Serotonin ELISA - IBL international

Transcrição

Instruções de Utilização
Serotonin ELISA
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa,
em diagnóstico in-vitro, de Serotonina em soro humano, plasma,
plaquetas, urina. Além disso, o teste pode ser usado para pesquisa em
homegeneizados de tecido e sobrenadantes de culturas celulares.
RE59121
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
Serotonin ELISA (RE59121)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de Serotonina em soro
humano, plasma, plaquetas, urina. Além disso, o teste pode ser usado para pesquisa em homegeneizados
de tecido e sobrenadantes de culturas celulares.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A serotonina é um produto intermediário do metabolismo do triptofano e está localizada principalmente nas
células enterocromafins do intestino, neurónios serotonérgicos cerebrais e plaquetas sanguíneas. É bem
reconhecida como um neurotransmissor do sistema nervoso central.
Quase toda a serotonina na circulação sanguínea encontra-se concentrada nas plaquetas. Alterações nas
concentrações de serotonina em circulação estão implicadas em várias condições patológicas incluindo
cefaleia de tensão crónica, esquizofrenia, hipertensão, doença de Huntington, distrofia muscular de
Duchenne e apendicite aguda precoce. A determinação dos níveis de serotonina no soro é de elevada
importância clínica para a avaliação do diagnóstico de síndrome carcinóide. Um aumento do interesse na
determinação de serotonina em plaquetas, incluindo cinética de captação e libertação, é esperado num
futuro próximo.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
A preparação de amostras (derivatização de serotonina a N-acilserotonina) faz parte da diluição de
amostras e é conseguida por incubação da respectiva amostra com o Reagente de Acilação.
O procedimento obedece ao princípio básico de ELISA competitivo, segundo o qual existe competição entre
um antigénio biotinilado e outro não-biotinilado por um número fixo de locais de ligação de anticorpos. A
quantidade de antigénio biotinilado que liga ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração da
amostra. Quando o sistema está em equilíbrio, o antigénio biotinilado livre é removido por um passo de
lavagem e o antigénio biotinilado ligado ao anticorpo é determinado usando estreptavidina fosfatasa
alcalina como marcador e p-nitrofenil fosfato como substrato. A quantificação de amostras é conseguida
comparando a actividade enzimática das amostras com uma curva resposta preparada usando padrões
conhecidos.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de
produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou
da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos
nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente
fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
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6.
PORTUGUÊS
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Certas comidas contêm quantidades substanciais de serotonina. Além disso, algumas medicações
podem causar libertação de serotonina, levando a níveis alterados. Os pacientes devem-se abster
de tais comidas ricas em serotonina (ex: abacates, bananas, café, ameixas, ananás, tomates,
nozes) assim como de algumas medicações (ex: aspirina, corticotropina, inibidores MAO,
fenacetina, catecolaminas, reserpina, nicotina).
Soro
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade
química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize
amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser
centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento:
Estabilidade
18-25°C
2-8°C
 -20°C (Alíquotas)
2h
6h
3 meses
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para
envio, as amostras devem ser congeladas.
Urina
É possível usar tanto a primeira urina do dia como urina de 24 h. O volume total de urina excretada
durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco contendo como conservante
10-15 mL de HCl 6 N. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as
amostras antes de iniciar o ensaio.
Armazenamento:
Estabilidade
6 meses
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
Plasma, Plaquetas
Mais de 98% da serotonina em circulação está localizada nas plaquetas e é libertada durante a
coagulação sanguínea. O sangue deve ser recolhido, por punção venosa, para tubos de plástico contendo
EDTA ou Citrato como anticoagulante (ex: 10 mL Monovette NC com 1 mL de Solução Citrato da
SARSTEDT).
As amostras são mantidas e centrifugadas à temperatura ambiente, durante 10 min a 200 x g, para obter
plasma rico em plaquetas (PRP). O sobrenadante PRP é então transferido para outro tubo e as
plaquetas são contadas.
Para obter o pellet de plaquetas, uma alíquota de 200 µL de PRP (contendo entre 350 000 e
500 000 plaquetas/µL) é adicionada a 800 µL de solução salina fisiológica e centrifugada a 4500 x g
durante 10 min a 4°C (ou a 10 000 x g durante 2 min a 4°C). O sobrenadante é então rejeitado.
200 µL de água bidestilada são adicionados ao pellet, que após isso pode ser armazenado congelado a <
-20°C durante várias semanas sem haver qualquer alteração no conteúdo em serotonina.
Após descongelamento das amostras congeladas centrifugar a 10 000 x g durante 2 min à temperatura
ambiente. 20 µL do sobrenadante são usados no ELISA (ver Acilação).
Se se quiser medir serotonina em plasma sem plaquetas (PFP), centrifugar uma alíquota de PRP
a 4500 x g durante 10 min a 4°C (ou a 10 000 x g durante 2 min a 4°C) para obter plasma sem plaquetas
(PFP). 50 µL do sobrenadante são usados no ELISA para medição da serotonina livre (não ligado a
plaquetas) (ver Acilação).
NOTA: A determinação directa de serotonina em PRP mostrou que em cerca de 10 % das amostras PRP
foram medidas concentrações de serotonina imprevisivelmente elevadas (resultados obtidos por HPLC e
Fluorometria). Para evitar tais discrepâncias, recomenda-se a medição em separado da serotonina em
plaquetas e em plasma sem plaquetas.
Armazenamento:
Estabilidade:
Plasma sem
Plaquetas
 -20°C
Plaquetas
(após separação do plasma)
 -20°C
 -80°C
(Alíquotas)
(Alíquotas)
(Alíquotas)
2 semanas
4 semanas
12 meses
Para envio, as amostras devem ser congeladas.
Homogeneizados de tecido, Sobrenadantes de Culturas Celulares
Homogeneizados de tecido centrifugados e sobrenadantes de culturas celulares podem ser usados sem
precauções especiais. Cuidado: O meio da cultura celular pode conter serotonina!
Armazenamento:
Estabilidade:
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6 meses
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7.
PORTUGUÊS
MATERIAIS FORNECIDOS
Os reagentes fornecidos com este kit são suficientes para determinações simples na preparação
de amostras (acilação) e para duplicados no ensaio. Reagentes adicionais serão disponibilizados
se pedidos.
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 8 mL
ANTISERUM
1 x 8 mL
BIOTIN
1 x 0.3 mL
ENZCONJ CONC
1 x 7 x 1 mL
CAL A-G
Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antisoro anti-coelho (cabra).
Serotonina Antisoro
Cor azul. Pronto a usar. Contêm: Antisoro (coelho), tampão fosfato, < 0.1 % NaN3.
Serotonina Biotina
Colorido Amarelo. Pronto a usar. Contêm: < 0.1 % NaN3.
Conjugado Enzimático, Concentrado (100x)
Contêm: Estreptavidina fosfatasa alcalina, Tampão Tris, HCl, < 0.1 % NaN3.
Padrão A-G
0; 0.08; 0.24; 0.73; 2.2; 6.6; 19.8 ng/mL
0; 0.45; 1.4; 4.1; 12.5; 37.4; 112.3 nmol/L
Pronto a usar. Contêm: Serotonina (acilado), tampão fosfato, < 0.1 % NaN3.
Controlo 1+2, liofilizado
1 x 2 x 0.5 mL CONTROL 1+2 LYO Contêm: Soro humano, < 0.1 % NaN .
3
Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos.
8.
1 x 3 mL
ACYLREAG
1 x 50 mL
ASSAYBUF CONC
2 x 50 mL
WASHBUF CONC
2 x 13 mL
PNPP SUBS
1 x 15 mL
PNPP STOP
3x
FOIL
Reagente de Acilação
Ácido Acético Anidro, acetona. Pronto a usar.
Tampão de Reacção Concentrado (10x)
Contêm: tampão fosfato, BSA, < 1 % NaN3.
Tampão de Lavagem Concentrado (20x)
Contêm: tampão fosfato, Tween, < 0.1 % Thimerosal.
Solução de Substrato PNPP
Pronto a usar. Contêm: p-nitrofenil fosfato (PNPP).
Solução de Paragem PNPP
Pronto a usar. Contêm: 1 M NaOH
Película Aderente
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 20; 25; 50; 100; 1000 µL
2. Tubos de ensaio de vidro descartáveis (12 x 75 mm)
3. Suporte para tubos de ensaio
4. Agitador orbital (500 rpm)
5. Vortex
6. Banho de água, 37 °C
7. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
8. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
9. Centrífuga;  1500 x g
10. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm
(comprimento de onda de referência 600-650 nm)
11. Água bidestilada ou bi-destilada
12. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
9.
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
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3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Alguns componentes contêm volume de solução  250 µL. Assegurar que a solução está toda no fundo
do recipiente antes de abrir.
5. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de
pipetagem.
6. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
7. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
8. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
9. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10. A força centrífuga relativa (g) não é equivalente a rotações por minuto (rpm) e tem que ser calculada de
acordo com o raio do rotor.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
Para a versão manual e automatizada
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas.
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
Se o cliente quiser reduzir o número de padrões de 7 para 6, pode omitir o Padrão G. O
intervalo relevante será então reduzido para 155 µg/L (plasma) ou 706 µg/L (soro, urina,
homogenados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares).
O procedimento de teste pode ser realizado numa versão reduzida com 3.5h de incubação
para soro, urina, plaquetas, homogenados de tecido e sobrenadantes de culturas celulares
MAS NÃO PARA PLASMA, ou numa versão alternativa, com uma incubação de um dia para
o outro para as mesmas amostras E PLASMA. O plasma deverá ser incubado SEMPRE de
um dia para o outro.
10.1.
Preparação de componentes liofilizados ou concentrados
Diluir /
dissolver
Componente
15 mL
ASSAYBUF
CONC
15 mL
60 µL
Diluente
juntar
agua bidest.
150 mL
Relação
Observações
1:10
Pode aparecer uma coloração
castanho-amarelada, que não
influencia os resultados dos
testes.
WASHBUF
juntar
agua bidest. 1:20
300 mL
CONC
CONTROL 1+2
com
agua bidest.
0.50 mL
LYO
Tampão de
ENZCONJ
com
Reacção
1:101
6.0 mL
CONC
diluído
Deixar repousar 15 min.
Misturar sem fazer espuma.
Preparar mesmo antes de usar
e utilizar apenas uma vez.
ArmazenaEstabilidade
mento
2-8°C
2 semanas
2-8°C
4 semanas
 -20°C
Data Validade
(Alíquotas)
18-25°C
2h
10.2. Diluição de Amostras
As amostras de que se suspeite conterem concentrações mais elevadas que o maior padrão têm que ser
diluídas com Tampão de Reacção.
10.3. Acilação de Amostras e Controlos (Padrões não)
O seguinte procedimento tem que ser executado de duas maneiras:
Amostra A: Soro, Urina, extracto de plaquetas, homogeneizados de tecido e controlos
Amostra B: plasma sem plaquetas
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PORTUGUÊS
Não acilar os padrões. Já estão acilados!
A preparação de amostras conduz a uma diluição de 107 vezes para soro, urina, plaquetas,
homogeneizados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares e controlos e a uma diluição de
23.5 vezes para amostras de plasma. Isto tem que ser considerado para o cálculo dos resultados.
10.3.1. Amostra A: Soro, Urina, extracto de plaquetas, homogeneizados de tecido e controlos
1.
Pipetar 20 µL de cada Controlo e amostra A para tubos de ensaio de vidro.
2.
Pipetar 100 µL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
Pipetar 25 µL de Reagente de Acilação para cada tubo.
3.
Agitar cada tubo no vortex imediatamente após pipetagem.
4.
Tapar os tubos. Incubar 15 min a 37 °C en um banho-maria.
5.
Pipetar 2 mL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
6.
Centrifugar todos os tubos durante 10 min a 1500 x g.
As amostras preparadas têm que ser testadas imediatamente.
O sobrenadante é estável apenas durante 1 h à 18-25 °C.
10.3.2. Amostra B: plasma sem plaquetas
1.
Pipetar 50 µL de cada amostra B para tubos de ensaio de vidro.
2.
Pipetar 100 µL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
Pipetar 25 µL de Reagente de Acilação para cada tubo.
3.
Agitar cada tubo no vortex imediatamente após pipetagem.
4.
Tapar os tubos. Incubar 15 min a 37 °C. en um banho-maria
5.
Pipetar 1 mL de Tampão de Reacção diluído para cada tubo. Agitar no vortex.
6.
Centrifugar todos os tubos durante 10 min a 1500 x g.
As amostras preparadas têm que ser testadas imediatamente.
O sobrenadante é estável apenas durante 1 h à 18-25 °C.
11.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
11.1. Versão reduzida (Nota: apenas para amostras A, mas não para plasma)
Pipete 50 µl de cada Padrão, Controlo acilado e amostra acilada para os respectivos poços da
1.
Placa de Microtitulação.
2.
Pipetar 50 µL de Biotina para Serotonina para cada poço.
3.
Pipetar 50 µL de Antisoro para Serotonina para cada poço.
4.
Tapar a placa com película adesiva.
Incubar 90 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de
5.
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
6.
Pipetar 150 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço.
7.
Tapar a placa com película adesiva.
Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de
8.
Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
9.
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.
Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar.
10. Pipetar 200 µL de Solução de Substrato PNPP para cada poço.
11. Incubar 60 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
12. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop PNPP a cada poço. Misturar
rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
13. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop.
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11.2.
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Versão Alternativa com incubação de um dia para o outro (Amostras A E B)
11.2.1. Primeiro Dia
Pipetar 50 µL de cada Padrão, Controlo acilado e amostra acilada para os respectivos poços da
1.
Microplaca.
2.
Pipetar 50 µL de Serotonina-Biotina para cada poço.
3.
Pipetar 50 µL de Antisoro para Serotonina para cada poço. Agitar cuidadosamente a placa.
Tapar a placa com película adesiva. Agitar cuidadosamente a placa.
4.
Incubar 16-20 h (de um dia para o outro) a 2-8 °C.
11.2.2. Segundo Dia
1.
2.
Pipetar 150 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço.
3.
Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min à TA (18-25 °C) num agitador orbital (500 rpm).
4.
Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
5.
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.
Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
6.
Pipetar 200 µL de Solução de Substrato PNPP para cada poço.
7.
Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop PNPP a cada poço. Misturar
8.
rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (Comprimento de onda de referência:
9.
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop.
12.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além
disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis
equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de
acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de
aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é
válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em
ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo
dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma
boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou
modelo logit-log.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar
um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).
A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Devido à diluição das amostras, os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente
para se obter as concentrações de serotonina em ng/mL:
Soro, urina, plaquetas, homogeneizados de tecido, sobrenadantes de culturas celulares, controlos: x 107
Plasma sem plaquetas:
x 23.5
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PORTUGUÊS
Os resultados de amostras com uma pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
O ensaio pode ser declarado válido se forem cumpridos os seguintes critérios:
50% D.O./D.O.max (ED 50): 0.60 - 1.00 ng/mL (média 0.8 ng/mL).
 D.O. Padrão A - Padrão G:  0.80 D.O.
Conversão:
Serotonina (ng/mL) x 5.67 = nmol/L
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como
descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
13.1. Cálculos para plaquetas
O conteúdo de serotonina em plaquetas é referido relativamente a 109 plaquetas. Em seguida é dado um
exemplo:
Concentração de serotonina: 100 ng/mL.
Número de plaquetas no PRP: 300 000/µL equivalente a 60 000 000/200µL PRP e 200 µL de volume de
extracção. Ao usar 20 µL no teste, tem-se um equivalente plaquetário de 6 x 106 plaquetas.
O conteúdo de serotonina refere-se a 1 mL. Por isso os equivalentes plaquetários usados em 20 µL têm
que ser multiplicados por 50.
6 x 106 x 50 = 0.3 x 109 plaquetas/ml com um conteúdo de serotonina de 100 ng.
O conteúdo de serotonina em plaquetas resultante é 333 ng/109 plaquetas (100 ng serotonina x 1.0 x 109 /
0.3 x 109 ).
OD 405nm
Curva de Calibração Típica
2.500
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
Serotonina
DOMédia
(ng/mL)
A
0.0
2.118
B
0.08
1.883
C
0.24
1.568
D
0.73
1.089
E
2.2
0.641
F
6.6
0.369
G
19.8
0.245
14.
DO/DOmax
(%)
100.0
88.9
74.0
51.5
30.3
17.4
11.6
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0.01
0.1
1
10
100
Serotonin ng/mL
VALORES ESPERADOS
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser
correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: (97.5 % percentil)
Espécime
Soro
Plasma sem Plaquetas
Plaquetas
24 h Urina
n
99
35
35
49
Unidade
ng/mL
ng/mL
ng/109 Plaquetas
µg/dias
Média
88.6
3.7
490
83.1
Intervalo
30 – 200
1.8 – 7.5
217 – 861
 200
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
15.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se
estiverem em concentrações inferiores às indicadas:
Hemoglobina
Bilirrubina
Version 2014-11
8.33 mg/mL
0.33 mg/mL
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PORTUGUÊS
DESEMPENHO
Substância
Especificidade Analítica
(Reactividade Cruzada)
N-Acil-Serotonina
5-HIAA
Melatonina
5-Metoxi-Triptamina
3-Indolacrylic acid
Indole-3-pyruvic acid
3-Indolacetic acid
5-Metoxytryptophol
L-5-OH-Triptofano
Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD
(como lido a partir da curva padrão)
Sensibilidade Analítica
(Limite de Detecção)
Reactividade
Cruzada (%)
100
0.110
0.040
0.015
< 0.01
Durante a noite: 0.014 ng/mL
versão reduzida: 0.025 ng/mL
Soro, Urina, Plaquetas, Homogeneizados de
tecido, Sobrenadantes de Culturas Celulares
versão reduzida: 2.68 ng/mL
(multiplicado pelo factor de diluição)
Plasma
Intervalo
CV (%)
Precisão
(ng/mL)
Soro
91 - 327
3.8 – 6.6
114 - 625
4.8 – 8.2
Intra-Ensaio Urina
Plasma
7.1 - 247
3.7 – 11.5
Soro
23 – 355
6.7 – 17.3
87 – 626
9.4 – 18.1
Inter-Ensaio Urina
Plasma
8.9 - 30
6.8 – 17.9
Intervalo
Diluição em Série
Intervalo (%)
(ng/mL)
até
1:16
90 - 125
Soro
226 – 1503
Linearidade
Urina
677 - 1264
1:32
89 - 117
Plasma
404 - 597
1:16
89 - 117
Média (%)
Intervalo (%)
Soro
104
85 – 119
% Recuperação após adição de
Recuperação
“reforço”
Urina
98
85 – 116
Plasma
100
83 –120
Soro
Teste IBL = 0.90 x HPLC + 19.5
r = 0.945; n = 28
Comparação Método
Urina
Teste
IBL
=
0.86
x
ELISA
+
20.0
r = 0.987; n = 32
Usado versus HPLC /
Plaquetas
*
Teste
IBL
=
0.992
x
HPLC
+
0.008
r
= 0.992; n = 50
outro ELISA
*Reference: Kluge, H; Serotonin in Platelets; J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999)
Version 2014-11
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17.
PORTUGUÊS
PROTOCOLO CURTO (DE UM DIA PARA O OUTRO E VERSÃO CURTA)
Tempo total do ensaio
Espécime
Pré-tratamento do amostra
Acilação
Volume de amostra
Tampão de Reacção diluído
Reagente de Acilação
Condição de incubação,
Banho de água
Tampão de Reacção diluído
Centrifugação
Pipetagem da Placa de
Microtitulação
Padrões/ amostra acilada
Serotonina Biotina
Serotonina Antisoro
Incubação da amostra
Tempo de incubação
Temperatura de incubação
Condição de incubação
Fases de lavagem
Incubação enzimático
Conjugado Enzimático
diluído
Fases de lavagem
Incubação do Substrato
Volume de pipetagem
Solução de Paragem
Medir a densidade óptica
Version 2014-11
<5h
(versão reduzida)
18-22 h
(Durante a noite)
18-22 h
(Durante a noite)
Soro, Urina, Plaquetasextracto,
Homogeneizados de
tecido e Controlos
Soro, Urina,
Plaquetas-extracto,
Homogeneizados de
tecido e Controlos
Plasma sem
Plaquetas
Não acile os padrões! Eles já são acilados.
20 µL
100 µL
25 µL
20 µL
100 µL
25 µL
50 µL
100 µL
25 µL
15 min 37 °C
15 min 37 °C
15 min 37 °C
2000 µL
10 min à 1500 x g
2000 µL
10 min à 1500 x g
1000 µL
10 min à 1500 x g
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
90 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
16-20 h
2-8 °C
não agitador
16-20 h
2-8 °C
não agitador
3 x 250 µL
3 x 250 µL
3 x 250 µL
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
150 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
3 x 250 µL
3 x 250 µL
3 x 250 µL
200 µL
60 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
200 µL
30 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
200 µL
30 min
TA (18-25 °C)
Agitador 500 rpm
50 µL
50 µL
50 µL
405 nm (comprimento de onda de referência: 600 – 650 nm)
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PORTUGUÊS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
Lahiri, D. K., Ge, Y.-W., Sharman, E. H., Bondy, St. C., Age-related changes in serum melatonin in
mice: higher levels of combined melatonin and 6-hydroxymelatonin sulfate in the cerebral cortex than
serum, heart, liver and kidney tissues. J. Pineal Res. May 2004, Vol. 36, issue 4, 217-223
Bethea, C. L., Lu, N. Z., Reddy, A., Shlaes, T., Streicher, J. M., Whittemore, S. R., Characterization of
reproductive steroid receptors and response to estrogen in a rat serotonergic cell line. Journal of
Neuroscience Methods 127, 31-41 (2003). Address: Bethea, C. L., Oregon National Primate Research
Center, Beaverton, USA.
Pan, J et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance regulator Modulates Neurosecretory
Function in Pulmonary Neuroendocrine Cell-Related Tumor Cell Line Models. Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol. Vol. 27, 553 – 560 (2002)
Khan, I., Thomas, P., Disruption of Neuroendocrine Control of Luteinizing Hormone Secretion by Aroclor
1254 involves Inhibition of Hypothalamic Tryptophan Hydroxylase Activity. Biology of Reproduction, 64,
955-964 (2001). Address: Khan, I.A., University of Texas at Austin, U.S.A.
Harenberg, J, Huhle, G., Giese Ch., Wang, L., Feuring, M., Song, X., Hofmann, U.: Determination of
serotonin release from platelets by enzyme immunoassay in the diagnosis of heparin-induced
thrombocytopenia. British Journal of Hematology, 109, 182-186 (2000) Address: Harenberg J.,
University of Heidelberg, Germany
Kluge, H., Bolle, M., Reuter, R., Werner, S., Zahlten, W., Prudlo, J., Serotonin in Platelets: Comparative
Analyses using New Enzyme Immunoassay and HPLC Test Kits and the Traditional Fluorimetric
Procedure. J Lab Med, 23 (6): 360-364 (1999) Address: Kluge, H., University of Jena, Germany
Balaskas, E., Bamihas, G., Karamouzis M., Voyiatzis, G., Tourkantonis, A. Histamine and Serotonin in
uremic pruritus: effect of ondansetron in CAPD-pruritic patients. Nephron, 78:395-402 (1998) Address:
Elias Balaskas, MD Ahepa University Hospital, Thessaloniki, Greece
Sprott,H., Kluge,H., Franke,S, Hein,G. Altered Serotonin-Levels in Patients with Fibromyalgia. In:
Journal of Musculoskeletal Pain, Abstracts from the 3rd World Congress on Myofascial Pain and
Fibromyalgia San Antonio, Texas, USA, Editor: I. J. Russel, p. 65. (1995) Address: Kluge,H., University
of Jena, Jena, Germany
Thomas Stratz, Wlodzimierz Samborski, Pawel Hrycaj, Thomas Pap, Stefan Mackiewicz, Pierre
Mennet, Wolfgang Müller Die Serotoninkonzentration im Serum bei Patienten mit generalisierter
Tendomyopathie (Fibromyalgie) und chronischer Polyarthritis. In: Medizinische Klinik, 88, 458-462
(1993).
Address: Thomas Stratz, Hochrhein-Institut für Rheumaforschung und Rheumaprävention, Bad
Säckingen/Rheinfelden, Germany
Version 2014-11
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
[email protected]
http://www.IBL-International.com
+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
[email protected]
http://www.IBL-International.com
LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20

Serotonin ELISA - IBL international

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