Leitlinie-Thrombozytopathien

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1 Leitlinie-Thrombozytopathien; Version 4.1; 30.10.2012
Leitlinie-Thrombozytopathien
AWMF-Register Nr. 086-003, Klasse: S2K
ICD10-Code Thrombozytopathie D69.1
Mitglieder der Konsensusgruppe
Autoren
Gesamtverantwortlich:
W. Streif, R. Knöfler, W. Eberl
Abschnittsverantwortliche:
Screening: W. Eberl
Aggregometrie: R. Knöfler
Durchflußzytometrie: H. Schulze
Coautoren:
Tamam Bakchoul, Frauke Bergmann, Siegmund Gehrisch, Christof Geisen, Saskia Gottstein, Susan
Halimeh, Ursula Harbrecht, Günther Kappert, Carl Kirchmaier, Beate Kehrel, Wolfgang Lösche,
Manuela Krause, René Mahnel, Oliver Meyer, Ann Kathrin Pilgrimm, Daniele Pillitteri, Hannelore
Rott, Sentot Santoso, Annelie Siegemund, Christian Schambeck, Monika Scheer, Markus Schmugge,
Thomas Scholl, Gabriele Strauss, Barbara Zieger, Rainer Zotz.
Konsensusfindung
Die vorliegende Leitlinie wurde unter Leitung der Ständigen Kommission Pädiatrie der Gesellschaft
für Thrombose- und Hämostaseforschung durch die Mitglieder Werner Streif, Ralf Knöfler und den
Vorsitzenden Wolfgang Eberl erstellt.
Die Leitlinie wurde von den Koordinatoren (W.Streif; R.Knöfler; W.Eberl) gemeinsam vorbereitet und
in Konsensuskonferenzen an der Deutschen Klinik für Diagnostik in Wiesbaden mit den
Teilnehmern/Coautoren (s.o.) am 28 - 29. September 2009 und 26.- 27. September 2011 in Modulen
weiter entwickelt. Die Module umfassten Screening (W. Eberl), Aggregometrie (R. Knöfler),
Durchflußzytometrie (H. Schulze) und Gesamtkoordination (W. Streif, R. Knöfler, W. Eberl). Am Ende
der Konsensuskonferenzen wurden die jeweiligen Abschnitte von allen Teilnehmern diskutiert und
verabschiedet.
Der Ablauf der Konsensusfindung gestaltete sich wie folgt:
- Vorstellung der Entwürfe und Gelegenheit zu Rückfragen
- Erfassung von begründeten Änderungsvorschlägen durch den Koordinator (W.Streif) im EinzelUmlaufverfahren
- Vorherabstimmung
- Diskussion von Passagen, für die kein Konsens erzielt werden konnte und Erarbeitung von
Lösungsvorschlägen
- endgültige Abstimmung.
Der Konsens wurde definiert als Gesamtzustimmung aller Teilnehmer. Eine Offenlegung der
Interessenskonflikte nach den Vorgaben der AWMF in der gültigen Fassung (AWMF-Formular zur
Erklärung von Interessenkonflikten im Rahmen von Leitlinienvorhaben; Stand 08.02.2010) wurde von
allen Teilnehmern vollständig ausgefüllt und unterschrieben. Diese wurde dem AWMF zur Einsicht
vorgelegt und beim Koordinator W. Streif archiviert. Die Interessenkonflikte aller Mitwirkenden
wurden von den Koordinatoren (W.Streif; R.Knöfler; W.Eberl) als unbedenklich bewertet.
Die überarbeitete Leitlinie wurde in der Sitzung der Ständigen Kommission Pädiatrie der Gesellschaft
für Thrombose im Rahmen der 56. Jahrestagung der Gesellschaft für Thrombose und
Hämostaseforschung in St. Gallen am Samstag, den 4. Februar 2012 im Rahmen einer strukturierten
Konsensuskonferenz vorgestellt (Moderation: W. Streif und W. Eberl). Sämtliche vorgebrachten
Verbesserungsvorschläge und Anregungen wurden überprüft und gegebenenfalls in die Leitlinie
eingearbeitet. Im Umlaufverfahren wurde die überarbeitete Leitlinie Version 3.0 von den Mitgliedern
der Konsensusgruppe (s.o.) verabschiedet.
Gültigkeitsdauer und Aktualisierung
Die Leitlinie ist bis 2017 gültig. Zwischenzeitlich erscheinende wissenschaftliche Erkenntnisse werden
von der Leitliniengruppe (W. Streif, R. Knöfler, W. Eberl) beobachtet. Gegebenenfalls wird von der
Leitliniengruppe ein Aktualisierungsverfahren vorzeitig eingeleitet. Verantwortlich für die
Aktualisierung sind W. Streif, R. Knöfler, W. Eberl.
Geltungsbereich
Die Leitlinie betrifft die Diagnose von angeborenen Störungen der Thrombozytenfunktion bei Kindern
und Jugendlichen.
Insbesondere die Entscheidungskriterien zur Auswahl geeigneter diagnostischer Maßnahmen und
der Einsatz, die Durchführung und Beurteilung diagnostischer Teste sind Gegenstand des Konsensus.
Die Leitlinie richtet sich an in Kliniken und Praxen tätige Kinder- und Jugendärzte sowie alle nicht
pädiatrisch
Tätigen
in
der
Versorgung
von
Patienten
mit
angeborenen
Thrombozytenfunktionsstörungen.
Beteiligte Fachgesellschaften
Der Entwurf der Leitlinie ist im Auftrag der Ständigen Kommission Pädiatrie der Gesellschaft für
Thrombose- und Hämostaseforschung erstellt worden. Zur Teilnahme eingeladen wurden Vertreter
für die
Deutsche Gesellschaft für Transfusionsmedizin (DGTI)
Berufsverband Deutscher Transfusionsmediziner (BDT)
Berufsverband der Deutschen Hämostaseologen (BDDH)
Deutsche Gesellschaft für Kinder- und Jugendmedizin (DGKJ)
Gesellschaft für pädiatrische Onkologie und Hämatologie (GPOH)
Österreichische Gesellschaft für Kinder- und Jugendheilkunde (ÖGKJ)
Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin (DGKL)
Allen Fachgesellschaften wurde die Leitlinie zur Beurteilung und Verabschiedung vorgelegt. Es
wurden keine Änderungen vorgeschlagen.
Andere Beteiligte
Patientengruppen wurden formal nicht involviert, die Hauptautoren sind jedoch ärztliche Berater
einer großen Patienten – Selbsthilfegruppe.
Problemstellung
Angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion stellen eine heterogene Gruppe von
Erkrankungen dar, die als Teil eines Symptomenkomplex („Syndrom“) oder auch isoliert als
hämorrhagische Diathese auftreten. Die Erkrankungen sind häufig schwierig zu diagnostizieren und
es gelingt oft nicht, sie einem beschriebenen klassifizierten Krankheitsbild zuzuordnen (1),(2).
Angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion insbesondere ohne Erniedrigung der
Thrombozytenzahlen unter 100.000/µl bleiben häufig bis zum Eintritt von Blutungssymptomen
unentdeckt. Klinische Folge einer Thrombozytenfunktionsstörung ist in den meisten Fällen eine
leichte bis moderate Blutung. Durch Kofaktoren, wie Medikamente, Operationen oder andere
Herausforderungen der Hämostase kann es zu einer klinisch relevanten Blutungsneigung kommen.
Typische Symptome sind Nasenbluten, Petechien, Hämatome, Schleimhautblutungen, perioperative
Blutungen und Menorrhagien. Blutungen treten oft plötzlich und unvorhergesehen auf.
Obwohl eine Vielzahl von Analysen zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion zur Verfügung steht,
haben nur einige sich zur Unterstützung klinischer Entscheidungen durchgesetzt. Zur
Diagnosestellung empfiehlt sich eine Stufendiagnostik. Die Auswahl der Thrombozytenfunktionstests
hängt ganz wesentlich auch von den lokalen Gegebenheiten ab. In aller Regel kann durch eine
Stufendiagnostik zumindest eine Thrombozytenfunktionsstörung ausgeschlossen, oder die
Verdachtsdiagnose Thrombozytenfunktionsstörung erhärtet und bestätigt werden. Eine exakte
Klassifizierung gelingt häufig nur in enger Zusammenarbeit mit spezialisierten hämostaseologischen
Zentren.
Patientenperspektive
Die Leitlinie wurde zur Durchführung von Thrombozytenfunktionstests entwickelt.
Ziele dieser Leitlinien sind:
1) Der Patient soll von der Diagnosestellung profitieren.
2) Die Stellung der Verdachtsdiagnose/Ausschlussdiagnose soll ortsnah in einem
Gerinnungslabor mit etablierten und robusten Methoden erfolgen.
3) Die Verdachtsdiagnose/Ausschlussdiagnose soll nur so viele Schritte, wie unbedingt
notwendig umfassen.
4) Dem Kliniker sollen umfassende Informationen über weitere rationale Abklärungsschritte
verfügbar gemacht werden.
5) Sie soll die Erarbeitung lokaler SOPs für die wichtigsten Thrombozytenfunktionstests
erleichtern.
Einleitung
Die vorliegende Leitlinie soll die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytopathien/
Thrombozytenfunktionsstörungen bei Kindern und Jugendlichen erleichtern. Zur rationalen und
zielgerichteten Diagnostik wurden einzelne Kapitel erarbeitet. In einem Stufenalgorithmus wird
zunächst die Diagnose einer Thrombozytopathie gestellt. Gegebenenfalls sind die diagnostischen
Schritte individuell anzupassen, abhängig von einer positiven Familienanamnese, Alter des Kindes,
akuter und chronischer Blutungsneigung, verfügbarer Blutmenge und anderem.
Für die häufigsten und am besten charakterisierten Thrombozytopathien werden weitere
Informationen in den folgenden Kapiteln gegeben. Die wichtigsten allgemein anerkannten Methoden
Aggregometrie einschließlich Varianten und Durchflußzytometrie, sind im Detail beschrieben. Zur
Unterstützung einer Klassifizierung der Thrombozytopathie, insbesondere solcher mit
Thrombozytopenie und assoziierten Symptomen („syndromal“) ist eine Liste beigefügt (Liste:
Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter Thrombozytopathien). Die
Liste enthält detaillierte Informationen zur klinischen Präsentation, der OMIM Nummer
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) dem Vererbungsmodus, dem genetischen Defekt und die
wichtigsten Diagnosekriterien. Für die weiterführende Diagnostik stehen die spezialisierten Zentren
des Kompetenznetzes der Ständigen Kommission Pädiatrie der GTH (http://www.gthonline.org/home/paediatrische-gth/kompetenznetz/index.php) zur Verfügung.
Die Leitlinie ist nicht geeignet für die Beurteilung von Patienten die plättchenaktive Substanzen
erhalten, oder erworbene Störungen der Thrombozyten-Funktion/Zahl aufweisen.
Stufendiagnostik einer hämorrhagischen Diathese
Für eine rationale Diagnostik einer hämorrhagischen Diathese wird ein Stufenschema verwendet
(3),(4),(5),(6),(7),(8;9).
1. Syndromal: Kinder mit komplexen Erkrankungen, Auffälligkeiten der Thrombozyten – siehe Anhang/Liste
„Molekulargenetik“.
2. Siehe Anhang „Medikamentenliste“.
3. Faktor XIII Mangel wird nicht von den globalen Gerinnungstests (PT, PTT) erfasst.
4. Bei Jungen stets Faktor VIII und IX-Mangel (Hämophilie A/B) ausschließen.
5. Von Willebrand Faktor-Ag und Ristocetin Kofaktor (alternativ Kollagenbindungsaktivität), evtl.
Multimere; Faktor VIII bei erniedrigtem vWF:Ag bestimmen!
6. Inhibitoren: Lupus Antikoagulans, Antiphospholipid Antikörper, FVIII/IX/vWF Hemmkörper
ausschließen.
7. Protein Z (Relevanz umstritten).
8. In vitro Phänomen bei Verwendung von EDTA als Antikoagulans.
9. TTP häufig mit defekter vW Protease (ADAMTS 13) assoziiert. TTP kann durch P2Y12 Inhibitoren
ausgelöst werden.
10. Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) im PRP, Impedanzaggregometrie (IA) und Durchflusszytometrie im
Zitrablut.
11. Siehe www.gth-online.org, Ständige Kommission Pädiatrie Kompetenznetzwerk.
Screening Methoden
In der klinischen Routine werden keine Tests der Thrombozytenfunktion durchgeführt (2). Durch
Fortschritte in der Medizin und dem stark zunehmenden Einsatz von plättchenhemmenden
Medikamenten gibt es ein steigendes Interesse an Thrombozytenfunktionstests. Die Bedeutung
dieser
Methoden
für
die
Diagnose
und
Klassifizierung
von
angeborenen
Thrombozytenfunktionsstörungen ist beschränkt.
Für die Durchführung einer rationalen Thrombozytenfunktionsdiagnostik soll immer ein Stufenplan
(Abklärungsalgorithmus siehe oben) verwendet werden, der auch die lokalen Gegebenheiten
berücksichtigt.
Als Vorinformation sollen zumindest Angaben zur Familien- und Individualanamnese vorliegen und
eine körperliche Untersuchung durchgeführt werden. Beispiele für Fragebögen zur Blutungsneigung
sind unter www.GTH-online.org, www.oegari.at und www.netzwerk-von-willebrand.de verfügbar.
Zumindest muss nach einer Neigung zu Epistaxis, Petechien, kutanen Hämatomen,
Schleimhautblutungen,
Menorrhagie,
Weichteilund
Gelenkblutungen
sowie,
postinterventionellen/postoperativen Blutungen gefragt werden.
Leitsymptome von 123 Kindern mit klassifizierter Thrombozytenfunktionsstörung nach THROMKID
(2)
Leitsymptom
Epistaxis
Hämatome
Schleimhautblutungen
peri- / postinterventionelle Blutungen
Menorrhagie
gastrointestinale Blutungen
Haemarthros
Häufigkeit in %
54
20
11
7
5
2
1
Als Basisuntersuchung soll eine Blutbildbestimmung einschließlich Retikulozytenzahl und
Leukozytendifferenzierung erfolgen. Eine im Rahmen der Routineblutbildbestimmung an allen
marktüblichen Großgeräten verfügbare Thrombozytengrößenverteilungskurve und das mittlere
Thrombozytenvolumen sollen angefordert und evaluiert werden. Die Thrombozytengröße und
Morphologie sind in der Lichtmikroskopie in Blutausstrichen mittels der Färbemethode von MayGrünwald-Giemsa zu beurteilen.
Bei lokaler Verfügbarkeit hat sich die Thrombozytenaggregation (LTA, IA) mit mindestens drei
verschiedenen Agonisten (ADP, Kollagen und Ristocetin) als Erstuntersuchung bewährt – siehe
Kapitel Aggregometrie.
Folgende Methoden sind eingeschränkt zur Feststellung einer Thrombozytenfunktionsstörung
geeignet:
In vivo Blutungszeit (10): Es sollen nur standardisierte Verfahren nach Ivy, Duke, Mielke,
Borchgrevink oder Marx mit Surgicutt, Template, Precisette oder Hemostilette von erfahrenen
Untersuchern angewendet werden. Die Patienten sollen über die Möglichkeit einer Narbenbildung
aufgeklärt werden. Für Kleinkinder, Patienten mit Bindegewebs- und Hauterkrankungen ist die
Methode nur eingeschränkt geeignet. Mangelnde Kooperation des Patienten, Anämie und
Thrombozytopenie < 100.000/µl führen zu verfälschten Ergebnissen.
PFA 100® Verschlusszeit („in vitro Blutungszeit“) (11),(12),(13): Eignet sich insbesondere zur
Diagnose von schweren Störungen der Thrombozytenfunktion. Das von Willebrand Syndrom und die
Thrombasthenie Glanzmann führen zu einer Verlängerung der Verschlusszeit. Zu beachten ist, dass
der von Willebrand Faktor beim Neugeborenen, Schwangeren und anderen Zuständen
(Akutphaseprotein!) erhöht ist. Bei Kindern mit rezidivierenden Infekten ist mit einer großen
Variabilität der Verschlusszeiten zu rechnen. Grundvoraussetzung für die Testdurchführung ist eine
Thrombozytenzahl über 100.000/µl und ein Haematokrit über 30 l/l. Verkürzte Verschlusszeiten
werden durch Hämolyse, HKT > 50 l/l, Thrombozyten > 500.000/µl und verlängerte Verschlusszeiten
durch Ikterus, Hämolyse, Anämie (HKT < 35%), Thrombozytopenie verursacht*. Aufgrund der
angewendeten Scherkräfte ist diese Methode grundsätzlich sensitiv zum Nachweis eines von
Willebrand Syndroms, einer Thrombasthenie Glanzmann und eines Bernard-Soulier Syndroms. Die
PFA 100® Verschlusszeit eignet sich auch zum Nachweis einer durch ASS induzierten
Thrombozytenfunktionsstörung. Eine P2Y Messzelle wurde zum Nachweis einer medikamentösen
Hemmung der Thrombozytenfunktion durch den ADP-Rezeptorinhibitor Clopidogrel entwickelt. Ein
verdächtiger oder pathologischer Befund bedarf einer weiteren Abklärung.
Ungeeignete
Methoden
zur
Diagnose
und
Klassifizierung
von
angeborenen
Thrombozytenfunktionsstörungen
sind
die
native
Thrombelastographie,
der
Prothrombinverbrauchstest, der Rumpel - Leede – Test und der Thrombusretraktionstest.
Das für das drug-monitoring entwickelte halbautomatische System VerifyNow® (Accumetrics) und
das Impact-R® (Matis Medical) sind für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen
Thrombozytenfunktionsstörungen nicht evaluiert und daher nicht geeignet.
Von den individuell eingesetzten und seltenen Methoden sind das Elektronenmikroskop (ELMI) und
die histochemische Färbung von Zellen als diagnostische Verfahren anerkannt. Beide Methoden
erfordern viel Erfahrung und werden daher nur an wenigen Zentren durchgeführt. Methodik,
Befundung und Befundinterpretation unterscheiden sich wesentlich von Labor zu Labor. Hinweise
über diese Methoden überschreiten die Ziele des Leitlinienprojekts. Informationen zu
hochspezialisierten Labors können der Liste des Kompetenznetzwerks auf www.gth-online.org,
Ständige Kommission Pädiatrie, entnommen werden. Die Bedeutung der konfokalen
Lasermikroskopie als Ersatz oder Ergänzung der ELMI ist in Erforschung. Über die klinische
Anwendung der aus der Wissenschaft bekannten Durchflusssysteme (Flow Chamber), die als
standardisierte Systeme erworben werden können, kann zur Zeit noch keine Aussage getroffen
werden.
*Auf Grund des verwendeten Vollblutes kann eine Hämolyse/Ikterus nicht detektiert/ausgeschlossen werden. Hämatokrit
und Zellzahlen haben einen direkten Einfluss auf die Fließeigenschaften des Blutes. Eine Bestimmung und Beurteilung des
Blutbildes wird empfohlen.
Aggregometrie
Die Aggregometrie ist als Standarduntersuchung der Thrombozytenfunktionsdiagnostik zu
bezeichnen. Es lassen sich damit eine Vielzahl von funktionellen Eigenschaften der Thrombozyten
charakterisieren. Die Durchführung der Untersuchung, die Interpretation der Befunde und die
Zuordnung zu einem definierten Krankheitsbild stellen eine große Herausforderung dar.
Lichttransmissionsaggregometrie (LTA)
Die LTA ist auch nach über 40 Jahren seit der Erstbeschreibung durch Born der Goldstandard zur
Beurteilung der Thrombozytenfunktion (14),(6),(4),(8). Die eingeschränkte Standardisierbarkeit und
eine große Auswahl an Agonisten und deren Konzentrationen haben diese Methode in der
Vergangenheit auf die Verwendung in spezialisierten Laboren eingeschränkt. Verschiedene
Fachgruppen und Organisationen haben sich in den letzten Jahren der Standardisierung dieser
Methode gewidmet.
Prinzip:
Kontinuierliche Registrierung der im Verlauf der Aggregation sich ändernden Transmission
langwelligen Lichts.
In einem in Bewegung gehaltenem plättchenreichen Citratplasma oder in einer Suspension
gewaschener Thrombozyten kommt es nach Zusatz von Agonisten zur Aggregation.
Zunehmende Aggregation führt zum Auftreten von Aggregaten und damit zur Zunahme der
Lichttransmission, welche fortlaufend photometrisch registriert und in Kurvenform aufgezeichnet
wird.
Präanalytik
Patient
Patient kurz ruhen lassen*. Kein Fasten**, aber auf Grund des potentiellen Störfaktors
alimentäre Lipidämie vermeiden.
Medikamentenanamnese laut Medikamentenliste (siehe unten).
Medikamente registrieren und nach Möglichkeit absetzen, sofern nicht dringend medizinisch
indiziert. Gegebenenfalls bekannte Auswirkungen der Medikation bei Befundung
berücksichtigen.
o NSAR mind. 3 Tage (Unterschiedliche HWZ beachten)
o Irreversible Aggregationshemmer (ASS) mind. 10 Tage.
o P2Y12 Hemmer (z.B. Clopidogrel) mind. 7 Tage.
o GP IIb/IIIa Inhibitor (z.B. Abciximab) mind. 3 Tage.
*Der Einfluss von den Punktionsschmerz lindernden Lokalanästhetika (EMLA®) auf das Testergebnis ist
ungeklärt.
** Alimentäre Hyperlipidämie vermeiden - interagiert mit Probenanalyse.
Blutgewinnung
Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen (DIN/ISO 6710 - Vacutainer
möglich).
Natriumcitrat 109 oder 129 mM resp. 3,2 oder 3,8%.
Citrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.
bei schlechten Venenverhältnissen und kleinen Kindern ggf. abtropfen lassen.
Nadel mit 19 bis 21 gauge.
Nur leicht und nicht zu lange stauen - bei problematischer Punktion erstes Röhrchen unbedingt
verwerfen.
3 bis 4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden.
Folgeabnahmeröhrchen für Thrombozytenanalyse verwenden- unbedingt Schaumbildung
vermeiden.
Über/unterfüllte Proben ablehnen, Füllung der Röhrchen wie vom Hersteller gefordert.
Proben nicht kühlen, Transport bei Raumtemperatur-keine Rohrpost!
Angabe der Uhrzeit der Blutentnahme auf der Probe (als auch Analysezeitpunkt) verzeichnen.
Thrombozytenzahl unbedingt vor Zentrifugation bestimmen.
Probenvorbereitung
Zentrifugation bei Raumtemperatur.
Bei Thrombozytenzahl in Ausgangsprobe < 100.000/µl Probe spontan sedimentieren lassen oder
schonende Zentrifugation nach Laborspezifikation.
PRP
o 150 x g für 10 min.
o Keine Bremse.
o Für Riesenplättchen: Sedimentation für ca. 45 min, 45° Winkel für Sedimentation,
nicht aufrichten und in 45° Winkel belassen für PRP Entnahme.
PPP
o 1500 x g für 10 min.
o Qualität der Proben kontrollieren.
o Hämolytische Proben verwerfen.
o Lipidämie berichten.
o Thrombozytenzahl im PRP messen.
o Keine Einstellung der Thrombozytenzahl erforderlich wenn Thrombozytenzahl im PRP
zwischen 150.000 und 500.000/µl.
o Bei Thrombozytenzahl im PRP < 150.000/µl Kontrolle mit angepasster
Thrombozytenzahl mitmessen. Niedrige Thrombozytenzahl bei z.B. BSS, VWS Typ 2B,
Platelet-Type VWS!
o Bei hoher Thrombozytenzahl > 500.000/µl mit autologem PPP korrigieren und auf
250.000 bis 300.000/µl einstellen
Methodik
Normalkontrolle als Qualitätsstandard mindestens 1 x/Wo mitführen.
Eichung des Gerätes mit plättchenarmen autologen Plasma als Markierung der
Lichttransmission von 100%.
Plättchenreiches Plasma bezeichnet den Nullwert der Lichttransmission.
Rührgeschwindigkeit: 1000 U/min.
Temperatur: 37°C.
Kurve vor Induktorzugabe für mind. 1 min beobachten (stabile Grundlinie,
Spontanaggregation registrieren).
Agonistenmenge (wässrige Lösung) darf 10% des Probenvolumens nicht übersteigen.
Beobachtung der Kurve für mind. 10 min bzw. bis zur maximalen Amplitude.
Abschluss der Untersuchung möglichst nach 2 h spätestens 4 h nach Blutabnahme (Zeitpunkt
dokumentieren!).
Agonisten
Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.
Prinzip: zunächst niedrige Agonistenkonzentration wählen, da hohe Konzentrationen Defekte
verdecken können.
Keine sequentielle Agonistenzugabe! Ausnahme: Ristocetin.
Ristocetin: 1,2 - 1,5 mg/ml (0,5 bis 0,6 mg/ml zur Erfassung des VWS Typ 2B). Bei Neugeborenen
sind niedrigere Endkonzentrationen der Agonisten erforderlich.
Arachidonsäure: 1,0 - 1,5 mM.
ADP: 2 - 3 µM (Verdopplung der Konz. falls keine Reaktion mit niedriger Konz.) – Beurteilung der
„second wave“. Eine Probe sollte bei einer Konzentration von 2-3 µM reagieren. Nach Standzeit
benötigen Proben höhere Konzentrationen: Erhöhung auf 4 µM.
Epinephrin: 5 µM (ggf. höhere Dosis, z.B. 10 µM).
Kollagen: 0,5 – 2 (bis 4) µg/ml je nach Art des Kollagens!
TRAP: 10 µM
Beurteilung von Aggregationskurven
Für jeden Agonisten und jede Konzentration sollen hauseigene Referenzwerte durch mindestens
jeweils 20 Analysen erfolgen – besonders wichtig bei Kollagen aufgrund der unterschiedlichen
Kollagenarten mit erheblichem Einfluss auf die Testergebnisse. Normalbereiche definieren - bei
größeren Fallzahlen dafür auch Verwendung von Perzentilen möglich - als pathologisch sind alle
Werte anzusehen, die außerhalb eines Bereiches von
2 SD liegen (Normalverteilung
vorausgesetzt).
Visuelle Beurteilung der Kurven auf Plausibilität.
Obligatorischer Bericht: Latenzphase (Lag-time), maximale Aggregation, Beurteilung einer
Desaggregation (vorhanden, bei >10% ->Angabe).
Optionaler Bericht: Maximale Aggregationsgeschwindigkeit (Kurvenanstieg), Formenwandel
(shape change), Bestimmung der Fläche unter der Aggregationskurve.
Typische Befundkonstellation (LTA)
ADP
Kollagen
Arachidonsäure
Ristocetin
-
N
N-
N-
-
N
N-
N-
-
N

N
N
-
N
N
Erkrankung
Thrombasthenie Glanzmann
Bernard-Soulier Syndrom
Aspirin-like Defekte
Storage-Pool Defekt
N Aggregation normal
 Aggregation herabgesetzt
 keine Aggregation
Impedanzaggregometrie (IA) im Vollblut - Whole Blood Aggregometry (WBA)
Die Impedanzaggregometrie ist eine Variante der Aggregometrie bei der mit isotoner Kochsalzlösung
verdünnte und mit Citrat antikoagulierte Vollblutproben analysiert werden (15). Diese Methode hat
in letzter Zeit vermehrt Verwendung als point of care in semi-automatischen Geräten gefunden. Die
Standardisierung ist schwierig.
Prinzip:
Eine Halterung mit zwei Elektroden wird in die mit einem Rührstäbchen versehene, auf 37°C
erwärmte Probe eingetaucht.
Mit Zugabe eines Agonisten (Induktors) kommt es zu einer Impedanzerhöhung infolge der
Anlagerung von aggregierten Thrombozyten an den Elektroden, welche als zeitliche Funktion der
Impedanzzunahme aufgezeichnet wird.
Präanalytik
Patient
Analog zur LTA (siehe oben).
Blutgewinnung
Analog zur LTA (siehe oben).
Ausnahme: Multiplate® ist für Hirudin-antikoagulierte Proben standardisiert. Empfohlenes
Abnahmeröhrchen: Dynabite HIRUDIN 4,5 ml für Multiplate Analyse, REF:MP0620.
Geräte
Chronolog-Aggregometer® (Chronolog Corporation, HavertownUSA).
Multiplate® (Dynabyte, München, Deutschland).
Probenvorbereitung
Vor Test Blut für mindestens 10-30 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.
Im Chronolog Aggregometer Blut in die mit NaCl 0,9% vorgefüllten Küvetten im Verhältnis von
1:1 (Gesamtprobenmenge 1000 µl: 500 µl Vollblut und 500 µl NaCl 0,9%) überführen und bei 37
°C für 15 bis 20 min im Gerät vorwärmen.
Die Vollblutprobe für Multiplate laut Vorgabe (mit dem Gerät verbundene halbautomatische
Pipette) mit NaCl 0,9% verdünnen.
Agonisten (Chronolog Aggregometer)
Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten.
Gleiches Prinzip wie bei LTA: mit niedriger Agonistenkonzentration beginnen.
ADP: 10 µM (ggf. steigern auf 20 µM)
Kollagen: 1 µg/ml (ggf. steigern auf 2 µg/ml)
Arachidonsäure: 0,5 mM (ggf. steigern auf 1,0 mM)
Ristocetin: 1,25 mg/ml (0,2 – 0,6 mg/ml bei Verdacht auf VWS Typ 2B)
Agonisten (Multiplate)
ASPI-Test (Arachidonsäure) mit 1 ml AD auflösen, aliquotiert bei –20°C einfrieren, und
unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
RISTO Test (Ristocetin) mit 1 ml AD auflösen, aliquotiert bei –20°C einfrieren, und unmittelbar
vor Gebrauch auftauen.
COL Test (Kollagen) mit 1 ml AD auflösen, bei Kühlschranktemperatur (4-6°C) lagern!
ADP Test (ADP) mit 1 ml AD auflösen, aliquotiert bei –20°C einfrieren, und unmittelbar vor
Gebrauch auftauen.
TRAP Test (Thrombin Receptor Activating Peptide) mit 1 ml AD auflösen, aliquotiert bei –20°C
einfrieren, und unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Chronolog Aggregometer)
Vor Beginn der Messung Kalibration mit einer mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllten Küvette.
Charakterisierung der Aggregationskurven durch folgende Parameter:
o Obligatorisch: Maximale Aggregation (in Ohm) und Latenzphase (lag-time in s).
o Optional: Aggregationsrate (in %/min) und Fläche unter der Kurve
o Altersabhängige Referenzbereiche beachten(16),(17).
Auswertungsmodus der Aggregationskurven (Multiplate)
Parameter: Fläche unter der Kurve (Area under the curve in Units), maximale Aggregation
(Aggregation Units), Aggregationsgeschwindigkeit (velocity in U/min).
Altersabhängige Referenzbereiche, siehe (12):
Luminometrische Bestimmung der ATP-Freisetzung
Mit dieser durch Lundin et al. erstmals vorgestellten Methode wird die thrombozytäre ATPFreisetzung gemessen, wodurch Sekretionsdefekte der δ-Granula (storage pool Defekt)identifiziert
werden können(18).
Prinzip
Zitratantikoaguliertem Vollblut oder PRP wird das Luciferin-Luciferase-Reagenz (LLR) zugefügt,
welches in Gegenwart von ATP luminesziert.
Die bei der ATP-Freisetzung entstehende Lumineszens wird photometrisch von einem
Photomultiplier erfasst.
Mit Hilfe eines externen ATP-Standards erfolgt die Auswertung der ATP-Freisetzungskurve.
Gerät
Chronolog-Lumiaggregometer® (Chronolog Corporation, Havertown, USA)
Agonisten
Gesamtprobenmenge 1000 µl (450 µl Citratblut, 450 µl NaCl 0,9% und 100 µl LLR).
Ansätze nach Zugabe von LLR bei 37 °C für 2 min vorwärmen.
Kollagen: 2 µg/ml
Thrombin: 1 E/ml
Auswertungsmodus der Freisetzungskurve
Freisetzungskurve bis zum Erreichen des Peaks aufzeichnen.
Parameter zur Charakterisierung der ATP-Freisetzungskurve:
Obligatorisch: maximale ATP-Freisetzung (Berechnung erfolgt unter Verwendung eines ATPStandards mit definierter ATP-Menge, die einer separaten Probe zugegeben wird)Optional:
Reaktionszeit bis zum Erreichen des Peaks.
Altersabhängige Referenzwerte beachten (analog zur Literatur unter IA für das Chronolog
Aggregometer)
Medikamentenliste
Medikamente*, Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine mit Einfluss auf die
Thrombozytenfunktion.
Die Präparatenamen wurden der Roten Listeentnommen (eingesehen 12/2011).
Modifiziert nach (19).
Abkürzungen:
a.T.A. = abnormale Thrombozyten Aggregation
a.B.Z. = abnormale in vivo Blutungszeit
* Nicht extra aufgelistet sind Präparate bei denen die Wirksubstanz bereits im Namen erwähnt ist.
Agens
Abnormalität
Antiphlogistika
Phenylbutazone
Piroxicam
Naproxen
Acetylsalicylsäure
Diclofenac
Ibuprofen
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A./ a.B.Z.
a.T.A./ a.B.Z.; klin. Blutungen
a.B.Z.; klin. Blutungen
a.T.A.
a.B.Z.
ß-Lactam Antibiotika:
Penicilline:
Mezlocillin, Piperacillin
Ampicillin, Penicillin G/Benzylpenizillin
Cephalosporine:
Cefotaxim
Cefamandol
Nitrofurantoin
a.T.A./ a.B.Z.
klin. Blutungen
Kardiovaskuläre Medikamente
Dipyridamole
Diltiazem
Isosorbidmononitrat
Nimodipin
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
Propranolol
Verapamil
a.T.A.
a.T.A.
Nifedipin
Nitroglycerin/Glyceroltrinitrat
a.T.A.
a.T.A./ a.B.Z.
Antikoagulantien und fibrinolytische Medikamente
Heparin
Alteplase
a.T.A./ a.B.Z.
Anästhetika und Narkotika
Benzocain
Kokain
Hydroxychloroquin
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
Lidocain
Procain
Tetracain
Halothan
Morphin
NO
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
Antiepileptika
Valproinsäure/Valproat
a.T.A.
Antidepressiva
Duloxetin
klin. Blutungen
Chemotherapeutika
Asparaginase
a.T.A.
kombinierte Chemotherapie:
Cisplatin, Cyclophosphamid
Carmustein oder Melphalan, Vincristin
Carmustin, Daunorubicin
Plicamycin
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
Antihistaminika
Chlorpheniramin, Diphenhydramin, Pyrilamin
a.T.A. in vitro
Radiographische Kontrastmittel
Iopamidol
a.T.A.
Diatrizoat/Amidotrizoesäure
Meglumin Diatrizoat und Natrium Diatrizoat
a.T.A.
a.T.A.
Andere Medikamente
Guaifenesin
Montelukast
a.T.A.
a.T.A.
Granulocyte colony stimulating factor G-CSF
(Filgrastim/Lenograstim)
a.T.A.
Prostaglandine:
Alprostadil
Epoprostenol
Iloprost
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine
Ingwer
Vitamin C/Ascorbinsäure
Kreuzkümmel, Gelbwurz (Kurkuma), Nelken,
Alkohol, n-3 Fettsäuren,
Omega-3 Fisch Öl, Gingko, Ginseng
Mu-Err Pilz, Knoblauch
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A.
a.T.A./ a.B.Z.
a.T.A.
Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist als fixer Bestandteil der Zelldiagnostik etabliert. Die Beurteilung von
Thrombozyten zur Diagnose von angeborenen Störungen der Thrombozytenfunktion ist relativ neu
und unzureichend standardisiert (20). Die Durchflusszytometrie eignet sich sehr gut zur Diagnose der
Thrombasthenie Glanzmann, des Bernard-Soulier Syndroms und der Storage Pool Erkrankung (α- / δGranuladefekte). Die besonderen Vorteile liegen in geringen benötigten Blutmengen und in der
einstufigen Diagnostik mit der Möglichkeit der Identifizierung heterozygoter Träger (21).
Prinzip
Quantifizierung konstitutiver Oberflächenrezeptoren und Messung von Granulainhaltsstoffen vor
und nach Aktivierung.
Präanalytik
Patient
Blutbild einschließlich Thrombozytenzahl bestimmen!
•
•
•
•
•
Kein Fasten.
Koffeinabstinenz mind. 2 Stunden.
Nikotinabstinenz mind. 60 min.
Patient kurz ruhen lassen.
Medikamentenanamnese siehe oben.
Blutgewinnung bei Indexpatient und gesundem Kontrollproband
Nur leicht und nicht zu lange stauen.
3 bis 4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden
Unterdruck- Abnahme-Systeme vermeiden (Vacutainer).
Nadel mit 19 bis 21 gauge.
Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen
Natriumcitrat 109 oder 129 mM resp. 3,2 oder 3,8%.
Citrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile.
•
Probenverarbeitung 30 - 90 min nach Abnahme.
•
Ausschließlich Analyse von Citrat-antikoaguliertem Vollblut ohne Fixans oder Konservierung
bis 3 Stunden nach erfolgter Färbung.
•
Keine Lyse der Erythrozyten durchführen - CAVE: ATP und ADP Freisetzung.
•
Proben bei Raumtemperatur transportieren und lagern, nie kühlen!
•
Schütteln und mechanischen Stress (auch Rohrpost) für Thrombozyten vermeiden.
Inkubation ca. 15 Minuten im Dunkeln, dann mit Puffer (1%BSA auf PBS) verdünnen und
messen.
Apparative Voraussetzung
•
Durchflusszytometer -allgemeine Qualitätskontrollen werden vorausgesetzt.
•
Thrombozytenzahl: Vollblutprobe benötigt im Regelfall keine Einstellung der
Thrombozytenzahl. CAVE: Gesamtzellzahl darf nicht über der "Auflösung" des Gerätes
liegen (am FACS-Canto II z.B. 10000 Events/sec).
•
Ansatz in Polypropylenröhrchen.
•
Direkt Fluorochrom-markierte AK verwenden.
•
Schwach exprimierte Antigene mit stark fluoreszierenden Farben markieren (z.B. PE) stark
exprimierte Antigene mit schwächeren Farben markieren (z.B. FITC).
•
•
•
•
•
Positive immunologische Erkennung der Thrombozyten durch Färbung eines konstitutiv
hochexprimierten Rezeptors mit einem PE-oder PE-Cy5-markierten AK gegen CD41 oder
CD42 oder CD61.
Sichere Erkennung von schwach exprimierten Rezeptoren oder aktivierungsabhängig
exprimierten Rezeptoren durch Messung einer adäquaten Isotyp-Kontrolle vor der jeweiligen
Rezeptormessung (IgG oder IgM beachten!). Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO
(Fluorescence-minus-one)-Kontrolle verwendet werden.
Darstellung der FSC- und SSC-Signale in logarithmischer Skalierung.
Stop-Kriterium der Messung: ca. 10.000 Thrombozyten im Gate. Es wird empfohlen alle
Zellen aufzunehmen um Makrothrombozyten und Thrombozytenaggregate identifizieren zu
können.
Falls Zähl-beads verwendet werden - nicht mit Thrombozyten zusammen ansetzen.
Empfohlen werden Antikörper gegen folgende Antigene:
CD41a
CD41b
CD42a/b
CD61
CD49b
Fibrinogenrezeptor (GPIIb/IIIa) - gesamter Komplex (stöchiometrisch)
Fibrinogenrezeptor (GPIIb)
von Willebrand Faktor Rezeptor (GPIb /IX)
Fibrinogenrezeptor (GPIIIa)
Kollagenrezeptor (GPIa/IIa)
Empfohlen werden folgende Antikörper gegen aktivierungsabhängig exprimierte Antigene:
Messung nach Stimulation der Thrombozyten mit ADP und TRAP
CD62P
P-Selectin (α- Granula)
CD63
GP-53 (lysosomale und δ- Granula)
CD107a/b
LAMP-1/2 (lysosomale Granula)
PAC1
aktivierterGPIIbIIIa Komplex -Fibrinogenrezeptor (Inside-outSignaling)gemessen durch den spezifischen IgM Antikörper PAC-1.
Zur Untersuchung der δ- Granula eignet sich der Mepacrine- Assay (22).
Glanzmann- Diagnostik*: Thrombozyten-Zahl normal, Größe (Forward Scatter) normal.
CD41a (gesamten Rezeptorkomplex stöchiometrisch erkennend)-Klon P2
CD41b (GpIIb)
CD 61 (GpIIIa)
-Aktivierungsmarker PAC-1, + CD42b (als Alternative FITC-markiertes Fibrinogen statt PAC1)
Glanzmann- Typ I: CD41a < 10% (Fib.rez. homozygot verändert)
Glanzmann- Typ II: CD41a >10%
*Vereinfachte Klassifizierung in Typ I und Typ II.
Bernard-Soulier-Diagnostik: Thrombozyten-Zahl: vermindert, Größe (Forward Scatter): erhöht
CD42a (Gp IX); vermindert
CD 42b (Gp Ibα); vermindert
CD 42c (Gp Ibβ); vermindert. Es können selektiv einzelne Komponenten, oder mehrere
Untereinheiten durch stöchiometrische Bindungseffekte reduziert sein.
Vorschlag für den rationalen Einsatz der Durchflußzytometrie:
Negativkontrolle:
IgG1- FITC/ IgG1-PE (gleiche Ig- Subklasse, oder AK gegen AG, welches nicht auf Thromboyten
exprimiert ist (gegen z.B. Neutrophile (CD16))
Positivkontrolle:
CD41a- FITC/ CD42b-PE
(zur Auffindung z.B. CD31 / CD36)
Thrombasthenie Glanzmann
-IgG1- FITC/ IgG1-PE
-CD41a-FITC oder CD41b- FITC/ CD61-PE
+FSC/SSC
- normale Oberflächenpräsentation von CD62P und CD63 nach Stimulation
- keine (erhöhte) Bindung von Fibrinogen oder dem Fibrinogen simulierenden anti GPIIbIIIa
Antikörper PAC1 nach Stimulation mit ADP, Kollagen, Thrombinrezeptor PAR-1 Aktivator (TRAP).
Bernard-Soulier Syndrom:
-IgG1- FITC/ IgG1- PE oder korrekte Isotypkontrolle
-CD42a-FITC/ CD42b-PE/ CD42c
+FSC/SSC (Shift wegen Grösse)
Aktivierungsmarker:
Fragestellung:
1. ADP-Rezeptor-Stimulierbarkeit
2. Thrombinrezeptor-Stimulierbarkeit
3. Vorhandensein von Granula
4. Regelrechte Ausschüttung der Granula
Granuläre Aktivierungsmarker:
α-Granula: CD62P
lysosomale Granula: CD63
Dense-Granula: Mepacrine- Beladung oder Serotonin- Reuptake- Test
Rezeptorassoziierte Aktivierungsmarker:
PAC-1: aktivierter Fibrinogenrezeptor
Storage-Pool-Disease Diagnostik:
Aktivatoren:
Standard: ADP und TRAP-6 (SFLLRN) --< humaner Protease Activated Receptor-1 (PAR1Peptid für basale Aktivierungsuntersuchungen)
weiterführend: Kollagen und Tx-A2-Agonisten (U-46619)
Agonistenkonzentrationen:
ADP: 2 µM – 10 µM
TRAP-6: (1 -) 10 µM – 100 µM (Konzentration Produkt-abhängig!)
Inkubation mit Aktivator für 5 Minuten, anschließend für weitere 15 Minuten Ak dazu (im
Dunkeln inkubieren!), dann Abstoppen mit Puffer (1% BSA oder Albumin auf PBS) und
innerhalb 30- max. 60 Minuten messen.
Vorschlag für rationalen Einsatz der Durchflußzytometrie mit Aktivierung:
unstimuliert
5 µM ADP
10 µM TRAP-6
100 µM TRAP-6
5 µM ADP
FITC
IgG1
CD62P
CD62P
CD62P
CD62P
PAC- 1
PE
IgG1
CD63
CD63
CD63
CD63
CD41
PE-Cy5/ PE-Cy7
CD41
CD41
CD41
CD41
CD41
Arbeitsbeispiel aus der Arbeitsgruppe Harald Schulze, Berlin, (4 Farben):
Antikörper
Agonist
FITC
PE
PE-Cy5 /
PerCP
APC
K1
CD61
CD29
CD42a
CD42b
---
K2
CD49b
CD49e
CD49f
CD41a
---
K3
PAC-1
CD63
CD41a
CD62P
---
K4
---
---
CD41a
CD62P
2 M ADP
K5
PAC-1
CD63
CD41a
FMO*
5 M ADP
K6
PAC-1
FMO*
CD41a
CD62P
1 M TRAP-6
K7
FMO*
CD63
CD41a
CD62P
5 M TRAP-6
Tube
* FMO: Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO (Fluorescence-minus-one)-Kontrolle verwendet werden.
Beurteilung
Nach mittlerer Fluoreszenzintensität und Vergleich gegenüber Normalkollektiv.
Nach MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) im Vergleich zur adäquaten Isotyp- oder FMOKontrolle.
Aktivierung auch als % positive Zellen ("% over threshold")
Deskriptive Angabe des Befundes (keine Zahlen).
Molekulargenetische Methoden
Obwohl molekulargenetische Untersuchungen eine immer wichtigere Rolle spielen, sind deren
Methoden aufgrund der großen Heterogenität der angeborenen und erworbenen
Thrombozytendefekte in der klinischen Praxis von geringem Nutzen. Sie können dazu dienen eine
vermutete Diagnose zu bestätigen (23). Bis auf wenige gut definierte Erkrankungen (24),(25) kann
mittels Molekulargenetik kaum eine Diagnose gestellt werden. Große Bedeutung hat die
Molekulargenetik zur Familiendiagnostik und Bestimmung eines heterozygoten Status.
Im Anhang „Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter
Thrombozytopathien“ finden Sie eine Liste zur Unterstützung der Identifikation von angeborener
Erkrankungen mit assoziierten Thrombozytenfunktionsstörungen/-penien. Die Einteilung erfolgt nach
Adhäsions, Aggregations, Rezeptor und Signaltransduktions, Granula, zytoskelettalen Defekten und
anderen.
Autorenliste (alphabetisch):
Tamam Bakchoul [email protected] Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin
Langhansstr. 7; D-35385 Gießen, Deutschland
Frauke Bergmann
Wolfgang Eberl
[email protected]
[email protected]
MVZ Wagnerstibbe, Amedes-Gruppe, Georgstr. 50; 30159
Hannover, Deutschland
Städtisches Klinikum Braunschweig gGmbH, Freisestr. 9/10, D- 38118
Braunschweig, Deutschland
Siegmund Gehrisch [email protected]
TU Dresden, Medizinische Fakultät, Inst. f. Klinische u. Lab. Med.
Fetscherstr. 74; 01307 Dresden, Deutschland
Christof Geisen
[email protected]
Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Sandhofstrasse
1, D-60528 Frankfurt am Main, Deutschland
Saskia Gottstein
[email protected]
Klin. f. Innere Medizin-Angiologie, Hämostasiologie; Vivantes-Klinikum im
Friedrichshain; Landsberger Allee 49, 10249 Berlin, Deutschland
Susan Halimeh
[email protected]
Gerinnungszentrum Rhein/Ruhr; Königstr. 13; 47051 Duisburg,
Deutschland
Ursula Harbrecht
[email protected]
Institut für Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin der
Universität Bonn; Sigmund-Freud-Straβe, D-53105 Bonn, Deutschland
Günther Kappert
[email protected]
Gerinnungszentrum Rhein/Ruhr; Königstr. 13; 47051 Duisburg,
Deutschland
Carl Kirchmaier
[email protected]
Deutsche Klinik für Diagnostik; Aukammallee 33; 65191
Wiesbaden, Deutschland
Beate Kehrel
[email protected]
Universitätsklinikum Münster, Klinik und Poliklinik für
Anästhesiologie und operative Labormedizin; Experimentelle und
klinische Hämostaseologie; Mendelstr. 11, 48149 Münster,
Deutschland
Ralf Knöfler
[email protected]
Universitätsklinikum Dresden, Klinik u. Poliklinik für Kinder- und
Jugendmedizin, Bereich Päd. Hämatologie u. Onkologie, Fetscherstr. 74,
01307 Dresden, Deutschland
Wolfgang Lösche
[email protected]
Uni-Klinikum Jena, IFB Sepsis, Center for Sepsis Control and Care, Erlanger
Allee 101; 07747 Jena, Deutschland
Manuela Krause
[email protected]
René Mahnel
[email protected]
Haemostas. Praxis u. Labor zur Diagnostik und Therapie von
Blutgerinnungsstörungen; Gartenstr. 134; 60596 Frankfurt a. Main,
Deutschland
Oliver Meyer
[email protected]
Institut für Transfusionsmedizin, Thrombozytenlabor / Blutbank mit
Immunhämatologie CVKAugustenburger Platz 1, D-13353 Berlin,
Deutschland
Ann Kathrin Pilgrimm [email protected] Deutsche Klinik für Diagnostik; Aukammallee 33; 65191
Daniele Pillitteri
[email protected]
Hannelore Rott
[email protected]
Gerinnungszentrum Rhein Ruhr, Königstr. 13, D-47051 Duisburg,
Deutschland
Sentot Santoso [email protected] Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin
Langhansstr. 7; D-35385 Gießen, Deutschland
Annelie Siegemund [email protected] MVZ Dr. Reising-Ackermann u. Kollegen, Strümpellstr. 40; 04289
Leipzig, Deutschland
C. Schambeck
[email protected] Hämostasikum München, Haderunstr. 10; 81375 München, Deutschland
Monika Scheer
[email protected]
Päd III, Universitätsklinikum Essen, Hufelandstrasse 55, 45122 Essen,
Deutschland
Markus Schmugge
[email protected]
Kinderspital Zürich, Hämatologie, Steinwiesstr. 75, CH-8032,
Zürich, Schweiz
Thomas Scholl
[email protected]
Harald Schulze
[email protected]
Gabriele Strauss
[email protected]
Klinik für Allgemeine Pädiatrie; Charite; Labor für Pädiatrische
Molekularbiologie Ziegelstraße 5-9, D-10117 Berlin; Deutschland
Charité Campus Virchow-Klinikum; Otto-Heubner-Centrum für Kinderund Jugendmedizin Augustenburger Platz 1; D-13353 Berlin, Deutschland
Werner Streif
[email protected]
Univ.-Klinik für Pädiatrie II , Med. Uni. IBK, Anichstraße 35, A- 6020
Innsbruck, Österreich
Barbara Zieger
[email protected]
Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Universitätsklinikum Freiburg,
Deutschland
R.B. Zotz
[email protected]
Centrum für Blutgerinnungsstörungen und Transfusionsmedizin
Immermannstr. 65A, 40210 Düsseldorf, Deutschland
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Leitlinie-Thrombozytopathien

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