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Transcrição

Mariana Castanheira
Caracterização de genes que codificam β-lactamases mediados por
integrons de classe 1 em amostras de Pseudomonas aeruginosa.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina para obtenção de título de
Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Universidade Federal de São Paulo
Co-orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari
Universidade Federal de São Paulo
São Paulo 2005
Castanheira, Mariana
integrons de classe 1 em amostras de Pseudomonas aeruginosa/Mariana
Castanheira. -- São Paulo, 2005.
xvi, 96 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação Ciências Básicas em Doenças Infecciosas e
Parasitárias.
Título em Inglês: Characterization of the β-lactamase encoding genes carried by
class 1 integrons in Pseudomonas aeruginosa isolates
1. β-lactamase, 2. Pseudomonas aeruginosa, 3. integrons
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Antonio Roberto Chacra
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
iii
Mariana Castanheira
integrons de classe 1 em amostras de Pseudomonas aeruginosa.
Banca examinadora:
Profa. Dra. Beatriz Meurer Moreira
Profa. Dra. Rosa Maria Silva
Prof. Dr. Sérgio Barsanti Wey
Dra. Silvia Costa
Profa. Dra. Elza Mazae Mamizuka
Dra. Luci Corrêa
iv
Dedico esse trabalho ao meu marido Rodrigo
que dividiu comigo todos os momentos
importantes durante esses últimos anos.
v
Agradecimentos
À minha orientadora Profa. Ana Cristina Gales, por dividir comigo suas
experiências e por ter reconhecido minha dedicação. Muito obrigada por ter apostado
em mim como o futuro do Laboratório ALERTA.
Ao meu co-orientador Prof. Antonio Carlo Campos Pignatari pelas oportunidades
que me foram e são dadas e pela confiança em meu trabalho.
Aos meus pais Reinaldo e Ana Maria e minhas irmãs Carolina e Camila que me
dão apoio e carinho inestimáveis.
Aos Professores Hélio Silva Sader e Ronald N. Jones que me deram uma
oportunidade muito valiosa, tornando possível meu estágio na University of Bristol,
Inglaterra.
Aos colegas do Laboratório ALERTA, do Laboratório Especial de Microbiologia
Clínica e do Laboratório IDIPA, pelas alegres conversas nos momentos de
descontração.
Aos professores e funcionários da Disciplina de Doenças Infecciosas e
Parasitárias da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP e do Instituto Paulista de
Doenças Infecciosas e Parasitárias pela ajuda e apoio nos momentos necessários.
Aos meus mentores Prof. Timothy R. Walsh e Dr. Mark A. Toleman que me deram
infinitas oportunidades, que tanto me ensinaram e a quem eu devo a realização desse
trabalho.
vi
Aos Professores Peter M. Bennett, Mathew Avison, Jim Spencer e Steve G.
Burston, da University of Bristol, pessoas brilhantes com quem tive o prazer de conviver
e que foram sempre muito solícitos nos momentos em que eu precisei de conselhos.
Não tenho palavras em português ou em inglês para agradecer às pessoas com
quem convivi em na University of Bristol, na Inglaterra. Amigos que jamais me deixaram
sentir só num país estrangeiro, que me ensinaram inglês, francês, genética,
enzimologia e muito mais, e que ainda, foram muito importantes para mim pelo
reconhecimento e pelo respeito que tiveram com meu trabalho.
Esse trabalho foi realizado com auxílio técnico e científico da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES.
vii
Sumário
Agradecimentos.............................................................................................................. vi
Sumário ........................................................................................................................ viii
Quadro............................................................................................................................ ix
Tabelas............................................................................................................................ x
Figuras............................................................................................................................ xi
Abreviaturas .................................................................................................................. xii
Apresentação ............................................................................................................... xiii
1
Introdução ................................................................................................................1
1.1
Pseudomonas aeruginosa..........................................................................1
1.2
Resistência aos β-lactâmicos em P. aeruginosa........................................3
1.2.1
Alteração de proteínas de membrana externa ....................................4
1.2.2
Hiperexpressão de sistemas ou bombas de efluxo.............................5
1.2.3
Alteração das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs)......................7
1.2.4
Produção de β-lactamases .................................................................8
1.2.4.1 Cefalosporinases cromossomais .................................................11
1.2.4.2 β-lactamases de espectro ampliado em P. aeruginosa................12
1.2.4.3 Metalo-β-lactamases....................................................................16
1.3
Disseminação horizontal de genes de resistência ...................................18
1.3.1
2
Integrons ...........................................................................................19
Artigos ....................................................................................................................22
2.1.
Artigo I ................................................................................................................22
2.2.
Artigo II ...............................................................................................................28
3
Discussão...............................................................................................................61
4
Referências ............................................................................................................67
viii
Quadro
QUADRO 1 – Características funcionais e moleculares dos principais grupos de βlactamases. ...................................................................................................................10
ix
Tabelas
Artigo II
TABLE 1. Oligonucleotides used as primers for PCR amplification and sequencing. ...53
TABLE 2. Antimicrobial susceptibility patterns of the five GIM-1 producer isolates from
Dusseldorf, Gemany, submitted to SENTRY Antimicrobial Surveillance Program in
2002...............................................................................................................................54
TABLE 3. Steady-state kinetic parameters of the purified GIM-1 in comparison with
those of IMP-1, VIM-1, VIM-2 and SPM-1. ....................................................................55
x
Figuras
Figura 1. Representação esquemática de um integron da classe 1 e de um gene
cassete circular livre. .....................................................................................................21
Artigo I
Figure 1. Schematic representations of different blaGES-1 containing integrons (a, b, c).
......................................................................................................................................27
Artigo II
FIGURE 1. Phylogenetic tree obtained for major classes of mobile metallo-βlactamases. The alignment is used was performed with CLUSTAL W. .........................56
FIGURE 1. Phylogenetic tree obtained for major classes of mobile metallo-βlactamases. The alignment is used was performed with CLUSTAL W. .........................56
FIGURE 2. Aligment of the amino acid sequence of GIM-1 with three representatives of
the MβL groups, IMP-1, VIM-1 and SPM-1....................................................................58
FIGURE 3. (a) Agarose gel electrophoresis: (M) 1kb plus ladder, (P) probe (TD)
genomic DNA, and (p5671) plasmid from strain 73-5671. .............................................59
FIGURE 4. Schematic representation of integron In77 carrying blaGIM-1 ....................60
xi
Abreviaturas
EUA – Estados Unidos da América
NNIS – National Nosocomial Infection Surveillance System
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
ESBLs – Extended spectrum β-lactamases
OMP – Outer membrane protein
PBPs – Penicilin binding proteins
MβLs – Metalo-β-lactamases
UFC – Unidades formadoras de colônia
EDTA – Ácido etileno-diamino-tetracético
MIC – Minimum inhibitory concentration
CS – Conserved sequence
PCR – Polimerase chain reaction
G – Guanosina
ICU – Intensive care unit
y/o – years old
PFGE – Pulsed field gel electrophoresis
IEF – Isoelectric focusing
IS – Insertion sequence
59-be – 59 base element
xii
Apresentação
Nesta tese de doutorado são apresentados dois trabalhos, recentemente
publicados no jornal Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Esses trabalhos relatam
a presença de genes que codificam β-lactamases mediados por integrons da classe 1
em amostras de Pseudomonas aeruginosa. As β-lactamases são determinantes de
resistência importantes, uma vez que a presença destas enzimas em patógenos
clinicamente relevantes, como P. aeruginosa, limita as opções de tratamento para as
infecções causadas por esses agentes. A presença de β-lactamases em estruturas
genéticas móveis, como os integrons da classe 1, é um tema atual e que aumenta as
preocupações com a disseminação desses determinantes de resistência entre
populações bacterianas da mesma espécie e de espécies diferentes que ainda
apresentam sensibilidade aos β-lactâmicos.
Os trabalhos apresentados foram realizados durante uma parceria entre o
Laboratório Especial de Microbiologia Clínica da Disciplina de Doenças Infecciosas e
Parasitárias da Universidade Federal de São Paulo; o centro coordenador do Programa
SENTRY de Vigilância aos Antimicrobianos, Laboratório JMI/The Jones Group (North
Liberty, EUA); e o grupo de pesquisa Bristol Center for Antimicrobial Research –
BCARE, da University of Bristol (Bristol, Reino Unido). As amostras estudadas foram
primeiramente avaliadas durante o Programa SENTRY e, devido as características
fenotípicas de resistência apresentadas por esses isolados, os mecanismos de
resistência aos β-lactâmicos foram estudados com técnicas moleculares.
xiii
1
1 Introdução
1.1 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo não fermentador da glicose
que pode ser isolado do solo, da água, das plantas e mesmo dos animais, incluindo os
seres humanos (Gales et al., 2001). Fatores tais quais a habilidade de utilizar uma
grande variedade de substratos orgânicos como fontes de carbono, a excepcional
habilidade de colonizar nichos ecológicos diversos, nos quais a oferta de nutrientes é
limitada, e a capacidade de sobreviver por longos períodos em ambientes úmidos
contribuem para as características ubiqüitárias apresentadas pelas amostras de P.
aeruginosa (Pollack, 1984). Ocasionalmente, essa espécie bacteriana é patogênica
para plantas e animais.
Raramente a P. aeruginosa se torna causa de infecções comunitárias em
indivíduos saudáveis, entretanto, essa espécie bacteriana assume importante papel
como agente etiológico de infecções hospitalares. Na maioria dos casos, o processo
infeccioso tem início com algum tipo de alteração ou destruição de barreiras físicas
entre as quais se evidenciam, a utilização de catéter urinário, sonda oro-traqueal,
realização de cirurgias, pacientes que sofreram queimaduras e pacientes que fazem
uso de drogas imunossupressoras (Lee et al., 1999, Pollack, 1984). Além disso, outros
fatores de risco para a aquisição de infecções causadas por P. aeruginosa são idade
avançada,
diabetes
mellitus,
hospitalização
prolongada
e
o uso
prévio de
antimicrobianos (Carmeli et al., 1999a). Sua baixa necessidade de nutrientes para o
crescimento, sua tolerância a uma série de condições físicas adversas e sua
2
resistência a agentes antimicrobianos contribuem para o sucesso ecológico e para o
importante papel da P. aeruginosa como um patógeno oportunista (Young et al., 1984).
Nos Estados Unidos, a P. aeruginosa é o segundo patógeno responsável por
pneumonias hospitalares segundo dados reportados pelo National Nosocomial Infection
Surveillance (NNIS) System do Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
coletados entre 1986 e 1998. Ainda segundo esses dados, a P. aeruginosa é a terceira
causa mais comum de infecções urinárias, a quarta causa de infecção de sítio cirúrgico
e o sétimo patógeno mais freqüentemente isolado em corrente sangüínea (NNIS,
2004).
No Brasil, segundo dados do Programa SENTRY de Vigilância de Resistência a
Antimicrobianos (Pfaller et al., 1998), a P. aeruginosa foi a causa mais freqüente de
infecções do trato respiratório, a segunda causa mais freqüente de infecções urinárias
e infecções de ferida cirúrgica e o sexto patógeno mais comum em infecções da
corrente sangüínea no período de 1997 a 2001 (Sader et al., 2004).
As opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas pela P.
aeruginosa são limitadas e incluem penicilinas com atividade antipseudomonas,
cefalosporinas de amplo espectro, aztreonam, carbapenens e fluoroquinolonas,
particularmente a ciprofloxacina (Carmeli et al., 1999a). Os aminoglicosídeos são
freqüentemente utilizados em regimes combinados aos β-lactâmicos na tentativa de
potencializar a atividade antimicrobiana e de evitar o desenvolvimento de resistência
bacteriana, sendo a monoterapia com esses agentes raramente utilizada.
Além de P. aeruginosa ser intrinsecamente resistente a diversos agentes
antimicrobianos comumente utilizados, esse microrganismo é altamente adaptável às
condições adversas, desenvolvendo resistência durante a terapia. O risco da
3
emergência de resistência parece variar de acordo com o agente antimicrobiano
utilizado, e evidências mostram que a terapia combinada pode reduzir o risco de falha
terapêutica devido à seleção de mutantes resistentes (Carmeli et al., 1999a, Carmeli et
al., 1999b).
1.2 Resistência aos β-lactâmicos em P. aeruginosa
Durante as duas últimas décadas, o aumento do uso de cefalosporinas para o
tratamento de infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa vem sendo
acompanhado por um aumento da prevalência de amostras de P. aeruginosa
produtoras de β-lactamases de espectro ampliado, conhecidas como ESBLs. Amostras
produtoras dessas enzimas são resistentes às cefalosporinas de amplo espectro e a
outros agentes da classe dos β-lactâmicos .(Carmeli et al., 1998, Carmeli et al., 1999a)
Um estudo publicado por Gales e colaboradores, no qual foram avaliadas
amostras de P. aeruginosa isoladas de cinco regiões geográficas (Ásia-Pacífico,
Canadá, Europa, América Latina e Estados Unidos), mostrou que de forma geral, as
taxas de resistência encontradas na América Latina são elevadas quando comparadas
às demais regiões. Os isolados de P. aeruginosa da América Latina apresentaram as
menores taxas de sensibilidade à ceftazidima e cefepima. Ainda nesse mesmo estudo,
quando os resultados de sensibilidade para piperacilina foram comparados com os
dados obtidos para esse agente em associação com o inibidor de β-lactamase,
tazobactam, foi observado um aumento nas taxas de sensibilidade, sugerindo que a
produção de ESBLs pode ser responsável pelos altos índices de resistência às
cefalosporinas de amplo espectro em P. aeruginosa nessa região (Gales et al., 2001).
4
Os carbapenens, cujos representantes mais amplamente utilizados são o
imipenem e o meropenem, são considerados agentes terapêuticos de escolha para o
tratamento de infecções graves causadas por bactérias resistentes aos demais βlactâmicos, especialmente nas localidades onde as taxas de prevalência de resistência
são elevadas (Woodford et al., 2000). No entanto, nos últimos anos, o isolamento de
amostras de P. aeruginosa resistentes também aos carbapenens vêm se tornando
mais comum em todo o mundo (Nordmann & Poirel, 2002).
Dados do Programa SENTRY de Vigilância de Resistência a Antimicrobianos
revelaram que 30,2% das amostras de P. aeruginosa do Brasil são resistentes aos
carbapenens (Sader et al., 2001). Essa taxas são ainda mais elevadas em amostras de
P. aeruginosa isoladas de pacientes hospitalizados em unidades de terapia intensiva.
Dados coletados entre 1997 e 2001 mostram que, nessas unidades, as taxas de
resistência aos carbapenens em P. aeruginosa podem ser de até 40,0%.
Diferentes mecanismos de resistência aos β-lactâmicos são descritos em P.
aeruginosa, a saber: (i) perda ou expressão reduzida de proteínas de membrana
externa, conhecidas como porinas; (ii) hiperexpressão de bombas de efluxo; (iii)
alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs); (iv) produção de βlactamases.
1.2.1 Alteração de proteínas de membrana externa
As proteínas de membrana externa (OMP) dos microrganismos gram-negativos,
também chamadas de porinas, são proteínas capazes de formar canais constituídos de
água no seu interior que permitem a difusão de solutos hidrofílicos através da
membrana externa e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana
5
(Nikaido, 1994). A perda ou a diminuição da expressão dos genes que codificam as
OMPs causam a redução da entrada de antibióticos na célula, diminuindo a
concentração interna do antimicrobiano, o que pode conferir resistência aos βlactâmicos (Quinn et al., 1988). Diferentes porinas podem ser encontradas na
membrana externa de amostras de P. aeruginosa, como OprF, OprC, OprD e OprE.
Dentre essas, a mais abundante é a OprF que é, provavelmente, a mais utilizada pela
maioria dos β-lactâmicos para penetrar no interior da bactéria (Livermore, 2002).
Contudo a proteína OprD parece estar mais envolvida na penetração dos carbapenens,
especialmente de imipenem, mas não de outros β-lactâmicos (Fung-Tomc et al., 1995,
Huang & Hancock, 1996, Livermore, 2001).
1.2.2 Hiperexpressão de sistemas ou bombas de efluxo
A hiperexpressão de sistemas de efluxo, que leva à redução da concentração de
antimicrobiano no interior das células, é outro mecanismo de resistência aos βlactâmicos freqüentemente reportado em espécies de Pseudomonas (Livermore, 2001).
Os genes que codificam as bombas de efluxo são constituintes normais do genoma
bacteriano e, portanto, fornecem para o microrganismo o potencial intrínseco de
desenvolver um fenótipo de resistência aos β-lactâmicos sem a aquisição de novos
genes (Hasdemir et al., 2004).
As proteínas que compõem os sistemas de efluxo são proteínas específicas
codificadas por genes cromossômicos ou plasmidiais. Esses sistemas contribuem para
a resistência intrínseca e adquirida da P. aeruginosa através da extrusão de vários
antimicrobianos, como tetraciclinas, fluoroquinolonas, cloranfenicol, eritromicina e βlactâmicos (Li et al., 1994). Alguns desses sistemas conferem também resistência a
6
compostos quaternários de amônio e desinfetantes (Nikaido, 1998). A energia para
esse transporte é obtida através do gradiente de prótons presentes na membrana
externa.
Os sistemas de efluxo são normalmente formados por proteínas de membrana
especializadas, que podem ser divididas de acordo com sua função em: i) bomba de
efluxo na membrana interna ou citoplasmática, ii) proteína formadora do canal extrusor
na membrana externa; iii) proteína de fusão que liga os outros dois componentes da
bomba de efluxo (Nikaido, 1994). Os genes que codificam as proteínas constituintes
dos sistemas de efluxo estão sob o controle de genes reguladores e mutações ou
mesmo deleções dos genes reguladores podem acarretar na elevação da expressão
das bombas de efluxo (Poole & Srikumar, 2001). Em P. aeruginosa quatro principais
sistemas de efluxo já foram descritos: i) MexAB-OprM, ii) MexCD-OprJ, iii) MexEFOprN, iv) MexXY-OprM, contudo, pelos menos cinco outros sistemas aguardam
caracterização (Livermore, 2002).
Entre os sistemas de efluxo já caracterizados, o sistema MexAB-OprM é o
sistema que tem a expressão mais notória e contribui para a extrusão de uma grande
variedade de β-lactâmicos (Li et al., 2003). O sistema MexCD-OprJ é responsável mais
especificamente pela extrusão das cefalosporinas de quarta geração, como cefepima e
cefpiroma (Gotoh et al., 1998, Poole et al., 1996). Ainda, mutantes que expressam
maiores níveis de MexCD-OprJ tornam-se mais sensíveis à imipenem, biapenem e
outros β-lactâmicos. Não há evidências de que os sistemas MexEF-OprN e MexXYOprM contribuam diretamente para o efluxo de β-lactâmicos (Aires et al., 1999, Masuda
et al., 2000).
7
1.2.3 Alteração das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs)
As proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) são carboxipeptidases localizadas na
membrana citoplasmática que atuam em uma etapa importante da estruturação do
peptideoglicano das bactérias, catalisando a transpeptidação entre duas subunidades
de mureína. O peptideoglicano é um constituinte essencial da parede celular bacteriana
(Spratt & Cromie, 1988). Essas proteínas são denominadas numericamente de acordo
com o peso molecular que apresentam, isto é, quanto maior o peso molecular menor a
numeração que recebem. Diferentes espécies e gêneros podem apresentar PBPs com
a mesma denominação, no entanto essas enzimas PBPs não são necessariamente
relacionadas. Nos bacilos gram-negativos são descritas oito PBPs com características
diferentes: -1a, -1b, -2, -3, -4, -5, -6, -7 e, -8 (Noguchi et al., 1979, Tuomanen &
Schwartz, 1987).
As PBPs são os sítios-alvo para a atividade dos antimicrobianos da classe dos βlactâmicos que se ligam covalentemente a essas estruturas, impedindo a formação da
parede celular e causando a lise osmótica da célula. A resistência aos antimicrobianos
β-lactâmicos, devido a alterações nas PBPs, é mais comum em microrganismos grampositivos que em gram-negativos. Entretanto, apesar de pouco freqüentes, alterações
nas PBPs já foram reportadas em isolados clínicos de P. aeruginosa (Godfrey et al.,
1981, Gotoh et al., 1998). Um estudo no qual foram avaliados mutantes laboratoriais
resistentes à penicilina mostrou que a resistência a esse antimicrobiano em P.
aeruginosa estava associada à expressão reduzida da PBP-3. Um outro estudo mais
recente demonstrou que a resistência a carbapenens em P. aeruginosa estaria
associada a alterações na PBP-4 (Bellido et al., 1990).
8
1.2.4 Produção de β-lactamases
Dentre os diferentes mecanismos de resistência aos β-lactâmicos que já foram
descritos em amostras de P. aeruginosa, a produção de β-lactamases é o mecanismo
prevalente e importante nessa espécie (Laraki et al., 1999). As penicilinas,
cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens podem ser hidrolisados por vários
membros da família das β-lactamases, e a interação entre essas enzimas e seus
substratos resulta em compostos inativos que permitem a sobrevida da célula
bacteriana (Bush, 2001).
Entre as amostras de P. aeruginosa, a produção aumentada de AmpC, as ESBLs
e as metalo-β-lactamases desempenham papéis importantes na resistência a
antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções causadas por esse agente
(Jacoby & Munoz-Price, 2005).
Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de
estabelecer um sistema de classificação para essas enzimas foram propostas ao longo
dos anos. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior
importância: a de AMBLER e a de BUSH-JACOBY-MEDEIROS (Ambler, 1980, Bush et
al., 1995).
A classificação de AMBLER foi proposta com base na estrutura molecular das βlactamases, de acordo com a seqüência de aminoácidos. Somente quatro classes
moleculares principais de β-lactamases foram descritas: A) β-lactamases de espetro
ampliado (ESBLs), penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases; C)
cefalosporinases cromossomais; D) oxacilinases.
9
A classificação de BUSH (Bush, 1989) foi a primeira a correlacionar o substrato
preferencial e propriedades inibitórias à estrutura molecular da enzima. Em 1995, uma
atualização da classificação de BUSH que combina características estruturais e
funcionais das β-lactamases, foi proposta (Bush et al., 1995).
O Quadro 1 apresenta de modo simplificado a correlação entre a classificação
molecular de AMBLER (1980) e a de BUSH-JACOBY-MEDEIROS (1995) e as
características funcionais das β-lactamases.
Classe Molecular
Grupo Funcional
A
A
D
A
A
2br
2c
2d
2e
2f
ND
B
A
2be
3ª, 3b, 3c
A
2b
Abreviatura: N.D., não determinada (Adaptado do artigo de Bush, 2001).
4
3
A
A, D
2
2ª
C
1
Subgrupos
Classificação de
AMBLER, 1989
Classificação de BUSH-JACOBYMEDEIROS, 1995
Enzimas não seqüenciadas que não se encaixam em outros grupos
Enzimas que hidrolisam a carbenicilina
Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina); pouco inibidas pelo ácido
clavulânico
Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico
Enzimas que hidrolisam carbapenens com sítio ativo serina, inibidas pelo
ácido clavulânico
Metalo-β-lactamases que conferem resistência aos carbapenens e todos os
outros β-lactâmicos com exceção dos monobactâmicos. Não são inibidas por
ácido clavulânico
β-lactamases derivadas da TEM resistentes ao inibidor de β-lactamases (IRT)
β-lactamases de espectro ampliado conferem resistência às cefalosporinas de
amplo espectro e monobactâmicos
Grande maioria das enzimas é inibida por ácido clavulânico
Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.
Conferem altos níveis de resistência às penicilinas
β-lactamases de espectro reduzido de bactérias Gram-negativas. Inclui TEM1 e SHV-1.
Enzimas cromossômicas e plasmidiais dos Gram-negativos. Isoladamente
conferem resistência a todos os β-lactâmicos, exceto carbapenens. Não são
inibidas pelo ácido clavulânico.
Características funcionais
QUADRO 1 – Características funcionais e moleculares dos principais grupos de β-lactamases.
10
11
1.2.4.1 Cefalosporinases cromossomais
As β-lactamases do grupo funcional 1 ou da classe molecular C, chamadas
cefalosporinases cromossomais ou AmpC, são encontradas constitutivamente em
amostras de P. aeruginosa e nas Enterobactérias. Na ausência de β-lactâmicos, a βlactamase AmpC é normalmente produzida em baixos níveis, mas, na presença de βlactâmicos indutores como, por exemplo, cefoxitina e imipenem, passam a ser
produzidas em grande quantidade. O grau de indução depende do β-lactâmico indutor
e, em alguns casos, a produção dessa enzima pode aumentar de 100 a 1000 vezes
(Lodge & Piddock, 1991). Quando esses antimicrobianos indutores são retirados do
meio, a produção pode voltar a níveis basais que, normalmente, são baixos.
Entretanto, a produção pode permanecer em níveis extremamente altos mesmo após a
retirada do indutor.
Em amostras de P. aeruginosa, a expressão do gene ampC leva à produção de
β-lactamases indutivas, podendo também originar mutantes que passam a produzir
essas β-lactamases constitutivamente em grandes quantidades. A freqüência de
mutações que leva à produção de β-lactamases AmpC desreprimidas em uma
população de P. aeruginosa é de 10-7 a 10-9/UFC. Os mecanismos de indução e
desrepressão têm sido amplamente estudados em enterobactérias, principalmente em
Enterobacter cloacae. Entretanto mecanismos regulatórios similares aos encontrados
em enterobactérias regulam também a expressão da β-lactamase AmpC em P.
aeruginosa (Bagge et al., 2000). O gene ampC está sob o controle regulatório de
outros genes designados como ampR, ampD e ampG. Mutações ou deleções no gene
ampD resultam na hiperexpressão de ampC. Poucos casos de isolados com mutações
12
em ampR que apresentam a hiperexpressão de AmpC foram descritos em P.
aeruginosa (Langaee et al., 2000, Normark, 1995).
1.2.4.2 β-lactamases de espectro ampliado em P. aeruginosa
As β-lactamases de espectro ampliado inibidas pelo ácido clavulânico pertencem
majoritariamente à classe A de AMBLER e estão distribuídas no grupo 2 de BUSHJACOBY-MEDEIROS. Conferem resistência a diversas cefalosporinas de amplo
espectro. Desde o início da década de 1980 essas enzimas passaram a ser
freqüentemente identificadas em membros da família das Enterobacteriáceas, no
entanto apenas recentemente as ESBLs vêm sendo descritas em amostras de P.
aeruginosa (Medeiros, 1997).
As ESBLs encontradas em amostras de P. aeruginosa, reportadas até o
momento, são: TEM e SHV, que são bastante comuns em diferentes membros das
enterobacteriáceas; PER, principalmente originária de amostras da Turquia; VEB,
encontrada em amostras oriundas do Sul da Ásia e, mais recentemente, os tipos IBC e
GES, que têm sido descritos em isolados da França, Grécia e África do Sul entre outros
países. Essas enzimas são remotamente relacionadas do ponto de vista genético, no
entanto, elas compartilham o mesmo perfil bioquímico de hidrólise e inibição pelos
diferentes compostos da classe dos β-lactâmicos. Devido aos genes que codificam
essas enzimas terem sido encontrados até o momento em um limitado número de
regiões geográficas, acredita-se que, pelo menos na maioria dos casos, esses genes
tenham um nicho ecológico específico (Weldhagen et al., 2003).
Estudos recentes indicam que a disseminação desses genes podem ter um
importante papel na disseminação de resistência aos antimicrobianos e que isso pode
13
limitar as escolhas terapêuticas para o tratamento de infecções graves causadas por
amostras de P. aeruginosa produtoras de ESBLs (Jacoby & Munoz-Price, 2005).
As enzimas do tipo SHV foram identificadas em poucos isolados de P.
aeruginosa: SHV-2 foi encontrada na França e SHV-5 e 12 foram detectadas na
Tailândia. Esses isolados eram, em sua maioria, isolados nosocomiais, com exceção
do isolado produtor de SHV-12 que foi recuperado de um paciente com uma infecção
adquirida na comunidade em um hospital tailandês (Naas et al., 1999, Poirel et al.,
2004, Yan et al., 2001b).
A análise das seqüências de DNA adjacentes ao gene que codifica a SHV-2a
encontrado em amostras de P. aeruginosa revelou seqüências idênticas àquelas
encontradas em um plasmídio de Klebsiella pneumoniae, que também contém o gene
blaSHV-2. Essa evidência sugere que os genes que codificam essas enzimas podem ser
transferidos geneticamente de membros da família Enterobacteriaceae para isolados
de P. aeruginosa, entretanto esse evento deve ocorrer com baixa freqüência devido a
possíveis incompatibilidades para a conjugação e replicação plasmidial entre os
diferentes gêneros (Naas et al., 1999).
Apenas quatro diferentes variantes do tipo TEM foram descritas em amostras de
P. aeruginosa: TEM-4, TEM-21, TEM-24 e TEM-42 (Marchandin et al., 2000, Mugnier et
al., 1996). Um estudo de vigilância realizado na França indica que apenas 1,9% do total
de isolados de P. aeruginosa são produtores de β-lactamases do tipo TEM, contudo
outras β-lactamases de menor espectro, como as OXAs e carbenicilinases, são
encontradas com maior freqüência em espécies de Pseudomonas (Weldhagen et al.,
2003).
14
A β-lactamase PER-1 foi a primeira ESBL a ser caracterizada a partir de uma
amostra de P. aeruginosa e foi reportada em 1993 (Nordmann et al., 1993). Essa ESBL
tem apenas 18 a 20% de homologia de aminoácidos com as enzimas dos tipos TEM e
SHV (Nordmann & Naas, 1994). A PER-1 foi encontrada em amostras de P. aeruginosa
isoladas de um paciente da Turquia que foi internado em um hospital em Paris, França,
no ano de 1991. Um estudo subseqüente revelou que o gene blaPER-1 estava
amplamente disseminado na Turquia e foi identificado em mais de 46% dos isolados de
Acinetobacer spp. e em 11% dos isolados de P. aeruginosa recuperados durante um
período de três meses no ano de 1999 (Vahaboglu et al., 1997). Adicionalmente, PER1 foi identificada em mais de 38% das amostras de P. aeruginosa resistentes à
ceftazidima, e a avaliação dessas amostras por ribotipagem revelou a presença de
diferentes clones. PER-1 já foi encontrada em regiões vizinhas à Turquia, como Síria,
Irã, Iraque, Leste Europeu, França, Bélgica e Itália, onde a imigração de cidadãos da
Turquia ocorre com freqüência (Claeys et al., 2000, Luzzaro et al., 2001, Pagani et al.,
2004).
A ESBL VEB-1 foi primeiramente caracterizada em um isolado de Escherichia coli
de uma criança transferida do Vietnã para um hospital na França (Naas et al., 2000).
Posteriormente, VEB-1 foi encontrada em uma amostra de P. aeruginosa de dois
paciente da Tailândia, também transferidos para a França (Girlich et al., 2001). Um
estudo realizado em um hospital universitário da Tailândia revelou que 93% das
amostras de P. aeruginosa resistentes à ceftazidima isoladas nessa instituição eram
produtoras de VEB-1. Além de amostras de P. aeruginosa, o gene blaVEB-1 foi
encontrado em amostras de enterobactérias resistentes à ceftazidima isoladas no
mesmo hospital. Durante esse mesmo estudo, uma variante de blaVEB-1 foi identificada
e o novo gene foi denominado blaVEB-2. A proteína codificada por esse gene tem
15
apenas uma alteração de aminoácido localizada fora do sítio ativo da enzima, quando
comparada a VEB-1. No Kuwait, amostras de P. aeruginosa produtoras de VEB-1
foram identificadas e, dentre as amostras avaliadas foram identificadas variantes de
blaVEB-1 que possuem alterações de um único nucleotídeo não gerando alteração da
proteína final. Essas variantes foram denominadas blaVEB-1a e blaVEB-1b (Poirel et al.,
2001a).
A enzima GES-1 foi inicialmente identificada de uma amostra de Klebsiella
pneumoniae isolada no ano de 1998 (Poirel et al., 2000). Essa β-lactamase foi
caracterizada de uma amostra coletada de um paciente internado em um hospital da
França, no entanto esse isolado foi recuperado no primeiro dia de admissão do
paciente que havia sido transferido da cidade de Cayenne, Guiana Francesa.
Posteriormente ao primeiro relato, blaGES-1 também foi encontrado em uma amostra de
P. aeruginosa isolada em outro hospital da França (Dubois et al., 2002). No ano de
2002, um surto de amostras K. pneumoniae produtoras de GES-1 foi detectado em
Lisboa, Portugal (Duarte et al., 2003). Vinte e quatro isolados recuperados de
diferentes sítios foram identificados como produtores de GES-1, e o gene que codifica
essa enzima foi encontrado em plasmídios de diversos tamanhos.
A GES-1 difere em dois aminoácidos da enzima denominada IBC-1 caracterizada
em amostras de Enterobacter cloacae isoladas na Grécia e difere em apenas um
aminoácido de IBC-2 identificada em amostras isoladas no mesmo país (Giakkoupi et
al., 2004, Mavroidi et al., 2001).
Em 2001, uma nova variante de GES-1 foi reportada de uma amostra de P.
aeruginosa isolada na África do Sul (Poirel et al., 2001b). GES-2 possuía uma única
alteração de aminoácido quando comparada a GES-1, no entanto, essa alteração
ampliou o espectro de atividade da enzima que mostrava atividade catalítica contra
16
imipenem, além das cefalosporinas de amplo espectro. A análise cinética de GES-2
mostrou uma eficiência catalítica contra imipenem 100 vezes maior do que a GES-1.
Entretanto, a atividade da GES-2 permanece 1000 vezes menor do que outras
carbapenemases como SME-1 e NMC-A.
Recentemente, novas variantes de GES foram relatadas em amostras de K.
pneumoniae isoladas no Japão (Wachino et al., 2004a, Wachino et al., 2004b). A GES3 foi isolada de amostras responsáveis por um surto em uma UTI neonatal, e a GES-4
foi isolada de um neonato internado nessa mesma unidade. GES-4, assim como a
GES-2 apresentaram níveis intermediários de resistência à imipenem quando expressa
em uma linhagem de E. coli hospedeira.
1.2.4.3 Metalo-β-lactamases
Dentre as diferentes classes de enzimas que degradam os β-lactâmicos, as
metalo-β-lactamases (MβLs) são notáveis por seu amplo espectro de atividade contra a
maioria dos β-lactâmicos, incluindo os carbapenens, e também pela resistência que
essas enzimas apresentam aos inibidores de β-lactamases (Laraki et al., 1999).
As MβLs, que são agrupadas na classe B de AMBLER e na classe 3 de BUSHJACOBY-MEDEIROS (Bush et al., 1995), possuem quatro características principais: (i)
possuem atividade contra os carbapenens; (ii) não hidrolisam os monobactans, como
aztreonam; (iii) são inibidas por agentes quelantes, como EDTA, derivados do tiol e
ácido dipicolínico; (iv) requerem íons Zn+2 ou outros cátions divalentes como cofator
(Laraki et al., 1999). As MβLs são produzidas constitutivamente por algumas espécies
bacterianas, incluindo: Bacillus cereus, Bacteriodes fragilis, Stenotrophomonas
17
maltophilia, Aeromonas spp. and Chryseobacterium meningosepticum (Nordmann &
Poirel, 2002).
Contudo, desde o início da década de 90, novos genes que codificam MβLs têm
sido descritos mundialmente em patógenos clinicamente importantes, como diferentes
espécies de Pseudomonas e Acinetobacter e também em membros da família
Enterobacteriaceae (Riccio et al., 2000, Yan et al., 2001a). Por serem localizados em
essruturas que conferem mobilidade aos genes, esses determinantes de resistência
são conhecidos como as MβL móveis ou também MβL adquiridas .
A primeira MβL móvel (IMP-1) foi caracterizada em um isolado de Serratia
marsecens no Japão (Watanabe et al., 1991), onde os carbapenens são amplamente
utilizados. Durante muitos anos, a ocorrência de isolados produtores de IMP-1 foi
restrita a esse país, entretanto, atualmente, IMP-1 tem sido encontrada em diversos
países e vem sendo isolada de diferentes microrganismos como Acinetobacter spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae entre outros (Castanheira et al.,
2003, Gales et al., 2003b, Koh et al., 2004, Mendes et al., 2004b, Tysall et al., 2002).
Em 1999, a segunda MβL, denominada VIM-1, foi caracterizada em uma amostra de P.
aeruginosa isolada em Verona, Itália (Lauretti et al., 1999). Desde então já foram
descritas 18 variantes de IMP em diferentes regiões geográficas e 12 diferentes tipos
de VIM, a maior parte na Europa, mas variantes também foram encontradas na
América do Norte, na América Latina e na Ásia (Galani et al., 2004, Libisch et al., 2004,
Mendes et al., 2004a, Patzer et al., 2004, Toleman et al., 2004, Walsh et al., 2003).
Recentemente, uma nova MβL adquirida foi descrita. Essa nova enzima foi
chamada de SPM-1 (Toleman et al., 2002) e deu origem a uma nova sub-classe de
MβL, devido à pouca homologia apresentada quando comparada a integrantes das
18
famílias IMP e VIM. A SPM-1 (sigla para São Paulo metalo-β-lactamase) foi isolada em
uma amostra de P. aeruginosa, recuperada do trato urinário de um paciente
hospitalizado no complexo Hospital São Paulo/UNIFESP (São Paulo, SP). Até o
presente momento, SPM-1 foi identificada somente em amostras de P. aeruginosa
isoladas no Brasil, todavia amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 estão
disseminadas por diversos estados brasileiros (Gales et al., 2003a).
1.3 Disseminação horizontal de genes de resistência
Diversos fatores contribuem para o êxito das ESBLs e MβLs como
determinantes de resistência, no entanto a grande capacidade de disseminação dos
genes que codificam essas β-lactamases mostram que esse é um problema
contemporâneo, de grande importância e que aumenta as preocupações com o uso
indiscriminado de cefalosporinas de amplo espectro e carbapenens no ambiente
hospitalar (Spencer et al., 2001). A habilidade dos bacilos gram-negativos de adquirir
genes de resistência aos antimicrobianos e subseqüentemente disseminá-los para
inúmeras espécies bacterianas é plenamente explicada pela transferência de
plasmídios, transposons e integrons. Os genes de resistência presentes em
transposons e/ou integrons podem ser mobilizados para diversos plasmídios e, uma
vez presente nos plasmídios, podem ser transferidos de uma bactéria para outra e
assim disseminados (Recchia & Hall, 1997).
Os plasmídios são responsáveis pela disseminação de muitas β-lactamases, no
entanto os genes que codificam essas enzimas são encontrados inseridos em
integrons os quais freqüentemente contêm outros genes que conferem resistência a
uma variedade de antibióticos. Por essa razão, as β-lactamases são usualmente
19
produzidas por organismos que também são resistentes a múltiplos agentes
antimicrobianos (Jacoby & Munoz-Price, 2005).
Trabalhos recentes mostram que a maioria das ESBLs e MβLs de P. aeruginosa
estão associadas a integrons (Poirel & Nordmann, 2002), assim como inúmeros genes
que
conferem
resistência
aos
aminoglicosídeos,
trimetoprim/sulfametoxazol,
cloranfenicol entre outros.
1.3.1 Integrons
Os integrons são unidades genéticas que incluem componentes para um sistema
de recombinação sítio-específica capazes de capturar e mobilizar genes contidos em
elementos móveis chamados de genes cassetes. O integron também contém um
promotor para a expressão dos genes cassetes (Bennett, 1999, Collis & Hall, 1995).
Os componentes essenciais do integron são um gene int que codifica uma
recombinase sítio-específica, pertencente à família das integrases e um sítio, adjacente
a esse gene, de reconhecimento e ligação, chamado attI (attachment site) (Collis &
Hall, 1995). O gene que codifica a integrase, incluindo o sítio de ligação attI é
conhecido como seqüência conservada 5’ (5’-CS). O attI é reconhecido pela integrase
e funciona como um sítio receptor para os genes cassetes (Partridge et al., 2000).
Os genes cassetes são elementos não-replicantes e incluem um gene que pode
codificar resistência aos antimicrobianos e um sítio de recombinação integraseespecífico, membro da família de sítios conhecida como elementos de 59 bases (59be). Genes cassetes podem existir tanto em sua forma livre circular ou podem estar
integrados a um sítio attI. Somente quando integrados os genes cassetes são
20
considerados formalmente parte de um integron (Collis et al., 1993, Partridge et al.,
2000).
Um único evento de recombinação genética, envolvendo o sítio associado à
integrase attI e um cassete associado ao 59-be, levam à inserção de genes cassetes
em um integron receptor. A integrase pode catalisar eventos de recombinação do attI e
o 59-be do gene cassete e também eventos de recombinação entre duas unidades de
59-be (uma no cassete a ser integrado e outra num gene cassete que já faz parte do
integron), no entanto um estudo revelou que a integrase tem preferência pelo primeiro
tipo de ligação descrita, entre o attI e o 59-be (Collis & Hall, 1992, Partridge et al.,
2000).
A integrase também catalisa eventos de recombinação que levam à excisão de
genes cassetes, ocasionando a perda dos mesmos e gerando um cassete circular livre.
Devido à habilidade de adquirir novos genes, os integrons têm um importante papel na
evolução de genomas de plasmídios e transposons que os contêm (Collis & Hall,
1992).
Os integrons podem ser agrupados em dez diferentes classes, de acordo com a
estrutura da integrase, mas apenas cinco dessas classes estão associadas a genes de
resistência aos antimicrobianos. Contudo a maioria dos integrons que contém genes de
resistência aos antimicrobianos, e portanto também os genes que codificam as βlactamases, pertencem à classe 1 (Correia et al., 2003).
Os integrons da classe 1 possuem a 5’-CS, característica desses elementos, e
adicionalmente, na extremidade 3’, está acomodado um gene o qual codifica
resistência a compostos de amônio quaternário denominado qacE∆1, truncado ao gene
que codifica resistência à sulfonamida sul1. Essa extremidade, que também é
21
conservada nos integrons da classe 1, é conhecida como 3’-CS (Figura 1). A inserção
de genes cassetes entre as seqüências conservadas 5’ e 3’ dá origem a novos
integrons.
gene cassete livre
59-be
intI1
gene
gene
qacE∆1/sul1
attI1
5’-CS
3’-CS
Figura 1. Representação esquemática de um integron da classe 1 e de um gene
cassete circular livre. As flechas representam os genes do integron e o sentido das
flechas representa o sentido da transcrição dos genes. À esquerda, a seqüência
conservada 5’, contendo o gene que codifica a integrase e o sítio de ligação attI. À
direita, a 3’-CS, contendo a estrutura truncada qacE∆1/sul1.
22
2 Artigos
2.1.
Artigo I
Emergence of the Extended-Spectrum β-lactamase GES-1 in a Pseudomonas
aeruginosa strain from Brazil: Report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program.
Publicado no periódico Antimicrobial Agents and Chemotherapy em maio de 2004,
volume 48, número 6, páginas 2344 a 2345.
23
Emergence of the Extended-Spectrum β-lactamase GES-1 in a Pseudomonas
aeruginosa strain from Brazil: Report from the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program
MARIANA CASTANHEIRA1,2, ANA C. GALES1, RODRIGO E. MENDES1,2, RONALD N.
JONES3, TIMOTHY R. WALSH2*
1
Disciplina de Doencas Infecciosas e Parasitarias, Universidade Federal de Sao Paulo,
Sao Paulo, Brazil
2
Department of Pathology & Microbiology, University of Bristol, Bristol, UK.
3
The JONES Group/JMI Laboratories, North Liberty, IA.
Key words: GES-1, Extended spectrum β-lactamase, Pseudomonas aeruginosa,
SENTRY
Running Title: GES-1 Extended spectrum β-lactamase in Brazil
*Corresponding author:
Timothy R. Walsh
Department of Pathology & Microbiology
School of Medical Sciences
University of Bristol
Bristol - UK
BS8 1TD
Tel.: +44 117 928-7522
Fax.: +44 117 928-7896
e-mail: [email protected]
24
The extended spectrum β-lactamases GES-1 was initially described from a
Klebsiella pneumoniae strain in 1998 (5). Since then, two closely related enzymes, IBC1 and GES-2, have also been described (4;6). GES-1-producing K. pneumoniae strain
has been reported from a French hospital, although the patient had just been
transferred from French Guiana, South America. blaGES-1 has also been found in a
Pseudomonas aeruginosa strain isolated in another French medical center (3) and from
K. pneumoniae in Lisbon, Portugal (2).
The GES-1 producing P. aeruginosa, isolate 48-8896, was recovered from a 63
year-old female who had a hysterectomy (São Paulo, Brazil) and developed a wound
infection while receiving ceftriaxone, amikacin and metronidazole. Blood cultures were
drawn and were positive for P. aeruginosa. Polymyxin B plus vancomycin were started
empirically and the infection was eradicated, but the patient died after being hospitalized
in the ICU for 3 months. Isolate 48-8896 showed resistance to imipenem (MIC, >8
µg/ml), meropenem (MIC, >8 µg/ml), ceftazidime (MIC, >16 µg/ml), cefepime (MIC, >16
µg/ml), piperacillin/tazobactam (MIC, >64 µg/ml), and all antimicrobial agents evaluated
(including aminoglycosides and quinolones), except for polymyxin B (MIC, <1 µg/ml).
Phenotypic detection of ESBL was positive using the (ceftazidime/ceftazidimeclavulanic acid and cefepime/cefepime-clavulanic acid) Etest strips (AB BIODISK,
Solna, Sweden).
Since several β-lactamase genes are part of gene cassettes that are class 1
integron mediated and most of them contain an aminoglycoside acetyl transferase gene
cassette, primers located in the 5’ conserved segment region (5’-CS) (5’CCAAGCTCTCGGGTAACATC-3’) and in the flanking region of aacA4 gene cassette
(5’-AACTTGCGAGCGATCCGATG-3’) were used. PCR amplification and subsequent
25
sequencing analyzes of the 1211 bp PCR product showed a blaGES-1 in the first position
of a class 1 integron (Fig. 1).
The integron harboring blaGES-1 showed a similar adjacent and upstream context
as described in the first report of GES-1 (K. pneumoniae ORI-1) (5). Beyond blaGES-1
was intI1, encoding the integrase of a class 1 integron. Between blaGES-1 and the intI1
was an attI1 site and two promoters (P2 and Pant). However, the P2 promoter appears
to have an absence of three G residues, and the space between the -35 and -10
sequences is 14 bp (Fig. 1). The secondary promoter (P2) is created by the insertion of
the three Gs, increasing the space between-35 and -10 regions to 17 bp (1). This
evidence suggests that P2 was probably not contributing to the transcription of blaGES-1,
as previously described in other integrons harboring this ESBL gene (3;5). In this study,
blaGES-1, integron lies a chloramphenicol-acetyl transferase gene cassette, catB8,
followed by the 3’-CS region of the class 1 integron, which is unique among blaGES-1
genes.
The detection of a GES-1-producing P. aeruginosa isolate in Latin America (Brazil)
was a very worrisome finding since it heralds the possibility for the emergence and
future dissemination of new GES derivatives with broader spectrum of hydrolyses, such
as carbapenem-hydrolyzing enzyme GES-2 (6).
The SENTRY Program was funded by an educational/research grant from BristolMyers Squibb.
26
References
(1)
Collis CM, Hall RM. Expression of antibiotic resistance genes in the
integrated cassettes of integrons. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39(1):155-162.
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Duarte A, Boavida F, Grosso F, Correia M, Lito LM, Cristino JM. Outbreak
of GES-1 -lactamase-producing multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae in a
university hospital in Lisbon, Portugal. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:14811482.
(3)
Dubois V, Poirel L, Marie C, Arpin C, Nordmann P, Quentin C. Molecular
characterization of a novel class 1 integron containing bla(GES-1) and a fused product
of aac3-Ib/aac6'-Ib' gene cassettes in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents
Chemother 2002; 46(3):638-645.
(4)
Giakkoupi P, Tzouveleskis L, Tsakris A, Loukova V, Sofianou D, Tzelepi
E. IBC-1, a novel integron-associated class A beta-lactamase with extended-spectrum
properties produced by an Enterobacter cloacae clinical strain. Antimicrob Agents
Chemother 2004; 44(9):2247-2253.
(5)
Poirel L, Le T.I., Naas T, Karim A, Nordmann P. Biochemical sequence
analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum beta-lactamase and the class I
integrn In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:662632.
(6)
P.
Poirel L, Weldhagen G.F., Naas T, De Champs C, Dove MG, Nordmann
GES-2, a class A -lactamase from Pseudomonas aeruginosa with increased
hydrolysis of imipenem. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45:2598-2603.
blaGESaacA
dfrXV
cm1A
aadA
qacE∆1/sul
aacA
blaGES-
qacE∆1/sul
-10
blaGEScatB
qacE∆1/sul
-10
P2
T T TT CAT G G CTT GT T AT G ACT GT TT TT T T- - - GT ACAG T CT AT G C C T C GGG
-35
-10
intI
t d )
P. aeruginosa 48-8896 integron (this
-35
P2
T T TT CAT G G CTT GT T AT G AC T GT TT TT T TG G G G T ACAG T CT AT G CCT CG G G
intI
(5)
P. aeruginosa Pa695 integron
-35
P2
T T T T CAT G G CT T G T T AT G A CT G T T T T T T T G G G G T AC AG T CT AT G C CT C G
intI
found in the P2 of P. aeruginosa 48-8896 is highlighted. The 59-be are represented with black dots.
Figure 1. Schematic representations of different blaGES-1 containing integrons (a, b, c). The absence of the three G residues
c)
b)
a)
K. pneumoniae ORI-1 integron (6)
27
28
2.2.
Artigo II
Molecular characterization of a β-lactamase gene, blaGIM-1 encoding a new sub-class of
Metallo-β-Lactamase.
Publicado no periódico Antimicrobial Agents and Chemotherapy em dezembro de 2004,
volume 48, número 12, páginas 4654 a 4661.
29
Molecular characterization of a β-lactamase gene, blaGIM-1 encoding a new subclass of Metallo-β-Lactamase
MARIANA CASTANHEIRA
1,2
*, MARK A. TOLEMAN
2
,RONALD N. JONES 3, FRANZ
J. SCHMIDT 4, TIMOTHY R. WALSH 2
1
Disciplina de Doencas Infecciosas e Parasitarias, Universidade Federal de Sao Paulo,
Sao Paulo, Brazil
2
Department of Pathology & Microbiology, University of Bristol, Bristol, UK
3
The JONES Group/JMI Laboratories, North Liberty, IA
4
Institut fur Laboratoriumsmedizin, Mikrobiologie, Minden, Germany
*Corresponding author:
Mariana Castanheira, MSc
Department of Pathology & Microbiology
School of Medical Sciences
University of Bristol
Bristol - UK
BS8 1TD
Tel.:
+44 117 9288819
Fax.:
+44 117 9287896
e-mail: [email protected]
30
Abstract
As part of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, five multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates were detected with metallo-βlactamase (MβL) activity. The isolates were recovered from different patients from a
medical site located in Dusseldorf, Germany during 2002. The resistant determinant
was isolated amplifying the region between the integrase and the aacA4 gene cassette.
Sequencing revealed a novel MβL gene, designated blaGIM-1. Additional analysis
showed that GIM-1, comprising 250 amino acids and with a pI value of 5.4, differs in its
primary sequence from that described for IMP, VIM and SPM-1 enzymes by 39 - 43%,
28 - 31% and 28%, respectively. The enzyme possesses unique amino acids within the
major consensus sequence (HXHXD) of the MβL family. Kinetics analysis revealed that
GIM-1 has no clear preference for any substrate and did not hydrolyze azlocillin,
aztreonam and the serine-β-lactamase inhibitors. blaGIM-1 was found on a 22 kb nontransferable plasmid. The new MβL gene was embedded in the first position of a 6 kb
class 1 integron, named In77, with distinct features, including an aacA4 cassette
downstream of the MβL gene that appeared to be truncated with blaGIM-1. The aacA4
was followed by an aadA1 gene cassette that was interrupted by a copy of the IS1394.
This integron also carried an oxacillinase gene, blaOXA-2, before the 3’-CS region. GIM-1
appears to be a unique MβL, which is located in a distinct integron structure, and
represents the fourth sub-class of mobile MβL enzyme to be characterized.
31
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is a leading cause of nosocomial-acquired infections,
giving rise to a wide range of life-threatening conditions. Its intrinsic resistance to many
antibiotics and its ability to develop multidrug resistance imposes a serious therapeutic
problem (8). Carbapenems are very useful antimicrobial agents for the treatment of
infections caused by P. aeruginosa; however, increasing use of these compounds has
resulted in the development of carbapenem-resistant P. aeruginosa. Mechanisms of
resistance to carbapenems in P. aeruginosa are associated with the following: reduced
uptake of the agent resulting from the loss or reduced expression of the OprD porin,
combined with de-repression of the chromosomal ampC β-lactamase gene (23);
overexpression of an efflux pump system (22,37); production of a metallo-β-lactamase
(MβL) (16).
The first mobile MβL (IMP-1) was found in P. aeruginosa in Japan in the early
1990s (33). For many years, the occurrence of IMP-1-producing bacteria was confined
to Japan. More recently, however, IMP-1 and IMP-variant enzymes have been reported
from many other countries and across four continents (6,9,12,13,24,27). Since the
emergence of IMP-1, two other sub-classes of clinically relevant MβLs have been
described: the VIM serie (15) and SPM-1 (29). VIM variants are now found throughout
the world as well (2,13,17,20,21,30,32,34,35), whereas so far, SPM-1 seems to be
restricted to Brazil.
In this study, we characterized a novel sub-class of Ambler class B enzyme, GIM1, which is encoded by a gene cassette located in the first position of a class 1 integron.
The carbapenem-resistant P. aeruginosa clinical isolates that produce GIM-1 were
32
recovered in Germany and were detected by The SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program in 2002.
33
Materials and Methods
Bacterial strains and susceptibility testing. In 2002, five clinical isolates of P.
aeruginosa (73-5671, 73-12198, 73-15553, 73-15574 and 73-15480) were collected in a
medical site located in Dusseldorf, Germany, and submitted to the SENTRY Program.
The clinical isolates were susceptibility tested using the reference broth microdilution
method as described by the National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS) (19). Rifampin-resistant (RifR) derivatives of E. coli K-12 and P. aeruginosa
PA01 (28) were used as recipients in conjugation experiments. E. coli DH5α and RifR
PA01 were used for transformation.
Phenotypic detection of MβL. MβL Etest strips (ABIODISK, Solna, Sweden) were
used to screen for class B β-lactamase production according to the manufacturer’s
instructions. In addition, carbapenemase activities of cell sonicates from overnight broth
cultures were determined by spectophotometric assays. These were carried out with
150 µM of imipenem and meropenem as substrates at 299 nm. Assays were performed
with and without EDTA (25mM) to ascertain if activity is inhibited by chelating agents.
DNA Analysis Methodology. Molecular screening for blaVIM, blaIMP and blaSPM-1 was
performed using PCR, as previously described (29), with primers targeting conserved
regions of the MβL genes (Table 1). Strains known to harbor MβL genes were used as
positive controls for the reactions. Since several β-lactamases are encoded on gene
cassettes, embedded in class 1 integrons, primers targeting the 5’ conserved sequence
and the aacA4 gene cassette were used in additional PCR screening reactions. The
integron structure was revealed with a walking sequencing strategy, using the primers
34
described in Table 1. Plasmid extraction from P. aeruginosa 73-5671 was undertaken
with a QIAprep Spin Mini prep kit (Quiagen, West Sussex, UK). Restriction
endonucleases analysis of the plasmid was carried out with seven different restriction
enzymes, namely Bam HI, Eco RI, Hind III, Hinc II, Spe I, Sma I, Xba I (Invitrogen,
Carlsbad, CA), singly and in pairs, to determine the size of the plasmid. Southern blot
analysis was performed on agarose gels using standard methods, and hybridization
was undertaken with a blaGIM-1 probe labeled
32
P, using random primer technique (25).
Transformation was carried out using electroporation and selection for transformants
was performed on nutrient agar (NA) plates containing ceftazidime 4 µg/ml. Conjugation
experiments were carried out in liquid medium and selection was performed on NA with
ceftazidime (4 µg/ml) and rifampicin (200 µg/ml). Primers intI1F and aacA4FR (Table 1)
were used to amplify the integron structure harboring the resistant determinant, and the
purified amplicons were cloned into PCRScriptCam SK+ (Stratagene Cloning Systems,
La Jolla, CA). DHα was used as a host for the recombinant plasmid.
DNA sequencing and computer analysis. The PCR products were sequenced on
both strands using Perking Elmer systems 377 DNA Sequencer. The nucleotide
sequences, deduced amino acid sequences and the phylogenetic relationships were
analyzed using Lasergene software package (DNASTAR, Madison, WI). Obtained
sequences
were
compared
to
sequences
available
on
the
internet
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/).
Analytical IEF. P. aeruginosa extracts showing β-lactamase activity were obtained by
cell lyses with BugBuster (Novagen, Nottingham, UK). IEF was performed with pH 3 –
35
10 Pre-Cast Vertical IEF gel with the NOVEX system (Invitrogen, Carlsbad, CA). The
conditions applied were according to the manufacturer’s instructions. The focused βlactamases were detected by overlaying the gel with nitrocefin solution (Microbiology
Systems, Cockeysville, MD). Isoelectric points were estimated by linear regression,
using the software Graf Prism (GraphPad Softaware Inc., San Diego, CA), by
comparison to reference proteins provided by a pI 4.5 to 9.5 Standard IEF Marker (BioRad, Richmond, CA) and the TEM-1 β-lactamase (31).
Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE. Genomic DNA was prepared in agarose
blocks and digested in situ with the restriction enzyme Spe I (Invitrogen, Carlsbad, CA).
DNA fragments were separated by electrophoresis in the CHEF-DR III apparatus
(BioRad, Richmond, CA). The band pattern was interpreted according to the
recommendation of Tenover et al (26).
β-lactamase purification. Cultures of P. aeruginosa 73-5671 were grown overnight at
37oC in 4 L of Terrific Broth (12% Tryptone, 20% Yeast Extract, 0.4 % Glycerol, 0.17 M
Monopotassium phosphate and 0.72 M Dipotassium phosphate). A periplasmic protein
preparation was obtained as previously described (1). This protein solution was treated
with 60% saturated ammonium sulfate solution to precipitate most of the proteins, which
were removed by centrifugation. The clarified supernatant was loaded onto a QSepharose column (Amershan Pharmacia Biotech Uppsala, Sweden) pre-equilibrated
with Buffer A (50 mM Cacodylate, 100 µM Zinc chloride, 1 mM β-Mercaptoethanol, 3
mM Sodium Azide pH 6.8). The proteins were eluted with a linear gradient of 300 mM to
800 mM Sodium chloride. Fractions showing the highest degree of β-lactamase activity
against nitrocefin were pooled, and proteins in the mix were subjected to a Superdex-
36
200 (Amershan Pharmacia Biotech) gel filtration column at 0.3 ml/min. During the
purification procedure, β-lactamase activity was tracked using nitrocefin hydrolysis.
The protein recovered in the flow-through was analyzed using sodium dodecyl
sulfate polyacrylamaide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and analytical IEF applied to
confirm the purity of the preparation.
Kinetic measurements. Purified β-lactamase was used to determine the kinetic
parameters kcat and Km. Reactions were performed at 25oC in 2 ml of Assay buffer (50
mM Cacodylate, 100 mM Sodium chloride, 100 µM Zinc chloride, pH 7.0). The rate of
hydrolysis of each β-lactam was calculated with triplicate reactions for at least five
different concentrations of substrate based on the extinction coefficients for each
substrate. The assays were performed in a Lambda 35 spectrophotometer (PerkinElmer, Cambridge, UK) by observing the changes in absorption resulting from the
opening the β-lactam ring at the specific wavelengths for each of the 20 antimicrobial
agents evaluated, as previously described (18).
Nucleotide sequence accession number. The nucleotide sequence data reported in
this paper have been assigned EMBL/GenBank nucleotide accession number
AJ620678.
37
Results
Properties of the P. aeruginosa clinical isolates. The five carbapenem-resistant P.
aeruginosa isolates were recovered from different patients from the same hospital ward
in Dusseldorf, Germany between February and July 2002. The index strain, 73-5671,
was recovered from a 37 y/o male ICU patient with nosocomial pneumonia in February
2002. All five isolates were submitted to the SENTRY Program as respiratory tract
specimens. The susceptibility patterns of the five isolates were found to be similar. The
isolates were highly resistant to 19 of the 20 antimicrobial agents tested (including all βlactams, aminoglycosides and quinolones), as shown in Table 3. The isolates showed
particular resistance to imipenem (MIC, >8 µg/ml), meropenem (MIC, >8 µg/ml),
ceftazidime (MIC, >16 µg/ml), cefepime (MIC, >16 µg/ml) and piperacillin/tazobactam
(MIC, >128 µg/ml). Of the antimicrobial agents tested, the five isolates were only
susceptible to polymyxin B.
By PFGE analysis, the five P. aeruginosa isolates were indistinguishable. These
strains were compared with six carbapenems-susceptible isolates recovered at the
same time from the same medical site in Germany. All susceptible isolates were, by
PFGE analysis, significantly different from the carbapenem-resistant isolates and also
distinct from each other (data not shown).
MβL screening and PCR experiments. Initial MβL screening experiments showed that
each of the five isolates produce an MβL. Analysis with MβL Etest strips showed
decreases in the MICs of imipenem in the presence of EDTA (from > 256 µg/mL to
imipenem to 2 µg/mL for the combination imipenem/EDTA). Spectrophotometric assays
demonstrated carbapenemase activity against carbapenems (meropenem-hydrolizing
38
activity between 0.0113 and 0.0287 Abs/min), which was 85% EDTA-inhibited in all five
P. aeruginosa isolates.
Preliminary PCR amplification experiments failed to detect previously described
MβL genes, whereas controls with blaVIM, blaIMP and blaSPM-like genes yielded PCR
products of the expected sizes. In contrast, amplicons of 900 pb were obtained from
PCR with the integrase (3F1 primer, see Table 1) and aacA4 primer pair. Sequence
analysis of these fragments revealed the same open reading frame of 753 bp coding for
a protein of 250 amino acids with significant similarities to some class B MβLs. The new
MβL gene was named blaGIM-1 (German imipenemase).
Sequence analysis and its deduced protein sequence. The nucleotide sequence of
blaGIM-1 showed a GC content of 42.1% and encoded a mature protein of 25,501 Da
with a theoretical pI of 5.3. Analytical IEF of P. aeruginosa revealed three β-lactamase
bands, one with a pI of 5.4 and that likely corresponded to GIM-1, and two additional
bands focused in pI 6.7 and 8.4. The additional band in pI 8.4 is probably the
chromosomally encoded AmpC. The results obtained in the IEF showed that the pI
value was 5.4, in agreement with the theoretical value.
The amino acid sequence of GIM-1 had low identity with other clinically significant
MβL genes. The amino acid sequence displayed most identity with IMP-variants IMP-6,
IMP-1 and IMP-4 (43.5, 43.1 and 43.1%, respectively), followed by VIM-variants ranging
from a high of 31.2% with VIM-7 to 28.8% with VIM-1, VIM-4 and VIM-5 and only 28.0%
similarity with SPM-1. A phylogenetic analysis placed the new enzyme in a new subclass of class B β-lactamases (Figure 1).
The predicted protein sequence showed that in the active site, GIM-1 has amino
39
acid motifs that are conserved in MβL enzymes (4,10), namely the consensus zinc
binding, following the BBL numbering system (11): motif HXHXD (residues 116 to 120)
and the other residues involved in the coordination of the Zn+2 ions: Hys196, Cys221
and Hys293; however, the zinc-binding motif of GIM-1 is unique in that there is a serine
at position 96 and a glutamic acid residue at position 98, amino acid residues that are
not found at these positions in other MβL enzymes (Figure 2).
Genetic environment harboring blaGIM-1. Plasmid DNA analysis showed that the five
P. aeruginosa clinical isolates harbored plasmids of the same size. The plasmid
obtained from strain 73-5671 was estimated to be approximately 22 kb in size, as
determined from DNA fragment profiles generated with different restriction enzymes.
Southern hybridization experiments showed that blaGIM-1 is in the plasmid (Figure 3),
although transfer of the β-lactam resistance by electroporation and conjugation could
not be demonstrated.
Extended analysis of the genetic environment of blaGIM-1 revealed key genetic
components found in class 1 integrons: the 5’-CS containing the intI1 integrase gene
with its own promoter and the attI1 recombination site, and the 3’-CS accommodating
the fused structure qacE∆1/sul1 (2). The MβL gene is located in the first gene cassette
position of this 6 kb class 1 integron, which was named In77. Two putative promoters
(P1 and P2) precede the blaGIM-1 start codon (ATG), both of which lie within the
integrase structural gene. The primary promoter (P1) had all the features of an
intermediate strength promoter: the -35 box TGGACA and the -10 box TAAACT being
separated by 17 bp (5). An insertion of three guanosine residues has been reported to
activate the second promoter (P2) by spacing the -35 and -10 hexamers to 17 bp (4).
40
This feature was not present in this integron, signaling that only the P1 drives the
expression of the gene cassettes embedded in the integron.
The MβL gene has been inserted at the attI1 recombination site, and although
blaGIM-1 is preceded by the expected core site (GTTAGAA), it is not immediately
followed by an inverse core site and other elements of a 59-be (2L and 2R regions). The
second cassette in In77 accommodates the aacA4 gene; however, the expected 59-be
between blaGIM-1 and aacA4 could not be found, even within the MβL gene. The aacA4
allele in this integron encodes an AAC(6’)-Ib aminoglycoside acetyltransferase that
confers resistance to netilmicin, gentamicin and tobramycin. The 3’ end of the aacA4
gene cassette leads to a 59-be that is 72 bp long, which is in turn followed by a second
aminoglycoside-resistant determinant, aadA1. However, this gene is interrupted at
nucleotide position 135 by a copy of IS1394 (GenBank accession number U37284) (36),
a 1,100 bp insertion sequence (IS), previously described in a strain of Pseudomonas
alcaligenes. The IS1394 encodes a transposase that shows identity with those of the
IS30 family of elements. As shown in Figure 4, the transcriptional orientation of the
IS1394 copy in In77 is opposite that of the genes acquired as cassettes. Following the
IS1394 is the remainder of the aadA1 gene cassette. The 59-be of the aadA1 gene
cassette is 60 bp long and shows all consensus features of the recombination site
structures (core site GTTRRRY, inverse core site RYYYAAC and the internal domains
2l and 2R). Finally, the aadA1 gene cassette is followed by another β-lactamase gene
cassette accommodating blaOXA-2. This is followed by the fused gene cassette
qacE∆1/sul1.
41
Patterns of β-lactam susceptibility of E. coli producing the GIM-1 enzyme. The
substrate specificity of GIM-1 and its contribution to resistance were investigated by
testing the susceptibility against β-lactams of E. coli DH5α carrying the recombinant
plasmid containing the integron borne blaGIM-1 (pGIM-1) and that produces GIM-1
enzyme in contrast to DH5α, which carries an empty vector.
GIM-1 production was associated with a decrease in the in vitro susceptibility of
the E. coli host to ceftazidime, cefotaxime, cefepime, imipenem, meropenem and
ampicillin, indicating that the enzyme can contribute to broad-spectrum resistance in the
microbial host.
Kinetic properties of GIM-1. By SDS gel electrophoresis, the purified preparation of
GIM-1 showed a single 26 KDa band and was estimated to be >95% pure (data not
shown). In addition, the pI of the protein was determined, and after a nitrocefin staining,
only one 5.4 band was observed in the gel.
The kinetic parameters of GIM-1, including kcat, Km and the ratio kcat/Km, were
determined for several different β-lactam compounds, as presented in Table 4. Under
the experimental conditions adopted, GIM-1 hydrolyzed most tested compounds, with
the exception of aztreonam, azlocillin and the serine β-lactamase inhibitors, clavulanic
acid and tazobactam. Even after prolonged incubation (1-3 h) of the enzyme with these
agents, enzyme activity was undetectable.
The kinetic parameters of the purified GIM-1 reveal a broad substrate profile, but
no clear preferences for any of the β-lactam subfamilies tested. Individual kinetic
parameters for GIM-1 for different β-lactam agents differed considerably. The highest
kcat/Km ratios were observed with cefuroxime, cephalothin and ceftazidime (0.802, 0.718
42
and 0.577 µM-1s-1, respectively). The lowest values were demonstrated with
moxalactam, carbenicillin and ticarcillin (0.014, 0.024 and 0.039 µM-1s-1, respectively).
For the carbapenems, GIM-1 showed 10 times greater turn over of imipenem
than meropenem (kcat of 27.1 s-1 and 2.7 s-1, respectively). However, the affinity of the
enzyme for imipenem is 10 times higher than for meropenem (Km of 287.5 and 25.4 µM,
respectively), which makes the kcat/Km ratios for the two compounds very similar (0.094
for imipenem and 0.106 µM-1s-1 for meropenem). This finding contrasts those for other
clinically important class B β-lactamases, which show larger kcat/Km ratios for imipenem
than for meropenem (Table 4).
The comparison of GIM-1 kinetic values with the parameters reported for other
clinically relevant MβL (Table 4) showed that, in general, the kcat/Km ratios obtained for
GIM-1 are lower than those of other MβLs, specifically IMP-1, VIM-1, VIM-2 and SPM-1.
43
Discussion
The novel class B β-lactamase, GIM-1, is divergent from other class B βlactamase enzymes and is the fourth sub-class of mobile MβL thus far identified. The
enzymes most closely related to GIM-1 are the IMP-variants, although GIM-1 shares
approximately 40% amino acid identity with this group. GIM-1 possesses the major
consensus features of the MβL family (8), such as the zinc-binding motif (HXHXD), with
amino acids not previously reported at the variable positions in this motif likely to be
relevant to the particular activity of the protein.
The kinetic properties of GIM-1 demonstrate that the enzyme has similar activity to
other members of the class B β-lactamases (7,14,18,21), although the kinetic
parameters for GIM-1 show these values are closer to those of IMP-1 than to those of
VIM-1, VIM-2 and SPM-1. GIM-1, like IMP-1, prefers penicillin and ampicillin (kcat/Km
0.142 and 0.157 µM-1s-1) over other penam antimicrobial agents, such as carbenicillin
and ticarcillin (kcat/Km 0.024 and 0.039 µM-1s-1, respectively). Although GIM-1 and IMP-1
exhibit similar kinetic properties when tested against penicillin and ampicillin, there are
differences in the kinetic activities of these enzymes against cephalothin and cefoxitin
as substrates (kcat/Km 0.718 and 0.040 µM-1s-1 for GIM-1 compared with 2.4 and 2.0 µM1 -1
s
for IMP-1). Unlike the other class B β-lactamases, which show more significant
activity against imipenem than against meropenem, GIM-1 demonstrates similar kinetic
ratios with imipenem and meropenem (kcat/Km 0.094 and 0.106 µM-1s-1, respectively). In
conclusion, the low kcat/Km ratios determined for GIM-1 with most β-lactam antimicrobial
agents reflect high substrate affinities (Km) and low substrate turn-over rates (kcat).
Like the majority of MβL genes, blaGIM-1 was found on a class 1 integron, In77, that
is carried on a 22 kb plasmid in P. aeruginosa 73-5671. In addition to a novel MβL gene,
44
this integron harbors three other resistance genes, aacA4, aadA1 and blaOXA-2, in that
order (Figure 4). The blaGIM-1 and aacA4 genes appeared to be accommodated in a
single gene cassette that has probably been generated from individual cassettes by
deletion of most of the intervening 59-be. The aadA1 cassette is bisected by an
insertion element, IS1394 that inactivates this particular gene. In addition, the IS1394 is
oriented so that its transposase gene is transcribed towards the integrase gene of the
In77. Since gene cassettes in class 1 integrons do not carry their own promoters (3),
and thus are under the control of the integron promoter embedded in the intI1, in this
integron structure, gene cassettes located downstream from the IS1394, such as blaOXA2,
are unlikely to be expressed.
The finding of blaGIM-1 in what appears to be five clonal isolates of P. aeruginosa
from different patients from the same hospital is evidence of a nosocomial outbreak.
The production of a novel MβL by these isolates is perhaps a warning of future clinical
problems with these and like strains. However, in its present form, the GIM-1 gene may
not be as mobile as those encoding IMP or VIM MβLs, because the 22 kb plasmid
carrying In77 is non-conjugative and appears to have a restricted host-range. Whether
the two-gene cassette accommodating blaGIM-1 and aacA4 will move to another integron
on a more easily transmissible plasmid, as has happened with other cassette-borne
MβL genes, only time will tell.
Several important points arise from this and other studies of MβL found in clinical
isolates: (i) of the four sub-classes of mobile MβL gene identified to date, two were
originally found in Europe, perhaps signaling future difficulties for empirical treatment
with carbapenems in this region; (ii) thus, it is clearly desirable that the incidence of
MβL-production in clinical isolates of key Gram-negative bacteria, such as P.
aeruginosa, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens and, Klebsiella pneumoniae be
45
carefully monitored; and (iii) the results reported in this communication attest to the
importance of global resistance surveillance programs such as SENTRY in identifying
the emergence and epidemic spread of new threats to the efficacy of antimicrobial
therapy.
46
Acknowledgments
We are grateful to Dr. Alan M. Simm and Tanya A. Murphy for their important
advice during the purification of GIM-1, and to Drs. Peter M. Bennett, Ayman Hawrani
and Helio S. Sader for critically reviewing this manuscript.
47
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53
TABLE 1. Oligonucleotides used as primers for PCR amplification and sequencing.
Primer
Target
Sequence (5’-3’)
IMP1F
blaIMP-like
TGAGCAAGTTATCTGTATTC
Accessio
n number
AJ223604
IMP1R
blaMP-1 59-be
GCTGCAACGACTTGTTAG
AJ223604
ATT1F
attI1
TTATGGAGCAGCAACGATGT
AJ515707
VIMR
blaVIM-like
CGAATGCGGCAGCACCAGG
AJ515707
SPM1F
blaSPM-like
CCTACAATCTAACGGCGACC
AJ492820
SPM1R
blaSPM-like
TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
AJ492820
intI1F
integrase
GCCGTAGAAGAACAGCAAGG
AJ515707
intI2F
integrase
TCAATCTCCGCGAGAAGTGC
AJ515707
ATT1R
attI1
GCCTGTTCGGTTCGTAAGCT
AJ515707
GIMF
blaGIM-1
AGAACCTTGACCGAACGCAG
This study
GIMR
blaGIM-1
ACTCATGACTCCTCACGAGG
This study
GIMFF
blaGIM-1 flanking region
CTACGTGACCAACAGCAACG
This study
aacA4F
aacA4
TGCGATGCTCTATGAGTGGC
AJ515707
aacA4R
aacA4
ATGTACACGGCTGGACCATC
AJ515707
aacA4FF
aacA4 flanking region
AACTTGCGAGCGATCCGATG
AJ515707
aacA4FR
aacA4 flanking region
AGCCACTCATAGAGCATCGC
AJ515707
aadA1F
aadA1
CGCCGAAGTATCGACTCAAC
AJ584652
IS1394R
IS1394
ACAGAGGTAGTGGCGTTGC
U37284
ISF
IS1394
CGGTCTTCTGGGTGATTTCC
U37284
ISFR
IS1394
CGCGCTTAGCTGGATAACG
U37284
aadA1R
aadA1
GACTACCTTGGTGATCTCGC
AJ584652
aadA1FF
aadA1 flanking region
GAGATCACCAAGGTAGTCGG
AJ584652
oxa2F
blaOXA-2
TTCAAGCCAAAGGCACGATAG
AF300985
oxa2R
blaOXA-2
TCCGAGTTGACTGCCGGGTTG
AF300985
oxa2FF
blaOXA-2 flanking region
AAGCGTTACCGCCCAACC
AF300985
oxa2FR
blaOXA-2 flanking region
ATGCGCGAAAGTGGCAAGAG
AF300985
QACR
qacE∆1
CGGATGTTGCGATTACTTCG
AJ515707
SUL2R
sul1
GGCTCTCATCGAAGAAGGAG
AJ515707
Sul1R
sul1
GGCTCTCATCGAAGAAGGAG
AJ515707
Piperacillin
Piperacillin/tazobactam
Ticarcillin
Ticarcillin/clavulanic acid
Ceftriaxone
Ceftazidime
Cefepime
Imipenem
Meropenem
Aztreonam
Ciprofloxacin
Levofloxacin
Gatifloxacin
Amikacin
Gentamicin
Tobramycin
Netilmicin
Tetracycline
Trimetoprim/sulfametoxazole
Polymyxin B
a
Not tested
Antimicrobial Agents
>128
>64
>128
>128
>32
>16
16
>8
>8
8
>4
>4
>4
4
>8
16
>32
>8
>2
2
73-5671
>128
>64
>128
>128
>32
>16
16
>8
>8
8
>4
>4
>4
4
>8
16
>32
>8
>2
2
73-12198
Antimicrobial Surveillance Program in 2002.
>128
>64
>128
>128
>32
>16
>16
>8
>8
16
>4
>4
>4
16
>8
>16
>32
>8
>2
4
73-15553
>128
>64
>128
>128
>32
>16
16
>8
>8
16
>4
>4
>4
16
>8
16
>32
>8
>2
1
73-15574
MIC (µg/ml)
>128
>64
>128
>128
>32
>16
16
>8
>8
16
>4
>4
>4
16
>8
>16
>32
>8
>2
1
73-15480
128
256
4
0.5
0.125
0.125
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
E. coli DH5α
(pGIM-1)
16
__a
__a
__a
E. coli
DH5α
0.5
__a
__a
__a
0.125
0.125
0.06
0.06
0.06
0.06
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
__a
TABLE 2. Antimicrobial susceptibility patterns of the five GIM-1 producer isolates from Dusseldorf, Gemany, submitted to SENTRY
54
6.6
3.3
4.1
NDa
6.9
2.3
5.8
16
5.9
8.3
18
1.1
17
27
2.7
14
NDa
NDa
NDa
kcat
(s-1)
46
20
170
NDa
69
57
12
22
7
206
31
4
431
287
25
1035
NDa
NDa
NDa
Km
(µM)
ND. data could not be determined
a
Penicilllin
Ampicillin
Carbenicillin
Azlocillin
Piperacillin
Ticarcillin
Nitrocefin
Cephalothin
Cefuroxime
Cefoxitin
Ceftazidime
Cefotaxime
Cefepime
Imipenem
Meropenem
Moxalactam
Aztreonam
Clavulanic acid
Tazobactam
Antibiotic
0.14
0.16
0.02
NDa
0.10
0.04
0.47
0.72
0.80
0.04
0.58
0.24
0.04
0.09
0.11
0.01
NDa
NDa
NDa
kcat/ Km
(µM-1s-1)
GIM-1this study
kcat/ Km
(µM-1s-1)
520
0.62
200
4.8
a
ND
0.02
b
__
__b
NDa
0.72
740 0.0015
27
2.3
21
2.4
37
0.22
c
8
2
44
0.18
4c
0.35
c
0.66
11
39
1.2
10
0.12
c
10
8.8
>1000 <1x10-5
__b
__b
>3.98 0.0039
Km
(µM)
. data not available
b
320
950
NDa
__b
NDa
1.1
63
48
8
16
8
1.3
7
46
50
88
>0.01
__b
>1000
kcat
-1
(s )
IMP-1(14)
Km
(µM)
kcat/ Km
(µM-1s-1)
29
841
0.034
37
917
0.04
167
75
2.2
1525
123
12
1860 3500
0.53
452
1117
0.41
95
17
5.6
281
53
5.3
324
42
7.7
26
131
0.2
60
794
0.076
169
247
0.68
549
145
3.8
2.0
1.5
1.3
13
48
0.27
b
b
__
__
__b
<0.01 >1000 <1x10-5
__b
__b
__b
5.3
337
0.016
kcat
-1
(s )
VIM-1(7)
c
49
__b
__b
__b
72
46
__b
44
22
24
98
32
184
10
5
80
NDa
__b
__b
Km
(µM)
1.14
__b
__b
__b
0.45
0.69
__b
1.28
0.55
0.12
0.90
0.86
0.03
0.99
0.28
0.18
NDa
__b
__b
kcat/ Km
(µM-1s-1)
108
117
74
53
117
NDa
0.53
43
37
8
28
16
18
33
63
13
NDa
NDa
0.6
kcat
-1
(s )
. Km was obtained as the Ki value
55.8
__b
__b
__b
32.7
31.7
__b
56.2
12.1
3
89
27.5
4.7
9.9
1.4
14.8
<0.5
__b
__b
kcat
-1
(s )
VIM-2(21)
38
72
814
147
59
<0.35
4
4
4
2
46
9
18
37
281
97
<0.3
>0.1
3
Km
(µM)
2.8
1.6
0.09
0.35
2
NDa
0.12
11.7
8.8
4
0.6
1.9
1
1
0.22
0.13
NDa
NDa
0.2
kcat/ Km
(µM-1s-1)
SPM-1(18)
TABLE 3. Steady-state kinetic parameters of the purified GIM-1 in comparison with those of IMP-1, VIM-1, VIM-2 and SPM-1.
55
with CLUSTAL W.
FIGURE 1. Phylogenetic tree obtained for major classes of mobile metallo-β-lactamases. The alignment is used was performed
56
M
.
.
.
Y
-
L
.
.
.
I
.
V
.
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
S
.
.
N
V
.
I
.
P
-
K
S
L
N
T
S
.
.
V
.
.
A
T
-
N
K
K
S
N
A
D
G
P
-
A
V
-
L
G
-
L
T
.
V
.
N
.
G
D
I
-
R
116 118 120
H S H E D R
. F . S . S
. F . D . .
. F . L . G
D
V
.
L
E
-
S
A
.
L
V
L
.
R
M
N
-
K
Q
E
E
T
K
V
-
P
A
G
G
G
Y
.
L
V
E
-
G
G
.
.
.
I
L
L
.
L
.
V
V
V
F
I
.
V
N
I
.
.
V
E
K
R
D
V
L
I
M
K
E
D
E
D
.
.
S
V
I
L
L
L
S
S
G
L
W
V
I
T
.
.
S
I
E
Y
P
V
.
S
A
L
.
.
Y
P
.
A
.
K
.
Q
Y
F
.
L
.
N
.
R
K
W
F
.
F
I
L
.
N
L
F
.
C
S
.
A
K
S
T
G
E
E
D
A
L
I
.
V
L
K
R
A
M
E
A
A
N
D
E
.
T
L
F
Y
.
S
.
G
G
E
K
K
L
G
.
.
A
L
.
M
.
I
.
V
A
D
.
N
G
V
.
.
T
V
F
T
.
P
.
A
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T
.
.
.
Y
.
W
K
A
C
.
.
T
.
.
.
K
E
A
Q
L
V
S
I
L
S
S
G
Y
.
.
W
L
K
A
T
H
.
.
D
P
I
V
A
T
A
A
S
L
.
.
.
T
.
I
S
A
.
M
P
S
.
.
.
L
V
.
M
S
.
A
D
L
T
A
.
E
.
P
D
S
T
A
D
F
.
T
V
A
.
V
S
L
.
S
.
W
.
E
.
K
E
Q
F
Q
A
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T
.
.
.
A
F
I
V
N
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S
V
G
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S
K
K
N
R
.
T
V
E
A
I
V
F
V
H
S
P
S
K
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R
Q
D
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K
K
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N
D
T
K
L
L
S
L
.
.
.
R
.
Q
T
G
.
.
D
P
.
A
D
L
.
A
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G
.
I
M
Y
W
R
D
H
H
A
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L
G
K
G
.
A
D
S
-
R
K
A
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Y
.
L
P
L
V
V
F
G
-
E
D
.
.
Q
K
P
K
V
.
Y
Y
E
-
G
.
.
N
V
I
.
K
D
P
P
S
P
-
K
.
N
.
M
K
T
V
S
K
.
.
S
-
K
A
G
R
V
N
H
.
.
G
-
D
S
.
A
A
G
.
.
V
E
-
57
N
K
F
.
G
.
S
E
D
S
.
E
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
I
L
L
M
L
.
A
.
G
N
.
E
P
V
E
I
L
.
.
V
G
.
.
.
L
K
P
.
V
Q
I
K
D
K
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N
Y
N
N
.
I
.
V
V
P
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.
A
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L
.
K
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L
.
L
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.
.
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T
.
.
A
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.
.
G
.
A
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L
V
.
V
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.
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.
.
Y
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S
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.
.
Y
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F
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V
V
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.
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K
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.
A
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V
.
I
.
L
V
G
.
.
.
D
G
G
N
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V
K
.
S
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.
P
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K
S
A
E
A
G
.
A
A
A
G
H
.
W
.
.
.
H
.
.
.
196
E
N
S
D
S
L
K
V
A
P
P
P
T
.
S
S
K
N
.
.
G
D
K
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.
E
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.
.
.
D
.
.
.
R
L
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.
.
.
I
M
K
V
R
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.
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L
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L
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L
.
L
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V
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.
Y
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.
K
-
L
.
V
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P
K
.
H
-
P
.
.
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V
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.
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K . S K P S N
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G
.
.
.
D
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.
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G
.
.
.
L
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.
.
.
C
.
.
.
221
K
V
I
.
I
S
G
G
S
.
.
H
.
.
.
263
L
F
A
M
Q
G
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.
.
R
K
H
K
S
K
K
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L
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.
P
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Y
L
K
F
Y
D
.
G
.
.
.
E
S
-
T
W
A
S
S
D
G
G
W
S
-
L
.
V
F
S
A
L
P
E
T
-
G
V
R
S
Residues involved in the coordination of the zinc ion are underlined and numbered according to the BBL system (in italic).
Differences in the amino acid sequences are noted by a single letter representing the amino acid change within a particular sequence.
FIGURE 2. Aligment of the amino acid sequence of GIM-1 with three representatives of the MβL groups, IMP-1, VIM-1 and SPM-1.
R
GIM-1
IMP-1
VIM-1
SPM-1
58
Kb plasmid from the index isolate harboring blaGIM-1.
5671. (b) Results of Southern blot analysis showing the hybridization of intI1F/GIMR marked probe with the probe fragment and the 22
FIGURE 3. (a) Agarose gel electrophoresis: (M) 1kb plus ladder, (P) probe (TD) genomic DNA, and (p5671) plasmid from strain 73-
59
arrows beneath the gene map indicate the positions of the primers used for PCR reactions and sequence analyses.
transcription). The black dots indicate 59-bes. In the third cassette position the aadA1 is interrupted by a copy of the IS1394. Block
FIGURE 4. Schematic representation of integron In77 carrying blaGIM-1 (the arrows in the gene boxes indicating the direction of
60
61
3 Discussão
O aumento, tanto na prevalência de infecções causadas por P. aeruginosa quanto
nas taxas de resistência a antimicrobianos utilizados empiricamente para o tratamento
de infecções causadas por esse agente, tem dificultado a escolha da terapêutica
antimicrobiana para o tratamento dessas infecções (Diekema et al., 1999). Os βlactâmicos com atividade antipseudomonas, como as cefalosporinas de amplo espectro
e os carbapenens, são agentes amplamente utilizados para terapia antimicrobiana em
pacientes acometidos por infecções causadas por P. aeruginosa. No entanto o
surgimento e a disseminação de genes que conferem resistência a esses β-lactâmicos
têm sido relatados em diversas partes do mundo (Nordmann & Poirel, 2002, Patzer et
al., 2004, Toleman et al., 2002, Toleman et al., 2005, Walsh et al., 2003).
Os trabalhos apresentados descrevem a presença de dois genes que codificam βlactamases, presentes em amostras de P. aeruginosa, encontrados inseridos em
integrons da classe 1, estruturas genéticas capazes de capturar genes de resistência e
que demonstram grande habilidade na mobilização e disseminação desses genes entre
diferentes
bactérias.
Os
isolados
clínicos
caracterizados
nos
dois
estudos
apresentados foram avaliados no Programa SENTRY de Vigilância de Resistência a
Antimicrobianos (Pfaller et al., 1998) no ano de 2002. Devido aos padrões de
resistência dessas amostras, as mesmas foram submetidas a estudos moleculares
para caracterização dos determinantes de resistência aos β-lactâmicos.
O primeiro trabalho descreve a presença de blaGES-1, uma β-lactamase de
espectro ampliado, que confere resistência às cefalosporinas de amplo espectro em
uma amostra isolada no Hospital São Paulo/UNIFESP. Amostras produtoras de GES-1
já foram relatadas em diferentes países (Duarte et al., 2003, Dubois et al., 2002,
62
Weldhagen et al., 2003), no entanto, apesar do gene que codifica essa enzima ter sido
isolado primeiramente de uma amostra proveniente da Guiana Francesa, país com o
qual o Brasil faz fronteira, até a publicação desse trabalho, esse gene não havia sido
descrito em amostras brasileiras, ou mesmo em outras amostras isoladas na América
Latina.
O gene blaGES-1 já foi encontrado em amostras de P. aeruginosa e também em K.
pneumoniae associado a integrons estruturalmente distintos que podem ser
encontrados nos plasmídios ou no cromossomo bacteriano. Os experimentos
realizados com a amostra 48-8896, apresentados no presente estudo, mostraram que
esse gene estava localizado no cromossomo bacteriano. A amostra estudada não
demonstrou a presença de plasmídios, apesar das diferentes técnicas de extração
utilizadas. Esse fato não exclui a possibilidade de disseminação horizontal do gene que
codifica a ESBL, porque as regiões de DNA, adjacentes a esse integron, podem conter
estruturas genéticas ainda não reveladas que permitam a mobilização dessa estrutura.
Contrariando a afirmação de alguns autores de que, na maioria dos casos, os
genes que codificam ESBLs em P. aeruginosa têm um nicho ecológico específico, os
genes pertencentes à família blaGES/IBC têm origens multifocais e parecem estar
disseminados por diversas áreas geográficas (Weldhagen et al., 2003). Amostras
produtoras das variantes de GES/IBC podem ser encontradas na França (Poirel et al.,
2000), Portugal (Duarte et al., 2003), Grécia (Giakkoupi et al., 2004), África do Sul
(Weldhagen & Prinsloo, 2004), Japão (Wachino et al., 2004a, Wachino et al., 2004b),
Brasil e, muito recentemente, GES-1 foi reportada de uma amostra de P. aeruginosa
produtora de VIM-11 isolada em 2002, na Argentina (Pasteran et al., 2005).
A diversidade estrutural dos integrons associados ao gene blaGES-1, somada aos
achados de três amostras distintas produtoras de GES-1 provenientes de diferentes e
63
distantes locais em países latino-americanos sugerem que as amostras produtoras de
GES-1 já estão estabelecidas nessa região e ainda que podemos ter um grande nicho
ecológico desse gene na América Latina. Contudo a presença de blaGES-1 em amostras
isoladas no Brasil e na América Latina é preocupante não somente pelo seu potencial
de disseminação entre diferentes cepas e espécies, mas também porque uma única
substituição de aminoácido no sítio ativo dessa enzima pode levar uma ESBL a
apresentar também resistência aos carbapenens, como acontece com GES-2 e GES-4
(Vourli et al., 2004), reduzindo ainda mais as opções terapêuticas para o tratamento de
infecções causadas por patógenos produtores dessas enzimas.
O segundo trabalho apresentado caracteriza genética e bioquimicamente uma
nova MβL, GIM-1 que, devido às divergências estruturais apresentadas por essa
enzima quando comparada às variantes de IMP, VIM e a SPM-1, foi agrupada em uma
nova sub-classe. Apesar de suas diferenças estruturais, GIM-1 demonstra todas as
características de uma MβL (Bush, 1998) e assim,como muitos outros genes que
codificam as MβLs adquiridas, o gene blaGIM-1 foi encontrado em um integron da classe
1, denominado In77.
Além de blaGIM-1, no integron In77 também estavam contidos dois genes os quais
conferem resistência aos aminoglicosídeos: o gene aacA4, que faz parte da família das
aminoglicosídeo acetil-tranferases, e o gene aadA1, que codifica uma aminoglicosídeo
adenil-transferase. Esse segundo gene está interrompido por uma seqüência de
inserção (IS), IS1394 a qual, além de impedir a expressão desse gene, pode também
interromper a expressão dos genes que se localizam a jusante a esta IS, nesse caso o
gene blaOXA-2. Isso pode ocorrer porque todos os genes cassetes do integron estão
sobre o controle do promotor da integrase, e a IS presente em In77, que tem o sentido
da transcrição inverso aos demais genes cassetes do integron, irá teoricamente
64
bloquear a atuação do promotor localizado na integrase. Experimentos não
apresentados no trabalho publicado foram realizados na tentativa de confirmar a
ausência de expressão de blaOXA-2. Esses experimentos, realizados pela técnica de
Reverse-Transcriptase PCR, mostraram a existência de RNA mensageiro para o gene
blaOXA-2, o que pode indicar a presença de uma segunda cópia desse gene em outro
lócus, ou então algum mecanismo desconhecido para a expressão do gene localizado
no integron. Estudos futuros mais aprofundados ainda são necessários para elucidar o
mecanismo de expressão do gene blaOXA-2 nessas amostras produtoras de GIM-1.
Como sugere o trabalho que caracterizou a nova MβL, o gene blaGIM-1 não parece
ter um grande potencial de disseminação, no entanto estudos adicionais mostraram
que In77 está inserido em um transposon que pode fornecer maiores possibilidades
para a disseminação desse gene. Ainda os resultados apresentados mostram que essa
enzima foi caracterizada de cinco amostras isoladas de diferentes pacientes em um
mesmo hospital da Alemanha com o mesmo perfil genético, por isso a disseminação
clonal de amostras produtoras de GIM-1 é um problema já existente.
Em ambos os casos reportados no presente estudo, a aquisição do gene que
codifica as β-lactamases parece ser um evento recente, uma vez que é sugerido que o
gene localizado na primeira posição do integron foi o último a ser integrado. Essa
hipótese é baseada na observação da preferência da integrase pela recombinação
entre o sítio attI e 59-be do gene cassete, a qual ocorre com freqüência
consideravelmente mais elevada que a ligação entre o 59-be de um gene cassete já
integrado com o 59-be do gene cassete livre (Collis & Hall, 1992).
Outra característica observada nos dois integrons é a ausência de um segundo
promotor na integrase, como descrito em muitos trabalhos. A integrase dos integrons
da classe 1 possuem originalmente um promotor, denominado Pant ou P1 (Bennett,
65
1999). A inserção de três moléculas de guanosina entre as seqüências putativas -10 e 35 localizadas abaixo do promotor principal, aumenta o espaço entre essas duas
seqüências de 14 pb para 17 pb, o que é necessário para a formação de um promotor.
Esse evento genético dá origem a um segundo promotor, P2, que incrementa a
expressão dos genes localizados no integron (Collis & Hall, 1995). Pode-se observar
nas descrições genéticas dos dois trabalhos, que os integrons caracterizados não
possuem a adição dos três Gs. Entretanto um evento genético futuro que promova a
inserção dessas três moléculas pode aumentar os níveis de expressão desses genes,
causando um aumento fenotípico dos níveis de resistência nesses isolados.
Além de fornecer uma explicação para a disseminação da resistência bacteriana,
a presença de múltiplos genes de resistência aos antimicrobianos em uma única
estrutura genética móvel também fornece uma hipótese para as elevadas taxas de
multiresistência
em
P.
aeruginosa.
Adicionalmente,
regimes
de
tratamento
antimicrobiano nos quais contenham cloranfenicol ou aminoglicosídeos, por exemplo,
podem aumentar a prevalência de genes que codificam resistência a antimicrobianos
estruturalmente não-relacionados, incluindo cefalosporinas de amplo espectro e até
mesmo carbapenens, pela seleção de integrons que contenham concomitantemente
genes para resistência a esses diferentes antibióticos.
A resistência à ceftazidima em isolados clínicos de P. aeruginosa é muitas vezes
atribuída à hiperprodução de AmpC, contudo a produção de ESBLs parece desempenhar
um papel importante na resistência a esse agente. Estudos que determinem a prevalência
de ESBLs em P. aeruginosa são necessários para otimizar a terapêutica antimicrobiana de
infecções causadas pelo agente etiológico em questão, uma vez que, para amostras
resistentes à ceftazidima que são hiperprodutoras de AmpC pode-se utilizar cefepima e,
para amostras produtoras de ESBLs, ocorreria falha terapêutica durante o tratamento com
66
esse agente.
Os esforços científicos para a caracterização e para o entendimento da
disseminação das β-lactamases são de grande importância para a implementação de
medidas de controle. Além disto, os estudos que contribuam para o conhecimento das
MβLs adquiridas e de sua disseminação são essenciais para que se desenvolvam
inibidores que possam ser usados clinicamente para o tratamento de infecções
causadas por bactérias produtoras dessas enzimas, assim como ocorre com os
inibidores para as ESBLs, a saber, o ácido clavulânico, o tazobactam e o sulbactam.
Programas de vigilância epidemiológica, como o Programa SENTRY, que
investe em estudos moleculares dos mecanismos de resistência aos antimicrobianos
contribuem consideravelmente para o entendimento dos padrões de surgimento e de
disseminação de genes que codificam a resistência, contudo, estudos locais mais
abrangentes utilizando as informações geradas pelos programas de vigilância são
necessários para complementar esses dados restritos a um pequeno número de
amostras, isoladas de um limitado número de instituições.
Com a experiência adquirida ao longo da realização desse trabalho,
pretendemos ampliar a linha de pesquisa em β-lactamases já existente no Laboratório
ALERTA da Disciplina de Doenças Infecciosas da UNIFESP, para que sejam
realizados estudos brasileiros elucidativos da prevalência, do surgimento e dos
mecanismos de mobilização e disseminação dos genes e dos elementos genéticos que
codificam essas enzimas de grande importância clínica.
67
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