Silencing von Lamin A und Quantifizierung des Knock-down

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RNAi
Silencing von Lamin A und Quantifizierung
des Knock-down-Effekts mittels qPCR
EFFI REES 1 , BERNHARD KORN 2 , CORNELIA FALTER 3 , ERHARD FERNHOLZ 3
1 RZPD, DEUTSCHES RESSOURCENZENTRUM FÜR GENOMFORSCHUNG GMBH,
HEIDELBERG
2 DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM (DKFZ), HEIDELBERG
3 ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, PENZBERG
Lamine sind Strukturproteine, die eine dünne Faserschicht, die Kernlamina, bilden. Gegenwärtig sind drei Arten von Laminen in Säugerzellen
bekannt: Lamin A, B und C. Lamine sind möglicherweise beteiligt an der
DNA-Replikation, Chromatin-Organisation, Differenzierung, Stützung der
Kernstruktur, dem Wiederaufbau der Kernhülle und einigen anderen Prozessen. Wir berichten hier über „Knock-down“-Experimente mit Lamin A,
die künftig für funktionelle Untersuchungen eingesetzt werden können.
Der Effekt wurde auf drei verschiedenen qPCR-Plattformen quantifiziert.
ó Mutationen bei Lamin A können Muskeldystrophie[1], dilatative Kardiomyopathie[2],
familiäre partielle Lipodystrophie[3] und andere Erkrankungen verursachen. Um die verschiedenen Funktionen dieses über 70 kDA
großen Proteins im Detail zu analysieren, sollte die Expression blockiert werden.
Es ist erwiesen, dass das posttranskriptionelle „Knock-down“ mittels siRNA am besten
geeignet ist, um die Funktion von Molekülen
aufzuklären. Diese Methode ist wesentlich
schneller und weniger aufwändig als „Knock–
outs“ und zuverlässiger als AntisenseTechnologien[4].
Erstellung von esiWay Silencing
Resources®
Wir verwendeten die Human mRNA- und ESTSequenzen, die vom UniGeneProjekt des
National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) geclustert
wurden und erzeugten Konsensus-Sequen-
zen für jedes Cluster. Mithilfe dieser Konsensus-Sequenzen wurden wiederum Homologien zwischen menschlichen Genen
ermittelt. Wir maskierten repetitive und konservierte Sequenzen in einem Umfang, der
auf BLAST-Homologien – eingeschränkt auf
einen Erwartungswert von 0,001 – basierte.
Alle übrigen Sequenz-Fragmente jedes
Transkripts wurden nach den Regeln von
Elbashir et al.[5] und Reynolds et al.[6] analysiert, um den Gehalt an guten siRNAs innerhalb des Pools an siRNA zu bestimmen. Die
optimalen Regionen wurden für die PCRAmplifikation mit genspezifischen Primern
ausgesucht. Diese PCR-Produkte von 100 bp500 bp wurden an beiden Enden mit starken
T7-Promotoren versehen (esiWay Silencing
Resource®) und einer Qualitätskontrolle
mittels Gelanalyse oder Kapillarelektrophorese unterzogen, um die Homogenität und die
korrekte Größe eines jeden Produktes zu validieren.
Synthese von esiRNAs
500 ng esiWay Silencing Resource® RZPDp
3000C044 für Lamin A wurden für die in
vitro-Transkriptionsreaktion mittels des
Microarray RNA Target Synthesis Kits (T7)
eingesetzt. Die RNA wurde durch Isopropanolfällung gereinigt, und nach anfänglicher
Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten und
Abkühlung für eine Stunde auf Raumtemperatur wurde durch Annealing doppelsträngige RNA (dsRNA) erzeugt.
30 μg dsRNA wurden bei 37 °C für 16 Stunden mit dem X-tremeGENE siRNA Dicer Kit
verdaut und anschließend nach dem Protokoll des Anbieters gereinigt. Die gereinigten
Produkte bezeichnet man als esiRNA (engl.:
endonuclease digested siRNA).
Transfektion von esiRNA
˚ Abb. 1: Relative Quantifizierung von Lamin A-mRNA aus unterschiedlich behandelten Zellen mit dem
LightCycler 2.0-Instrument.
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Um ein Gen-Knock-down im erforderlichen
Ausmaß zu erreichen, muss die esiRNA mit
hoher Effizienz und geringer Zytotoxizität in
die Zielzellen transfiziert werden. Wir verwendeten HeLa-Zellen (DSMZ, Braunschweig,
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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Kat.No. ACC 57). Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf 24-Loch-Platten
ausplattiert. 7,4 x 104 Zellen pro Vertiefung
wurden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 x PEN/STREP und 2 mM L-Glutamin
ausgesät. Die Zellen wurden mithilfe von 5 μl
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent,
20 μl OPTIMEM und 25 μl OPTIMEM/esiRNAGemisch nach dem Anbieterprotokoll transfiziert.
RNA-Isolierung und cDNA-Präparation
48 Stunden nach der Transfektion wurde die
RNA mithilfe des High Pure RNA Isolation
Kits nach dem Anbieterprotokoll isoliert.
Ein Mikrogramm der Gesamt-RNA von
jeder RNA-Präparation wurde mithilfe des
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kits
nach Anleitung revers transkribiert.
Quantifizierung der mRNA mit dem
LightCycler® 2.0 Instrument
˚ Abb. 2: Relative Quantifizierung von Lamin A-mRNA aus unterschiedlich behandelten Zellen mit den
Real-Time-PCR-Instrumenten 7500 und 7900.
Die quantitative Real-Time-PCR wurde mit
dem LightCycler® 2.0 Instrument von Roche
unter Verwendung der LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe und des Universal ProbeLibrary Sets, Human (Sonde #9)
durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit
der LightCycler ® Software 4. Die mRNAMenge wurde gegen die Menge des Transkripts des Housekeeping-Gens HPRT1 normalisiert.
Quantifizierung der mRNA mit dem
7500 und 7900 Real-Time-PCRSystem
Alternativ wurde die quantitative Real-TimePCR sowohl mit einem 7500 Real-Time-PCRSystem als auch mit einem 7900 Real-TimePCR-System durchgeführt (beide von Applied
Biosystems) und dazu der FastStart Taqman®
Probe Master (ROX) und auch wieder die Sonde #9 des Universal ProbeLibrary Sets,
Human, verwendet. Bei den PCR-Reaktionen
im 7900 Instrument wurde die Konzentration des Referenzfarbstoffs auf 400 nM
erhöht. Die mRNA-Menge wurde gegen die
Menge des Transkripts des HousekeepingGens HPRT1 normalisiert.
Ergebnisse und Diskussion
¯ Abb. 3: Amplifikation von HPRTcDNA aus unterschiedlich behandelten Zellen mit den Real-Time-PCRInstrumenten 7500 und 7900, unter
Nutzung des FastStart TaqMan
Probe Masters.
Da Lamin A an wichtigen Interaktionen in
jeder Zelle beteiligt ist, entwickelten wir mehrere Kontrollversuche zur Differenzierung
zwischen Einflüssen von Transfektionsreagenz und Transfektionsprozedur auf die
Knock-down-Versuche. Erstens wurde siRNA
gegenüber Luciferase (Dharmacon) zusamBIOspektrum | 01.07 | 13. Jahrgang
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men mit dem gleichen Transfektionsreagenz verwendet, um die
Spezifität nachzuweisen. Zweitens wurde das Transfektionsreagenz allein verwendet, um von
den toxischen Nebenwirkungen
des Transfektionsreagenzes zu
differenzieren.
Alle Transfektionsreaktionen
wurden parallel laufen gelassen.
Visuell stellten wir in keinem Versuch signifikante Toxizitäten fest.
Daher isolierten wir die GesamtRNA der behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen und präparierten die entsprechende
cDNA mithilfe des Transcriptor
First Strand cDNA Synthesis Kits.
Die Quantifizierung erfolgte
mit drei verschiedenen RealTime-PCR-Instrumenten mithilfe der LNA-spezifischen Sonde
#9 des neuen Universal ProbeLibrary Sets. Für die relative
Quantifizierung wurde die
HPRT1-spezifische (Housekeeping-Gen) Sonde #22 verwendet.
Mit dem LightCycler® 2.0 Instrument wurde eine Knock-downEffizienz von 88 % für Lamin A
mit der esiWay Silencing Resource® RZPDp3000C044 verzeichnet (Abb. 1).
Im alternativen Assay wurde
das Knockdown von Lamin A mit
den Real-Time-PCR-Instrumenten
7500 und 7900 unter Verwendung des neuen FastStart Taqman® Probe Masters (ROX) analysiert. Die Ergebnisse erwiesen
sich als fast identisch mit den
Ergebnissen des LightCycler® 2.0
Instruments und zeigten eine
Knock-down-Effizienz von rund
90 % (Abb. 2).
Interessanterweise zeigte die
Quantifizierung der mRNA des
Housekeeping-Standards HPRT1,
die aus den unterschiedlich
behandelten HeLa-Zellen isoliert
wurde, einen ähnlichen Ct-Wert
(Abb. 3). Dies belegt, dass weder
vom Transfektionsreagenz noch
vom Lamin-A-Knock-down toxische Nebenwirkungen feststellbar sind.
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Zusammenfassung
Die Quantifizierung mit drei verschiedenen
Real-Time-PCRInstrumenten belegte die Effektivität der esiWay Silencing
Resources®, des Universal ProbeLibrary Sets und des neuen
FastStart Taqman® Probe Masters
(ROX). Bei Verwendung der alternativen Systeme ergaben sich fast
identische Messungen für das
Silencing von Lamin A.
ó
Danksagung
Diese Arbeiten wurden teilweise
mit Mitteln des Forschungsprogramms NGFN2 des BMBFPRIS08T01 finanziert.
Literatur
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Scaringe, S., Marshall, W. S., Khvorova, A.
(2004): Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnology 22: 326–330.
Korrespondenzadresse:
Effi Rees
Deutsches Ressourcenzentrum für
Genomforschung (RZPD)
Im Neuenheimer Feld 580
D-69120 Heidelberg
[email protected]