Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und Circulardichroismus

Functional Genomics in Biotechnologie,
Land- und Forstwirtschaft
Zeitaufgelöste
UV-Vis, Fluoreszenz und
CirculardichroismusSpektroskopie
Christian Obinger
Molekülspektroskopie
10- -3
Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und
Circulardichroismus-Spektroskopie
PiStar-180 UV-Vis, Fluoreszenz und CD Multi-mixing Stopped-flow Spektrometer
von Applied Photophysics
Zeitauflösung:
Stopped-flow Spektroskopie
Konventionelle Stopped-flow
Technik:
A+BC
Detektion ab 1,5 ms:
Sample-handling unit
UV-Vis (Monochromator, Dioden-Array)
Fluoreszenz
Circulardichroismus
Zeitauflösung:
Stopped-flow Spektroskopie
Sequentielle Stopped-flow
Technik (Multi-mixing)
A + B C (ageing: ms - s)
D+E
Detektion ab 1,5 ms:
UV-Vis (Monochromator,
Dioden-Array)
Fluoreszenz
Circulardichroismus
Circulardichroismus-Spektroskopie
Unter Circulardichroismus versteht man den
Unterschied in der Lichtabsorption von rechtsund links- polarisiertem Licht. Die meisten
Biomoleküle zeigen Circulardichroismus!
Elliptizität
180
250
Circulardichroismus-Spektroskopie
180 – 250 nm
Sekundärstruktur von
Peptiden und Proteinen
250 – 340 nm
Aussagen zur Tertiärstruktur von
Proteinen
CD-Signale von aromatischen
Aminosäuren (Phe, Tyr, Trp)
und Disulfidbindungen (Cystin)
180 – 320 nm
Aussagen zu Struktur von DNA und
RNA
CD-Signale von den Purin- und
Pyrimidin-Basen
Circulardichroismus-Spektroskopie
CD-Spektren verschiedener
β-Proteine
+ Mo
- Mo
CD-Spektren des
Mo-sensing protein aus E. coli.
Circulardichroismus-Spektroskopie
350 – 800 nm
Strukturelle Information über aktives
Zentrum von Proteinen bzw. Enzymen
CD-Signale von prosthetischen Gruppen
(z.B. Häm oder Flavin oder Metall),
Cofaktoren (z.B. NAD(P)H) oder Liganden.
CD-Spektrum eines
Flavocytochroms
Fette Linie:
Intaktes Flavocytochrom
Strichlierte Linie:
Stöchiometrische
Mischung aus getrennt
exprimiertem Cytochromund Flavoprotein
Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und
Circulardichroismus-Spektroskopie
ANWENDUNGEN
Beispiele:
n
Aufklärung von Enzymmechanismen
Identifizierung von Enzymintermediaten
Bestimmung von Geschwindigkeitsskonstanten
Bestimmung thermodynamischer Größen
(Aktivierungsenergie, Enthalpie, Entropie, Freie Enthalpie,
Gleichgewichtskonstanten, Reduktionspotentiale usw.)
Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und
Circulardichroismus-Spektroskopie
ANWENDUNGEN
Beispiele:
o
Aufklärung der Wechselwirkung Ligand mit
Protein/Enzym bzw. DNA/RNA
Beispiele:
Ligand-Rezeptorwechselwirkung
Ligand-Prosthetische Gruppe
Ligand-DNA
p
Aufklärung der Wechselwirkung Protein-DNA
Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und
Circulardichroismus-Spektroskopie
ANWENDUNGEN
Beispiele:
q
Strukturinformation von Peptiden/Proteinen bzw.
DNA/RNA
Rekombinante Proteine
Proteinengineering
Membranproteine
Kinetik der Proteinfaltung (Faltungsintermediate)
Qualitätskontrolle von Biomolekülen (thermodyn. Parameter)