97016671 - cobeq-ic 2009 - Universidade Federal de Uberlândia

BIOSSÍNTESE DE GOMA XANTANA AVALIADA POR ESPECTROSCOPIA IV
1
Elizângela Maia e Sá, 2 Sandra Faria, 3 Vicelma Luiz Cardoso
1
Bolsista de Programa de Ensino (PIBEG/UFU), discente do curso de Graduação em Engenharia Química
Bolsista de Pós-Graduação (FAPEMIG/UFU), discente do curso de Pós-Graduação em Engenharia Química
3
Professora da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG
2
1,2,3
Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121,
Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100.
e-mail: [email protected]
RESUMO - O desenvolvimento deste estudo através da biotransformação da sacarose contida
no caldo de cana-de-açúcar visou à produção de goma xantana por fermentação submersa,
assim como a determinação espectroscópica IV dos grupamentos funcionais existentes no
biopolímero. As respostas monitoradas foram: concentração celular, conversão de substrato a
produto e viscosidade da solução de xantana a 1%, para concentrações de sacarose de
15,0 g/L, 25,0 g/L ou 35,0 g/L. Os valores obtidos para conversão foram 0,29, 0,58, 0,43 g.g-1,
respectivamente, enquanto nesta ordem, a viscosidade alcançada a 0,75 s-1 para a solução de
xantana a 1% foi 8814, 20500, 7360 cP. Para o ensaio realizado empregando 25,0 g/L de
sacarose avaliou-se o espectro IV da goma produzida em decorrência dos resultados
relevantes apresentados tanto para a conversão quanto para a viscosidade. Observou-se as
bandas pertinentes à deformação axial de grupos hidroxila (-OH), da ligação (C-H), da carbonila
(C=O) e de C-O e de deformações angulares de C-H nitidamente, pois, cada grupo funcional
absorve em freqüência característica de radiação na região do IV. A interpretação cuidadosa do
espectrograma da amostra revela pico a pico boa prova para identificar previamente a
bioestrutura, sendo que, similaridades e diferenças encontradas podem estar associadas às
condições de processo.
Palavras-Chave: biopolímero, goma xantana, espectroscopia IV.
INTRODUÇÃO
A goma xantana é um biopolímero
classificado
como
hetero-exopolissacarídeo
ramificado, aniônico, produzido por fermentação,
empregando a bactéria Xanthomonas.
Dentre
as
gomas
produzidas
por
microorganismos, a xantana ocupa lugar de
destaque no mercado por apresentar propriedades
reológicas bastante distintas e incomuns, tais
como: alto grau de pseudoplasticidade, elevada
viscosidade mesmo a baixas concentrações,
compatibilidade e estabilidade com a maioria dos
sais
metálicos,
excelente
solubilidade
e
estabilidade tanto em meio ácido quanto alcalino,
resistência à degradação a elevadas temperaturas,
assim como, a oscilações de pH. A goma exibe
inúmeras
vantagens
como
espessante,
estabilizante, gelificante, agente de suspensão e
de floculação nas indústrias alimentícia, petrolífera,
farmacêutica, cosmética, de tintas, têxtil e de
produtos agrícolas (Mulchandani et al., 1988;
Ashtaputre e Shah, 1995).
A posição privilegiada do Brasil como maior
produtor de cana-de-açúcar é um fator que
contribui e impulsiona pesquisadores a criarem
novas alternativas para viabilizar processos
biotecnológicos empregando caldo de cana como
matéria-prima.
A espectrofotometria é o processo
instrumental
de
medição
baseado
nas
propriedades de absorção e emissão de energia
eletromagnética em alguma região do espectro
eletromagnético. Algumas das vantagens dessa
técnica são: a facilidade de preparação das
amostras e a possibilidade do uso em filmes
sólidos em amostras líquidas e gasosas.
A espectroscopia no infravermelho é
certamente uma das técnicas analíticas mais
importantes para a química. Através da
espectroscopia
no
infravermelho
pode-se
identificar compostos orgânicos e inorgânicos.
Esta análise tem sido amplamente empregada
para identificação de biopolímeros, entre outras
utilidades, como análise de misturas complexas
como gasolina e poluentes atmosféricos.
A energia denominada infravermelho
corresponde à região do espectro eletromagnético
situada na faixa de número de ondas entre 14290
e 200 cm-1.
Diferentemente das radiações nas regiões
do ultravioleta e do visível, que ao incidirem sobre
uma molécula causam transições eletrônicas, a
radiação infravermelha causa alteração nos modos
rotacionais e vibracionais das moléculas.
Os átomos podem se mover um em relação
ao outro, ou seja, o comprimento da ligação pode
aumentar ou diminuir, ocasionando o estiramento
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
(deformação axial) da ligação. Ocorrendo variação
no ângulo das ligações, diz-se de uma deformação
angular (Barbosa, 2007).
Esse estudo visa avaliar a biossíntese de
goma xantana através de espectroscopia IV, com
a identificação parcial da estrutura molecular do
composto, comparando a mesma com uma goma
xantana comercial.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microrganismo e Meios de Manutenção
Foi utilizada a bactéria Xanthomonas
campestris pv. campestris NRRL B-1459, fornecida
pela Coleção de Cultura Tropical da Fundação
André Tosello.
As linhagens da bactéria Xanthomonas
campestris pv. campestris foram mantidas em
meio YMA (extrato de levedura, malte e ágar)
(Nakajima et al., 1990) com a seguinte
composição em g/L: glicose 10,0; extrato de
levedura 3,0; extrato de malte 3,0; peptona 5,0;
ágar 18,0. O pH do meio foi ajustado para 6,0 pela
adição de HCl (0,1 N) e a esterilização foi a 110 ±
0
1 C por 20 minutos.
Matéria-Prima
Os
experimentos
foram
conduzidos
empregando caldo de cana como fonte de
sacarose. A cana foi coletada, moída, e o caldo
filtrado foi armazenado em baixa temperatura
(-5ºC) durante toda a fase experimental sob
condições assépticas.
Produção de Goma Xantana em Fermentador
Utilizou-se como inóculo, 10% (v/v) de um
cultivo crescido sob agitação (150 rpm) em mesa
agitadora, a temperatura de 28 ± 1oC, por
24 horas. O meio utilizado para preparação do
inóculo era constituído em g/L: sacarose 20,0;
extrato de levedura 3,0; NH4NO3 0,86 ; Na2HPO4
2,5; KH2PO4 2,5 (Alves, 1991; Lima, 1999). A
concentração celular média do inóculo foi de 0,29
± 0,05 g/L.
Os
ensaios
foram
realizados
em
fermentador Biostat-B com 2,0 L de capacidade,
contendo 1,5 L de meio de produção. O meio de
produção era constituído em g/L por: sacarose
(15,0 g/L, 25,0 g/L ou 35,0 g/L), extrato de
levedura (3,0 g/L), NH4NO3 (0,86 g/L), Na2HPO4
(2,5 g/L), KH2PO4 (2,5 g/L) e antiespumante.
Durante o processo, a agitação e a aeração foram
mantidas em 750 rpm e 0,5 vvm (Amanullah et al.,
o
1998; Lima, 1999), a temperatura foi de 28 ± 1 C e
o tempo de 24 horas.
Determinação Quantitativa da Sacarose
A sacarose foi hidrolisada, para obter
glicose e frutose, e determinada por método
enzimático utilizando o kit glicose-oxidase (GPOPAP, cepa) (Shu e Yang, 1990). Após a reação
enzimática, a intensidade da cor da solução era
medida a 500 nm em espectrofotômetro Thermo
Spectronic modelo Genesys 10 UV.
Determinação da Biomassa por Massa Seca
O mosto foi diluído 1:1 em solução salina a
0,85% (De Vuyst e Vermeire, 1994) e as células
foram separadas por centrifugação em centrífuga
Beckman Coulter Avanti J-25 a 18900 g por
30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas
em solução salina 0,85% para eliminação dos
componentes do meio e dos metabólitos. A
quantificação celular foi feita por massa seca a
90°C ± 1°C, em estufa, até peso constante.
Recuperação e Purificação da Goma
O mosto fermentado diluído em água na
razão de 1:1, foi processado em centrífuga
Beckman Coulter Avanti J-25, para retirada das
células, a 18900 g por 40 minutos. O sobrenadante
foi filtrado a vácuo e tratado com solução de KCl e
o polímero recuperado por precipitação com etanol
(Ramírez et al., 1988). Após procedeu-se à
lavagem do precipitado com soluções de etanol
em concentrações crescentes iguais a 70%, 80%,
90% e etanol absoluto, o qual permaneceu em
contato por cerca de 10 minutos (Alves, 1991). A
secagem do produto foi realizada em placas de
Petri recobertas com filme plástico perfurado e
o
mantida em estufa à temperatura de 30 ± 1 C.
Avaliação do Comportamento Reológico
A reologia da solução polimérica a 1% foi
determinada com o auxílio do reômetro Brookfield
RVDVIII. Para tal, foram utilizados os dados de
tensão cisalhante, medidos a partir de taxas de
deformação, seguindo o modelo de Ostwald de
Waele ou power-law (Chhabra e Richardson,
1999). Assim, a viscosidade absoluta para um
fluido “power-law” foi determinada a partir da
Equação 1:
µa =
τ
n −1
= K (γ )
γ
(1)
Sendo: µa - viscosidade aparente; τ - tensão
cisalhante; γ - taxa de deformação; K - índice de
consistência; n - índice de comportamento.
Preparo da Solução 1% de Goma Xantana para
Análise Reológica
o
Após secagem em estufa a 30 ± 1 C, a
goma foi triturada na forma de pó para hidratação
da sua solução 1%, segundo López et al. (2003).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os experimentos foram conduzidos em
reator nas seguintes concentrações de sacarose
15,0, 25,0 e 35,0 g/L. Os níveis de agitação,
aeração e temperatura foram 800 rpm, 0,5 vvm e
o
o
28 ± 1 C, respectivamente (Lima, 1999).
Avaliando os experimentos na Tabela 1,
observou-se que com 25 g/L de sacarose para um
-1
tempo igual a 24 h, tanto conversão (0,579 g.g )
como viscosidade da solução de xantana a 1%
(20493,7 cP) expressaram as respostas mais
promissoras. A concentração máxima de goma
alcançada nessa combinação foi 15,100 g/L e a
concentração celular máxima de 2,740 g/L com
12 h de processo.
Tabela 1 - Valores obtidos para as respostas
relativas às diferentes concentrações de sacarose
(g/L).
No Concentração Tempo ΥP/S Viscosidade
exp. de sacarose
(h)
(g.g-1) da goma a
(g/L) (X1)
(X2)
0,75 s-1 (cP)
1
15
24
0,285
8813,6
24
24
0,579
0,431
20493,7
7356,3
3.0
27.0
15
22.5
12
18.0
1.8
13.5
X
S
1.2
P
9
6
9.0
0.6
Concentração de goma - P [g/L]
2.4
Substrato - S [g/L]
A espectrofotometria é o processo
instrumental
de
medição
baseado
nas
propriedades de absorção e emissão de energia
eletromagnética em alguma região do espectro
eletromagnético. Algumas das vantagens dessa
técnica são: a facilidade de preparação das
amostras e a possibilidade do uso em filmes
sólidos em amostras líquidas e gasosas.
Esta análise tem sido amplamente
empregada para identificação de biopolímeros e foi
realizada com as amostras purificadas das gomas
produzidas e da goma comercial, através de
pastilhas de KBr, em Espectrômetro marca Perkin
Elmer, Spectrum 1000, FT-IR Spectrometer. A
espectroscopia
de
infravermelho
fornece
informações
importantes
a
respeito
da
caracterização da estrutura molecular e dos
grupamentos
funcionais
existentes.
A
heterogeneidade
da
composição
em
monossacarídeos da xantana e a formação de
interações intermoleculares que normalmente
ocorrem no metabolismo tornam esta técnica
complexa (Botelho, 1999). Uma vez determinados
os espectrogramas das gomas pesquisadas e da
xantana comercial, a comparação dos vários picos,
e a consulta em tabelas constitui boa prova de
identificação das estruturas moleculares do
composto.
25
35
A Figura 1 mostra a evolução da
concentração celular, do consumo de sacarose e
da concentração de goma em função do tempo pra
a fermentação com concentração inicial de
sacarose de 25 g/L.
Crescimento celular - X [g/L]
Espectroscopia na Região do Infravermelho
das Gomas Produzidas
2
3
3
4.5
0.0
0.0
0
10
20
0
30
Tempo [h]
Figura 1 - Evolução da concentração celular (),
concentração de sacarose (25,0 g/L de sacarose
inicial) (o), concentração de goma xantana ()
durante a fermentação.
Lima (1999) atingiu o máximo de 15 g/L de
biopolímero quando o processo foi conduzido com
Xanthomonas campestris pv. campestris LFR-4. Já
para as linhagens NRRL B-1459 e LFR-3, a
concentração de goma foi 12,5 e 8 g/L,
respectivamente. Para a mesma linhagem de
Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B1459, o valor da concentração de goma
encontrado nesse trabalho foi significativamente
maior do que o encontrado por Lima (1999), para
condições de processo similares, com exceção da
matéria-prima empregada, no caso este autor
utilizou glicose.
El-Salam et al. (1994) pesquisaram a
produção de goma xantana por Xanthomonas
campestris E-NRC-3 a partir de xarope de caldo de
cana e alcançaram para 3,0% de açúcar total no
meio fermentado 15,5 g/L de xantana e uma
conversão de substrato a produto de 0,58 g.g-1,
resultados que estão bastante próximos aos
obtidos nesta pesquisa.
Bilanovic et al. (1994) utilizando resíduos
cítricos e um meio padrão à base de glicose
obtiveram para 24 h de processo de 2,0 a 4,0 g/L
de xantana em média, resultados estes bastante
inferiores aos alcançados nesta pesquisa.
Espectroscopia na região do infravermelho
numa
O espectro de infravermelho (IV) consiste
metodologia adotada para detectar
similaridades ou diferenças na estrutura química
da goma produzida no laboratório e da comercial.
Analisando o espectro de IV da goma obtida
na concentração de sacarose de 25 g/L e da
xantana comercial na Figura 2 pode-se observar
que a banda característica da deformação axial de
grupos hidroxila (-OH) ocorreu entre 3200 a
-1
3450 cm , mostrando a presença de álcoois e
fenóis associados por ligação de hidrogênio.
120
Transmitância (%)
100
80
60
produzida neste trabalho e as gomas comerciais
utilizadas pelos autores.
CONCLUSÃO
Os melhores resultados obtidos em
fermentador foram com concentração de sacarose
25 g/L em tempo de 24 h. Neste ensaio obteve-se
a concentração de goma de 15,100 g/L, a
-1
conversão de substrato a produto de 0,579 g.g e
a viscosidade da solução de goma a 1% de
20.493,7 cP.
Os espectros de Infravermelho IV da goma
xantana comercial foram bastante similares àquele
obtido para a situação de concentração de
sacarose de 25 g/L no meio de produção pela
linhagem de Xanthomonas campestris pv.
campestris NRRL B-1459.
40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
20
Xantana Comercial
Xantana (25g/L)
0
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
-1
Número de ondas (cm )
Figura 2 - Espectro na região do infravermelho da
amostra de xantana produzida a uma concentração
de sacarose de 25 g/L comparado com uma goma
comercial.
-1
A banda em torno de 2850 a 2950 cm é
atribuída à deformação axial da ligação C-H e
CHO.
A banda característica da deformação axial
da carbonila (C=O) de ésteres, ácidos carboxílicos,
aldeídos e cetonas apareceu nitidamente em 1710
-1
-1
cm a 1730 cm . Na região entre 1530 a 1650 cm
1
observou-se a banda característica de
deformação axial de C=O de enóis (β-dicetonas).
-1
Em 1420 a 1430 cm , deformação angular
-1
de C-H e entre 1050 a 1150 cm , notou-se uma
deformação axial de C-O, típica de éteres, alcoóis,
fenóis, ácidos graxos, ésteres e anidridos
(Barbosa, 2007).
As bandas características dos grupos
funcionais encontrados foram os mesmos tanto
para a goma de origem comercial quanto para os
ensaios realizados neste estudo.
Logo, verificou-se que o espectro de IV da
goma comercial é bastante similar àquele obtido
para concentração de sacarose de 25 g/L no meio
de produção pela linhagem de Xanthomonas
campestris pv. campestris NRRL B-1459.
Comparando os espectros obtidos nesse
estudo com aqueles realizados por Su et al.
(2003), trabalhando com goma xantana e goma
xantana modificada quimicamente visando elevar a
taxa de dissolução das mesmas, conclui-se que o
formato dos picos apresenta similaridade,
comprovando assim a semelhança entre a goma
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao apoio financeiro
da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Minas Gerais) – Brasil.