RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz

RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz
Vorlesung
System-Biophysik
9. Jan. 2008
Literatur
Martens: BIOspektrum 4/02 8. Jahrgang
M. Kuhlmann: Biol. Unserer Zeit Nr.3 (2004), S. 142.
Genregulation durch
Transkriptionsfaktoren
(Jacob&Monod)
RNA Interferenz
(Fire&Mello)
RNA Moleküle können interferieren, d.h.
insbesondere kann doppelsträngige RNA
den Abbau von RNA und damit die
posttranskriptionelle Stillegung (Silencing)
eines Gens bewirken.
Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2006
Andrew Z. Fire
and Craig C. Mello
for their discovery of
"RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Auch RNA kann komplementäre Strukturen bilden
}
Doppelstrang
(dsRNA)
The simplest of all viral life cycles.
The hypothetical virus shown
consists of a small double-stranded
DNA molecule that codes for only a
single viral capsid protein. No known
virus is this simple.
The life cycle of the Semliki forest virus.
The virus parasitizes the host cell for most of its biosyntheses.
Beispiele für virale Genome
RNAtobacco mosaic virus
parvovirus
DNAT4 bacteriophage
fX174 bacteriophages
SV40
The life cycle of a retrovirus.
The enzyme reverse transcriptase first makes a DNA copy of the viral RNA molecule and
then a second DNA strand, generating a double-stranded DNA copy of the RNA genome.
The integration of this DNA double helix into the host chromosome, catalyzed by the
viral integrase, is required for the synthesis of new viral RNA molecules by the host-cell
RNA polymerase.
Transposons
Transfektion
Plasmid-DNA
genomic
DNA
mRNA
proteins
Die Einführung von Fremd-DNA
(exogener Gene) in den Zellkern
erlaubt die Expression beliebiger
Proteine.
Nucleic acid is a potentially powerful drug:
transient expression or stable transformation of forgein genes in human cells
genomic
DNA
mRNA
proteins
therapeutic
plasmid
Gene transfer into eucaryotic cells
mechanical methods
microinjection
electroporation
chemical vectors
Ca++ phosphate
cationic polymers
cationic liposomes
non-viral
gene delivery systems
viral vectors
retroviruses (Rv)
Adenovirus (Ad)
AAV, SV40
Kationische Liposome sind effiziente TransfektionsReagenzien
„lipoplexes“
lipid-DNA-complexes
DNS
DNA
cationic
liposomes
DNA und Liposome
fusionieren zu flüssigkristallinen
Aggregaten
CATIONIC AMPHIPHILES
+
+
DOTAP
O
CH3
H3C N
CH3
H
+
+
+
+
O
O
Silvius, 1986
O
+
+
+
+
+
DDAB
H3C
H3C
+
Cationic Liposome
N
NH3
+
Pinnuduwage, B.B.A. ,1989
DOGS
NH2
O
C N
H2N
H3N
C
O
Behr, PNAS ,1989
Felgner et al. PNAS 1987
Gene Delivery Mediated by Synthetic Reagents
cationic
liposomes
- Transfer across many barriers
k0
DNA
complex formation
k1
endocytosis
k2
endosomal breakup
Golgi
DNase
ER
k3
nuclear translocation
nucleus
Monitoring Gene Expression via Reporter Genes
Green Fluorescent Protein GFP
optical real time assay
firefly enzyme:
GFP expressing cell culture
Luciferase as reporter : capable of
emitting light through ATP, O2
dependent oxidationof luciferin
bacterial enzymes:
e.g.
β-Galactosidase
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase
Ein Transkriptions-Aktivator und ein TranskriptionsRepressor kontrollieren das lac-Operon
Hefe-Zwei-Hybrid-System
englisch Yeast Two-Hybrid System (Y2H)
Der Transkriptionsfaktors GAL4 besitzt zwei verschiedene Domänen, eine
zum Binden an derDNA (Bindedomäne, GAL4-Bd) und eine, welche die
Transkription aktiviert (Aktivierungsdomäne, GAL4-AD). Es werde
künstlich Fusionsproteine der Domänen mit zwei unterschiedlichen
Proteinen erzeugt, die man Köder (Bait) und Beutetier (Prey) bezeichnet.
Der Transkription kann nur erfolgen,
wenn Bait und Prey interagieren und
die Domänen zusammenbringen.
Y2H Screening
zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen
Die offenen Fragen im klassischen Modell
der Genregulation
(bis 1998)
1. Das Problem mit der Petunie
- „cosuppression“
2. Antisense DNA
Die blaue Farbe der Petunie wird durch das
Enzym Chalkonsynthase erzeugt
Läßt sich die blaue Farbe durch Zugabe von zusätzlichen
Chalkonsynthase-Genen verstärken?
Überraschung:
Die Zugabe eines zusätzlichen Gens für ChalkonSynthase führt zur Unterdrückung der Farbe - Ein
Phänomen das man „Cosuppression“ nennt.
Die Antisense Strategie
Durch Zugabe kleiner Antisense DNA Stücke
werden spezifische mRNA Moleküle für die
Translation gesperrt
Das Experiment von Fire und Mello
RNA carrying the code for a muscle protein is injected into the worm C.
elegans. Single-stranded RNA has no effect. But when double-stranded RNA
is injected, the worm starts twitching in a similar way to worms carrying a
defective gene for the muscle protein.
RNA silencing
1. DICER: analog einer
RNase III
2. siRNA
(small interfering RNA)
3. RISC: RNAi-induzierter silencing complex
(mit unbekannter Untereinheit : SLICER)
Standardmodell für RNAi:
RISC:
RNAi-induzierter
silencing complex
(mit unbekannter Untereinheit : SLICER)
doppelsträngige RNA wird von Dicer (ein Homolog der dsRNAspezifischen RNase III) in siRNAs zerlegt, siRNAs werden von RISC
gebunden und entwunden, der Antisense-Strang spezifiziert RISC
(RNA Induced Silencing complex mit ssRNase-Aktivität) zur
Degradation der Ziel-mRNA.
Alternativer RNAi Mechanismus
Entwundene siRNAs dienen der RNA
abhängigen RNA-Polymerase RdRP
als Primer, sodass mit der mRNA als
Matrize ein neuer Doppelstrang
gebildet wird. Weil dieser Doppelstrang
wieder als Substrat für Dicer dienen
kann, ist die mRNA Degradation durch
RISC theoretisch nicht erforderlich.
Verbindung zwischen Antisense RNA und RNAi
Natürliche Funktionen des Gene Silencings
Zelluläre Funktionen von RNAi
Abbau aberranter RNAs und RNA-Bruchstücke
Post-transkriptionale Genregulation durch endogene
Antisense-RNAs
Unterdrückung von springenden Genen (Transposons)
Erhalt der Chromosomenintegrität durch RNA-vermittelte
DNA Methylierung
Abwehr von Retroviren (z.B. Aids, TMV etc.)
Retro-Virus indiziertes Gene Silencing
Molekulare Geschwister:
siRNA und miRNA
endogen codierte micro-RNA
(miRNA) wird durch den
RNAi Mechanismus in
Bruchstücke zerlegt die
spezifisch die Translation
unterdrücken können.
Gene „knock down“
Die siRNA werden in isolierte Zellen
eingebracht (transfiziert) und die mRNA des
Zielgens wird abgebaut. Die resultierende
Verringerung der Genprodukte (knock down)
ermöglicht es, Hinweise auf die
physiologische Bedeutung des betreffenden
Genes zu erhalten.
genomic
DNA
mRNA
RISC
proteins
siRNA
Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs
mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494-8.
Beispiel : siRNA zur Bekämpfung von HIV
Ansatzpunkte für siRNA bei HIV: Angriff auf virale RNA: Hier kann gleich
die RNA nach dem Eindringen in die Zelle angegriffen werden, noch bevor
die Reverse Transkriptase die virale RNA in cDNA umwandeln kann.
siRNA Therapieansatz gegen Krebs
Einsatzmöglichkeiten von siRNA bei Krebserkrankungen ist z.B. die Unterdrückung des
mutierten p53-Proteins. Wildtyp-p53 funktioniert als Tumorsuppressor, indemes die Zelle
dazu zwingt, in Apoptose oder einen Zellzyklus-arrest überzugehen. Eine sporadisch
entstandene Mutation in einem Allel des p53-Gen wirkt dominant und kann so den Eintritt in
die Apoptose oder den Zellzyklusarrest verhindern. siRNA-vermittelte Inhibition des
mutierten p53-Allels könnte daher die Krebsentstehung verhindern.
Zusammenfassung
RNAi ...
* Kann Verdau von mRNA triggern
* Benötigt „Dicer“, „RISC“ und RdRP
* Ist in der Lage spezifische mRNA (damit Gene) auszuschalten
* Ist Teil eines “alten” molekularen Immunsystems zur RNA Kontrolle
* Ist auf zwei Arten für die Gentechnik von hoher Bedeutung
a) Therapeutisch b) Research Bereich