Linfoma em bovinos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
LABORATÓRIO DE PATOLOGIA VETERINÁRIA
PROJETO DE PESQUISA
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Mestrado
Área de concentração: Patologia e Patologia Clínica
Aspectos epidemiológicos, clínicos, anatomopatológicos e imunohistoquímicos do linfoma em bovinos (1965-2014)
Aluno: Welden Panziera
Orientador: Rafael Almeida Fighera
Santa Maria – RS
Maio – 2013
RESUMO
O objetivo deste estudo é analisar os casos de linfoma em bovinos que foram
diagnosticados no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM) entre 1965 a 2014. Serão analisados os aspectos
epidemiológicos, clínicos, anatomopatológicos e imuno-histoquímicos, dos casos de
linfoma em bovinos, com o objetivo de melhor direcionar clínicos e patologistas para o
diagnóstico. Os aspectos histológicos e imuno-histoquímicos permitirão classificar os
linfomas de bovinos com base no sistema REAL (Revised European-American
Classification of Lymphoid Neoplasms). Para isso, os arquivos de necropsia e biópsia
serão revisados em busca dos referidos casos e se procederá uma reavaliação
histológica e uma categorização imuno-histoquímica quanto à origem dos linfócitos
neoplásicos
(B
ou
T).
Com
base
nos
dados
epidemiológicos,
clínicos
e
anatomopatológicos obtidos a partir dos casos de linfoma em bovinos, esperamos
fornecer subsídios, principalmente aos clínicos de grandes animais, para que possam, a
campo, realizar com propriedade o diagnóstico presuntivo, tanto in vivo com postmortem, dessa, que é a terceira forma mais comum de tumores em bovinos de nossa
região. Além disso, esperamos auxiliar os patologistas veterinários na utilização da
classificação atual dos linfomas, já há anos utilizada para tumores linfoides de
humanos.
Palavras-chave: linfossarcoma; tumores linfoides; leucose; sistema REAL
1) IDENTIFICAÇÃO
1.1 IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA
1.1.1. Título do projeto
Aspectos epidemiológicos, clínicos, anatomopatológicos e imuno-histoquímicos do
linfoma em bovinos (1965-2014).
1.1.2. Período
Março de 2013 a dezembro de 2014.
1.1.3. Instituição envolvida
Laboratório de Patologia Veterinária (LPV), Centro de Ciências da Saúde (CCS),
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).
1.1.4. Equipe de trabalho
a. Coordenador: Rafael Almeida Fighera, Médico Veterinário, Doutor (SIAPE
2583800). Professor Adjunto 3 do Departamento de Patologia Veterinária da UFSM –
CCS, LPV, ramal: 8168, e-mail: [email protected]
b. Executor: Welden Panziera, Médico Veterinário, aluno de mestrado do Programa de
Pós-graduação em Medicina Veterinária da UFSM, área de concentração Patologia e
Patologia
Clínica
(matrícula
201360421),
LPV,
ramal:
8168,
e-mail:
[email protected]
c. Colaboradores:
Glaucia Denise Kommers. Médica Veterinária, PhD (SIAPE 0382851). Professora
Associado 1 do Departamento de Patologia Veterinária da UFSM – CCS, LPV, ramal:
8168, e-mail: [email protected]
Claudio Severo Lombardo de Barros, Médico Veterinário, PhD (SIAPE 0378502).
Professor Titular do Departamento de Patologia Veterinária da UFSM – CCS, LPV,
ramal: 8168, e-mail: [email protected]
1.2 REVISÃO DE LITERATURA
As expressões “neoplasias linfoides”, “distúrbios linfoproliferativos” e “leucose
linfoide” denotam um grande grupo de entidades neoplásicas malignas que se
manifestam com diferentes aspectos clínicos e anatomopatológicos, mas que tem em
comum originar-se dos linfócitos. Linfoma (previamente linfossarcoma) é uma forma de
apresentação do distúrbio linfoproliferativo em que o tumor linfoide se origina mais
frequentemente em órgãos hematopoiéticos sólidos, como linfonodo, baço ou tecido
linfoide associado à mucosa (MALT), e, menos frequentemente, em órgãos não
linfoides, porém sempre fora da medula óssea (FIGHERA; GRAÇA, 2010). É um
neoplasma hematopoiético descrito em várias espécies de animais, e em bovinos,
dependendo do local do mundo, é considerado o neoplasma mais frequentemente
incriminado como causa de morte (JACOBS et al., 2002). Em um estudo retrospectivo
recente, realizado no Rio Grande do Sul, de 6.706 necropsias de bovinos, 586 casos
correspondiam a neoplasias. Desses 586 casos, 101 eram linfomas (17,2% de todos os
tumores) (LUCENA et al., 2011).
Diferentemente de outras espécies de mamíferos domésticos, bovinos possuem
uma classificação anatômica própria para os linfomas. Ao contrário da tradicional
subdivisão em multicêntrico, alimentar, mediastínico e extra-nodal, os linfomas bovinos
são divididos em dois grandes grupos: esporádicos e enzoóticos (FIGHERA; GRAÇA,
2010). Linfomas enzoóticos são causados pelo vírus da leucemia bovina (BLV, bovine
leukemia virus) (VALLI, 2007), um retrovírus da família Retroviridae, subfamília
Orthoretrovirinae (RAVAZZOLO; COSTA, 2012). Já linfomas esporádicos não têm
nenhuma relação com essa infecção viral. Linfomas enzoóticos ocorrem basicamente
em bovinos adultos, com idade entre 2 a 15 anos, mas mais frequentemente entre cinco
e sete anos, e em rebanhos em que técnicas de manejo propiciem a disseminação do
BLV. Por outro lado, linfomas esporádicos ocorrem em bovinos entre um mês e quatro
anos de idade, ou seja, em uma faixa etária inferior aos afetados pelos casos
enzoóticos. Linfomas enzoóticos são agrupados sob a denominação “leucose enzoótica
bovina” (LEB), uma expressão comumente utilizada em veterinária para se referir à
doença causada pela presença dos tumores, independentemente de suas localizações
ou do aspecto anatomopatológico (FIGHERA; GRAÇA, 2010).
1.2.1. Linfoma enzoótico
O linfoma enzoótico que afeta bovinos é causado pelo BLV, que é transmitido
principalmente de forma horizontal através de fômites sujos de sangue, principalmente
instrumentos cirúrgicos, luvas de palpação e agulhas hipodérmicas. Outras formas de
transmissão horizontal do BLV incluem hematofagia por insetos, transfusão sanguínea,
descorna, tatuagem e colocação de brincos (WERLING et al., 2004; BARROS et al.,
2006; BARROS, 2007). A prevalência do linfoma enzoótico é alta em áreas onde o BLV
ocorre de forma enzoótica e baixa nos rebanhos livres de infecção. Os bovinos afetados
são adultos, com idade entre 2 a 15 anos, mas mais frequentemente entre cinco e sete
anos. Essa forma apresenta maior prevalência nas raças leiteiras de alta produção
devido ao tipo de criação, que por ser intensiva permite uma maior proximidade entre os
animais e requer práticas de manejo constantes, o que influencia muito na
disseminação do BLV. Entretanto, quando bovinos de corte são criados em
confinamento, os índices de infecção podem assemelhar-se aos observados em vacas
leiteiras (FIGHERA; GRAÇA, 2010). No mesmo estudo retrospectivo descrito
anteriormente, que identificou 101 casos de linfoma em bovinos, 57% dos bovinos
afetados eram de raças leiteiras, e a maioria dos linfomas foi interpretada como
enzoótico (LUCENA et al., 2011).
No Brasil, vários estudos epidemiológicos sobre a prevalência da LEB foram
realizados, todos utilizando avaliação sorológica de rebanhos. Embora em algumas
regiões do país a prevalência da infecção pelo BLV seja muito alta, é importante
resaltar que apenas 1 a 5% dos bovinos sorologicamente positivos desenvolverão
linfoma (FIGHERA; GRAÇA, 2010). Vários sinais clínicos são associados com o linfoma
enzoótico, e dependem da localização das massas tumorais e das funções vitais
afetadas (BARROS, 2007). A apresentação mais comum é o aumento de volume dos
linfonodos (linfadenomegalia), principalmente dos pré-escapulares e pré-crurais, que às
vezes podem atingir tamanhos gigantescos (FIGHERA; GRAÇA, 2010). Os linfonodos
ilíacos geralmente são acometidos, e pode ser facilmente detectados por palpação retal
(BARROS et al., 2006; BARROS, 2007). Outros sinais clínicos importantes incluem:
perda de peso, queda da produção leiteira, anorexia, febre, dispneia, constipação
(devido ao aumento dos linfonodos do trato gastrointestinal), exoftalmia (devido ao
aumento dos linfonodos da região retrobulbar), incoordenação, paresia/paralisia
progressiva dos membros pélvicos (devido à compressão da medula espinhal por
massas neoplásicas epidurais), insuficiência cardíaca direita (devido à presença de
massas neoplásicas no átrio direito) e distocia (JACOBS et al., 2002; BARROS et al.,
2006; BARROS, 2007; VALLI, 2007; FRY; MCGAVIN, 2009; FIGHERA; GRAÇA, 2010)
Hematologicamente, cerca de dois terços dos bovinos adultos com linfoma
enzoótico apresentam hemogramas normais, e o restante desenvolvem anemia não
regenerativa leve e/ou leve a moderada mudança no número de leucócitos. Alguns
bovinos desenvolvem uma linfocitose reativa, que em alguns pode ser persistente
(linfocitose persistente) (JACOBS et al., 2002).
Na necropsia, os órgãos mais comumente acometidos são os linfonodos, o
abomaso, o coração e o útero. Outros órgãos/tecidos em que massas neoplásicas são
frequentes incluem: rins, intestinos e canal vertebral (BARROS et al., 2006). O achado
de necropsia mais frequente é um aumento generalizado dos linfonodos superficiais e
internos. Ao corte eles são macios, por vezes friáveis. A superfície de corte é
homogênea, branco-amarelada, não sendo possível realizar uma delimitação
corticomedular (padrão difuso) (JACOBS et al., 2002; BARROS et al., 2006; BARROS,
2007; VALLI, 2007; FRY; MCGAVIN, 2009; FIGHERA; GRAÇA, 2010). Nos linfonodos
maiores são comuns áreas necróticas amareladas ou avermelhadas, multifocais ou
focalmente extensas. Raramente, um padrão caracterizado por múltiplos nódulos
brancos e multifocais (padrão folicular) pode ocorrer (FIGHERA; GRAÇA, 2010). No
coração, as massas ocorrem sempre no átrio direito, mas podem infiltrar outras áreas,
de acordo com a evolução de cada caso. Quando o coração é afetado, lesões de
insuficiência cardíaca congestiva direita, como ascite, fígado de noz-moscada, edema
subcutâneo e edema cavitários, são comuns (BARROS et al., 2006; BARROS, 2007).
No abomaso, observam-se grandes massas, nódulos ou placas, recobertas por mucosa
íntegra ou ulceradas. Na medula espinhal, os tumores correm principalmente na região
lombar e estão dispostos extraduralmente ao longo do canal vertebral, o que leva a
compressão da medula espinhal e, consequentemente, sinais neurológicos (BARROS,
2007; FIGHERA; GRAÇA, 2010).
Na histologia, o linfoma enzoótico pode apresentar múltiplos padrões, mas o
mais comum é o padrão difuso, no qual se observa uma obliteração de toda a
arquitetura nodal. As células neoplásicas são grandes linfócitos que possuem
citoplasma abundante e núcleo redondo a oval, formado por cromatina frouxa a
vacuolizada. O número de nucléolos varia de um a três, e há muita mitose e apoptose.
Ocasionalmente células com núcleos multilobulados podem ser observadas (FIGHERA;
GRAÇA, 2010).
1.2.2. Linfoma esporádico
Sob a expressão “linfoma esporádico” encontram-se todos os casos de linfoma
de bovinos que não são associados à infecção pelo BLV. Esses linfomas são raros e
dificilmente ocorre mais de um caso em um mesmo rebanho (BARROS et al., 2006;
FIGHERA; GRAÇA, 2010; LUCENA et al., 2011). Linfomas esporádicos ocorrem
basicamente de três formas: multicêntrica, tímica e cutânea (FIGHERA; GRAÇA, 2010).
Linfoma multicêntrico, também chamado de linfoma de bezerro ou linfoma
juvenil, ocorre em bezerros de um a seis meses de idade (FIGHERA; GRAÇA, 2010).
Os principais sinais clínicos observados são depressão, perda de peso e fraqueza.
Hematologicamente observa-se anemia e linfocitose (BARROS et al., 2006; BARROS,
2007). A doença progride para a morte em 2-8 semanas. Na necropsia, há
linfadenomegalia simétrica dos linfonodos superficiais e profundos e infiltração de
células neoplásicas no fígado, no baço e na medula óssea, e, menos comumente,
outros órgãos também podem estar afetados (FIGHERA; GRAÇA, 2010; VALLI, 2007).
Linfoma tímico, também chamado de linfoma adolescente, acomete bovinos com
seis a dois anos e meio de idade (FIGHERA; GRAÇA, 2010). Bovinos da raça Hereford
parecem apresentar uma maior predisposição em desenvolver essa forma de linfoma
(BARROS et al., 2006). Clinicamente, linfoma tímico é caracterizado pela presença de
massas grandes e únicas no pescoço (região ventral) e no mediastino anterior,
podendo ocorrer compressão do esôfago e traqueia. Os bovinos acometidos podem
apresentar disfagia, timpanismo, tosse e dispneia. A evolução é de 2-9 semanas
(BARROS et al., 2006; BARROS, 2007). Ocasionalmente, linfonodos e músculos da
região da cabeça, e ossos (mandíbula e maxilar) podem ser acometidos devido à
infiltração neoplásica (JACOBS et al., 2002; FIGHERA; GRAÇA, 2010). Linfadenopatia
não é comum (BARROS, 2007).
Linfoma cutâneo afeta bovinos com um a quatro anos de idade (FIGHERA;
GRAÇA, 2010). As lesões iniciais aparecem como urticas, e em seguida evoluem para
lesões elevadas, circulares e sem pelos. Algumas lesões podem ser ulceradas com
necrose na região central (JACOBS et al., 2002). Geralmente a pele do pescoço, região
das escápulas, região do períneo e membros posteriores são as mais acometidas
(JACOBS et al., 2002; BARROS et al., 2006; BARROS, 2007). Na histologia, a invasão
da pele pelos linfócitos tumorais lembra a micose fungoide de humanos (BARROS et
al., 2006). Eventualmente, os bovinos desenvolvem a forma multicêntrica de linfoma
(JACOBS et al., 2002), e vários outros órgãos podem estar afetados, como coração,
medula espinhal, pulmão e abomaso (BARROS, 2007). As lesões aparecem e depois
regridem por meses, e por algum tempo a pele pode ficar livre de lesões (JACOBS et
al., 2002).
A imuno-histoquímica é comumente utilizada em linfomas bovinos para confirmar
a origem das células neoplásicas (JACOBS et al., 2002).
Os linfomas enzoóticos
(forma que está associada à infecção pelo BLV) originam-se, predominantemente, de
linfócitos B maduros, já os linfomas esporádicos (forma que não está associada à
infecção com o BLV) originam-se tanto de linfócitos B como de linfócitos T (ISHIGURO
et al., 1994; TANI et al., 1997; VERNAU et al., 1997; STEP et al., 2001; JACOBS et al.,
2002; HARBO et al., 2004). O uso de anticorpos para a imuno-marcação de linfócitos B
e T já foi padronizado há vários anos e diversos são aqueles que têm sido utilizados
para a imunomarcação de linfócitos tumorais em bovinos (ISHINO et al., 1990;
VERNAU et al., 1992; ASAHINA et al., 1995; TANI et al., 1997; SATO et al., 2002;
OTROCKA-DOMAGALA et al., 2012). Preconiza-se para linfócitos B a utilização do
anticorpo primário monoclonal anti-humano CD79αcy, produzidos em camundongos, e
para linfócitos T, a utilização do anticorpo policlonal anti-humano CD3, produzidos em
coelhos (HARBO et al., 2004; BUCZINSKI et al., 2006; ANJIKI et al., 2009; OTROCKADOMAGALA et al., 2012).
1.3 QUALIFICAÇÃO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO
Linfoma é o terceiro tumor mais diagnosticado em bovinos da nossa região, atrás
apenas de tumores do trato alimentar, basicamente carcinoma de células escamosas
(CCEs) induzidos pela ingestão continuada de Pteridium aquilinum (samambaia), e
tumores cutâneos, principalmente CCEs (LUCENA et al., 2011). No entanto, apesar da
alta prevalência, não há quase estudos sobre linfoma bovino no Brasil. A prevalência
desse tumor em nosso laboratório sugere que ele ocorra com elevada frequência nas
propriedades rurais de nossa região. Assim, com base na falta desses dados, julgamos
importante um estudo completo, que nos forneça dados relacionados à epidemiologia
(sexo, raça, idade e tipo de manejo), à clínica (sinais clínicos e métodos de diagnóstico
in vivo) e à anatomopatologia (achados macroscópicos, aspectos histológicos e
comportamento imuno-histoquímico).
Diferentemente do que ocorre com bovinos intoxicados por P. aquilinum e que
desenvolvem CCEs (SOUTO et al., 2006; ANJOS et al., 2008; MASUDA et al., 2011)
por exemplo, nenhum estudo foi conduzido em nossa rotina acerca de linfoma, o que,
consequentemente, não permite saber se os nossos casos demonstram ou não os
mesmos aspectos clínicos, epidemiológicos e anatomopatológicos daqueles descritos
na literatura internacional, que é embasada em trabalhos científicos produzidos nos
Estados Unidos, Canadá, África do Sul e parte da Europa. Além disso, observamos que
cada vez que abordamos um determinado assunto, isso não apenas gera informação
científica relevante, mas, principalmente, leva os clínicos de grandes animais da região
a se interessarem mais pelo tema em questão, o que acaba por melhorar os
diagnósticos por eles realizados. Isso pode ser notado pelo aumento no número de
diagnósticos de uma determinada doença em nossa rotina após realização de um
estudo prévio. Isso ocorre porque esses estudos são frequentemente publicados em
periódicos aos quais os clínicos de campo têm fácil acesso e isso, finalmente, faz com
que eles reciclem-se ou aprendam a diagnosticar doenças que não estão acostumados.
Com base no fato de que em nossa rotina atualmente é comum clínicos de campo não
conseguirem reconhecer casos típicos de linfoma em bovinos, consideramos justificável
um estudo acerca do tema, visando encontrar possíveis diferenças que podem ser a
causa dessa baixa prevalência de diagnósticos clínicos quando comparada a alta
prevalência de diagnóstico na necropsia.
1.4 ALTERNATIVAS
Estabelecer os aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do
linfoma em bovinos é possível desde que os casos sejam previamente confirmados
através de exame morfológico dos tecidos afetados, ou seja, realmente sejam casos de
linfoma. Dessa forma, os estudos acerca do tema são feitos basicamente com a rotina
de laboratórios de patologia. Uma alternativa a essa prática seria a realização desse
mesmo estudo através de inquéritos epidemiológicos e avaliações físicas em bovinos a
partir de exames sorológicos para o vírus da leucemia bovina (VLB), a causa básica
desses tumores em bovinos adultos, realizados, por exemplo, por laboratórios de
virologia. Entretanto, sabe-se que no máximo 5% dos bovinos infectados pelo VLB
desenvolverão linfoma, o que inviabiliza utilizar os dados obtidos estudando uma
população de bovinos infectados para categorizar os achados epidemiológicos e
clínicos em bovinos como linfoma, uma minoria que está realmente doente no rebanho.
Além disso, ao ser conduzido em um laboratório de patologia, é possível se estudar
casos antigos de linfoma, pois os tecidos contidos em blocos de parafina se prestam
perfeitamente para reavaliações e reclassificações histológicas e, principalmente, para
avaliação imuno-histoquímica. Isso é bem menos oneroso e arriscado, já que por ser
um estudo parcialmente retrospectivo, o material a ser estudado está disponível e
independe da necessidade em buscar novos casos.
2) OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar os casos de linfoma em bovinos diagnosticados no LPV-UFSM entre os
anos de 1965 e 2014.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer os aspectos epidemiológicos em bovinos com linfoma;
Determinar a prevalência dos sinais clínicos em bovinos com linfoma;
Determinar os achados anatomopatológicos (macroscópicos) em bovinos com
linfoma;
Classificar histologicamente os linfomas bovinos através do sistema REAL
(Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms), utilizando para
isso a imuno-histoquímica.
3) RESTRIÇÕES
Para
execução
desse
estudo,
as seguintes restrições podem ser
previamente identificadas:
- Disponibilidade de recursos financeiros para aquisição de materiais de consumo;
- Ausência de blocos de parafina no arquivo do LPV-UFSM referentes aos casos de
linfoma em bovinos, devido a ser um estudo retrospectivo de 50 anos;
- Viabilidade dos blocos de parafina encontrados;
- Viabilidade dos tecidos imersos nesses blocos de parafina, principalmente no que se
refere à possibilidade ou não de recuperação antigênica, pois no passado, aspectos
como tempo de fixação dos tecidos não eram tão importante quanto após o advento da
imuno-histoquímica;
4) HIPÓTESE CIENTÍFICA
Em relação aos aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos a
principal hipótese é que esses tumores ocorram de forma semelhante ao descrito na
literatura internacional. Entretanto, com base no fato de que estudos recentes têm
demonstrado diferenças clínicas e anatomopatológicas, principalmente em relação à
imuno-histoquímica, acreditamos ser válida a investigação. Além disso, com base na
dissociação entre diagnósticos clínicos e de necropsia, é possível que haja diferenças
clínicas entre os casos clássicos descritos na literatura e aqueles vistos na rotina da
clínica de bovinos no RS.
5) MATERIAL E MÉTODOS
Inicialmente serão procurados e identificados os casos de linfoma em bovinos no
Sistema de Arquivo de Laudos do LPV-UFSM. Esse levantamento de dados
retrospectivo será realizado da seguinte maneira: 1) localizando-se os casos de linfoma
diagnosticados entre 1965 e 2012 através do banco de dados de cada ano, 2)
localizando-se os laudos dos respectivos casos e (3) revisando individualmente cada
laudo. Os dados coletados nessa revisão incluirão aspectos relacionados à
epidemiologia, à clínica e à anatomopatologia. Os aspectos epidemiológicos incluirão
sexo, raça, idade e também as técnicas de manejo rotineiras que cada bovino afetado
havia sido submetido. Os aspectos clínicos serão baseados no histórico relatado pelos
clínicos e que consta nos laudos de necropsia. Os aspectos anatomopatológicos
incluirão apenas os achados macroscópicos, pois serão incluídos nos estudos apenas
casos em que há blocos de parafina viáveis a ponto de se poder reavaliar a histologia
de cada caso. Na avaliação dos dados de macroscopia será levado em conta não
apenas a descrição feita pelo patologista na época e registrada no laudo, mas também,
sempre que possível, uma reavaliação do padrão macroscópico com base em nosso
arquivo fotográfico. Esses mesmos aspectos serão avaliados prospectivamente durante
os anos de 2013 e 2014.
De todos os casos de linfomas bovinos encontrados, serão procurados os blocos
de parafina presentes no Arquivo de Blocos de Parafina do LPV-UFSM. A partir dos
casos encontrados serão confeccionados cortes histológicos, a fim de validar o
diagnóstico de linfoma através de critérios histológicos estabelecidos pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) (JARRET; MACKEY, 1974) e pela Armed Forces Institute of
Pathology (AFIP), ambos para tumores do tecido linfoide e hematopoiético (VALLI et al.,
2002). Casos em que os blocos de parafina não forem encontrados serão excluídos.
A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) empregada será a imunomarcação para
linfócitos B (CD79 αcy) e T (CD3) em tecidos embebidos em parafina, conforme
protocolo descrito a seguir e baseado em Gocke (2006).
Será realizada a desparafinização e reidratação dos tecidos, e para a recuperação
antigênica a utilização de solução tampão de Tris–EDTA pH 9,5 no microondas por 10
minutos. O bloqueio das peroxidases e avidinas endógenas será realizado com H 202
comercial a 3% por dois tempos de dez minutos e leite em pó comercial diluído em
tampão
fosfato
salino
com detergente
Tween
20
(PBST)
por
15
minutos
respectivamente. Como anticorpo primário será utilizado anticorpo policlonal antihumano CD3 e anticorpo monoclonal anti-humano CD79αcy produzidos em coelhos e
camundongos respectivamente. Para o CD3 será utilizada a diluição de 1:800 e para o
CD79αcy a diluição de 1:200, ambos diluídos em PBST, e incubados por 1 hora a 37°C.
O anticorpo secundário (polímero) 1 será utilizado consecutivamente, incubado a 25ºC
por 30 minutos e marcado através da adição do cromógeno de tetracloreto de 3-3’
diaminobenzidina (DAB)2 por cinco minutos. As lavagens entre as etapas da técnica
serão feitas com PBST em pH 7,6. A contra-coloração será realizada com hematoxilina
de Harris3. Como controles positivos serão utilizados órgãos linfoides de bovinos. Como
controle negativo, as mesmas secções serão utilizadas, com substituição do anticorpo
primário por PBST.
Por fim, serão considerados como linfoma de células B, todos os linfomas que
tiveram suas células neoplásicas imunomarcadas para CD79αcy, mas não para CD3, e
1
Easy Path EP-12-20502®, Erviegas, Rua Lacedemonia, 268, Jardim Brasil, São Paulo, SP, Brasil.
Dako Cytomation K3468®, Dako Cytomation, 6392 Via Real, Carpinteria, CA, USA.
3
®
Easy Path EP-101071 , Erviegas, Rua Lacedemonia, 268, Jardim Brasil, São Paulo, SP, Brasil.
2
como linfomas de células T, todos os linfomas que tiverem suas células neoplásicas
imunomarcadas para CD3, mas não para CD79αcy.
6) RESULTADOS E IMPACTO ESPERADOS
Com base nos dados epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos obtidos a
partir dos casos de linfoma em bovinos da nossa região, esperamos fornecer subsídios
principalmente aos clínicos de grandes animais, para que possam, a campo, realizar
com propriedade o diagnóstico presuntivo, tanto in vivo como post-mortem, dessa
comum forma de neoplasia de bovinos. Além disso, esperamos que os patologistas
veterinários que trabalham com diagnóstico de doenças de bovinos possam, através
dos nossos resultados histológicos, melhor compreender a heterogeneidade da
apresentação microscópica do linfoma. Com isso, eles poderão diagnosticar com mais
propriedade científica esse neoplasma, bem como para diferenciar alguns padrões
menos agressivos (de baixo grau, por exemplo) para com desordens linfoides benignas
(como por exemplo, hiperplasias linfoides atípicas).
7) METAS
Gerar conhecimento acerca do tema (linfoma em bovinos) a ponto de auxiliar
clínicos de grandes animais e patologistas veterinários no diagnóstico dessa doença.
8) CRONOGRAMA

Atividades para 2013
Atividade Mês
1
1
2
3
4
5
x
x
6
7
8
9
10
11
12
2
x
3
x
4
x
5
x
x
x
x
6
x
x
x
x
7
x
x
x
x
8
9
10
11
12
x
x
x
x
x

Atividades para 2014
Atividade Mês
1
2
3
4
8
x
x
x
x
9
x
x
x
x
10
5
6
7
x
x
x
11
1. Confecção do projeto.
2. Procura dos casos de linfoma bovino no Sistema de Arquivo de Laudos do LPVUFSM.
3. Procura dos laudos dos respectivos casos.
4. Revisão dos laudos e coleta de dados.
5. Procura dos blocos de parafina.
6. Realização de cortes histológicos.
7. Validação dos diagnósticos de linfoma através da análise de cortes histológicos.
8. Realização da imuno-histoquímica
9. Avaliação das imunomarcações.
10. Classificação dos linfomas pela associação dos aspectos histológicos e imunohistoquímicos.
11. Confecção do artigo científico.
9) ORÇAMENTO
Quanti
Unidade
Discriminação
Valor
dade
Total (R$)
unitário
(R$)
01
Frasco 100g
Eosina Y
45,00
45,00
01
Frasco 50 g
Hematoxilina
270,00
270,00
10
Frasco 1L
Xilol
30,00
300,00
01
Frasco 1L
Formol
37,00
37,00
10
Pacote 1 Kg
Parafina
10,00
100,00
01
1 ml
Anticorpo anti-linfócito B (CD79αcy)
2.400,00
2.400,00
01
1 ml
Anticorpo anti-linfócito T (CD3)
1.600,00
1.600,00
01
1 kit (100 ml)
Kit LSAB +Sys, HRP, Lg Vol (Ac 3.000,00
3.000,00
secundário
biotinilado
–
estreptavidina-peroxidade)
01
1 kit (100 ml)
Kit LSAB +Sys, AP, Lg Vol (Ac
secundário
biotinilado
–
3.000,00
3.000,00
3,90
39,00
estreptavidina-fosfatase alcalina)
10
Caixa 50 unid.
Lâmina para microscopia
03
Caixa 75 unid
Lâminas para microscopia c/ carga 140,00
420,00
elétrica
05
Caixa 100 unid
Lamínula 24x50
6,20
31,00
01
Frasco 100 ml
Entellan New
85,00
85,00
01
Caixa 100 unid.
Navalhas descartáveis
200,00
200,00
02
500 unid
Pipeta Pasteur (3ml)
45,00
90,00
02
Caixa 100 unid.
Luvas para procedimentos
9,50
19,00
01
Caixa
38,50
38,50
1000 Ponteiras para micropipetas 100- 38,50
38,50
unid.
01
Caixa
unid
1000 Ponteiras para micropipetas 20200ul
1000ul
Total
11.713,0
10) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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11) CONCLUSÃO
O referido estudo é proposto no sentido de contribuir, a partir da geração de
informações muito relevantes, para o diagnóstico do linfoma em bovinos. Acreditamos
que os resultados encontrados nortearão clínicos de grandes animais no momento do
diagnóstico desse tão comum neoplasma em nossa rotina. Também auxiliará
patologistas veterinários que trabalham principalmente, ou apenas, com diagnóstico de
doenças de grandes animais a reconhecer os diversos padrões morfológicos do linfoma
nessa espécie.