NOVA LiteTM F-Actin Rat Epithelial

QUANTA Lite® PR3 SC ELISA Bulk Pack
704660.10
Para utilização em diagnóstico In Vitro
Complexidade CLIA: Elevada
Aplicação Diagnóstica
Este kit destina-se à determinação in vitro dos autoanticorpos IgG anti-proteinase 3 (PR3) presentes no soro
humano com o objectivo de diagnosticar alguns tipos de vasculites autoimunes, incluindo granulomatose de
Wegener, em conjunto com outros dados clínicos. São fornecidos reagentes suficientes para testar até 41
amostras em duplicado ou 89 amostras simples, com a curva de calibração e os controlos positivo, negativo.
Resumo e Explicação do teste
Os anticorpos anti-PR3 encontram-se entre o conjunto dos oito principais anticorpos anti-neutrófilos
citoplasmáticos (ANCA). Na sua maioria os alvos antigéniccos dos ANCA são os enzimas provenientes dos
neutrófilos, os quais incluem: Mieloperoxidase (MPO), Proteína do Incremento de Permeabilidade Bactericida
(BPI), Lisozima, Elastasa, Lactoferrina, Catepsina G e Azurocidina.
Os neutrófilos fixados em etanol quando marcados e visualizados por imunofluorescência (IF) dão origem aos três
padrões principais de ANCA: perinuclear (p-ANCA), citoplasmático (c-ANCA) e ANCA atípico. O padrão c-ANCA é
essencilamente originado pelo enzima PR3.
Os autoanticorpos anti-PR3 podem actuar como marcadores para a doença bem como para a actividade,
conjuntamente com o aumento do nível de anticorpos durante a fase activa da doença.
A incidência dos autoanticorpos PR3 em diferentes vasculites e as condições associadas estão sumariados
abaixo:
DOENÇA
Granulomatose de Wegener10
Doença inflamatória crónica do intestino3
Poliangite microscópica3
Sindrome Churg-Strauss3
INCIDÊNCIA (%)
>95
citado
citado
30
Embora a standardisação da IF ou ELISA se encontre ainda em desenvolvimento, é recomendado o seguinte
procedimento: a técnica IF deve ser utilizada inicialmente para efectuar a identificação do tipo de ANCA, isto é pou c-ANCA e o título. Cada amostra positiva por IF deve ser testada seguidamente por ELISA de modo a
determinar o antigénio específico do autoanticorpo presente. Por exemplo, deve realizar-se a determinação do
antigénio PR3 por ELISA para uma amostra positiva c-ANCA. Para informações adicionais consultar as referências
1, 2 e 4-9.
Princípio do método
Os poços da microplaca estão revestidos com o antigénio PR3. Os calibradores, controlos e amostras diluídas dos
doentes são pipetados nos poços, os autoanticorpos que reconhecem o PR3 e ligam-se, durante a primeira
incubação. Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o
conjugado de cabra anti-IgG humana, marcado com um peroxidase purificado. O conjugado liga-se ao anticorpo
humano capturado e o excesso de conjugado é removido através de lavagens. Após a adição do substrato 3,3’,5,5’
Tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidade é proporcional à concentração de
anticorpo na amostra. É adicionado ácido sulfúrico a cada poço produzindo uma cor amarela que indica o término
da reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
10 Placas de ELISA de micropoços de poliestireno PR3 antígeno (12-1 x 8 poços), com suporte em
embalagem de protecção com dessecantes
Controlo Negativo ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos
humanos a PR3, pré-diluído, 1,2 ml
Calibrador A PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3 , pré-diluído, 1,2 ml
Calibrador B PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3 , pré-diluído, 1,2 ml
Calibrador C PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3 , pré-diluído, 1,2 ml
Calibrador D PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3 , pré-diluído, 1,2 ml
Calibrador E PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3, pré-diluído, 1,2 ml
Controlo Positivo PR3 SC ELISA, 5 frascos de solução tampão com conservantes e soro humano com
anticorpos PR3 , pré-diluído, 1,2 ml
Diluente da amostra Type III, 19 frascos cor-de-amarelo, contém, Tween 20, estabilizadores proteicos e
conservante, 50 ml
Solução de lavagem HRP, 10 frascos 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e
Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método.
Conjugado HRP PR3 SC IgG, 10 frascos – de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e
conservante, 10 ml
Cromogénio TMB, 10 frascos com estabilizadores, 10 ml
Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 10 frascos – incolor, 10 ml
1
Advertências
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) nos controlos e no conjugado,
considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. O l diluente com Proclin 150. Evitar inalar, ingerir
ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões.
Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e
deu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HBsAg, HIV e
HCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outros
agentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores PR3 SC manipulados como material
potencialmente infectante.12
A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido
ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou
cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de
reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas
substâncias.
O Conjugado HRP PR3 SC IgG contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico
quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a
ocorrência de queimaduras químicas.
O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou
absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões.
A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases,
metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e
pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de
queimaduras químicas.
Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes.
Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações
ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos.
Precauções
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Utilizar somente para diagnóstico In Vitro.
Deve seguir-se as instruções com rigor.
Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notas
específicas e avisos ao longo das instruções de uso.
Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-á
verificar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmo
invólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos.
Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nunca
repor nos frascos originais reagentes não utilizados
Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar a
resultados inconsistentes.
O substrato TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água.
Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenham
partículas em suspensão.
A diluição não pode ser verificada visto que os controlos estão prontos a usar. Recomenda-se a utilização
de pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ).
A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticos
pode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É da
responsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurar
que os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado de
CQ associado.
Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante.
Precauções particulares de conservação
1.
2.
3.
O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e não deve ser congelado. O armazenamento a temperaturas
inapropriadas irá afectar os resultados.
A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C.
A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior.
Colheita da amostra
1.
2.
3.
4.
As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulo
naturalmente e a separação do soro.
O soro pode ser conservado a 2-8°C até 7 dias antes do teste11, ou em aliquotas a -20°C ou menos, para
períodos mais prolongados.
Devem evitar-se o descongelamento e congelamento sucessivo.
As amostras de soro não podem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsos
positivos.
Procedimento
Material fornecido
•
•
•
•
Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste.
Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote.
PR3 SC Coated Wells (Microplaca revestida com PR3): 10 placas contenção 12 tiras fraccionáveis
constituidas por 8 poços cada revestidos com antigénio PR3 (de cor vermelho). Cada microplaca é
embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes de exsicante.
Type III Sample Diluent (Diluente da amostra Tipo III): 19 frascos contendo 50mL de tampão para a
diluição da amostra. Com coloração amarela e formato pronto a usar.
2
•
•
•
•
•
•
•
HRP Wash Concentrate (Tampão de lavagem, concentrado 40 vezes): 10 frascos contendo 25mL de
tampão de lavagem dos poços da microplaca concentrado 20 vezes.
PR3 SC Calibrators (Calibradores PR3): 25 facscos (5 frascos cada um) com 1,2mL de soro humano com
autoanticorpos anti-PR3 com as seguintes concentrações: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Pronto a usar.
PR3 SC Positive Control (Controlo positivo PR3 SC): 5 frascos contendo 1,2mL de soro humano. Pronto
a usar.
ELISA Negative Control (Controlo negativo ELISA): 5 frascos contendo 1,2mL de soro humano. Pronto a
usar.
HRP PR3 SC IgG Conjugate (Conjugado HRP PR3 SC IgG): 10 frascos contendo 10mL de anticorpo para
IgG humana marcado com um peroxidase. Coloração azul. Pronto a usar.
TMB Chromogen (Cromogénio TMB): 10 frascos contendo 10mL de substrato TMB. Pronto a usar.
HRP Stop Solution (Solução de paragem): 10 frascos contendo 10mL de ácido sulfúrico 0,344 M. Pronto
a usar.
Material adicional necessário mas não fornecido
•
•
•
•
•
•
Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuada
manualmente.
Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar.
Água destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade.
Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 1000, 100 e 10μL.
Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem de volumes de 100μL do conjugado, cromogénio e s
olução de paragem.
Pontas de plástico/vidro: Para a diluição das amostras.
Método
Antes de iniciar
1.
2.
3.
4.
5.
Conduzir o kit à temperatura ambiente
• O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24°C).
• Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. As
microplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente.
Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana.
Componentes do kit
Agitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar.
Diluição do tampão de lavagem
Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a
975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem
ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou
desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma
semana a 2-8º C.
Diluição da amostra
Diluir 10μL de cada amostra com 1000μL de diluente da amostra (1:100) e misturar bem. Nota: Após sua a
diluição a amostra deve ser utilizada nas 8 horas seguintes.
Manuseamento das tiras e da moldura das tiras
Colocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades,
posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor,
de imediato, as tiras não utilizadas no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamente de
modo a minimizar a exposição ao ar.Cuidado para não perfurar ou rasgar o invólucro. AVISO: A
exposição das tiras à humidade ou contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultar na
deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultados falsos.
Técnica
Manter durante o teste a mesma sequência de pipetagem.
1.
Amostra
Pipetar 100μL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:100) nos poços da microplaca.Nota: As
amostras devem ser pipetadas de imediato para a placa com o objectivo de minimizar as alterações aos
resultados do teste, o tempo começa a contar após a pipetagem da ultima amostra.Incubar à
temperatura ambiente durante 30 minutos.
2.
Lavagem
Os passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poços
quando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevado
background. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com 200-300μL tampão de lavagem, por poço.
A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo com
as indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente,
batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente.
Lavagem manual das microplacas:
a.
Deitar fora o conteúdo dos poços.
b.
Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente.
c.
Encher cada poço com 200-300μL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal.
d.
Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana.
e.
Repetir os passos de a-d duas vezes.
f.
Repetir a e b.
3
3.
4.
5.
6.
7.
Adição do conjugado
Pipetar 100μL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a
remover qualquer salpico.Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de
conjugado no frasco correspondente.Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lavagem
Repetir o descrito no passo 2.
Adição do Cromogénio (TMB)
Pipetar 100μL de cromogénio (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de
modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de
Cromogénio (TMB) no frasco correspondente.Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30
minutos.
Paragem da reacção
Pipetar 100μL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo.
Leitura da densidade óptica
Ler a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após a
adição da solução de paragem.
Controlo de qualidade
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Controlo de qualidade
Para o teste ser considerado válido devem ser respeitados os seguintes critérios:
• Os calibradores e os controlos positivo e negativo devem ser incluídos em cada série de testes.
• Os resultados dos controlos negativo e positivo devem encontrar-se dentro do intervalo especificado no
Certificado CQ.
A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ.
Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados o teste é considerado inválido e deve ser
repetido.
Cálculo da media das densidades ópticas (somente para os testes realizados em duplicado)
Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. A
percentagem do coeficiente de variação (%CV) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%.
Curva de calibração
A curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando o valor das
concentrações dos autoanticorpos anti-PR3 na escala logarítmica e as DO correspondentes a cada
calibrador, na escala linear.
• Automaticamente – utilizar um software adequado.
• Manual – utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos, (não traçar uma
linha recta nem "ponto a ponto").
Tratamento de pontos anómalos
Caso algum ponto se encontre fora da curva de calibração, este pode ser removido. Caso a ausência
deste ponto determine uma forma que não seja semelhante à da curva padrão de calibração, ou caso
surjam outros pontos irregulares, o teste deve ser repetido.
Cálculo dos valores dos controlos
Deterninar o nível dos autoanticorpos anti-PR3 dos controlos directamente a partir da curva de calibração.
Os valores devem encontrar-se no intervalo fornecido pelo certificado CQ.
Cálculo dos níveis de anticorpos nas amostras diluídas
Determinar o nível dos autoanticorpos anti-PR3 das amostras directamente a partir da curva de calibração.
Nota: Os valores dos calibradores foram ajustados por um factor de 100 correspondente ao factor de
diluição da amostra (1:100). Não é necessário fazer qualquer outra correcção.
Calibração do ensaio
O teste é calibrado em U/mL por um calibrador de referência arbitrário, uma vez que não se encontra
disponível uma preparação internacional de referência reconhecida.
Limitações do método
1.
2.
Este kit é utilizado somente para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outros
dados clínicos e outros testes serológicos.
Os resultados obtidos com este ensaio não servem para confirmar o diagnóstico da presença ou ausência da
doença.
Valores esperados
O intervalo de referência foi determinado, utilizando soros de 187 dadores de saudáveis. O limite superior deste
intervalo é expresso como a média das concentrações + 7 DP e equivale a 3,5 U/mL, com uma média de 0,38
U/mL e um SD de 0,43 U/mL.
Os testes de ELISA são muito sensíveis e capazes de detectar pequenas diferenças nas amostras. Recomenda-se
que cada laboratório determine os seus intervalos de referência.
Valores esperados
≤ 3,5 U/mL
Resultados negativos
> 3,5 U/mL
Resultados positivos
4
Características de desempenho
Precisão
A precisão inter- e intra-ensaio foi determinada para três amostras cujos valores se encontram no intervalo da
curva de calibração. Os valores obtidos para a média e a %CV para cada amostra são apresentados na tabela
seguinte.
PRECISÃO INTRA-ENSAIO
n=16
Concentração (U/mL)
% CV
Amostra 1
5,1
3,0
Amostra 2
16,6
5,0
Amostra 3
24,3
2,5
PRECISÃO INTER-ENSAIO
n=3
Concentração (U/mL)
Amostra 1
5,1
% CV
5,8
Amostra 2
15,0
4,5
Amostra 3
25,2
8,3
Intervalo de valores normais
Foram determinados os níveis de anticorpos anti-PR3 em 187 amostras de soro fornecidas por doadores
saudáveis. Com base num cut-off positivo de >3,5 U/mL apenas uma amostra deu resultado positivo, o equivalente
a 0,5% da população. Este valor de cut-off fornecido é somente ilustrativo. Recomenda-se que cada laboratório
determine os seus valorers de referência.
Especificidade, Sensibilidade e Concordãncia Relativas
A especificidade, sensibilidade e concordância relativas foram determinadas com base num kit alternativo de EIA
de anti-PR3, utilizando 66 amostras.
EIA alternativo
+
BINDAZYME
Anti-PR3 EIA
-
+
25
0
-
2
39
Sensibilidade relativa
92,6%
Especificidade relativa
100%
Concordância relativa
97,0%
Substância Interferentes
Foram testados vários tipos de soro de modo a verificar o possível efeito de substâncias interferentes. O número
de resultados positivos/número de testes realizados são apresentados na tabela seguinte:
Soro
Lipemico
Hemolisado
Bilirubina - Elevada
Hiperproteina (Mieloma)
Positivo/Nº de testes
0/8
0/10
0/10
0/10
Sensibilidade Analítico
A sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 DP de 16 determinações do diluente da
amostra. O valor obtido é igual a 0,1 U/mL.
Intervalo de Leitura
O intervalo de leitura é de 1,23 – 100 U/mL.
5
Esquema da Microplaca
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Sumário do Procedimento
1.
2.
3.
4.
Pipetar 100μL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:100) nos poços.
Incubar durante 30 minutos.
Lavar.
Adicionar 100μL de conjugado em cada poço.
Incubar durante 30 minutos.
Lavar.
Adicionar 100μL de substrato em cada poço.
Incubar durante 30 minutos.
Adicionar 100μL de solução de paragem em cada poço.
Ler as absorvâncias a 450nm.
QUANTA Lite é uma marca registada da
INOVA Diagnostics, Inc.
6
Referências
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
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Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD
Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of
Health, 2007, Fifth Edition.
Fabricado por:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) :
877-829-4745
Technical Service (Outside the U.S.) :
00+ 1 858-805-7950
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October 2010
Revision 0
7