pulsen“
der präsentierenden Zellen mit dem Bisphosphonat sein muss, wurden THP-1 Zellen mit
100 µmol/l Zoledronat inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde ein Teil der
Zellsuspension entnommen, gewaschen und in bisphosphonatfreiem Medium aufgenommen.
Dann wurden die THP-1 Zellen mit PBL vermischt und nach zwei Tagen Kultur die CD25Expression auf den γδ-T-Zellen bestimmt. Schon eine Inkubationszeit von 15 Minuten reichte
für eine sehr schwache γδ-T-Zell-Aktivierung aus, nach 30 Minuten induzierten die THP-1
Zellen eine mittelstarke γδ-T-Zell-Antwort. Bei Stimulation durch THP-1 Zellen, die über
vier Stunden mit 100 µmol/l Zoledronat inkubiert wurden, waren in manchen Experimenten
über 60 % der γδ-T-Zellen CD25-positiv. Eine längere Inkubationsdauer brachte keine
weitere Steigerung (vgl. Abb. 32).
*
70
60
CD25+ [% pan-γδ+]
4,5 h
4,5 h
ns
100 µmol/l
4,5 h
18 h
50
30 min
40
1:5
30
20
*
10
0 min
ns
15 min
0 min
0 min
***
ns
1 : 10
Negativk.
10 µmol/l
0 µmol/l
0
Inkubationsdauer 1 Inkubationsdauer 2 Inkubationsdauer 3 ZOL-Konzentration
THP-1/PBL
Verhältnis
Abb. 32: Stimulation von γδ-T-Zellen durch mit Zoledronat (ZOL) behandelte THP-1 Zellen:
Einfluss von Inkubationsdauer, Zoledronat-Konzentration und Zellzahl.
Wenn nichts anderes angegeben ist, betrug die Inkubationsdauer 4,5 h, die ZoledronatKonzentration war 100 µmol/l und das THP-1/PBL-Verhältnis war 1 zu 2.
Dargestellt sind die Mittelwerte von Doppel- (Versuche Inkubationsdauer 2 und 3 und ZOLKonzentration), Dreifach- (Versuch Inkubationsdauer 1) bzw. Vierfach-Bestimmungen (Versuch
THP-1/PBL-Verhältnis) ± Standardfehler sowie Ergebnisse von t-Tests: ns = kein signifikanter
Unterschied; *P < 0,05; ***P < 0,001.
Inkubierte man THP-1 Zellen mit geringeren Zoledronat-Konzentrationen (10 µmol/l,
1 µmol/l), so kam es nicht zu einer Aktivierung von γδ-T-Lymphozyten (vgl. Abb. 32). Auch
längere Inkubationszeiten (> 12 Stunden) hatten keinen Effekt.
95
Die Stärke der γδ-T-Zell-Antwort wurde auch durch die Anzahl der THP-1 Zellen beeinflusst.
Am günstigsten erwies sich ein Verhältnis von 1 : 2 THP-1 zu PBL (das entspricht etwa
einem THP-1 zu γδ Verhältnis von 10 : 1); eine Aktivierung der γδ-T-Lymphozyten ließ sich
auch noch bei einem THP-1 zu PBL Verhältnis von 1 : 5 nachweisen (vgl. Abb. 32).
1.5.1.3
Präsentation von Zoledronat durch unterschiedliche Zelllinien
Um die mit den THP-1 Zellen gewonnenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden mit einer
weiteren monozytären Zelllinie – U937 – entsprechende Präsentationsversuche durchgeführt.
Allerdings bewirkten mit 100 µmol/l Zoledronat vorinkubierte U937 Zellen keine Aktivierung
von γδ-T-Zellen. Allerdings induzierten mit PMA (Phorbolmyristatacetat; führt zur
Ausdifferenzierung von Zellen) behandelte U937 Zellen nach vierstündiger Inkubation mit
100 µmol/l Zoledronat die CD25-Expression auf γδ-T-Zellen. Aber auch die erythroide
Zelllinie K562 und die B-Zelllinie U266 konnten den γδ-T-Zellen Zoledronat präsentieren
(vgl. Tab. 16). Das zeigt, dass nicht alleine monozytäre Zellen die Fähigkeit zur Präsentation
von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten besitzen.
Tab. 16: Aktivierung von γδ-T-Zellen durch mit 100 µmol/l Zoledronat vorbehandelte Zellen.
Zoledronat
100 µmol/l
0 µmol/l
U937
U937 PMA
K562
U226
+
+
+
+
+
CD25 [% pan-γδ ] CD25 [% pan-γδ ] CD25 [% pan-γδ+] CD69 [% pan-γδ+]
16,1 ± 1,5
37,5 ± 0,8*
45,5 ± 8,6*
64,5 ± 3,5*
13,1 ± 3,2
21,7 ± 2,5
16,0 ± 2,8
38,5 ± 2,1
+
Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardabweichung von Doppelbestimmungen. *P < 0,05, Wert
unterscheidet sich signifikant von der zugehörigen Negativkontrolle (Ko-Kultur von unbehandelten Zellen mit
PBL) (t-Test).
1.5.1.4
Präsentation von Zoledronat durch PBL
Um zu prüfen, ob auch Zellen, die in der PBL-Population enthalten sind, den
γδ-T-Lymphozyten
Zoledronat
präsentieren
können,
wurden
ähnliche
Vorinkubationsversuche durchgeführt wie auch mit den Zelllinien (vgl. oben). Allerdings tritt
hierbei eine Schwierigkeit auf: Durch den direkten Kontakt mit Zoledronat werden in den
vorinkubierten PBL (PBLinku) die γδ-T-Zellen aktiviert (vgl. Abb. 34 A, PBLinku alleine).
Um eine Antwort der γδ-T-Zellen der unbehandelten PBL (PBLunbeh) zu erkennen, wurden
zwei verschiedene Methoden angewandt. Zum einen wurden Kontrollen mitgeführt, bei denen
die vorinkubierten PBL und die unbehandelten PBL erst kurz vor der
durchflusszytometrischen Analyse29 gemischt wurden. Wenn nur die γδ-T-Zellen stimuliert
werden, die direkten Kontakt mit Zoledronat hatten, dann ist zu erwarten, dass sich bei
Versuch und Kontrolle die gleichen Werte ergeben. Werden zusätzlich auch die γδ-TLymphozyten der unbehandelten PBL aktiviert, dann wird der Anteil CD25-positiver
γδ-T-Zellen im Versuch höher sein als in der Kontrolle (vgl. Abb. 33).
29
Hierbei eignen sich nur die Aktivierungsassays, da die Gesamtzahl der γδ-T-Zellen konstant bleibt.
96
65 %
a
Zoledronat
b
Versuch
PBLinku
45 %
Kontrolle
CD25
PBL
γδ
PBLunbeh
Vorinkubation
Waschen
Inkubation 2 d
FACS-Analyse
Abb. 33: Nachweis der Präsentation von Zoledronat durch PBL; schematische Darstellung.
Versuch: PBL werden mit Zoledronat vorinkubiert (PBLinku), gewaschen und mit unbehandelten
PBL (PBLunbeh) ko-inkubiert; nach zwei Tagen wird der Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt.
Kontrolle: PBL werden mit Zoledronat vorinkubiert (PBLinku), gewaschen und wieder in Kultur
genommen; nach zwei Tagen werden sie mit unbehandelten PBL (PBLunbeh) gemischt und sofort der
Anteil der CD25-positiven γδ-T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt.
Möglichkeit a: Der Anteil CD25-positiver γδ-T-Zellen ist im Versuchsansatz höher als im
Kontrollansatz. D. h. auch γδ-T-Zellen, die keinen direkten Kontakt zu Zoledronat
hatten, werden aktiviert. Eine Präsentation von ZOL findet statt.
Möglichkeit b: Der Anteil CD25-positiver γδ-T-Zellen ist im Versuchs- und Kontrollansatz gleich
hoch. D. h. nur γδ-T-Zellen, die direkten Kontakt zu Zoledronat hatten, werden
aktiviert. Eine Präsentation von ZOL findet nicht statt.
Zum anderen wurden für die Vorinkubation PBL verwendet, aus denen die γδ-TLymphozyten durch positive Selektion entfernt worden waren (PBL–γδ). Damit stammten
alle γδ-T-Lymphozyten im Versuchsansatz aus den unbehandelten PBL, die Auswertung
erfolgte wie bei den Standard CD25/γδ- bzw. γδ/CD3-Assays (vgl. Kap. C1.1.3.1 und
C1.1.3.2).
Mit beiden Methoden ließ sich nachweisen, dass mit Zoledronat vorbehandelte PBL
γδ-T-Zellen stimulieren können (vgl. Abb. 34). Im Gegensatz zu den THP-1 Zellen reichte
schon eine Zoledronat-Konzentration von 10 µmol/l aus, um die PBL nach vierstündiger
Inkubation stimulierend für Vγ9Vδ2-T-Zellen zu machen.
CD25+ [% pan-γδ+]
A
97
***
70
***
60
50
ns
40
Versuch
Kontrolle
PBL(inku) alleine
30
20
10
0
ZOL100 µmol/l
pan-γδ+ [% CD3+]
B
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ZOL10 µmol/l
IPP 20 µmol/l
PBL-γδ (gew)
PBL-γδ (nicht gew)
*
ns
ns
ZOL100 µmol/l
ZOL10 µmol/l
IPP 20 µmol/l
ns
BrHPP 10 µmol/l Negativkontrolle
Abb. 34: Präsentation von Zoledronat (ZOL), IPP und BrHPP durch PBL.
A: Aktivierung; Vorinkubation der Gesamt-PBL, Schema vgl. Abb. 30.
Versuch: PBL werden direkt nach Vorinkubation und Waschen (PBLinku) mit unbehandelten
PBL (PBLunbeh) gemischt. Kontrolle: PBLinku werden erst unmittelbar vor der FACS-Analyse
mit PBLunbeh gemischt. PBL(inku) alleine: PBLinku werden nicht mit PBLunbeh gemischt.
Dargestellt sind Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler; ***Wert von Versuch
und Kontrolle unterscheiden sich signifikant, P < 0,001; ns: nicht signifikant (ANOVA).
B: Proliferation; Vorinkubation von PBL, aus denen γδ-T-Zellen mittels
magnetischer Separation entfernt wurden (PBL–γδ).
PBL–γδ (gew): PBL–γδ werden nach Vorinkubation gewaschen und mit unbehandelten PBL
gemischt. PBL–γδ (nicht gew): Als Positivkontrolle dienen PBL–γδ, die nach Vorinkubation
ungewaschen mit unbehandelten PBL gemischt werden.
Dargestellt sind Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler; *Wert von Versuch
und Negativkontrolle unterscheiden sich signifikant, P < 0,05; ns: nicht signifikant (ANOVA).
1.5.1.5
Präsentation von Phosphoantigenen
Frühere Untersuchungen zur Präsentation von Antigenen hatten ergeben, dass
Phosphoantigene direkten Kontakt zu γδ-T-Zellen haben müssen, um diese zu aktivieren. Ein
„Pulsen“ antigenpräsentierender Zellen war nicht möglich (Morita und Mitarbeiter, 1995). In
einer neueren Arbeit zeigen Kato und Mitarbeiter dagegen, dass Tumorzellen, die mit
1 mmol/l Ethylpyrophosphat behandelt wurden, γδ-T-Zell-stimulierendes Potential aufweisen
können (Kato und Mitarbeiter, 2001). Daher untersuchten wir, ob in unserem System
Phosphoantigene präsentiert werden können. IPP oder Bromhydrinpyrophosphat30 (BrHPP)
wurde in verschiedenen Konzentrationen mit PBL, PBL–γδ oder THP-1 Zellen inkubiert und
die gewaschenen Zellen auf ihre Fähigkeit getestet, die Expression von Aktivierungsmarkern
oder die Proliferation von Vγ9Vδ2-T-Zellen zu induzieren. In keinem der durchgeführten
Experimente war eine Stimulation von γδ-T-Zellen nachweisbar.
30
4-Brom-3-methyl-3-hydroxybutylpyrophosphat
98
In Abb. 34 sind zwei typische Ergebnisse dargestellt. Die höchste IPP-Konzentration, die zum
Einsatz kam, war 40 µmol/l. Da IPP im selben Konzentrationsbereich wie Zoledronat
wirksam ist, wäre zu erwarten, dass damit zumindest die empfindlicheren PBL „gepulst“
werden können. Weil möglicherweise Phosphoantigene weniger effektiv präsentiert werden
als N-BPs, wurde das ca. zwei Zehnerpotenzen aktivere synthetische Phosphoantigen BrHPP
(EC50 ≈ 20 nmol/l; eigene Versuche) eingesetzt, aber auch mit 10 µmol/l BrHPP vorinkubierte
PBL zeigten keine γδ-T-Zell-stimulatorische Aktivität.
1.5.1.6
Zusammenfassung
Unsere Experimente zeigten, dass verschiedene Zelllinien und auch PBL Zoledronat
präsentieren und in nicht voraktivierten Vγ9Vδ2-T-Zellen die Expression von
Aktivierungsmarkern und Proliferation induzieren. Phosphoantigene dagegen wurden nicht
oder nur wenig effektiv präsentiert. Das bestätigt und erweitert die Ergebnisse ähnlicher
Untersuchungen mit Pamidronat (Kato und Mitarbeiter, 2001; Miyagawa und Mitarbeiter,
2001). Für diese Befunde gibt es im Prinzip zwei Erklärungen:
1. Stickstoffhaltige Bisphosphonate und Phosphoantigene binden an Zelloberflächen –
entweder unspezifisch oder an unbekannte präsentierende Moleküle – und werden so
von γδ-T-Zellen erkannt. Dabei ist die Bindung der Bisphosphonate entweder stabiler
(eventuell begünstigt durch die basische Stickstofffunktion im Molekül), oder aber
Phosphoantigene werden an der Zelloberfläche rasch dephosphoryliert und verlieren
dadurch ihre Antigenität.
2. Der Mechanismus der Antigenerkennung von N-haltigen Bisphosphonaten und
Phosphoantigenen ist unterschiedlich. Bisphosphonate werden von präsentierenden
Zellen aufgenommen und bewirken dadurch Veränderungen an der Zelloberfläche
oder die Freisetzung löslicher Mediatoren, was wiederum zu einer Aktivierung von
γδ-T-Zellen führt. Phosphoantigene dagegen werden direkt erkannt. Für
unterschiedliche Erkennungsmechanismen spricht die Beobachtung, dass
Phosphoantigene γδ-T-Lymphozyten in Abwesenheit von Bystander-Zellen aktivieren
können, während N-BPs gegenüber reinen γδ-T-Zelllinien inaktiv sind (Miyagawa und
Mitarbeiter, 2001).
1.5.2
1.5.2.1
99
Versuche zum Mechanismus der Antigenpräsentation
Ko-Kultur
Um zu prüfen, ob für die Stimulation von γδ-T-Lymphozyten durch Zoledronat-gepulste
Zellen direkter Zellkontakt nötig ist, wurden Experimente im Zweikammer-Kultursystem
durchgeführt. Dabei sind verschiedene Zellpopulationen durch eine Membran getrennt, die für
gelöste Substanzen durchlässig ist. Es wurden THP-1 Zellen mit 100 µmol/l Zoledronat und
PBL mit 10 µmol/l Zoledronat behandelt. Brachte man diese Zellen in direkten Kontakt mit
unbehandelten PBL, so führte das zu einer Aktivierung von γδ-T-Zellen. Waren die Zellen
jedoch räumlich getrennt, so war keine Aktivierung zu beobachten. Damit war auch
ausgeschlossen, dass ungenügendes Waschen der präsentierenden Zellen der Grund für ihr
stimulatorisches Potential war.
Nachdem so gezeigt war, dass Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und γδ-T-Zellen
Voraussetzung für deren Aktivierung ist, sollte überprüft werden, ob dazu intakte Zellen
notwendig sind. Dafür wurden PBL vier und 15 Stunden mit 100 µmol/l Zoledronat inkubiert,
gewaschen und auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt. Mit einem Aliquot der
Zellsuspension wurden unbehandelte PBL stimuliert, der Rest der Zellen wurde mit Hilfe
einer Ultraschallsonde aufgebrochen und die resultierende Suspension aus Zellbestandteilen
ebenfalls mit PBL in Kontakt gebracht. Die unverletzten Zellen konnten wie erwartet
γδ-T-Zellen aktivieren, dagegen waren die nicht intakten Zellen inaktiv. Das zeigte
gleichzeitig, dass auch nach Einwirkung eines N-haltigen Bisphosphonats die Konzentration
an Phosphoantigenen (IPP, DMAPP, GPP, FPP) nicht für eine γδ-T-Zell-Aktivierung
ausreicht.
1.5.2.2
Einfluss von Isoprenoidalkoholen und von alkalischer Phosphatase
Falls N-BPs γδ-T-Zellen über einen intrazellulären Mechanismus stimulieren, ist die
Isoprenoidbiosynthese ein möglicher Angriffspunkt. Dies würde auch gut erklären, warum
das γδ-T-Zell-stimulierende Potential vieler N-BPs mit ihrer Fähigkeit, die Knochenresorption
zu hemmen, korreliert (vgl. Kap. C1.4.4). Es wurde schon gezeigt, dass Farnesol und
Geranylgeraniol keinen Einfluss auf die Aktivierung von γδ-T-Zellen durch direkt
zugegebenes Zoledronat haben (vgl. C1.3.4). Hier wurde nun ihre Wirkung auf die
Präsentation von Zoledronat durch THP-1 Zellen untersucht. Dafür wurden THP-1 Zellen mit
100 µmol/l Farnesol bzw. Geranylgeraniol und gleichzeitig mit 100 µmol/l Zoledronat
inkubiert. Nach vierstündiger Inkubation wurde ein Teil der Zellen entnommen, gewaschen
und wieder in Kultur genommen. Dabei wurde jeweils der Hälfte der Zellen 100 µmol/l
Farnesol bzw. Geranylgeraniol zugesetzt (vgl. Abb. 35, THP-1 ZOL 4 h + FOH/GGOH 20 h),
die andere Hälfte wurde ohne Zusatz eines Isoprenoidalkohols weiter kultiviert (vgl. Abb. 35,
THP-1 ZOL + FOH/GGOH 4 h).
100
Die restlichen THP-1 Zellen wurden nach 20 Stunden gewaschen (vgl. Abb. 35, THP-1 ZOL
+ FOH/GGOH 20 h); danach wurden sofort alle THP-1 Zellen mit PBL gemischt und 24
Stunden später der Anteil der CD69-positiven γδ-T-Zellen gemessen. Alle mit Zoledronat
vorinkubierten THP-1 Zellen stimulierten im Gegensatz zu den Negativkontrollen (vgl. Abb.
35, THP-1 FOH/GGOH 20 h) γδ-T-Zellen. Es ergaben sich keine Unterschiede zwischen den
verschiedenen behandelten THP-1 Zellen und auch nicht zu Kontrollen, die alleine in
Gegenwart von Zoledronat inkubiert wurden. Dieses Ergebnis ist ein starker Hinweis darauf,
dass
nicht
eine
beeinträchtigte
Synthese
von
oder
Geranylgeranylpyrophosphat für das γδ-T-Zell-stimulierende Potential Zoledronatbehandelter Zellen verantwortlich ist.
80
kein Isoprenoidalkohol
FOH
GGOH
+
+
CD69 [% pan-γδ ]
70
60
50
40
30
20
10
0
THP-1 ZOL +
FOH/GGOH 4h
THP-1 ZOL 4h +
FOH/GGOH 20 h
THP-1 ZOL +
FOH/GOOH 20 h
THP-1 FOH/GGOH
20 h
Abb. 35: Einfluss von Farnesol (FOH) und Geranylgeraniol (GGOH) auf die Stimulation von
γδ-T-Zellen durch mit Zoledronat (ZOL) behandelte THP-1 Zellen.
Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler. Die Ergebnisse für die Stimulation von γδT-Zellen durch THP-1 Zellen, die mit Zoledronat alleine oder gleichzeitig mit Farnesol oder
Geranylgeraniol vorinkubiert wurden, unterscheiden sich signifikant von den zugehörigen
Negativkontrollen (P < 0,001) aber nicht untereinander (ANOVA).
Eine Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase könnte jedoch auch zu einer
Akkumulation von Vorläufern führen, zu denen auch die Phosphoantigene IPP, DMAPP und
GPP gehören. Allerdings ist es sehr unwahrscheinlich, dass diese Isoprenoide freigesetzt
würden und so zur Aktivierung von γδ-T-Lymphozyten führten (vgl. auch Kap. B.1.5.2.1). Es
ist aber nicht auszuschließen, dass Phosphoantigene aus dem Zellinnern auf der Oberfläche
präsentiert werden. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurden IPP und Zoledronat mit PBL in
Gegenwart von alkalischer Phosphatase (AP) inkubiert. Während die stimulierende Aktivität
von IPP in Gegenwart der Phosphatase erwartungsgemäß aufgehoben wurde, zeigte sie auf
Zoledronat keine Wirkung (vgl. Abb. 36). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die AP
durch die Gegenwart von Zoledronat inhibiert wird, wurden in einem weiteren Experiment
PBL über Nacht mit 100 µmol/l Zoledronat inkubiert und erst nach gründlichem Waschen mit
dem Enzym versetzt. Auch hier war keine Einschränkung der Aktivität gegenüber γδ-TLymphozyten zu beobachten. Dieses Ergebnis demonstriert, dass Phosphoantigene bei der
Zoledronat-vermittelten γδ-T-Zell-Aktivierung vermutlich keine Rolle spielen. Allerdings
kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass aktivierende Phosphoantigene, z. B.
durch Bindung an ein präsentierendes Molekül, vor einem Angriff der alkalischen
Phosphatase geschützt werden.
***
ns
60
ohne AP
mit AP
***
50
CD25+ [% pan-γδ+]
101
40
ns
30
20
10
0
IPP 20 µmol/l
IPP 2 µmol/l
ZOL 40 µmol/l
ZOL 4 µmol/l
Abb. 36: Stimulation von γδ-T-Zellen durch IPP und Zoledronat (ZOL) in Abwesenheit
Gegenwart von alkalischer Phosphatase (AP).
Mittelwert von Doppelbestimmungen ± Standardfehler. ***Signifikanter Unterschied der
Ergebnisse (P < 0,001); ns: nicht signifikant (ANOVA).
1.5.2.3
Saponin
Um der Frage nachzugehen, ob zur Präsentation von Zoledronat intrazelluläre Vorgänge
beitragen, wurde ein Weg gesucht, die Konzentration des Bisphosphonats in den Zellen zu
erhöhen. Es wurde schließlich versucht, durch Verwendung von Saponin die Durchlässigkeit
der Zellmembran zu steigern. Saponin ist ein Gemisch von Triterpen-Glykosiden, das aus der
Rinde von Quillaja saponaria gewonnen wird. Saponin hat eine hohe Affinität zu Cholesterin
und lagert sich daher in biologische Membranen ein, wodurch es zur Porenbildung kommt. Im
Unterschied zu anderen Detergenzien ist die Permeabilisierung durch Saponin reversibel,
solange die Zellen nicht zu lange zu hohen Konzentrationen ausgesetzt werden.
THP-1 Zellen wurden in Gegenwart von 0,01 – 0,001 % Saponin für 30 Minuten bei 4 °C mit
verschiedenen Zoledronat- und IPP-Konzentrationen inkubiert. Danach wurden die Zellen
gewaschen, in Medium aufgenommen und mit PBL in Kontakt gebracht. Nach zwei bzw.
sieben Tagen wurde die Aktivierung oder Proliferation der γδ-T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt. Zu hohe Saponin-Konzentrationen zerstörten die THP-1
Zellen, daher kam es nicht zu einer Stimulation von γδ-T-Zellen (vgl. Abb. 37 A, 0,01 %
Saponin), zu niedrige Saponin-Konzentrationen hatten keine Wirkung (vgl. Abb. 37 A,
0,001% Saponin). In Gegenwart von 0,0025 – 0,005 % Saponin wurden THP-1 Zellen aber
durch niedrigere Zoledronat-Konzentrationen (10 µmol/l) und durch kürzere
Inkubationszeiten (30 min) stimulierend für γδ-T-Lymphozyten als ohne Zugabe eines
Detergens (vgl. Abb. 37 und Kap. B.1.5.1.2). Um auszuschließen, dass freies Zoledronat für
die beobachtete Aktivierung der γδ-T-Zellen verantwortlich ist, wurden mit 10 µmol/l
Zoledronat und 0,0025 % Saponin behandelten THP-1 Zellen nach dem Waschen für vier
Stunden in 10 %igem AB-Medium inkubiert. Nach Abzentrifugieren der Zellen wurden PBL
in diesem Überstand aufgenommen. Dadurch kam es nicht zu einer γδ-T-Zell-Stimulation
(vgl. Abb. 37 B), d. h. auch hier scheinen lösliche Faktoren keine Rolle zu spielen. Mit IPP
ließ sich auch durch Saponin-Zusatz keine Wirkung erzielen.
102
B
A
**
50
Zoledronat 10 µmol/l - Überstand
+
CD25 [% pan-γδ ]
40
30
20
10
40
30
+
+
+
CD25 [% pan-γδ ]
60
**
50
ns
ns
0
20
10
ns
ns
0
THP-1
0,01 %
Saponin
THP-1
0,005 %
Saponin
THP-1
0,001 %
Saponin
THP-1
THP-1
0,0025 % Saponin
THP-1
Abb. 37: Präsentation von Zoledronat durch mit Saponin behandelte THP-1 Zellen.
A: Einfluss der Saponin-Konzentration.
Zoledronat-Konzentration: 10 µmol/l; Inkubationsdauer: 30 min.
Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardfehler. **P < 0,01: Wert unterscheidet sich
signifikant von der Negativkontrolle (THP-1: Inkubation von THP-1 Zellen mit 10 µmol
Zoledronat ohne Saponin); ns: nicht signifikant (ANOVA).
B: Verschiedene Zoledronat-Konzentrationen, Überstand.
Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler. **P < 0,01: Wert unterscheidet sich
signifikant von der Negativkontrolle (THP-1: Inkubation von THP-1 Zellen mit 10 µmol
Zoledronat ohne Saponin); ns: nicht signifikant (ANOVA).
1.5.2.4
Andauern des γδ-T-Zell-stimulierenden Potentials
In den bisher beschriebenen Versuchen zur Antigenpräsentation wurden die präsentierenden
Zellen unmittelbar nach Inkubation mit der stimulierenden Verbindung mit den PBL in
Kontakt gebracht (einschließlich der nötigen Waschschritte nach ca. ein bis vier Stunden). In
dem in Abb. 38 dargestellten Experiment wurden THP-1 Zellen nach Vorinkubation mit
Zoledronat und Waschen in eine 96-well-Platte pipettiert und sofort oder nach drei, sechs und
neun Tagen mit PBL gemischt. Am jeweils nächsten Tag wurde die Aktivierung der γδ-TZellen gemessen. Erstaunlicherweise waren die mit 100 µmol/l Zoledronat vorinkubierten
THP-1 Zellen selbst nach sechs Tagen noch in der Lage, γδ-T-Lymphozyten zu aktivieren.
Die Aktivitätsabnahme an Tag neun könnte mit dem wiedereinsetzenden Zellwachstum
zusammenhängen. Um die Zahl der THP-1 Zellen konstant halten zu können, wurden in
einem weiteren Versuch THP-1 Zellen mit 100 µmol/l Zoledronat vorinkubiert, gewaschen
und anschließend in einer Zellkulturflasche inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die
Zellen gewaschen, gezählt, ein Aliquot der Zellsuspension entnommen, mit PBL ko-inkubiert
und anschließend die Aktivierung der γδ-T-Zellen bestimmt. Hierbei zeigten die THP-1
Zellen auch nach Wiedereinsetzen des Zellwachstums noch starkes γδ-T-Zell-stimulatorisches
Potential.
CD69+ [% pan-γδ+]
50
**
20
**
40
15
ns
30
10
20
5
10
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Zellzahl [x10E+05 Zellen/ml]
**
60
103
10
Zeit [d]
THP-1
THP-1 Zoledronat 100 µmol/l
THP-1 Zellzahl
THP-1 Zoledronat 100 µmol/l Zellzahl
Abb. 38: Die Fähigkeit, γδ-T-Zellen zu stimulieren, bleibt THP-1 Zellen, die mit 100 µmol/l
Zoledronat inkubiert worden waren, über einen längeren Zeitraum erhalten.
Aktivierung: Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehler. **P < 0,01 Werte
unterscheiden sich signifikant; ns: nicht signifikant (t-Test).
1.5.2.5
Zusammenfassung
Die Ergebnisse unserer und anderer Gruppen zeigen eindeutig, das die Stimulation von
γδ-T-Zellen durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate zellvermittelt abläuft. Ziel der in
diesem Kapitel dargestellten Versuche war es, Hinweise auf den Mechanismus dieser
„Antigenpräsentation“ zu erhalten. Wie schon in Kapitel C1.5.1.6 diskutiert, stellt sich als
erstes die Frage, ob N-haltige Bisphosphonate an Elemente der Zelloberfläche binden und auf
diese Weise erkannt werden, oder ob sie im Zellinneren wirken. Die Ergebnisse der
„Präsentations-Versuche“ mit Saponin lassen auf eine Beteiligung intrazellulärer Vorgänge
schließen.
Bekanntermaßen greifen internalisierte N-BPs in den Isoprenoid-Stoffwechsel ein, indem sie
die Farnesylpyrophosphat-Synthase hemmen; dies stellt somit einen möglichen Weg dar, wie
Stickstoff enthaltende Bisphosphonate auf potentiell antigenpräsentierende Zellen wirken. Im
Einklang mit dieser Hypothese steht die Beobachtung, dass das γδ-T-Zell-stimulierende
Potential mancher N-BPs mit ihrer Fähigkeit, die Knochenresorption zu hemmen, korreliert
(vgl. Kap. C1.4.4). In Tumorzellen führt der durch N-haltige Bisphosphonate induzierte
Mangel an Farnesyl- und Geranylgeranylpyrophsophat durch den Verlust prenylierter
Proteine zu Zytostase und/oder Apoptose; durch externes Farnesol oder Geranylgeraniol
lassen sich diese Effekte verhindern (vgl. Kap. B3.2.1).
Auf die Fähigkeit Zoledronat-behandelter THP-1 Zellen zur Stimulation von γδ-T-Zellen
hatten die Isoprenoid-Alkohole keinen Einfluss; die Verarmung an längerkettigen IsoprenoidPhosphaten ist danach nicht verantwortlich für die Erlangung der γδ-T-Zell-stimulierenden
Aktivität.
104
Die Blockierung der Farnesylpyrophosphat-Synthase kann aber auch zu einer Akkumulation
von FPP-Vorläufern führen, darunter die phosphathaltigen Metabolite IPP, DMAPP und GPP.
Eine Anreicherung dieser hochpolaren Phosphoantigene im Kulturmedium ist aber sehr
unwahrscheinlich, vor allem in den für eine Stimulation von γδ-T-Zellen notwendigen
mikromolaren Konzentrationen. Die Ergebnisse der in Kapitel C1.5.2.1 beschriebenen
Experimente sowie die Versuche zur Stimulation von γδ-T-Zellen durch Zoledronat in
Gegenwart von alkalischer Phosphatase (vgl. Kap. C1.5.2.2) bestätigen, dass Stickstoff
enthaltende Bisphosphonate nicht durch Freisetzung größerer Mengen an Phosphoantigenen
auf γδ-T-Zellen wirken.
Dies schließt allerdings nicht aus, dass die präsentierenden Zellen nach einer Behandlung mit
N-haltigen Bisphosphonaten bei Zell-Zell-Kontakt mit den γδ-T-Lymphozyten
Phosphoantigene gerichtet freisetzen und es so zu lokalen Konzentrationsmaxima kommt oder
dass Phosphoantigene in Zelloberflächenmolekülen präsentiert werden.
Einen weiteren Hinweis auf eine Beteiligung des Isoprenoid-Stoffwechsels an der
Präsentation von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten liefern Gober und Mitarbeiter in
einer aktuellen Veröffentlichung (Gober und Mitarbeiter, 2003). Sie zeigen, dass der HMGCoA-Reduktase-Hemmer Mevastatin verhindern, dass Daudi-Zellen durch Zoledronat
stimulierend für Vγ9Vδ2-T-Zellen werden. Doch selbst wenn man der dargelegten
Argumentation folgt, dass die Akkumulation endogener Mevalonat-Metaboliten durch
Hemmung der FPP-Synthase die Ursache für das γδ-T-Zell-stimulatorische Potential von mit
N-haltigen Bisphosphonaten behandelten Zellen ist, fehlt der endgültige Beweis, dass
γδ-T-Zellen die endogenen Phosphoantigene präsentiert werden. Möglicherweise kommt es
noch zu anderen Veränderungen der Zelle, die ausschlaggebend für die Aktivität gegenüber
γδ-T-Lymphozyten sind. Welche Bedeutung das lang anhaltende stimulatorische Potential
Zoledronat-gepulster Zellen (vgl. Kap. C1.5.2.5) in diesem Zusammenhang hat, muss
ebenfalls in späteren Untersuchungen geklärt werden.
2 Bakterielle Phosphoantigene
2
2.1
2.1.1
105
Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen
Antigen aus E. coli
Untersuchung der Bindungsfähigkeit an Lektine
Ziel einer früheren Arbeit in unserem Labor war die Aufreinigung und Charakterisierung der
Phosphoantigene aus E. coli. Nach zahlreichen chromatographischen Schritten gelang zwar
eine starke Anreicherung der antigenen Aktivität, es lag aber noch immer ein mit den
eingesetzten Verfahren nur schwer zu trennendes Vielkomponentengemisch aus Nukleotiden
sowie weiteren, nicht identifizierten Substanzen vor (Feurle, 1999). Die Entwicklung einer
spezifischen Aufreinigungsmethode stellt daher eine Möglichkeit zur sauberen Isolierung und
Identifizierung der γδ-T-Zell-Antigene aus E. coli dar.
Ausgehend von einer von Pfeffer und Mitarbeitern beschriebenen Bindung von
mykobakteriellen Phosphoantigenen an Lektine (Pfeffer und Mitarbeiter, 1992) sollte
untersucht werden, ob sich Phospholiganden aus E. coli mit Hilfe verschiedener Lektine von
anderen Substanzen mit ähnlichen chromatographischen Eigenschaften abtrennen lassen. Zur
Gewinnung einer Phosphoantigen-haltigen Lösung wurden E. coli-Kulturen am Ende der
Phase des exponentiellen Wachstums geerntet, die Zellen durch Ultraschall aufgebrochen und
die unlöslichen Bestandteile sowie Makromoleküle durch Zentrifugation und anschließende
Ultrafiltration mit einer Ausschlussgrenze von 3 kDa abgetrennt. Die Aktivität der so
gewonnenen E. coli-Extrakte wurde durch Inkubation mit PBL und anschließender
durchflusszytometrischer Bestimmung der aktivierten γδ-T-Zellen nach zwei Tagen und
gelegentlich auch des γδ-T-Zell-Anteils nach sieben Tagen bestimmt. In der Regel waren die
Extrakte in bis zu hundertfacher Verdünnung wirksam.
Die E. coli-Extrakte wurden mit verschiedenen Lektinen (vgl. Tab. 17) in einer
Endkonzentration von 0,5 mg/ml versetzt und für 20 – 60 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Lektine durch Ultrafiltration abgetrennt und die
Überstände auf ihre γδ-T-Zell-stimulierenden Eigenschaften getestet.
Tab. 17: Übersicht über die eingesetzten Lektine
Lektin aus
Glycine soja (SBA)
Ulex europaeus (UEA I)
Canavalia ensiformis (ConA)
Bandeira simplicifolia (BS-II)
*
Minderung der γδ-T-Zellstimuliernden Aktivität von
E. coli-Extrakten
−
−
−
−
Minderung der γδ-T-Zellstimulierenden Aktivität von
mykobakteriellen Extrakten*
3
3
−
n.d.
(Pfeffer und Mitarbeiter, 1992)
-: γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität unverändert; 3: γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität vermindert;
n. d.: nicht durchgeführt.
106
Im Gegensatz zu den von Pfeffer berichteten Ergebnissen mit mykobakteriellen Extrakten
(Pfeffer und Mitarbeiter, 1992) lies sich hier mit keinem der eingesetzten Lektine eine
Verminderung der Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen feststellen (vgl. Tab. 17). Möglicherweise
beruht der von Pfeffer beobachtete Effekt auf einem anderen Mechanismus als der Bindung
der γδ-T-Zell-stimulierenden Liganden an Lektine. Auf jeden Fall lassen sich die untersuchten
Lektine nicht zur Aufreinigung von Phosphoantigenen aus bakteriellen Extrakten einsetzen.
2.1.2
Massenspektrometrische Untersuchungen
Zur Identifizierung polarer Verbindungen aus komplexen Gemischen ist die Kopplung der
Hochleistungsflüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie (HPLC-MS) eine gut
geeignete Methode. Chromatographie an einer Cyclodextrin-Phase und anschließende
Detektion mittels Elektrosprayionisierungs-Tandemmassenspektrometrie (ESI-MS/MS) hat
sich zum Nachweis von phosphorylierten Verbindungen bewährt (Feurle und Mitarbeiter,
1998). Allerdings reichte die Empfindlichkeit der Methode nicht aus, um Phosphoantigene
aus E. coli zu identifizieren. Kurz nach Beginn dieser Arbeit veröffentlichte die Gruppe von
Fournié einen Artikel, in dem sie über die Strukturaufklärung von TUBAg1 berichten. Der als
γδ-T-Zell-Antigen wirksame Pyrophosphomonoester aus Mycobacterium fortuitum wurde als
3-Formyl-1-butylpyrophosphat identifiziert (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Da somit das
Molekulargewicht des mykobakteriellen Phosphoantigens bekannt war, versuchten wir die
Verbindung auch in Extrakten aus E. coli mittels eines „Selected-Reaction-Monitoring“
(SRM) Experiments nachzuweisen. SRM ist eine tandemmassenspektrometrische Methode,
bei der Prekursorionen mit einem festgelegten m/z-Verhältnis ausgewählt werden. Nach
Stoßaktivierung wird ein charakteristisches Produktion anhand seines definierten m/zVerhältnisses erfasst. Dadurch ist dieser Modus besonders selektiv und empfindlich.
Wie Abb. 39 zeigt, gelang es in einer partiell aufgereinigten E. coli -Probe31 tatsächlich, eine
Verbindung mit der molekularen Masse des mykobakteriellen Antigens (262 amu) anhand
seines Molekülions [M-H]−, m/z 261, das ein für Phosphate typisches Fragment abspaltet,
nachzuweisen. Ein Produktionenscan ergab jedoch, dass zwei unterschiedliche Verbindungen
mit dem Molekülion m/z 261 [M-H]− koeluierten.
31
Diese E. coli-Probe wurde schon früher im Rahmen dieses Projekts durch zahlreiche chromatographische
Schritte aus einer 20 l Fermenterkultur erhalten.
107
rel. Intensität [%]
100
75
50
25
0:00
2:30
5:00
7:30
10:00
12:30
15:00
Retentionszeit [min]
Abb. 39: HPLC-MS/MS-Analyse zum Nachweis einer pyrophosphathaltigen Verbindung aus
E. coli mittels eines SRM-Experiments mit m/z 261 [M-H]− als Prekursorion und
m/z 159 [HP2O6]− als Tochterion
HPLC 3, Methode 1 (vgl. Kap. D2.3 und D3.9).
Durch Veränderung der HPLC-Bedingungen gelang es, zwei basisliniengetrennte Peaks mit
Retentionszeiten von 10:50 min (Verbindung 1) und 11:20 min (Verbindung 2) zu erhalten.
Bei Verbindung 1 handelte es sich nicht um eine phosphorylierte Verbindung. Das
Produktionenspektrum von Verbindung 2 wies die für Pyrophosphate typischen
Fragmentionen m/z 159 [HP2O6]−, m/z 97 [H2PO4]− und m/z 79 [PO3]−, sowie ein Signal für
einen Wasserverlust (m/z 243 [M-H2O-H]−) auf (vgl. Abb. 40 C). Um zu überprüfen, ob das
Auftreten dieser Verbindung mit der biologischen Aktivität korreliert, wurde die Probe unter
den gleichen chromatographischen Bedingungen getrennt und im interessierenden Bereich
(10 bis 12 Minuten) wurden im Abstand von 10 Sekunden Fraktionen gesammelt. In der
Fraktion von 10:40 bis 10:50 Minuten lies sich durch erneute HPLC-MS/MS-Analyse nur
Verbindung 1 nachweisen, was bestätigte, dass die Trennung erfolgreich war. Anschließend
wurde aus den einzelnen Fraktionen das organische Lösungsmittel durch Abblasen entfernt,
die verbleibende wässrige Phase auf 0,5 ml aufgefüllt und in verschiedenen Verdünnungen
auf ihr γδ-T-Zell-stimulierendes Potential getestet. Wie Abb. 40 A und B zeigt, koeluierte
Verbindung 2 mit der biologischen Aktivität.
Eine weitere Auftrennung der E. coli-Probe war durch Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
von Jean-Jacques Fournié in Toulouse möglich, wo eine AnionenaustauschchromatographieHPLC-Anlage der Firma Dionex und ein LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer (Finnigan) mit
einer Nanospray-ESI-Ionenquelle (The Protein Analysis Co.) zur Verfügung standen. Der
Einsatz eines selbstregenerierenden Mikromembran-Anionensuppressors erlaubte die direkte
Analyse der durch Anionenaustauschchromatographie gewonnenen Fraktionen mittels
Massenspektrometrie. Die Bioaktivität der einzelnen Fraktionen wurde durch Messung der
TNF-α-Sekretion aktivierter γδ-T-Zellen bestimmt (vgl. Kap. D3.2.4).
108
+
+
CD25 [% pan-γδ ]
A
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10:30 10:40 10:50 11:00 11:10 11:20 11:30 11:40
Zeit [min]
B
100
0
12:00
11:00
Retentionszeit [min]
C
[M-H]-
[PO3]79
261
100
25
1.1E+06
2080
x4
[HP2O6]-
1560
159
1040
[(M-H)-H2O][(
243
[H2PO4]-
520
97
0
50
Abb. 40:
100
m/z
150
200
250
HPLC-MS/MS-Analyse einer E. coli-Probe zum Nachweis phosphorylierter
Verbindungen; Korrelation mit der biologischen Aktivität.
A: γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität der einzelnen HPLC-Fraktionen;
Verdünnung 1 : 3000 (CD25-Assay)
B: Ausschnitt aus einem HPLC-MS/MS-Chromatogramm einer
phosphorylierten Verbindung mit m/z 261 [M-H]− m/z → 159 [HP2O6]−
C: Produktionenspektrum der phosphorylierten Verbindung
HPLC 3, Methode 2 (vgl. Kap. D2.3 und D3.9).
109
Nur zwei der in den beiden aktiven Fraktionen detektierten Molekülionen, m/z 261 und
m/z 275, konnten phosphorylierten Verbindungen zugeordnet werden (Phosphoverbindung 1
bzw. 2). Das Produktionenspektrum der Phosphoverbindung 1 entsprach wie erwartet dem der
unbekannten Verbindung 2 aus Abb. 40 C. Das Fragmentierungsmuster der
Phosphoverbindung 2 zeigte zwei Neutralverluste von 18 (H2O) und 98 amu (H3PO4) sowie
die Phosphat-spezifischen Ionen m/z 79 und m/z 97. Es handelt sich wahrscheinlich um die
von Feurle als Phosphoaldonsäure charakterisierte Verbindung (Feurle, 1999) (vgl. auch Kap.
B1.5.1.1).
A
Chlorid
E. coli Phosphoantigene
IPP
UV 210 nm
Leitfähigkeit [µS]
TNF-α [pg/ml]
Absorption [mAU]
N-Acetylmannosaminuronsäure-1-phosphat
Acetat
Bioaktivität
B
Phosphoverb. 1
[M-H]
Abb. 41:
261
Phosphoverb. 2
[M-H]
275
A: Trennung der E. coli-Probe durch Anionenaustauschchromatographie und
Korrelation mit der biologischen Aktivität.
HPLC 2, Methode 3 (vgl. Kap. D2.3 und D3.9); Detektion: Leitfähigkeit, UV 210 nm,
TNF-α Freisetzung (Bioaktivität).
B: Massenspektrum der vereinigten biologisch aktiven Fraktionen.
(vgl. Kap. D2.4)
110
Zusammenfassend kann man feststellen, dass wir in E. coli einen Pyrophosphomonoester mit
einem Molekulargewicht Mr 262 nachweisen konnten, bei dem es sich um ein Phosphoantigen
handelte. Ein ähnliches Phosphoantigen mit identischen massenspektrometrischen
Eigenschaften war aus M. fortuitum isoliert worden. Neueste Arbeiten an gentechnisch
veränderten E. coli identifizierten die Verbindung als (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyldiphosphat (HMB-PP) (Hintz und Mitarbeiter, 2001). Allerdings handelt es sich dabei um ein
Isomer des mykobakteriellen Phosphoantigens 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat (FB-PP). Wie
schon in Kapitel B1.5.1.1 ausführlich diskutiert, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich auch
bei der aus Mykobakterien isolierten Verbindung um HMB-PP handelt. Ein Vorkommen von
FB-PP kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Ob es sich auch bei der zweiten
Phosphoverbindung in der bioaktiven E. coli-Fraktion (Mr 276) um eine γδ-T-Zellstimulierende Verbindung handelt, bleibt weiter offen.
2.2
Versuche zu C. ammoniagenes
Wie in Kapitel B1.5.1.1 ausführlich dargelegt, produzieren viele Bakterien
Phosphorverbindungen, die Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivieren können. Zu Beginn dieser Arbeit
war noch kein bakterielles Phosphoantigen32 vollständig charakterisiert, es existierten aber
starke Hinweise darauf, dass diese Verbindungen über den alternativen Weg der IsoprenBiosynthese gebildet werden. Interessanterweise gibt es bestimmte Bakterien, die unter
oxidativem Stress einen Metaboliten dieses Biosynthese-Weges akkumulieren – das 2-CMethyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP). Im Folgenden wurde exemplarisch an
dem Pflanzenpathogen Corynebacterium ammoniagenes der Einfluss dieser Stress-Reaktion
auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität untersucht.
2.2.1
Wirkung von Benzylviologen auf verschiedene Bakterien
C. ammoniagenes und auch Micrococcus luteus gehören zu den Bakterien, die gegenüber
„inneren“ oxidativen Stress, wie er durch Benzylviologen induziert werden kann, resistent
sind und darauf mit Akkumulation von MEcPP reagieren. Die Wachstumskurven dieser
Bakterien wurden durch Zusatz von 50 µg/ml Benzylviologen nicht beeinflusst (vgl. Kap.
B2.4 und Abb. 44). E. coli und Agrobacterium tumefaciens – zwei Spezies die ebenfalls den
MEP-abhängigen Weg der IPP-Biosynthese besitzen und somit auch über die Fähigkeit zur
MEcPP-Synthese verfügen – zeigten dagegen in Gegenwart von Benzylviologen gehemmtes
Wachstum (vgl. Abb. 42 A). Als Beispiel für Bakterien mit Mevalonat-abhängiger
Isoprenoid-Biosynthese dienten Lactobacillus casei und L. plantarum, deren Wachstum durch
Zugabe von Benzylviologen kaum beeinflusst wurde.
32
Außer IPP, das aber für die beobachtete Antigenität von Bakterien keine Rolle spielt, vgl. Kapitel B1.5.1.1.
111
Durch Aufbrechen der Zellen mit Ultraschall, Zentrifugation und Ultrafiltration wurden aus
Kulturen der genannten Bakterienspezies Extrakte gewonnen und auf ihre γδ-T-Zellstimulierenden Eigenschaften untersucht. Im Fall von C. ammoniagenes und M. luteus zeigten
die Proben der in Gegenwart von Benzylviologen gewachsenen Bakterien eine gesteigerte
Aktivität verglichen mit den Kontrollproben. Bei C. ammoniagenes war dieser Effekt
besonders deutlich ausgeprägt (vgl. folgende Abschnitte), deshalb wurden die weiteren
Versuche mit diesem Bakterium durchgeführt. Auf die Aktivität der E. coli- und
A. tumefaciens-Extrakte gegenüber γδ-T-Zellen hatte Benzylviologen keinen Einfluss (vgl.
Abb. 42). Die Lactobazillen-Proben zeigten wie erwartet in keinem Fall Aktivität gegenüber
γδ-T-Lymphozyten. Benzylviologen selbst konnte γδ-T-Zellen nicht aktivieren; es wirkte
vielmehr toxisch auf PBL-Kulturen.
OD550
A
B
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
CD25+ [% pan-γδ+]
70
Zeit [h]
20
ns
ns
10
**
**
ns
ns
ns
ns
1 : 10
1 : 100
1 : 1000
**
**
**
**
30
30
**
**
50
20
10
**
**
60
40
E. coli
E. coli + BV
A. tume.
A. tume + BV
ns
**
ns
ns
ns
ns
*
ns
0
11 h
11 h BV
23 h
E. coli
23 h BV
11 h
11 h BV
23 h
23 h BV
A. tumefaciens
Negativkontrolle
Abb. 42: Einfluss von 50 µg/ml Benzylviologen (BV) auf das Wachstum und die γδ-T-Zellstimulierende Aktivität von E. coli- und A. tumefaciens-Kulturen.
A: Bakterienwachstum.
OD550: optische Dichte bei 550 nm; Pfeil: Zeitpunkt der Benzylviologenzugabe (4 bzw. 5,5 h).
B: Stimulation von γδ-T-Zellen durch Bakterienextrakte.
Die Bakterien wurden nach 11 bzw. 23 h geerntet und die Extrakte in drei Verdünnungsstufen
(1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000) im γδ-T-Zell-Assay getestet. Angegeben sind die Mittelwerte von
Dreifachbestimmungen ± Standardfehler. **P < 0,01, *P < 0,05: Werte unterscheiden sich
signifikant von der Negativkontrolle; ns: kein signifikanter Unterschied zur Negativkontrolle).
2.2.2
Einfluss der Extraktionsmethode
Eine C. ammoniagenes-Kultur wurde nach neun Stunden Inkubation bei 30 °C (2 – 3 Stunden
nach Beginn des exponentiellen Wachstums) mit 50 µg/ml Benzylviologen versetzt und noch
weitere 15 Stunden im Brutschrank belassen (C.a. BV). Eine Kontrollkultur ohne
Benzylviologen-Zusatz wurde mitgeführt (C.a.). Nach Ende der Inkubationszeit wurde jeweils
ein Teil der Kultur mit Ultraschall behandelt, um die Bakterienzellen aufzubrechen. Der
Bakterienextrakt wurde durch Zentrifugation und anschließende Ultrafiltration gewonnen.
112
Beim anderen Teil der Kulturen wurden Überstand und Bakterienzellen durch Zentrifugation
getrennt und die intakten Zellen mit Ethanol/Wasser 1 : 1 extrahiert. Kulturüberstand und
Ethanol-Extrakt wurden ebenfalls ultrafiltriert. Die so gewonnenen C. ammoniagenes-Proben
wurden in γδ-T-Zell-Assays auf ihre biologische Aktivität hin getestet.
90
A
80
**
**
**
70
1 : 10
1 : 50
1 : 100
1 : 1000
**
**
**
+
+
CD25 [% pan-γδ ]
**
60
**
**
50
**
**
**
**
**
**
40
**
**
30
ns
ns
20
**
**
ns
ns
ns
10
0
C.a. US
B
C.a. Üst C.a. EtOH C.a. + BV C.a. + BV C.a. + BV NegativUS
Üst
EtOH
kontrolle
**
90
80
**
**
**
**
** **
1 : 10
1 : 100
1 : 1000
1 : 5000
**
**
+
+
pan-γδ [% CD3 ]
70
**
60
50
**
**
**
**
*
40
ns
30
20
ns
ns
ns
10
0
C.a. US
Abb. 43:
C.a. Üst C.a. EtOH C.a. + BV C.a. + BV C.a. + BV NegativUS
Üst
EtOH
kontrolle
Stimulation von γδ-T-Lymphozyten in PBL-Kulturen durch Proben von
C. ammoniagenes; Wirkung von Benzylviologen und Vergleich verschiedener
Aufarbeitungsmethoden.
A: Aktivierung (CD25);
B: Proliferation.
C.a.: C. ammoniagenes; BV: Benzylviologen; US: Extrakt nach Ultraschallbehandlung;
Üst: Kulturüberstand; EtOH: Ethanol-Extrakt. Die Bakterienproben wurden jeweils in vier
verschiedenen Verdünnungsstufen (1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 5000) eingesetzt.
Gezeigt werden Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardfehler. **P < 0,01, *P < 0,05:
Werte unterscheiden sich signifikant von der Negativkontrolle; ns: kein signifikanter Unterschied
(ANOVA).
113
Wie Abb. 43 zeigt, stimulierten die mit Benzylviologen behandelten Bakterien wesentlich
stärker die Aktivierung und Proliferation von γδ-T-Lymphozyten. Dieser Effekt war bei allen
durchgeführten Aufarbeitungsmethoden sichtbar. Zwischen der Aktivität der
Kulturüberstände und der mit Ultraschall behandelten Proben bestand kein Unterschied. Die
γδ-T-Zell-stimulierenden Substanzen wurden also entweder aktiv ins Medium sezerniert oder
sie wurden während der Kultur oder Zentrifugation durch Zellruptur freigesetzt. Die EthanolExtrakte waren etwas weniger aktiv33. Allerdings war hier von Vorteil, dass der größte Teil
des Benzylviologens mit dem Medium abgetrennt wurde und so die zytotoxische Wirkung auf
die PBL geringer ausfiel (vgl. Abb. 43 B). In den folgenden Versuchen wurde die Aktivität
des Kulturüberstandes und/oder der Ethanol-Extrakte gemessen.
2.2.3
Zeitverlauf der Benzylviologen-abhängigen Produktion von
γδ-T-Zell-Antigenen
90
2
80
1,8
70
1,6
1,4
60
1,2
50
1
40
0,8
30
OD550
CD25+ [% pan-γδ+]
Es wurde die Abhängigkeit der γδ-T-Zell-stimulierenden Aktivität von C. ammoniagenesProben von der Kulturdauer mit Benzylviologen und vom Zeitpunkt der BenzylviologenZugabe untersucht. Sowohl in unbeeinflussten C. ammoniagenes-Kulturen als auch in
Kulturen, die in Gegenwart von Benzylviologen wuchsen, war die biologische Aktivität zum
Ende der Phase des exponentiellen Wachstums am größten, nahm danach leicht ab und blieb
dann über den gesamten Untersuchungszeitraum (10 Stunden) etwa konstant.
C.a. 1:100
C.a. + BV 1:100
C.a. 1:1000
C.a. + BV 1:1000
Negativkontrolle
OD550 C.a.
OD550 C.a. BV
0,6
20
0,4
10
0,2
0
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h] nach BV Zugabe
Abb. 44: Einfluss von Benzylviologen auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität von
C. ammoniagenes-Proben in Abhängigkeit von der Kulturdauer.
C.a. BV: Zugabe von 50 µg/ml Benzylviologen (BV) zu einer C. ammoniagenes-Kultur nach 10 h.
C.a.: Kontrollkultur ohne BV-Zugabe; OD550: optische Dichte bei 550 nm (Bakterienwachstum).
Die Bakterienüberstände wurden in zwei Verdünnungsstufen (1 : 100, 1 : 1000) im CD25/γδAssay eingesetzt. Gezeigt sind Mittelwerte von Doppelbestimmungen ± Standardfehle.
33
Die Ethanol-Konzentration in der PBL-Kultur betrug maximal 2,5 % und hatte keine negative Auswirkung auf
die Zellen.
114
Das bedeutet, dass der Zeitpunkt der Probennahme relativ unkritisch für das zu erwartende
Ergebnis ist. Man sollte allerdings sicherstellen, dass sich die Bakterien schon in der
stationären Phase des Wachstums befinden. Auch der Zeitpunkt der Benzylviologen-Zugabe
zeigte keine großen Auswirkungen auf die biologische Aktivität. Nur wenn die Zugabe erst
beim Übergang in die stationäre Phase des C. ammoniagenes-Wachstums erfolgte, war die γδT-Zell-stimulierende Wirkung der Bakterienextrakte deutlich verringert, wenn auch immer
noch eindeutig stärker als ohne Benzylviologen-Zusatz.
2.2.4
Einfluss anderer Stressoren auf die γδ-T-Zell-stimulierende
Aktivität von C. ammoniagenes
Es wurde überprüft, ob sich der verstärkende Effekt von Benzylviologen auf die γδ-T-Zellstimulierende Aktivität von C. ammoniagenes auch durch andere Möglichkeiten der
Erzeugung von oxidativem Stress erreichen lies. Dazu wurden 2,3-Dimethoxy-1,4naphthoquinon (DMNQ), ein weiterer Redoxcycler, und Wasserstoffperoxid eingesetzt.
Außerdem wurden Bakterien einem Hitzeschock ausgesetzt, da auch dadurch reaktive
Sauerstoffspezies erzeugt werden können.
C. ammoniagenes-Kulturen waren gegenüber DMNQ bis zu einer Konzentration von
50 µmol/l resistent. E. coli dagegen zeigten eine Wachstumshemmung vergleichbar mit der,
die durch 50 µg/ml Benzylviologen verursacht wurde. Eine erhöhte Aktivität gegenüber γδ-TLymphozyten lies sich allerdings auch in C. ammoniagenes-Proben nicht nachweisen. Für ein
anderes redox-aktives Quinon, Menadion (2-Methyl-1,4-naphthoquinon), ist die Induktion der
Bildung von MEcPP nachgewiesen, allerdings in schwächerem Ausmaß als für
Benzylviologen. Es ist also möglich, dass DMNQ prinzipiell den gleichen Effekt wie
Benzylviologen auf C. ammoniagenes hat, dieser aber aufgrund der schwächeren Ausprägung
nicht nachweisbar war.
Wasserstoffperoxid hatte in Konzentrationen bis 10 mmol/l keine Wirkung auf das Wachstum
von C. ammoniagenes, das Wachstum von E. coli-Kulturen wurde von 10 mmol/l
Wasserstoffperoxid völlig gehemmt. Ein Einfluss auf die γδ-T-Zell-stimulierende Aktivität
der Bakterienextrakte war nicht zu erkennen. Allerdings kann die erhöhte
Widerstandsfähigkeit der Corynebakterien auf anderen Mechanismen beruhen als auf ihre
Resistenz gegenüber Redoxcyclern; vielleicht ist sie nur Ausdruck einer höheren KatalaseAktivität. Die Einwirkung von Hitze hatte ebenfalls keinen Effekt auf die Aktivität von
C. ammoniagenes-Extrakten im γδ-T-Zell-Assay.
2.2.5
115
Nachweis von 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat
Um zu prüfen, ob BV-behandelte C. ammoniagenes tatsächlich MEcPP akkumulieren, sollte
die Verbindung mittels HPLC-MS-Analyse in ethanolischen Bakterienextrakten
nachgewiesen werden. Dabei kam die schon in Kapitel C2.1.2 beschriebene Kopplung von
Chromatographie an einer Cyclodextrinphase mit der ESI-MS zum Einsatz. Es lies sich
sowohl in der BV-Probe als auch in der Kontrollprobe eine Verbindung mit einem m/zVerhältnis von 277 [M-H]− nachweisen34.
10
m/z 277 → m/z 79
8
6
4
6,9 min
2
0
C
0
5
10
15
B
m/z 277 → m/z 79
100
7,1 min
80
20
A
60
20
16
[PO3]12 79
8
[H2PO4]97
-H3PO4
179
4
50
40
25
[M-H]277
100
150 200 250
20
0
0
5
10
Zeit [min]
15
20
25
Abb. 45: HPLC-ESI-MS/MS-Analyse von ethanolischen Extrakten aus C. ammoniagenes
A, B: SRM m/z 277 → m/z 79 zum Nachweis von MEcPP in Proben aus
C. ammoniagenes (A) und C. ammoniagenes + BV (B).
C: Produktionenspektrum von MEcPP
HPLC 3, Methode 2 (vgl. Kap. D2.3 und D3.9)
Die Chromatogramme in Abb. 45 sind so skaliert, dass das Verhältnis der Peakhöhen auch
das Verhältnis der absoluten Intensitäten wiedergibt. Daraus wird ohne genauere
Quantifizierung sichtbar, dass diese Verbindung in Proben von mit BV behandelten
C. ammoniagenes in erhöhter Konzentration vorliegt. Das Produktionenspektrum zeigte einen
Neutralverlust von 98 amu (Abspaltung von H3PO4) sowie zwei typische Phosphatsignale bei
m/z 97 [H2PO4]− und m/z 79 [PO3]− (vgl. Abb. 45 C). Im Unterschied zu anderen
Diphosphaten trat bei dieser Verbindung kein Fragmention mit m/z 159 [HP2O6]− auf, was
aber an der cyclischen Struktur von MEcPP liegen kann.
34
Das Molekulargewicht von MEcPP beträgt 278 amu.
116
Zusammengenommen belegen unsere Daten also, dass in mit BV behandelten
C. ammoniagenes eine phosphathaltige Verbindung mit einem Molekulargewicht von
278 amu angereichert wurde, die anhand der massenspektrometrischen Daten als MEcPP
identifiziert werden konnte.
2.2.6
Untersuchung zur Art der γδ-T-Zell-stimulierenden Verbindungen
und Zusammenfassung
Es ist bekannt, dass C. ammoniagenes Phosphoantigene produzieren (Jomaa und Mitarbeiter,
1999). Um zu überprüfen, ob der durch Benzylviologen verursachte Zuwachs an γδ-T-Zellstimulierender Aktivität ebenfalls durch phosphathaltige Verbindungen verursacht wird,
wurden C. ammoniagenes-Präparationen aus Kulturen, die unter oxidativem Stress gewachsen
waren, mit alkalischer Phosphatase behandelt. Dadurch wurde die Aktivität gegenüber γδ-TLymphozyten völlig zerstört. Somit wird vermutlich durch die Benzylviologen-Behandlung
die Konzentration des Phosphoantigens bzw. der Phosphoantigene in C. ammoniagenes
erhöht.
Es ist denkbar, dass sich in MEcPP-akkumulierenden Bakterien auch die Konzentration
anderer Metaboliten der MEP-abhängigen Isoprenoidbiosynthese erhöht. Somit könnte das als
Phosphoantigen wirksame IPP für die beobachtete Aktivitätssteigerung verantwortlich sein.
Daher sollte der IPP-Gehalt von Proben, die aus mit Benzylviologen behandelten
C. ammoniagenes und M. luteus gewonnen wurden, ermittelt werden. Die Bakterienpräparate
wurden durch Zellaufschluss mit Ultraschall hergestellt und zeichneten sich durch eine
erhöhte Aktivität gegenüber γδ-T-Zellen aus. Die direkte Bestimmung von IPP in
Bakterienproben gestaltet sich schwierig. Daher wurde die gaschromatographische Analyse
von mit alkalischer Phosphatase behandelten Proben eingesetzt, um den IPP-Gehalt der
Bakterien abzuschätzen. Dabei wird der aus IPP freigesetzte Alkohol Isopentenol mittels
Headspace-GC und FID-Detektion nachgewiesen. Für reines Isopentenol in Wasser lag die
Nachweisgrenze der gaschromatographischen Methode bei etwa 50 ng/ml, berechnet als IPP.
Für IPP in Medium betrug die Nachweisgrenze 100 ng/ml. In keiner der untersuchten
Bakterienproben (mit Benzylviologen behandelte und Kontrollproben) lies sich IPP
nachweisen.
Da zum Auslösen einer messbaren γδ-T-Zell-Antwort über 500 ng/ml IPP in den
Bakterienextrakten vorhanden sein müssten35 kann eine Akkumulation dieser Verbindung als
Grund der erhöhten biologischen Aktivität ausgeschlossen werden. Da die Bildung von IPP
und DMAPP durch das selbe Enzym erfolgt, erscheint auch DMAPP als verantwortliches
Phosphoantigen unwahrscheinlich, vor allem da seine Aktivität noch um das zehnfache
niedriger liegt als die von IPP.
35
Dies wurde aus IPP-Titrationskurven abgeleitet.
117
Gegen MEcPP als mögliches Phosphoantigen sprechen die bisherigen Ergebnisse: Die
Aktivität von C. ammoniagenes-Proben zeigte sich Phosphatase empfindlich, während ein
zyklisches Diphosphat kein Substrat für die alkalische Phosphatase darstellt; bei der
Chromatographie an einer Cyclodextrin-Phase eluierte MEcPP vor der biologischen Aktivität
(vgl. Abb. 40 A mit Abb. 45 A/B). Darüber hinaus war in den biologisch aktiven Fraktionen
aus E. coli mittels HPLC-MS/MS kein MEcPP nachweisbar (SRM m/z 277 → m/z 79). Dank
der Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Professor Bacher standen neben
synthetischem MEcPP auch 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritols (CDP-ME) und
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (CDP-ME2P) für den Test im γδ-TZell-Stimulationsassay zur Verfügung. Bei keiner der Proben konnte allerdings eine
Aktivierung (CD25-Expression) oder Proliferation von γδ-T-Lymphozyten festgestellt
werden.
Zusammenfassend kann man feststellen, dass die durch Benzylviologen erhöhte γδ-T-Zellstimulierende Aktivität von Extrakten aus C. ammoniagenes mit dem Anstieg der MEcPPKonzentration, einem Metaboliten des MEP-Wegs der Isoprenoid-Biosynthese, zusammenfiel
und dass es sich bei der (den) stimulierenden Verbindung(en) um Phosphoantigen(e) handelte.
Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit dem MEP-Weg
assoziiert sind. MEcPP sowie die früheren Metabolite D-1-Desoxyxylulose-5-phosphat
(DOXP), Methylerythritol-4-phosophat (MEP), CDP-ME, und CDP-ME2P sind keine
Phosphoantigene, die Phosphoantigene IPP und DMAPP sind nicht in ausreichender
Konzentration vorhanden, um das γδ-T-Zell-stimulierende Potential zu erklären.
Wahrscheinlich ist daher eine erhöhte Konzentration des Phosphoantigens (E)-4-Hydroxy3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMB-PP), das ebenfalls ein Metabolit der Mevalonatunabhängigen Isopentenylpyrophosphat-Biosynthese (Hintz und Mitarbeiter, 2001; Hecht und
Mitarbeiter, 2001) ist, der Grund für die durch BV verursachte Aktivitätssteigerung. Dabei
kann die Verbindung entweder ebenfalls in den Bakterien akkumuliert werden, oder aber sie
wird während der Aufarbeitung oder der γδ-T-Zell-Assays in situ aus MEcPP gebildet.
118
D Experimentalteil
D EXPERIMENTALTEIL
1
1.1
Material
Chemikalien
Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, in p.a.-Qualität von den Firmen
Sigma, Aldrich, Fluka (alle Deisenhofen), ICN (Eschwege) und Merck (Darmstadt) bezogen.
Die im γδ-T-Zell-Stimulierungsassay eingesetzten Bisphosphonate sind in Tabelle 18 und 19
aufgeführt. Lösungsmittel wurden zusätzlich über Füllkörperkolonnen rektifiziert.
Folgende Verbindungen wurden von externen Arbeitsgruppen zur Verfügung gestellt:
[2-Methyl,2-13C2]4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol,
1,2,2’,3,4-13C5-4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphat,
U-13C5-2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (Prof. A. Bacher, TU München);
Zoledronat und verschiedene Bisphosphonate (vgl. Tab. 19) (Dr. J. Green, Novartis, Basel);
Bromhydrinpyrophosphat und aufgereinigtes TUBAg1 (J.-J. Fournié, Toulouse).
Tab. 18: Bisphosphonate
Nr. Trivialname
(Handelsname)
4
Clodronat
3
Etidronat
14
Ibandronat*(Bondronat®)
2
Pamidronat*(Aredia®)
13
Risedronat (Actonel®)
12
Zoledronat*(Zometa®)
*
Verbindung
Vertrieb
Dichlormethylenbisphosphonat;
Dinatriumsalztetrahydrat
1-Hydroxyethan-1,1-diyl-bisphosphonat;
Dinatriumsalz
1-Hydroxy-3-(methylpentylamino)propan1,1-diyl-bisphosphonsäure
3-Amino-1-hydroxypropan1,1-diyl-bisphosphonat; Dinatriumsalz
1-Hydroxy-2-(pyridin-3-yl)-ethan1,1-diyl-bisphosphonat; Mononatriumsalz
Astra GmbH
(Plankstadt)
Gehe Medica
(Stuttgart)
Roche AG
(Penzberg)
Novartis (Wehr)
1-Hydroxy-2-(1H-imidazol-1-yl)-ethan1,1-diyl-bisphosphonsäure
Procter &
Gamble
(Weiterstadt)
Novartis (Basel)
Die Aktivität dieser Verbindungen im CD25/γδ- und γδ/CD3-Assay wurde durch Titration ermittelt.
1 Material
119
Tab. 19: Bisphosphonate, die von der Firma Novartis zur Verfügung gestellt wurden.
Nr. Verbindung
17 3-{[4,4-Bis(4-fluorophenyl)butyl]amino}1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
18* 3-[(2,3-Dihydro-1-benzofuran-2-ylmethyl)amino]1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
19 1-Hydroxy-3-{[2-(4-methoxyphenoxy)ethyl]amino}-propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
20 3-(Acetylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonat; Trinatriumsalz
21 3-(Benzoylamino)-1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonat; Dinatriumsalz
22 1-Hydroxy-3-{[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}propan-1,1-diyl-bisphosphonat;
Dinatriumsalz
23* 1-Hydroxy-3-[methyl(5-phenylpentyl)amino]propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
24 1-Hydroxy-3-[[2-(2-hydroxyphenoxy)ethyl](methyl)amino]propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
25* 3-[(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-2-ylmethyl)(methyl)amino]1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
26* 3-[[(7-Chlor-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-yl)methyl](methyl)amino]1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
27* 1-Hydroxy-3-[(3-phenoxypropyl)(propyl)amino]-propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
28 1-Hydroxy-3-(4-phenylpiperidin-1-yl)propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
29 1-Hydroxy-3-(4-phenylpiperazin-1-yl)propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
30 1-Hydroxy-3-[4-(4-methoxyphenyl)piperidin-1-yl]propan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
31* 3-[3-(4-Chlorphenyl)pyrrolidin-1-yl]-1-hydroxypropan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
32 3-(1,5-Dimethyl-3-azabicyclo[3.1.1]hept-3-yl)-1-hydroxypropan-1,1-diylbisphosphonsäure
33 3-(3,3-Dimethyl-6-azabicyclo[3.2.1]oct-6-yl)-1-hydroxypropan-1,1-diylbisphosphonsäure
34 2-(1H-Pyrazol-1-yl)-ethan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
35 2-(1H-1,2,4-Triazol-1-yl)ethan-1,1,-diyl-bisphosphonsäure
36 2-(1H-imidazol-2-yl)ethan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
37* 2-(1-Methyl-1H-imidazol-5-yl)ethan-1,1-diyl-bisphosphonsäure
38* (1,3-Thiazol-2-ylamino)methylenbisphosphonsäure
39* [(5-Methyl-1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
40* [(4-Methyl-1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
41* [(5-Chlor-1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
42* [(5-Isopropyl-1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
43 [(5-Phenyl-1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
44 [Butyl(1,3-thiazol-2-yl)amino]methylenbisphosphonsäure
45 (1,2,4-Thiadiazol-5-ylamino)methylenbisphosphonsäure
46 (1,3,4-Thiadiazol-2-ylamino)methylenbisphosphonsäure
47 {[(Dimethylamino)methylen]amino}methylenbisphosphonsäure
48* ({[Methyl(3-phenoxypropyl)amino]methylen}amino)methylenbisphosphonsäure
49 Aminomethylenbisphosphonsäure
50 Dimethylaminomethylenbisphosphonsäure
51 3-Hydroxy-N,N,N-trimethyl-3,3-diphosphonopropan-1-aminium
52 4-(Dimethylamino)-2-phosphonobuttersäure
*
120
1.2
D Experimentalteil
Sterile Röhrchen, Zellkulturgefäße und Pipetten
Sterile Röhrchen, Flaschen, Mikrotiterplatten, Pipetten und Filter wurden von folgenden
Firmen bezogen: Greiner (Frickenhausen), Sarstedt (Nümbrecht), Eppendorf (Hamburg),
Sartorius (Göttingen), Schleicher & Schuell (Dassel), Behringwerke (Marburg).
1.3
Medien und Puffer
Supplementiertes RPMI-Medium
500 ml RPMI-Medium (Life Technologies, Paisley, Schottland) werden zusammen mit einem
Antibiotikacocktail aus Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml, Biochrom,
Berlin) sowie L-Glutamin (2 mmol/l, Life Technologies, Paisley, Schottland) sterilfiltriert
(< 0,2 µm sterile Membranfilter, Schleicher & Schuell, Dassel).
1 %iges FCS-Medium
Fötales Kälberserum (FCS; Sigma, Deisenhofen) wird zur Komplementinaktivierung
30 Minuten bei 56 °C inkubiert, anschließend sterilfiltriert (Minisart Plus 0,2 µm
Membranfilter mit GF-Vorfilter, Sartorius, Göttingen) und 1 : 100 mit supplementiertem
RPMI-Medium verdünnt.
10 %iges FCS-Medium
Fötales Kälberserum (FCS; Sigma, Deisenhofen) wird zur Komplementinaktivierung
30 Minuten bei 56 °C inkubiert, anschließend sterilfiltriert (Minisart Plus 0,2 µm
Membranfilter mit GF-Vorfilter, Sartorius, Göttingen) und 1 : 10 mit supplementiertem
RPMI-Medium verdünnt.
10 %iges AB-Medium
10 ml humanes AB-Serum (PAA Laboratories, Linz, Österreich) wird mit 90 ml
supplementiertem RPMI-Medium gemischt und sterilfiltriert.
10 %iges AB-Medium mit 100 IE/ml IL-2
10000 IE IL-2 (Proleukin, Chiron, Ratingen) werden in 10 ml humanem AB-Serum (PAA
Laboratories, Linz, Österreich) aufgenommen, mit 90 ml supplementiertem RPMI-Medium
gemischt und sterilfiltriert.
Waschpuffer
1000 ml PBS (phosphate buffered saline; Life Technologies, Paisley, Schottland) wird mit
10 ml FCS und 1 ml Natriumazid (20 %ige Lösung) versetzt.
1 Material
121
MACS-Puffer
10 ml sterile EDTA-Lösung (20 mmol/l; Sigma, Deisenhofen) und 0,5 ml steriles,
inaktiviertes FCS werden mit sterilem PBS auf 100 ml aufgefüllt.
Medium 1 (Luria-Bertani- (LB-)Medium)
10,0 g Trypton (Difco, Detroit, MI, USA)
5,0 g Hefeextrakt (Difco, Detroit, MI, USA)
5,0 g NaCl
ad 1000 ml H2O
autoklavieren.
Medium 2 (Glucose-haltiges LB-Medium)
Lösung 1:
5,0 g Hefeextrakt (Life Technologies, Paisley, Schottland)
5,0 g NaCl
ad 990 ml H2O
autoklavieren.
Lösung 2:
1,0 g Glucose
ad 10 ml H2O
< 0,2 µm sterilfiltrieren.
Lösung 1 und Lösung 2 mischen.
Medium 3 (Lactobacillen-Medium)
10,0 g Fleischextrakt (Life Technologies, Paisley, Schottland)
5,0 g Hefeextrakt (Life Technologies, Paisley, Schottland)
20,0 g Glucose
1,0 g Tween 80
2,0 g K2HPO4
5,0 g Natriumacetat
2,0 g Diammoniumcitrat
0,2 g MgSO4 x 7 H2O
0,05 g MnSO4 x H2O
< 0,2 µm sterilfiltrieren.
122
1.4
D Experimentalteil
Zellen
PBL
Mittels Leukapherese gewonnene periphere Blutlymphozyten (PBL) eines Normalspenders
werden durch Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala,
Schweden) isoliert und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Nach
dem Auftauen werden die Zellen zweimal mit je 10 ml 1 %igem FCS-Medium gewaschen,
zum Ausschluss der toten Zellen mit Trypanblau (0,2 %ig, Merck, Darmstadt) gefärbt und in
einer Neubauer-Zählkammer gezählt.
Zelllinien
Zelllinie
THP-1
U937
K562
DSMZ-Nr.
ACC 16
ACC 5
ACC 10
U266
ACC 9
Zelltyp
akute monozytäre Leukämie
histiozytäres Lymphom
chronische myeloische Leukämie in der
Blastenkrise
multiples Myelom
Beschreibung
monozytäre Zelllinie
monozytäre Zelllinie
erythroide Zelllinie
B-Zelllinie
Alle Zelllinien wurden von der Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig) bezogen und liegen kryokonserviert vor.
1.5
Bakterien
Bakterium
Escherichia coli
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Agrobacterium tumefaciens
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei
1
Stamm
O:128
ATCC 11303
DSM 348
DSM 20305
DSM 30199
DSM 20174
DSM 20011
Quelle
Prof. J. Hacker (Würzburg)1
Sigma (Deisenhofen)
DSMZ2
DSMZ2
DSMZ2
DSMZ2
DSMZ2
Institut für Molekulare Infektionsbiologie, Universität Würzburg;
Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig.
2
Medium
1
1, 2
1, 2
1, 2
1, 2
3
3
1 Material
1.6
123
Antikörper
Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden folgende Antikörper verwendet:
Antigen
Isotyp
Klon
Konjugation
Quelle
CD3
CD25
CD69
pan-γδ
Vγ9
Vδ2
APO2.7
IgG1 (Maus)
IgG2a (Maus)
IgG2b (Maus)
IgG1 (Maus)
IgG1 (Maus)
IgG1 (Maus)
IgG1 (Maus)
UCHT1
B1.49.9
TP1.55.3
IMMU 510
IMMU 360
IMMU 389
2.7A6A3
PE
PE
PE
FITC
FITC
FITC
PE
Coulter-Immunotech (Hamburg)
"
"
"
"
"
"
2
2.1
Geräte
Durchflusszytometer
FACS 1:
FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg)
Laser:
FSC-Detektor:
SSC-Detektor:
Fluoreszenzdetektoren:
Argon-Laser, 488 nm
Festphasen-Silikon-Detektor mit 488 nm Bandpassfilter
Photomultiplier mit Brewster-Winkel Strahlteiler
Datenauswertung:
Photomultiplier mit Bandpassfiltern 530 nm und 585 nm
und Photomultiplier mit Hochpassfilter 650 nm
CellQuest 1.0
FACS 2:
FACS Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg)
Laser 1:
Laser 2:
FSC-Detektor:
SSC-Detektor:
Fluoreszenzdetektoren:
Argon-Laser, 488 nm
Roter Diodenlaser, 635 nm
Festphasen-Silikon-Detektor mit 488 nm Bandpassfilter
Photomultiplier mit Brewster-Winkel Strahlteiler
Datenauswertung:
Photomultiplier mit Bandpassfiltern 530 nm, 585 nm, und 661 nm
und Photomultiplier mit Hochpassfilter 650 nm bzw. 670 nm (für
vierfach Fluoreszenz-Messung)
CellQuest 1.0
Trägerflüssigkeit für die Durchflusszytometrie:
FACS-Flow (Becton Dickinson, Erembodegun, Belgien)
124
2.2
D Experimentalteil
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
HPLC 1:
Photodiodenarray Hewlett Packard 1100 Serie
Pumpe:
Ausgabe:
Hewlett Packard Hochdruckpumpe für binäre Hochdruckgradienten,
1100 Serie
Rheodyne 7125 Probenventil, Probenschleife 50 µl
Nucleodex β-OH (250 x 4 mm, 5 µm) (Macherey-Nagel, Düren)
Hewlett Packard Photodiodenarray 1100 Serie mit Hewlett Packard
Aufnahme- und Auswertesoftware
HP-Drucker (Hewlett Packard)
HPLC 2:
DX500 Ionenchromatographie-System (Dionex, Sunnyvale, CA)
Pumpe:
Gradientenformer:
Trennsäule 2:
GP50 Gradientenpumpe (Dionex, Sunnyvale, CA)
EG40 Eluenten-Generator (Dionex, Sunnyvale, CA)
IonPac AS11 Anionenaustausch-Säule (250 x 4 mm, 13 µmol/l) mit
Vorsäule (50 x 4 mm) (Dionex, Sunnyvale, CA)
selbst-regenerierender Mikromembran-Anionensuppressor ASRS-ultra
(Dionex, Sunnyvale, CA)
CD20 Leitfähigkeitsdetektor (Dionex, Sunnyvale, CA)
Dioden-Array-Detektor
Injektor:
Trennsäule 1:
Detektor:
Ionensuppression:
Detektor 1:
Detektor 2:
2.3
HochleistungsflüssigchromatographieTandemmassenspektrometrie (HPLC-MS/MS)
HPLC 3:
Hochdruckgradientenanlage (Applied Biosystems)
Pumpe:
Applied Biosystems140B Spritzenpumpe für binäre
Hochdruckgradienten
Rheodyne 8125 Probenventil, Probenschleife 5 µm
Nucleodex β-OH (150 x 2,1 mm, 5 µm), Edelstahlgehäuse mit
PEEK-Liner (Säulenmaterial: Macherey-Nagel, Düren; Säulenpackung:
Ziemer, Mannheim)
Injektor:
Trennsäule 3:
Tandemmassenspektrometer:
Spektrometer:
Finnigan TSQ 7000 Triple-Stage-Quadrupol-Tandemmassenspektrometer (Finnigan MAT, Bremen) mit ESI-Interface
ESI-Koppelkapillare: Deaktivierte Fused Silica Kapillare (50 µm i. d.; J & W, Folsom)
Sheathgas:
Stickstoff 5,0, 60 psi
Hilfsgas:
Stickstoff 5,0, 10 Skalenteile
Kollisionsgas:
Argon 5,0, Kollisionsgasdruck 1,5 - 2,2 mTorr
Kollisionsenergie:
15 eV - 25 eV
Ionenquelle:
Atmosphärendruck, Raumtemperatur
Eingangskapillare: 200 °C - 250 °C
2 Geräte
Kapillarspannung:
Multiplier:
125
3,0 oder 3,5 kV (ESI negativ)
1200 V, 1400 V oder 1600 V im Fullscan-Modus, 2200 V oder 2400 V
bei Prekursor- oder Tochterionenexperimenten
Datenaufnahme und
-auswertung:
DEC 500/33 Workstation (Digital Equipment, Unterföhring)
Software ICIS 8.1 (Finnigan MAT, Bremen)
2.4
Nanospray-Massenspektrometrie
Spektrometer:
Ionenquelle:
Transferkapillare:
Spannung der
Nanospray-Nadel:
Ionensammelzeit:
Kollisionsenergie:
Datenaufnahme und
-auswertung:
2.5
GC:
LCQ Ionenfallen-Massenspektrometer (Finnigan MAT, San Jose, CA)
Nanospray-ESI mit Palladium- und Gold-verkleideten Kapillaren
(The Protein Analysis Co., Odense, Dänemark)
150 °C
700 V (negativer Modus)
800 ms
25 eV
Navigator 1,2 (ThermoQuest, San Jose, USA)
Headspace-GC
HRGC Mega 2 (Fisons Instruments, Mainz)
Autosampler:
HS 850 Headspace Autosampler
Ofentemperatur:
90 °C
Inkubationszeit:
60 min
Schüttelzeit:
15 s an, 15 s aus
Spritzentemperatur: 105 °C
Prefill:
nein
Injektionsvolumen: 2,25 ml
Aufziehgeschwindigkeit:
25 ml/min
Injektionsgeschwindigkeit:
15 ml/min
Kryofokussierung: MTFA 815 Cryofocusing Unit, -120 °C - 180 °C; Kühlzeit 25 s
Trennsäule:
DB-Wax Megabore® (30 m, df = 0,531 µm) (J&W)
Trägergas:
Stickstoff 20 kPa
Make-up-Gas:
Stickstoff 65 kPa
Brenngase:
Wasserstoff 75 kPa
Luft 70 kPa
Detektor:
FID, Temperatur 240 °C
Temperaturprogramm:
60 °C, 3 min isotherm, 10°/min auf 100 °C, 2°/min auf 120 °C, 10°/min
auf 140 °C, 1 min isotherm
126
2.6
D Experimentalteil
Zentrifugen
Zentrifuge 1:
Zentrifuge 2:
Zentrifuge 3:
Zentrifuge 4:
Zentrifuge 5:
2.7
Rotixa/K mit Rotor 5094 (Hettich, Tuttlingen)
Rotana/AP mit Rotor 5094A (Hettich, Tuttlingen)
3K-2 Kühlzentrifuge, max. 800 x g (Sigma, Deisenhofen)
5417C mit Rotor FA 45-30-11 (Eppendorf, Hamburg)
Universal 16R mit Rotoren 1614 und 1616 (Hettich, Tuttlingen).
Sonstige Geräte
Autoklaven:
Brutschrank:
Kryokonservierung:
Lyophilisator:
Mikroskope:
pH-Meter:
Photometer:
Schüttelinkubator:
Sterilbank:
Ultraschallbad:
Ultraschallsonde:
Vortex:
Waagen:
Melag Dampfautoklav Typ 23 (Melag)
Varioklav Dampfsterilisator Typ 300/400/500 EP-Z (H + P
Labortechnik, Oberschleißheim)
Forma Scientific Water Jacketed Incubator, Modell 3164
5 % CO2, 37 °C (Labotect, Göttingen)
Nicool plus (Air Liquide, Düsseldorf)
Alpha 1-4; 0,1 mbar (Christ, Osterrode)
Stereo-Mikroskop (Zeiss-Winkel, Göttingen)
Inverses Mikroskop Wilovert (Hund, Wetzlar)
inoLab pH Level-1 mit pH-Elektrode Sentix 41
(WTW, Weinheim)
Ultrospec 1000 UV-VIS Spectrophotometer (Pharmacia,
Freiburg)
Swip KS-10 (Bühler)
Biogard 1360-112 (Sanford, Maine, USA)
Branson 1210 (Heinemann, Schwäbisch Gmünd)
Bandelin Sonoplus HD 2070 (Bandelin Electronic, Berlin)
Vortex Genie 2™ (Bender & Hobein, Zürich)
Mettler PL 300 (Mettler, Gießen)
Sartorius BP 210 S (Sartorius, Göttingen)
Bosch PE 628 (Bosch)
Chyo JL-180 (Chyo Balance, Japan)
3 Methoden
3
3.1
3.1.1
127
Methoden
Zellkultur
Zählen von Zellen
Zellen werden gezählt, um vor der Kultur die richtige Zellkonzentration einzustellen, um
während der Kultur das Zellwachstum zu kontrollieren oder um nach einer FACS-Analyse die
Absolutzahl einer Zellpopulation berechnen zu können. Ein Aliquot der Zellsuspension wird
zum Ausschluss der toten Zellen mit Trypanblau (0,2 %ig, Merck, Darmstadt) gefärbt und in
einer Neubauer-Zählkammer gezählt.
3.1.2
Kultur von PBL
Kryokonservierte PBL werden aufgetaut, frische PBL werden aus Blut mittels
Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala, Schweden) isoliert
(Zentrifuge 2); anschließend werden die Zellen je zweimal mit 1 %igem FCS-Medium
gewaschen und gezählt. Je 5 x 104 oder 1 x 105 Zellen werden in 100 µl 10 %igem ABMedium (eventuell in Gegenwart von 100 IE/ml IL-2) pro Well zusammen mit der
Testsubstanz in 96-Well-Rundbodenplatten (Greiner, Frickenhausen) bei 37 °C in 5 %iger
CO2-Atmosphäre inkubiert. Je nach durchgeführtem Assay beträgt die Inkubationsdauer einen
(Aktivierung; CD69/γδ), zwei bis drei (Aktivierung; CD25/γδ) oder sieben bis neun
(Proliferation; γδ/CD3) Tage.
3.1.3
Kultur von Zelllinien
Die unterschiedlichen Zelllinien werden in 10 %igem FCS-Medium in Zellkulturplatten oder
Zellkulturflaschen verschiedener Größe (abhängig vom Volumen des Mediums) bei 37 °C in
5 %iger CO2-Atmosphäre kultiviert. Die Zellen werden zwei- oder dreimal in der Woche (je
nach Zellteilungsrate) mit frischem Medium verdünnt und die Zelldichte so bei 5 x 105 bis
1 x 106 Zellen/ml gehalten. Reichern sich zu viele tote Zellen in der Kultur an, so werden
diese mittels Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala,
Schweden) entfernt.
3.2
3.2.1
Messung der Aktivierung und Proliferation von γδ-T-Zellen
Vorbereitung der zu testenden Verbindungen
Die in Tab. 20 aufgeführten Testsubstanzen liegen zum Teil als wässrige Lösungen vor oder
sie werden in Wasser (bzw. Ethanol für Farnesol und Geranylgeraniol) gelöst und
anschließend mit RPMI auf die passenden Verdünnungen eingestellt. Die Bisphosphonate
(Tab. 18 und 19) werden in Wasser oder in 0,05 mol/l NaOH gelöst. Wenn nötig, wird mit
1 mol/l NaOH oder 1 mol/l HCl ein pH-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt.
128
D Experimentalteil
Die so erhaltenen wässrigen Lösungen mit Substanzkonzentrationen zwischen 25 und
100 mmol/l werden mit RPMI auf 10 mmol/l verdünnt. Ausgehend von diesen
Stammlösungen werden mit RPMI weitere Verdünnungen hergestellt und diese zu den PBLKulturen gegeben. Für die Screening-Versuche werden Endkonzentrationen von 1 mmol/l,
100 µmol/l, 10 µmol/l und 1 µmol/l verwendet, bei den Titrationen kommen Konzentrationen
von 0,01 µmol/l – 100 µmol/l zum Einsatz.
Tab. 20: Weitere Verbindungen, mit denen γδ-T-Zell-Assays durchgeführt wurden.
Nr.
1
11
53
5
6
9
8
10
7
15
16
54
55
56
57
Verbindung
Isopentenylpyrophosphat*
Dimethylallylpyrophosphat*
Bromhydrinpyrophosphat*
Ethylphosphonsäure
Propylphosphonsäure
3-Aminopropylphosphonsäure
2-Aminoethylphosphat
3-Aminopropanol
2-Butylamin
trans,trans-Farnesol
Geranylgeraniol
Benzylviologen
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat
Aktivität im Assay
+
+
+
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–
–
–
*
3.2.2
3.2.2.1
Messung der Aktivierung von γδ-T-Zellen
Messung des Anteils CD69-positiver γδ-T-Zellen
5 x 104 oder 1 x 105 PBL eines Normalspenders werden in 100 µl 10 %igem AB-Medium pro
Well zusammen mit der Testsubstanz als Duplicat oder Triplicat in 96-WellRundbodenplatten (Greiner, Frickenhausen) ausplattiert und einen Tag bei 37 °C in 5 %iger
CO2-Atmosphäre inkubiert. 50 - 100 µl der Zellsuspension werden mit jeweils 1,5 - 3 µl der
Antikörperlösungen (CD69-PE und pan-γδ-FITC) versetzt und mindestens 30 Minuten bei
4 °C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen der gefärbten Zellen mit 2 ml Waschpuffer
wird der Prozentsatz der CD69-positiven Zellen bezogen auf die gesamten γδ-T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt. In jedem Assay werden IPP (0,02 - 2 µmol/l; Sigma,
Deisenhofen) als Positivkontrollen sowie Mediumblindwerte als Negativkontrollen
mitgeführt.
3 Methoden
3.2.2.2
129
Messung des Anteils CD25-positiver γδ-T-Zellen
5 x 104 oder 1 x 105 PBL eines Normalspenders werden in 100 µl 10 %igem AB-Medium
(meist mit 100 IE/ml IL-2) pro Well zusammen mit der Testsubstanz als Duplicat oder
Triplicat in 96-Well-Rundbodenplatten (Greiner, Frickenhausen) ausplattiert und zwei bis drei
Tag bei 37 °C in 5 %iger CO2-Atmosphäre inkubiert. 50 - 100 µl der Zellsuspension werden
mit jeweils 1,5 - 3 µl der Antikörperlösungen (CD25-PE und pan-γδ-FITC) versetzt und
mindestens 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen der gefärbten
Zellen mit 2 ml Waschpuffer wird der Prozentsatz der CD25-positiven Zellen bezogen auf die
gesamten γδ-T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. In jedem Assay werden IPP
(0,02 - 2 µmol/l; Sigma, Deisenhofen) als Positivkontrollen sowie Mediumblindwerte als
Negativkontrollen mitgeführt.
3.2.3
Messung der Proliferation von γδ-T-Zellen
5 x 104 PBL eines Normalspenders werden in 100 µl 10 %igem AB-Medium (100 IE/ml IL-2)
pro Well zusammen mit der Testsubstanz als Duplicat oder Triplicat in 96-WellRundbodenplatten (Greiner, Frickenhausen) ausplattiert und sieben bis neun Tag bei 37 °C in
5 %iger CO2-Atmosphäre inkubiert. 50 - 100 µl der Zellsuspension werden mit jeweils
1,5 - 3 µl der Antikörperlösungen (CD3-PE und pan-γδ-FITC) versetzt und mindestens
30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen der gefärbten Zellen mit 2 ml
Waschpuffer wird der Prozentsatz der γδ-TZR-positiven Zellen bezogen auf die CD3positiven Zellen (= T-Zellen) durchflusszytometrisch bestimmt. In jedem Assay werden IPP
(0,02 - 2 µmol/l; Sigma, Deisenhofen) als Positivkontrollen sowie Mediumblindwerte als
Negativkontrollen mitgeführt.
3.2.4
Messung der TNF-α-Sekretion von γδ-T-Zellen
Durch 15-tägige Inkubation von PBL (1 x 106 Zellen/ml) in 10 %igem AB-Medium
(100 IE/ml IL-2) in Gegenwart von aufgereinigtem TUBAg 1 (ca. 10 nmol/l) werden γδ-TZelllinien erzeugt. 1 x 104 dieser γδ-T-Zellen werden mit je 10 µl der zutestenden Fraktionen
der E. coli-Proben, 100 µl 10 %igem AB-Medium und 25 IE IL-2 für 24 Stunden bei 37 °C in
5 %iger CO2-Atmosphäre inkubiert. 50 µl des Kulturüberstandes werden zu 3 x 104 WEHI13VAR-Zellen (ATCC CRL-2148) in 10 %igem AB-Medium (plus Actinomycin D (2 µg/ml)
und LiCl (40 mmol/l)) gegeben und für 20 h bei 37 °C in 5 %iger CO2-Atmosphäre inkubiert.
Die WEHI-Zellen sind TNF-α-sensitiv, d. h. sie sterben durch TNF-α ab.
Die Lebensfähigkeit der WEHI-Zellen wird im MTT-Assay gemessen. Metabolisch aktive
Zellen reduzieren das Tetrazoliumsalz MTT zu einem wasserunlöslichen Formazan. Nach
Lösen dieses farbigen Formazans wird die Absorption gemessen, die direkt mit der Zahl
lebender Zellen korreliert.
50 µl MTT (Sigma, St. Louis, MO; 2,5 mg/ml in PBS) werden zugefügt; nach einer
Inkubationszeit von vier Stunden (bei 37 °C) werden 50 µl Solubilisations-Puffer (20 % SDS,
66 % Dimethylformamid, pH 4,7) zugefügt und die Absorption bei 570 nm gemessen.
130
D Experimentalteil
Die Menge des freigesetzten TNF-α wird mittels einer Kalibrationskurve ermittelt, die durch
Verwendung von humanem rTNF-α (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ) erstellt wird.
3.3
Ermittlung der EC50-Werte für die Stimulation von γδ-T-Zellen
durch N-haltige Bisphosphonate und Phosphoantigene
Die Testsubstanzen werden im Konzentrationsbereich von 0,01 µmol/l bis 500 µmol/l im
CD25/γδ- oder γδ/CD3-Assays getestet. Die Messergebnisse werden mittels nichtlinearer
Regression sigmoiden Dosis-Wirkungskurven angepasst und so die EC50-Werte ermittelt
(Graphpad Prism).
3.4
3.4.1
Versuche zur Charakterisierung der Stimulation von γδ-TZellen durch N-haltige Bisphosphonate
Bestimmung des Aktivierungsprofils
PBL werden ohne IL-2 zusammen mit 4 µmol/l Zoledronat, 40 µmol/l Pamidronat, 2 µmol/l
IPP, 0,2 µmol/l IPP sowie ohne Zusatz (Negativkontrolle) inkubiert. Nach 0, 5, 22, 29, 44 ½,
54 und 72 Stunden wird die Aktivierung durch Messung des Anteils CD69-positver und
CD25-positiver γδ-T-Zellen aus jeweils zwei Wells bestimmt.
3.4.2
Einfluss von IL-2 auf die Aktivierung von γδ-T-Zellen
PBL werden in Gegenwart von 100 IE/ml IL-2 inkubiert. Nach einer Vorinkubationszeit von
0, 24 oder 48 Stunden werden Zoledronat (Konzentration im Well 4 µmol/l) oder IPP
(Konzentration im Well 2 µmol/l) zugesetzt; bei den Negativkontrollen erfolgt kein Zusatz.
Nach einer weiteren Inkubationszeit von jeweils 24 Stunden wird der Anteil CD25-positiver
γδ-T-Zellen aus jeweils zwei Wells bestimmt.
3.4.3
Proliferationshemmender Effekt von N-haltigen Bisphosphonaten
„Waschversuche“:
PBL werden in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml in 10 %igem AB-Medium (100
IE/ml IL-2) aufgenommen und mit Zoledronat oder IPP in verschiedenen Konzentrationen 4
bis 24 Stunden inkubiert. Anschließend wird die Hälfte der Zellen dreimal mit 1 %igem FCSMedium gewaschen, in 10 %igem AB-Medium (100 IE/ml IL-2) aufgenommen, gezählt und
auf eine Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml eingestellt. Je 100 µl jeweils beider
Zellsuspensionen (gewaschen und nicht gewaschen) werden in 96-Well-Rundbodenplatten
ausplattiert und bis zu einer Gesamtinkubationszeit von zwei bzw. sieben Tagen inkubiert.
Danach wird die Aktivierung bzw. Proliferation der γδ-T-Zellen durchflusszytometrisch
mittels CD25/γδ- bzw. γδ/CD3-Assay bestimmt.
3 Methoden
3.5
3.5.1
131
Messung der Apoptose
Annexin V
Bei vitalen Zellen sind die Phospholipide asymmetrisch in der Lipiddoppelschicht der
Zellmembran verteilt: Phosphatidylserin ist alleine in der inneren Schicht lokalisiert.
Apoptotische Zellen dagegen haben auch auf der äußeren Seite der Zytoplasmamembran
Phosphatidylserin. Annexin V ist ein Calcium-abhängiges Phospholipid-bindendes Protein
mit sehr hoher Affinität zu Phosphatidylserin und bindet daher spezifisch an apoptotische
Zellen. Zur durchflusszytometrischen Detektion apoptotischer Zellen kann daher FITCmarkiertes Annexin V eingesetzt werden.
Zellen werden zweimal mit kalter PBS gewaschen und in Annexin V-Bindungspuffer
(10 mmol/l Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/l NaCl, 2,5 mmol/l CaCl2; BD PharMingen) zu
1 x 106 Zellen/ml resuspendiert. Zu 100 µl dieser Suspension werden 5 µl Annexin V-FITC
(BD PharMingen) und 10 µl Propidiumiodid-Lösung (50 µg/ml Propidiumiodid in PBS;
Coulter-Immunotech, Marseille, Frankreich) gegeben und 15 min bei Raumtemperatur im
Dunkeln inkubiert. Anschließend werden die Zellen durchflusszytometrisch vermessen. Vitale
Zellen zeigen keine Fluoreszenz, apoptotische Zellen sind Annexin V-FITC-positiv und
Propidiumiodid- (PI-) negativ, tote (und spätapoptotische) Zellen sind sowohl Annexin-VFITC- als auch PI-positiv.
3.5.2
Apo2.7
Der Antikörper Apo2.7 reagiert mit einem Protein der Mitochondrienmembran, das in
apoptotischen Zellen freigelegt wird. Zur durchflusszytometrischen Detektion apoptotischer
Zellen kann daher der PE-markierte Antikörper eingesetzt werden.
0,5 – 1,0 x 106 Zellen werden in 100 µl Lysis-Puffer (100 µg/ml Digitonin (Sigma) in
Waschpuffer) 20 Minuten auf Eis inkubiert, mit Waschpuffer gewaschen und in wenig
Waschpuffer aufgenommen. Dann werden die Zellen mit 5 – 10 µl Apo2.7-PE gefärbt,
15 Minuten bei 4 °C inkubiert, gewaschen und einer FACS-Analyse unterzogen.
Apoptotische Zellen zeigen PE-Fluoreszenz, nichtapoptotische Zellen werden von dem
Antikörper nicht angefärbt.
132
3.6
D Experimentalteil
Präsentationsexperimente
Die präsentierenden Zellen werden in einer Konzentration von ca. 1 x 106 Zellen/ml in
10 %igem AB-Medium oder 10 %igem FCS-Medium aufgenommen und mit der Testsubstanz
in der jeweils angegebenen Konzentration 4 – 24 Stunden bei 37 °C in 5 %iger CO2Atmosphäre inkubiert. Anschließend werden die Zellen mindestens dreimal mit 1 %igem
FCS-Medium gewaschen, in 10 %igem AB-Medium (ev. 100 IE/ml IL-2) aufgenommen,
gezählt und auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt. Je 50 µl dieser
Zellsuspension werden mit 50 µl PBL (1 x 106 oder 2 x 106 Zellen/ml in 10 %igem ABMedium (ev. 100 IE/ml IL-2) in 96-Well-Rundbodenplatten (Greiner, Frickenhausen)
ausplattiert und einen bis neun Tage bei 37 °C in 5 %iger CO2-Atmosphäre inkubiert. Danach
wird die Aktivierung oder Proliferation der γδ-T-Zellen durchflusszytometrisch mittels
CD69/γδ-, CD25/γδ- oder γδ/CD3-Assay bestimmt. Als Negativkontrollen dienen
präsentierende Zellen, die bis auf die Zugabe eines Antigens analog behandelt wurden. Bei
den Positivkontrollen wird die Testsubstanz zur Mischung dieser Zellen mit PBL zugefügt.
Vorinkubation in Gegenwart von Saponin:
THP-1 Zellen werden in einer Konzentration von ca. 1 x 106 Zellen/ml in 10 %igem FCSMedium, dem 0,001 – 0,01 % Saponin zugesetzt wurde, aufgenommen und mit Zoledronat
oder IPP in verschiedenen Konzentrationen 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Anschließend
werden die Zellen mindestens dreimal mit 1 %igem FCS-Medium gewaschen, das weitere
Vorgehen ist wie oben beschrieben.
3.7
Entfernen der γδ-T-Zellen aus der PBL-Population mittels
magnetischer Zell-Separation
Bei der magnetischen Zell-Separation (MACS) werden bestimmte Zellen einer Zellpopulation
über spezifische Antikörper an magnetische Beads gebunden. Die Zellen werden anschließend
über eine Säule getrennt, die in ein Magnetfeld eingebracht wurde. Markierte Zellen werden
in der Säule zurückgehalten, während die unmarkierten Zellen mit der Elutionsflüssigkeit
durch die Säule laufen. Nach Entfernen des Magnetfelds können auch die vorher
zurückgehaltenen Zellen als positiv selektierte Fraktion eluiert werden.
Markieren der γδ-T-Zellen:
Etwa 2 x 107 PBL werden gewaschen und in 80 µl MACS-Puffer aufgenommen. Nach
Zufügen von 20 µl TZR-γδ-Hapten-Antikörper (Isotyp: IgG1 Maus; Klon: 11F2; Miltenyi
Biotec, Bergisch Gladbach) werden die Zellen zehn Minuten bei 4 °C inkubiert. Anschließend
werden 30 µl MACS-Puffer und 40 µl MACS Anti-Hapten-MicroBeads-FITC zugefügt und
nach gutem Mischen wird nochmals 15 Minuten bei 4 °C inkubiert. Dann werden die Zellen
mit 1 ml MACS-Puffer gewaschen und in 100 µl MACS-Puffer resuspendiert.
3 Methoden
133
Abtrennen der γδ-T-Zellen:
Die Trennsäule (MS+/RS+; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) wird in das Magnetfeld des
MACS-Magneten (VarioMACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) eingebracht und mit
500 µl MACS-Puffer gespült. Die Zellsuspension wird in 500 µl MACS-Puffer auf die Säule
gegeben und die nicht zurückgehaltenen PBL werden gesammelt. Anschließend wird die
Säule dreimal mit MACS-Puffer gespült, diese Spülflüssigkeit wird ebenfalls aufgefangen.
Weiterbehandlung der γδ-T-Zell-depletierten PBL (PBL–γδ):
Die Zellen werden zweimal mit 1 %igem FCS-Medium gewaschen und anschließend in
10 %igem AB-Medium (ev. 100 IE/ml IL-2) aufgenommen. Durch FACS-Analyse (γδ/CD3)
wird überprüft, ob die γδ-T-Zellen vollständig entfernt wurden.
3.8
3.8.1
Gewinnung von Bakterienextrakten
Bakterienkultur
Alle Bakterien werden in autoklavierten, mit Papierstopfen verschlossenen Erlenmeyerkolben
bei 37 °C (E. coli, Agrobacterium, Lactobacillus) oder 30 °C (Micrococcus,
Corynebacterium) und mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 220 Umdrehungen/min in LBMedium bzw. Lactobacillen-Medium kultiviert. Eingefrorene Bakterienkulturen werden in
einer Übernachtkultur angezüchtet und am nächsten Tag in frisches Medium überimpft. Das
Bakterienwachstum wird mittels Messung der optischen Dichte bei 550 nm überwacht. Die
Kultur wird vier bis acht Stunden nach Erreichen der stationären Phase bzw. zum
angebebenen Zeitpunkt beendet.
Soll die Auswirkung von Benzylviologen untersucht werden, wird anstelle des LB-Mediums
Glucose-haltiges LB-Medium (1 % Glucose) verwendet. Nach Einsetzen der log-Phase wird
Benzylviologen in einer Konzentration von 50 µg/ml zur Bakteriensuspension gegeben. Eine
Kontrollkultur ohne Benzylviologen wird mitgeführt.
3.8.2
Zellaufschluss mittels Ultraschall
Die Bakteriensuspension wird auf Eis gelagert und in sechs 70 %-Zyklen von jeweils zehn
Sekunden Dauer mittels einer Ultraschallsonde aufgebrochen; zischen den einzelnen Zyklen
wird die Probe immer wieder abgekühlt. Durch Zentrifugation werden Zelltrümmer
abgetrennt (Zentrifuge 1), durch Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 3 kDA) werden
makromolekulare Bestandteile aus dem Bakterienextrakt entfernt.
3.8.3
Extraktion der Bakterienzellen mit Ethanol
Durch Zentrifugation werden Bakterienzellen und Kulturüberstand getrennt (Zentrifuge 1).
Die Zellen werden dreimal mit einer Mischung aus Ethanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1
extrahiert und die Extrakte vereinigt. Kulturüberstand und Ethanol-Extrakt werden
ultrafiltriert (Ausschlussgrenze 3 kDA) (Zentrifuge 1 oder 4).
134
D Experimentalteil
Vor dem Einsatz im γδ-T-Zell-Stimulierungsassay werden bakterielle Ethanol-Extrakte mit
RPMI so verdünnt, dass das Volumen dem ursprünglichen Kulturvolumen entspricht.
3.9
Bindung von bakteriellen Phosphoantigenen an Lektine
Lektin aus Glycine Soja (Sojabohne; SBA; Calbiochem),Ulex europaeus (Stechginster, UEA
I), Canavalia ensiformis (Jackbohne, ConA) und Bandeira simplicifolia (BS-II) (alle Sigma,
Deisenhofen) wird in PBS in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst. 180 µl E. coli-Extrakt
(durch Aufbrechen der Zellen mit Ultraschall) werden mit je 20 µl Lektin-Lösung versetzt
und 20 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Ultrafiltration
(Ausschlussgrenze 3 kDa) werden die Lektine abgetrennt und die resultierende E. coli-Proben
im γδ-T-Zell-Stimulierungsassay getestet.
3.10 Hochleistungsflüssigchromatographie
Methode 1:
Fließmittel:
Flussrate:
Gradient 1:
Detektion:
A: Wasser + 5 mmol/l NH4Oac
B: Acetonitril
200 µl/min
0 min 80 % B, 1 min 80 % B, 11 min 50 % B, 15 min 50 % B
MS/MS (ESI neg.; SRM: Scanzeit: 1s; Kollisionsenergie 15 ev)
Methode 2:
Fließmittel:
Flussrate:
Gradient 2:
Detektion:
B: Acetonitril
200 µl/min
MS/MS (ESI neg.; SRM: Scanzeit 1 s; Kollisionsenergie 15 eV bzw. 25 eV)
γδ-T-Zell-Stimulierungsassay (CD25/γδ)
Methode 3:
Fließmittel:
Flussrate:
Gradient 3:
Detektion:
A: 0,1 mol/l NaOH
B: Wasser
2 ml/min
Leitfähigkeit
UV 210 nm
γδ-T-Zell-Stimulierungsassay (Freisetzung von TNF-α)
3 Methoden
135
Methode 4:
Fließmittel:
Flussrate:
Gradient 4:
Detektion:
B: Acetonitril
0,7 ml/min
γδ-T-Zell-Stimulierungsassay (CD25/γδ)
3.11 Isopentenolbestimmung mittels Headspace-GC
Je 3 ml Bakterienextrakt (nach Aufbrechen mit Ultraschall), 3 ml steriles Medium und 3 ml
steriles Medium + 2 µg IPP (Sigma, Deisenhofen) werden lyophilisiert, in 1 ml Wasser gelöst
und mit 0,5 mol/l NaOH auf pH 8 eingestellt. Nach Zugabe von 15 U alkalischer Phosphatase
(EC 3.1.3.1, Boehringer, Mannheim) werden die Gefäße mit gasdichten PTFE/Silikon-Septen
verschlossen, übernacht bei 42 °C inkubiert und mittels Headspace-GC analysiert. Zur semiquantitativen Bestimmung von Isopentenol werden wässrige Lösungen von synthetischem
Isopentenol (Sigma, Deisenhofen) hergestellt und mittels Headspace-GC analysiert. Die
Konzentration der Isopentenol-Lösungen betragen 324, 162, 65, 32 und 16 ng/ml, das
entspricht 925, 462, 185, 92 und 46 ng/ml IPP.
136
E Literaturverzeichnis
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ANHANG
Statistische Auswertung zu Kapitel C1.3.2, Tabelle 10, CD25:
Nr.
12 (V1) 12 (V2) 12 (V3)
12 (V1)
ns
ns
12 (V2)
ns
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12 (V3)
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13
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1 (V1)
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1 (V2)
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Statistische Auswertung zu Kapitel C1.4.2, Tabelle 12, Werte nicht korrigiert:
Nr.
12
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2
41
27
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12
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48
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26
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ns
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ns
Statistische Auswertung zu Kapitel C1.4.2, Tabelle 12, korrigierte Werte:
Nr.
12
48
37
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23
38
2
41
27
31
18
25
26
12
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48
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37
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39
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ANOVA mit Mehrfachvergleich nach Tukey (GraphPad Prism).
***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05; ns: nicht signifikant.
18
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Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die Dissertation „Stimulation humaner Vγ9Vδ2-TZellen: Untersuchungen zur Wirkung von Stickstoff enthaltenden Bisphosphonaten und zu
bakteriellen Phosphoantigenen“ selbständig angefertigt und keine anderen als die von mir
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher oder anderer Form bereits
in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Ich habe früher außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden keine
weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Würzburg, den
____________________________
(Susanne Eckstein)

Dokument_1. - OPUS Würzburg

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