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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE FORTALEZA
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
RASTREABILIDADE MOLECULAR DE Staphylococcus spp. NO
BENEFICIAMENTO DE PRODUTOS LÁCTEOS CAPRINOS
FRANCISCA GEOVANIA CANAFÍSTULA DE SOUSA
AREIA – PB
Novembro - 2013
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE FORTALEZA
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
Bióloga
AREIA – PB
Novembro – 2013
ii
Tese apresentada ao Programa de Doutorado
Integrado de Pós-graduação em Zootecnia da
Universidade
Federal
da
Paraíba,
Universidade Federal Rural de Pernambuco e
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para obtenção do titulo de doutora em
Zootecnia
Comitê de orientação
Celso José Bruno de Oliveira – Orientador principal
Patrícia Emília Navez Givisiez
Paulo Sérgio de Azevedo
AREIA – PB
Novembro – 2013
iii
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e
pesquisa, desde que citada à fonte.
Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da
Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB.
S586r
Sousa, Francisca Geovânia Canafístula de.
Rastreabilidade molecular de Staphylococcus spp. no
beneficiamento de produtos lácteos caprinos. / Francisca Geovânia
Canafístula de Sousa. - Areia: UFPB/CCA, 2013.
78f. : il.
Tese (Doutorado em Zootecnia) - Centro de Ciências Agrárias.
Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2013.
Bibliografia.
Orientador (a): Celso José Bruno de Oliveira.
Coorientador (a): Patrícia Emíia Naves Givisiez e Paulo Sérgio de
Azevedo.
1. Leite de cabra – Cariri paraibano 2. Leite caprino –
Contaminação microbiológica 3. Segurança alimentar –
Staphylococcus I. Oliveira, Celso José Bruno de (Orientador) II.
Título.
UFPB/CCA
CDU: 637.17(043.3)
iv
v
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
FRANCISCA GEOVANIA CANAFÍSTULA DE SOUSA – Filha de Augustinho Ferreira
de Sousa (in Memória) e Fátima Canafístula de Sousa, nasceu em 1 de fevereiro de
1983, na cidade de Sobral no estado do Ceará. Em 2003 ingressou no curso de
Licenciatura plena em Biologia da Universidade Estadual Vale do Acaraú, na cidade
de Sobral-CE, concluindo o curso de graduação no ano de 2007. Durante a
graduação, estagiou na Embrapa caprinos-CNPC entre os anos de 2005-2007 no
Laboratório de Bacteriologia da unidade. No ano de 2008 ingressou no curso de
mestrado em Zootecnia, do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da
Paraíba, no município de Areia-PB, na área de produção animal e defendeu a
dissertação de mestrado em fevereiro de 2010. Em março de 2010 ingressou no
curso de doutorado pelo Programa Integrado em Zootecnia no Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, na cidade de Areia e defendeu a tese
em novembro de 2013, na área de produção animal.
vi
A tribulação produz perseverança;
A perseverança, experiência;
E a experiência, esperança.
Romanos 4: 3-4
vii
Dedico
Com imenso carinho as minhas avós materna,
Lindelmira Canafístula e paterna, Maria Gomes (In Memória)
pelo exemplo que são para mim de humildade,
fé, caridade e amor ao próximo.
E pela serenidade que sempre cultivaram em
seus rostos, mesmo nos momentos de dificuldade.
À amiga Candice Maria Cardoso Gomes de Leon
por todas as orações e momentos partilhados.
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus por toda a benção derramada sobre mim e como reconhecimento de que
sem Ele eu nada poderia ter feito e de que minhas conquistas seriam em vão.
Ao Programa de doutorado Integrado em Zootecnia pela oportunidade a mim
concedida.
Ao Conselho Nacional de Amparo a Pesquisa (CAPES) pela concessão da bolsa.
À minha mãe, irmãos e avô materno por todo o amor, carinho e respeito a mim
dedicado.
À Rodrigo Pereira Leite por seu companheirismo, paciência e amor.
Os Meus mais sinceros agradecimentos, aos professores Celso José Bruno de
Oliveira e Patrícia Naves Givisiez pela orientação, amizade, confiança e
oportunidades a mim concedidas.
Ao professor Paulo Sérgio de Azevedo e demais professores do programa de pósgraduação pelo carinho.
A Lea Chapaval com enorme carinho, sempre, por todo o incentivo e apoio para que
eu ingressasse na carreia acadêmica.
Aos Companheiros de pós-graduação e estudantes de graduação que fazem parte
do grupo de pesquisa do Laboratório de Avaliação de Produtos de Origem Animal
(LAPOA/CCA/UFPB). Obrigada!
A Noádia Priscila, Ariana Meira e Élcio Santos por todo o conhecimento partilhado.
As amigas, Ana Paula Gomes, Anaiane, Jailma Santos, Jussara Telma, Luana
Paula, Luziana Pollyana Agra e Rosana pelos momentos de muita alegria no dia-adia e na hora do café.
A todos que contribuíram direta e indiretamente para a construção desta obra, os
meus mais sinceros agradecimentos.
ix
LISTA DE SIGLAS
blaz – gene para produção de β- lactamases
fem –A – gene fator essencial de resistência a meticilina
mec A – gene para produção da proteína alvo modificada de ação da meticilina
sea – gene para produção de enterotoxina estafilocócica A
seb – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica B
sec – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica C
sed – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica D
see – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica E
seg – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica G
seh – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica H
sei – gene para a produção de enterotoxina estafilocócica I
ica- D – gene para produção de biofilme
REP – elementos palindrômicos repetidos
Housekeeping – genes envolvidos com a produção de proteínas essenciais para a
manutenção da célula e metabolismo microbiano
arcC – gene carbamato quinase
aroE – gene chiquimatodesidrogenase
glK – gene glycerol kinase
gmK – gene para a produção da enzima guanilato quinase
pta – gene para a produção da enzima fosfato acetil transferase
tip – gene para a produção da enzima triose fosfato isomerase
yqiL – gene para a produção da enzima Acetil CoA acetil transferase
MIC – Concentração inibitória mínima
OD – densidade óptica
ODC – ponto de corte da densidade óptica
Pb – pares de bases
Kb – Kilobases
SCP - Staphylococcus coagulase positivo
SCN – Staphylococcus coagulase negativo
TAE – Tris, Acetato e EDTA
x
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
x
xi
xii
xiii
1
Capítulo I
Investigação ecoepidemiológica de Staphylococcus spp. em sistema de
produção de leite de cabra
Resumo
Abstract
1. Introdução
2. Material e métodos
2.1 Coleta de amostras
2.2 Isolamento de Staphylococcus spp.
2.3 Extração de DNA genômico
2.4 Genotipagem por REP-PCR
2.5 Multilocus sequence typing (MLST)
3. Análise dos dados
4. Resultados e discussão
5. Conclusão
6. Referências Bibliográficas
3
4
5
6
6
6
7
7
8
9
9
14
14
Capítulo II
Similaridade genética, genes enterotoxigênicos e produção de biofilme em
Staphylococcus spp. multirresistentes isolados de queijo caprino
Resumo
Abstract
1. Introdução
2.2 Avaliação da susceptibilidade antimicrobiana
2.3 Produção fenotípica de biofilme
2.3.1 Determinação da produção de biofilme em ágar Congo Red
2.3.2 Determinação de biofilme em microplaca
2.4 Extração do DNA genômico
2.5 Pesquisa do gene ica-D
2.6 Pesquisa de genes enterotoxigênicos
2.7 Pesquisa de genes de resistência (fem A, mec A e blaZ)
2.8 Genotipagem
3 Análise de dados
4 Resultados e discussão
5 Conclusão
17
18
19
20
20
21
21
21
22
23
24
24
24
25
26
26
33
33
xi
Capítulo III
Vias de contaminação de Staphylococcus spp. na linha de produção de
queijo coalho caprino
Resumo
Abstract
1. Introdução
2.3.1 Método de disco difusão
2.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima por microdiluição
2.7 Pesquisa de genes enterotoxigênicos
2.9 Genotipagem
3. Análise de dados
5. Conclusão
38
39
40
40
41
41
41
42
42
43
44
44
44
45
46
46
47
47
48
49
57
57
CONSIDERAÇÕES FINAIS
60
ANEXO
61
xii
LISTA DE TABELAS
Páginas
Capítulo II
Tabela 1. Resistência a antimicrobianos em Staphylococcus (n=81)
isolado de leite de cabra produzido com leite pasteurizado ou cru nos
Estados do Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte
Tabela 2. Perfil de resistência a antimicrobianos em Staphylococcus spp.
(n=81) isolados de queijos fabricados com leite de cabra nos Estados do
Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte
27
28
Capítulo III
Tabela 1. Frequências de resistência avaliadas pelo método de discodifusão em Staphylococcus coagulase positivos e negativos isolado de
pontos da linha de produção de queijo coalho fabricado com leite de cabra
pasteurizado
Tabela 2. Perfis de resistência a antimicrobianos em Staphylococcus spp.
(n=93) isolado de pontos da linha de produção de queijo coalho fabricado
com leite de cabra pasteurizado
Tabela 3. Concentração inibitória mínima de Staphylococcus spp. (n=79)
de pontos da linha de produção de queijo coalho fabricado com leite de
cabra pasteurizado
Tabela 4. Presença de genes associados a fatores de virulência em
Staphylococcus spp. (n=56) isolado de pontos da linha de produção de
queijo coalho fabricado com leite de cabra pasteurizado.
50
50
52
54
ANEXO
Descrição dos oligonucleotídeos utilizados na identificação de fatores de
virulência e na genotipagem de Staphylococcus spp.
61
xiii
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Capítulo I
Figura 1. Dendrograma gerado a partir da análise de perfis moleculares
obtidos por REP-PCR em Staphylococcus coagulase positiva isolado do
leite cru e pasteurizado, mão de manipulador e equipamento de usinas de
beneficiamento de leite de cabra em Monteiro, Sumé e Cabaceiras.
12
obtidos por REP-PCR em Staphylococcus coagulase negativa isolado do
leite cru e pasteurizado, mão de manipulador e equipamento de usinas de
beneficiamento de leite de cabra em Monteiro, Sumé e Cabaceiras
13
Capítulo II
obtidos por REP-PCR em Staphylococcus spp. isolado em queijo coalho
fabricado com leite de cabra cru e pasteurizado em queijarias dos
Estados do Ceará, Paraíba e Rio grande do Norte
32
Capítulo III
obtidos por REP-PCR em Staphylococcus spp. isolado de leite cru e
pasteurizado, utensílios, equipamentos, mão de manipulador e queijo
coalho fabricado com leite de cabra pasteurizado
56
xiv
RESUMO
Staphylococcus spp. são microrganismos ubiquitários presentes na produção de
leite de cabra e importantes para a saúde publica do ponto de vista da segurança
alimentar. Por esta razão, objetivou-se identificar clones epidemiológicos através da
REP-PCR com Rw3A em Staphylococcus spp. isolado de leite, queijos e em pontos
da produção de queijo coalho caprino. Adicionalmente foi avaliado o perfil de
resistência fenotípica antimicrobiana, a produção de biofilme por métodos
fenotípicos, a presença de genes de resistência, enterotoxigênicos e para a
produção de biofilme (ica-D). Observou-se que Staphylococcus coagulase negativo
são as principais espécies encontradas na linha de produção de queijo coalho e que
MRSA foram ausentes entre os isolados que participaram do estudo. Pelo método
de disco-difusão e pelo método de microdiluição foi possível verificar que
Staphylococcus isolados de queijos e pontos da produção foram resistentes
principalmente a antibióticos β-lactâmicos. Os métodos de MtP e CRA mostraram-se
pouco eficiente na determinação da produção de biofilme em Staphylococcus spp.
na produção de queijo coalho caprino. Entre os isolados do estudo, apenas 5
(15,6%) isolados foram positivos para a presença de genes de virulência (blaZ, IcaD,
fem, seg e sei) em Staphylococcus spp. isolados de queijos produzidos com leite cru
e pasteurizado em queijarias do Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte. Uma
frequência maior de genes de virulência foi observada em Staphylococcus spp.
isolados de diversos pontos da linha de produção de queijo coalho elaborado com
leite de cabra em usina da Paraíba. Os resultados do presente estudo indicaram
ainda que a manipulação do leite e a contaminação residual em equipamentos
podem ser importantes vias de contaminação do leite de cabra. Staphylococcus
aureus do leite de cabra cru e pasteurizado avaliados por mlst foram identificados
como ST 133, um complexo clonal associado a animais ungulados e nunca isolado
de casos clínicos humanos. Outro fato importante observado no estudo é a
similaridade entre Staphylococcus multirresistentes distribuídos em diferentes
queijarias dos Estados do Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte. Pela analise de
perfis de similaridade foi possível observar que a mão do manipulador é uma
importante fonte de contaminação no beneficiamento do leite de cabra e na
produção de queijo coalho.
Palavras-chave: leite de cabra, qualidade e segurança alimentar
xiii
ABSTRACT
Staphylococcus spp. are ubiquitous microorganisms present in the production of goat
milk and important to public health from the point of view of food security. Therefore,
this study aimed to identify epidemic clones by REP- PCR with Rw3A in
Staphylococcus spp. isolated from milk, cheese and goat’s cheese production .
Additionally, we evaluated the antimicrobial profile of phenotypic resistance to biofilm
production by phenotypic methods, the presence of resistance genes and
enterotoxigenic for the production of biofilm (ica -D). It was observed that
Staphylococcus coagulase negative are the main species found in the production of
the cheese production and MRSA were absent among the isolates in the study. By
disk diffusion and the microdilution method was verified that Staphylococcus isolates
from cheeses and cheese production were mainly resistant to β -lactam antibiotics.
The methods MtP, and CRA proved to be inefficient in determining the production of
biofilm in Staphylococcus spp. in the production of goat cheese. Among isolates of
the study, only 5 (15.6 %) isolates were positive for the presence of virulence genes
(blaZ, icaD, sei, seg and fem A) in Staphylococcus spp. isolated from cheeses made
with raw milk and pasteurized dairy products of Ceará, Paraíba and Rio Grande do
Norte. A higher frequency of virulence genes was observed in Staphylococcus spp.
isolated from different parts of the production of cheese made with goat’s milk plant
in Paraiba . The results of this study also indicated that the handling of milk and
residual contamination in equipment may be important pathways of contamination of
goat milk. Staphylococcus aureus from raw goat milk and pasteurized evaluated by
MLST were identified as ST 133 clonal complex associated with ungulates and never
isolated from human clinical cases. Another important fact observed in the study is
the similarity of multiresistant Staphylococcus distributed in different dairies in the
states of Ceará, Paraíba and Rio Grande do Norte. For the analysis of profiles of
similarity was observed that the hand of the handler is an important source of
contamination in the processing of goat milk and production of cheese.
Keywords: food quality and safety, goat’s milk
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Staphylococcus aureus são microrganismos ubiquitários associados a
doenças de origem alimentar, principalmente através da produção de toxinas em
produtos lácteos.
Em animais de produção de leite, é também um dos principais agentes da
mastite ou mamite, uma infecção da glândula mamária responsável por grandes
prejuízos econômicos em todo o mundo. Em cabras, outras espécies de
Staphylococcus,
principalmente
coagulase
negativas,
apresentam
grande
importância na etiologia da mastite, podendo também contaminar o ambiente de
produção, equipamentos, instalações e o leite após a pasteurização. Esses
microrganismos causadores da mastite podem ser transferidos para o leite durante a
ordenha e para derivados lácteos através da contaminação cruzada ao longo das
etapas de produção. A maioria do conhecimento produzido relaciona-se a S. aureus
na espécie bovina e muito pouco se sabe sobre a importância da contaminação por
Staphylococcus coagulase positivos e negativos em leite e derivados de origem
caprina.
Objetivou-se, com esse estudo, investigar fatores de patogenicidade
(produção
de
biofilme,
resistência
antimicrobiana
e
presença
de
genes
enterotoxigênicos) e a similaridade genética de Staphylococcus spp. isolados de
diferentes etapas de beneficiamento de leite e produção de queijo de origem
caprina. Espera-se, com isso, que as informações geradas possam contribuir para a
avaliação do real impacto da contaminação estafilocócica em leite e queijo de
origem caprina e identificar possíveis fontes e pontos de contaminação que
possibilitem implementar medidas de controle e redução da contaminação. Esses
conhecimentos são fundamentais para o desenvolvimento da caprinocultura leiteira
regional, uma vez que a produção de alimentos seguros é ponto-chave no sucesso
da indústria de alimentos.
1
Capítulo I
Investigação ecoepidemiológica de Staphylococcus spp. em sistema de
produção de leite de cabra
INVESTIGAÇÃO ECOEPIDEMIOLÓGICA DE Staphylococcus spp. EM SISTEMA
DE PRODUÇÃO DE LEITE DE CABRA
RESUMO GERAL
O objetivo do presente estudo foi investigar a similaridade genética de Staphylococcus spp.
isolados de diferentes pontos durante o beneficiamento de leite caprino em três usinas da
região do Cariri Paraibano. Staphylococcus spp. foram obtidos de leite de conjunto in natura,
leite pasteurizado, swabs de superfície do tanque de recepção de leite, embaladora, tanque
pré-pasteurização, tanque pulmão e mãos dos manipuladores. Foi realizada genotipagem de
79 isolados coagulase positivos e negativos através da Rep-PCR utilizando-se iniciadores
RW3A. Adicionalmente, alguns isolados da espécie S. aureus foram tipificados por
multilocus sequence typing (mlst). O método de Rep-PCR foi eficiente (valor D=0,99) na
discriminação de Staphylococcus spp. isolados de usinas de beneficiamento de leite
caprino. Dos 5 agrupamentos produzidos, três apresentaram Staphylococcus com perfil
genotípico similar obtidos de diferentes pontos e diferentes usinas. Em cada um dos clusters
foi identificado pelo menos um isolado da mão de manipulador com perfil genético similar a
isolados de leite cru. O fato dos isolados obtidos da mão dos manipuladores terem
apresentado maior similaridade genética com isolados de origem láctea do que os isolados
de casos clínicos humanos indicam que os manipuladores podem atuar na contaminação
cruzada de Staphylococcus em usinas de leite caprino. Os resultados do presente estudo
indicaram ainda que a manipulação do leite e a contaminação residual em equipamentos
podem ser importantes vias de contaminação do leite de cabra. Staphylococcus aureus do
leite de cabra cru e pasteurizado avaliados por mlst foram identificados como ST 133, um
complexo clonal associado a animais ungulados e nunca isolado de casos clínicos
humanos. De fato, de acordo com a genotipagem por Rep-PCR, não foram identificadas
similaridades entre os isolados das usinas e aqueles cultivados de infecções em humanos,
inseridos nesse estudo como controle. Por fim, a presença de isolados geneticamente
similares de leite cru e leite pasteurizado pode indicar falhas no processo de pasteurização.
Palavras-chave: qualidade de leite, Rep-PCR e segurança alimentar
3
INVESTIGAÇÃO ECOEPIDEMIOLÓGICA DE Staphylococcus spp. EM SISTEMA
DE PRODUÇÃO DE LEITE DE CABRA
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the genetic relatedness of Staphylococcus spp.
isolates from different points during the processing of goat milk in three goat dairy plants
located in Cariri region, Paraiba . Staphylococcus spp . were obtained from fresh whole milk,
pasteurized milk , swabs from bulk milk tank, pre- and post-pasteurization tanks, packing
machine and hand swabs from handlers. Genotyping was performed by Rep -PCR using
primers RW3A and some isolates confirmed S. aureus species were typed by multilocus
sequence typing (MLST). The method of Rep- PCR was efficient ( D value = 0.99) in the
discrimination of Staphylococcus spp. isolated from goat dairy plants. Isolates were grouped
in five different clusters and three of them included Staphylococcus from different points and
different plants sharing similar genotypic profilings obtained. In each of those clusters there
was at least one isolate from handlers related genetically to raw milk staphylococci. The fact
that the isolates obtained from the hand of the handlers presented greater genetic
relatedness with isolates of dairy origin than those from human clinical cases indicate that
handlers may play a key role in the cross-contamination of goat milk by Staphylococcus as
well as residual contamination in equipments Staphylococcus aureus from raw and
pasteurized goat milk evaluated by MLST were identified as ST 133, which belongs to a
clonal complex associated with ungulates and still not reported as a pathogen associated
with disease in humans. In fact, according to the Rep- PCR genotyping, there was no
relatedeness between the isolates from the dairy plants with those isolates associated with
infections in humans included in this study as a control. Finally, the presence of strains
sharing similar genotipic profilling from raw and pasteurized milk may indicate problems in
the pasteurization process.
Keywords: qualidade de leite, Rep-PCR e segurança alimentar
4
1.Introdução
Staphylococcus aureus são reconhecidos como agentes causadores de
doenças de origem alimentar em todo o mundo. A contaminação do leite de cabra
por Staphylococcus pode ter origem a partir de infecções na glândula mamária
(JORGENSEN et al. 2005; SPANU et al. 2013) e contaminar o ambiente após a
ordenha, implicando na manutenção e circulação da bactéria nos sistemas de
produção. Staphylococcus coagulase negativos são patógenos oportunistas
comumente isolados de leite caprino e as espécies que mais comumente
identificadas são coagulase negativas, tais como Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus caprae e Staphylococcus simulans (KOOP et al. 2012).
Em sistemas de produção de leite de cabra, não há informações sobre a
dinâmica da contaminação estafilócica de Staphylococcus nesse ambiente, de forma
que a tipificação dos isolados pode fornecer informações importantes para o controle
de Staphylococcus spp. no ambiente de produção e no leite de cabra beneficiado.
Diferentes métodos de genotipagem têm sido utilizados em investigações
epidemiológicas de Staphylococcus spp. em sistemas de produção de leite caprino,
com objetivo de comparar
S. caprae isolado de infecções humanas e mastite
caprina (VANDERNESCH et al. 1995), identificar S. aureus subespécie anaerobius
isolados de infecções em rebanhos caprinos (SZALÚS-JORDANOW et al. 2013),
tipificar Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) em mastite caprina
(ARAS et al. 2012) ou mesmo avaliar comparativamente Staphylococcus aureus
envolvidos na mastite caprina, bovina e ovina (MORK et al. 2005), Dentre os
métodos de genotipagem, a REP-PCR com iniciadores RW3A tem sido utilizada com
sucesso em investigações epidemiológicas de Staphylococcus aureus e S.
coagulase negativos com diferentes propóstitos, representando alternativa mais
eficiente e de menor custo em relação a outros métodos genotípicos e fenotípicos de
tipificação.
Portanto, esse estudo objetivou investigar a similaridade genética de
Staphylococcus spp. isolados de diferentes pontos durante o beneficiamento de leite
caprino em usinas da região do Cariri Paraibano. De acordo com nosso
conhecimento, esse é o primeiro estudo para caracterização genotípica de
5
Staphylococcus em sistemas de produção de leite de cabra. utilizando Rep-PCR
com RW3A.
Foi realizado um estudo longitudinal em três mini usinas de beneficiamento
de leite de cabra localizadas nas cidades de Monteiro, Cabaceiras e Sumé, todas na
região do cariri da Paraiba. As amostras foram colhidas durante um período de 12
meses, sendo que o intervalo de colheita para cada usina foi de 15 dias. O número
de colheitas em cada uma das usinas foram 16, 14 e 5 nas usinas de Monteiro,
Cabaceiras e Sumé, respectivamente.
Amostras de leite de conjunto in natura (35), leite pasteurizado (35), swabs
de superfície do tanque de recepção de leite (35), tanque de expansão (35), tanque
pulmão (35) e mãos dos manipuladores (35) foram adquiridas e transportadas em
caixa isotérmica com gelo ao Laboratório de Avaliação de Produtos de Origem
Animal, do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba
UFPB/CCA.
Para a coleta do leite, foram utilizados frascos de vidro estéreis e swabs em
meio semi-sólido Stuart (COPAN, Itália) para amostragem das mãos de
manipuladores. Nas superfícies dos equipamentos e paredes, foram utilizadas
esponjas de celulose previamente hidratadas com 10 mL de caldo Letheen e
polisorbato 80 e armazenadas em embalagens plásticas estéreis (Whirl-Pak, Nasco,
U.S.A). As amostras de equipamentos, ambiente e mão dos manipuladores foram
colhidades antes do início processo de beneficiamento e posteriormente aos
procedimentos de limpeza e desisfecção rotineiramente empregados em cada uma
das usinas.
As amostras de leite foram diluídas em tubos de 9mL de solução de Ringer
(2,25g/mL de NacL;0,105g/mL de KCl; 0,12g/mL de CaCl; 0,05g/mL de bicarbonato).
As diluições seriadas foram semeadas sobre a superfície do ágar Baird-Parker
6
(Himedia, Índia) e incubadas a 35°C por 24 - 48 horas de acordo com
recomendações de BENETTE E LANCETTE, (2001).
A presença ou ausência de Staphylococcus spp. foi avaliada pelas
características das colônias. As colônias com coloração negra ou cinza, bordas lisas
e côncavas, com bordas lisas ou irregulares, formadoras de halo ou não foram
repicadas em ágar infuso cérebro coração (BHI, Difco, U. S. A) e incubadas a 37ºC
por 24 horas. Após incubação, as colônias foram submetidas aos testes de
coloração de Gram, catalase e coagulase.
Os swabs das mãos foram semeados diretamente sobre a superfície do ágar
Baird Parker. As soluções utilizadas para umidificar as espojam de celulose foram
semeadas em estrias na superfície do ágar Baird-Parker. As condições de
incubação e a identificação das colônias obtidas da superfície de equipamentos
foram realizadas conforme descrito para as amostras de leite.
Staphylococcus spp. isolados de leite cru (41), leite pasteurizado (19),
tanque de expansão (4), tanque pulmão (3) e mãos de manipuladores (11) foram
selecionados para a genotipagem de acordo com o resultado do teste de coagulase
e o ponto de origem, totalizando 79 isolados.
O DNA bacteriano foi extraído a partir de uma alíquota de 1,5 mL do cultivo
bacteriano preparado em caldo triptona de soja (TSB, Himedia, Índia) suplementado
com 0,06% de extrato de levedura (Himedia, Índia), incubado por 18-24 horas.
O kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Alemanha) foi utilizado com
lisozima (Research Organics, U. S. A) na concentração de 20 mg/mL de acordo com
as recomendações do fabricante.
A quantidade e qualidade do DNA foram avaliadas em espectrofotômetro
plus (Eppendorf, Alemanha) e o DNA diluído para uma concentração final de 50 ng/
µL.
2.4 Genotipagem por REP-PCR
Cada reação de PCR foi preparada pela mistura de tampão 1x concentrado,
3mM de MgCl2, 1µM do primer RW3A (E-OLIGOS), 0,2 µM de DNTP, 2U de taq
polimerase (LGC bio) e 130ng de DNA em um volume final de 25µL. A cepa
7
Staphylococcus aureus ATTCC 25923 foi utilizada como controle positivo das
reações.
As condições de reação e amplificação foram utilizadas de acordo com VAN
DER ZEE et al. (1999) com modificações. A amplificação foi realizada em
termociclador TC-3000 (TECHNE TC3000, Reino Unido) programado para uma
desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos seguidos por 30 ciclos com 94ºC por 1
minuto, 50ºC por 1 minuto e 72ºC por 2 minutos. Uma extensão final foi realizada a
72ºC por 5 minutos.
A eletroforese foi realizada a 70V em tampão TAE 1x concentrado (LGCBiotecnologia, Brasil). Um volume de 10 µL de cada amplificado foi aplicado nos
poços do gel. Antes da aplicação, o amplificado foi misturado a 2 µL do tampão de
carreamento da amostra (4g de glicose;0,025g de azul de bromofenol; 0,025g de
xileno de cianol; 10ml de água deionizada autoclavada).
Marcadores moleculares de 100pb e 1kb (LGC biotecnologia) foram
inseridos nas extremidades dos géis preparados com agarose 1,5% (LGCbiotecnologia) diluída em tampão TAE 1x concentrado.
A coloração dos géis foi realizada por 30 minutos em agitação mecânica
utilizando se produto comercial (Gel red, Biotium) 3X concentrado, de acordo com as
recomendações do fabricante.
A presença e a ausência de bandas foram utilizadas como critério para
avaliar a similaridade entre Staphylococcus spp. e gerar uma matriz de similaridade
utilizandos-e programa comercial (BioNumerics versão 7.1, Applied Maths, Belgium).
O coeficiente de similaridade de Dice a 2% foi utilizado para gerar a matriz de
similaridade e o agrupamento obtido pelo método de UPGMA (Unweighted Pair
Group Method, Arithmetic Mean).
Um grupo controle de perfis genotípicos de Staphylococcus spp. de origem
humana e de um isolado de swab nasal de suíno foram inseridos junto as amostras
no dendrograma.
2.5 Multilocus sequence typing (MLST)
Dentre os coagulase positivos, alguns isolados foram aleatoriamente
selecionados (n=10) e submetidos à caracterização por MLST, realizado junto ao
8
Laboratório de Doenças Infecciosas e Epidemiologia Molecular (IDMEL) da
Universidade do Estado de Ohio (OSU), Estados Unidos.
Fragmentos especificos de 7 genes housekeeping (400-450pb) arcC, aroE,
glp, gmk, pta, tip e yqiL foram amplificados e sequenciadas. Perfis alélicos e
sequências genotípicas foram comparados com outros perfis genéticos disponíveis
em uma base de dados disponível em http://saureus.mlst.net.
3. Análise dos dados
O poder discriminatório do método foi calculado conforme descrito por
HUNTER E GASTON, (1998) pela equação abaixo:
Em que: D = Índice discriminatório, N = O número total de isolados , S = O
numero total de genótipos descritos e Nj = O número total de isolados pertencentes
ao genótipo j
4. Resultados e Discussão
O elevado poder discriminatório (valor D=0,99) indicou eficiência do método
REP-PCR na tipificação de Staphylococcus coagulase positivos em usinas de
beneficiamento de leite. A Figura 1 mostra o dendrograma gerado pelo método
UPGMA a partir de Staphylococcus coagulase positivos isolado em amostras de leite
de cabra cru e pasteurizado, equipamentos e mão de manipulador das usinas de
Monteiro, Sumé e Cabaceiras no Cariri Paraibano. Considerando o coeficiente de
similaridade de 70%, observaram-se cinco agrupamentos (clusters I a V). Os clusters
I, II, e III apresentaram isolados similares de diferentes pontos e diferentes usinas.
Em cada um dos clusters foi identificado pelo menos um isolado da mão de
manipulador com perfil genético similar a isolados de leite cru. O fato dos isolados
obtidos da mão dos manipuladores terem apresentado maior similaridade genética
com isolados de origem láctea do que os isolados de casos clínicos humanos
(cluster IV) indicam que os manipuladores podem atuar na contaminação cruzada de
Staphylococcus em usinas de leite caprino.
9
A análise desses clusters permite ainda identificar isolados similares obtidos
do leite cru e do tanque pós-pasteurização (isolados NS8 e P3S8, cluster II) ou
mesmo de leite cru e leite pasteurizado (isolados NS4 e PS9, cluster III e isolados
CPM04 e CCM04, cluster V). Apesar de não haver menção de níveis de
contaminação do leite caprino pasteurizado por Staphylococcus coagulase positivos
na legislação brasileira (IN 37, MAPA), a presença dessas bactérias é indesejada e
os resultados indicam a existência de falhas no processo de pasteurização e
problemas de recontaminação dos equipamentos, de natureza residual ou cruzada,
causada pelos manipuladores.
O
cluster
IV
foi
composto
exclusivamente
por
isolados
controle
(outgrouping), de infecções em humanos e um isolado de origem suína. Não foi
detectada qualquer indicação de relação clonal entre isolados clínicos humanos com
isolados do leite, dos manipuladores ou ambiente das usinas.
O cluster V foi formado por isolados de leite cru e pasteurizado apenas,
mesmo que originados de municípios distintos. Esses resultados são interessantes,
pois grupo apresentou-se bastante distante geneticamente de isolados das mesmas
usinas identificados nos clusters I, II e III.
De acordo com os resultados do multiloccus sequence typing (MLST), quatro
isolados de leite cru (NS9 e CC2a) e leite pasteurizado (PS09), identificados como
S. aureus, foram confirmados como ST133. Esse sequence typing está associado a
animais ungulados e ainda não foi descrito em casos de infeções em humanos. De
acordo com Smith et al. (2009), algumas linhagens de Staphylococcus aureus
associadas a ruminantes podem ter sua origem genética em divergências ocorridas
a partir de linhagens associadas a humanos, incluindo a linhagem ST 133 adaptadas
a animais ruminantes como bovinos, caprinos e ovinos.
Em relação aos isolados coagulase negativos (Figura 2), houve menor
similaridade genética entre os mesmos, ou seja, o dendograma apresentou um
número maior de genótipos distantes geneticamente. O poder discriminatório da
Rep-PCR para Staphylococcus coagulase negativos foi elevado (valor D= 0,99) e,
assim como ocorrido para S. coagulase positivos, pode ser utilizado com sucesso
em estudos epidemiologicos envolvendo isolados coagulase negativos.
Isso é esperado, uma vez que existe maior variabilidade fenotípica entre
isolados coagulase negativos. Muitos isolados apresentaram perfil genotípico único
10
utilizando-se coeficiente de similaridade de 70%. Foram identicados 13 clusters e
tendência de formação de agrupamentos por origem das amostras, ou seja, três
clusters apresentaram isolados de uma única localidade. Nesses clusters,
identificou-se isolados similares geneticamente oriundos de amostras diferentes, o
que sugere possíveis vias de contaminação microbiológica. Assim como ocorrido no
caso dos isolados coagulase positivos, similaridade genética foi observada entre
amostras de mão de manipulador e leite cru (isolados P6S2 e NS8, cluster III; P7S9
e CS22, cluster V), mão de manipulador e leite pasteurizado (P6M11 e PM11, cluster
IV), mão de manipulador e tanque de recepção de leite (P2M3 e P8M3 cluster VI).
Esses achados confirmam a possibilidade de circulação de Staphylococcus
coagulase negativos entre diferentes pontos no beneficiamento do leite de cabra.
Ressalta-se a importância do manipulador nos ciclos de contaminação por
Staphylococcus em usinas. Manipuladores são fontes em potencial de contaminação
de alimentos por terem as superfícies da pele, garganta e narinas colonizadas por
Staphylococcus aureus.
Ao contrário do que observado para Staphylococcus coagulase positivos,
ocorreu menor similaridade entre isolados de leite cru e leite pasteurizado. Nesse
sentido, a presença de Staphylococcus em leite pasteurizado parece estar
relacionada principalmente à contaminação residual dos equipamentos e à
contaminação cruzada pelo manipulador.
Os Staphylococcus coagulase negativos são microrganismos comuns no
leite caprino pois além de serem ubíquos e colonizarem o teto de cabras sadias
(KOOP ET AL. 2012a), são também os principais causadores de mastite nessa
espécie (KOOP ET AL. 2012b).
O consumo de leite de cabra contaminado por Staphylococcus pode
representar um risco para a saúde dos consumidores, pois muitos isolados tem a
capacidade de produzir enterotoxinas termoresistentes, leucocidinas, hemolisinas e
toxina da síndrome do choque tóxico (SPANU ET AL. 2013). Há uma carência de
estudos sobre a caracterização de Staphylococcus no leite caprino e em seu sistema
de produção, tornando difícil avaliar o real impacto em saúde pública da
contaminação do leite de cabra por esses microrganismos. Sabe-se, no entanto, que
Staphylococccus coagulase negativos isolados de leite caprino também são capazes
de produzir enterotoxinas (LYRA et al. 2013), justificando a necessidade de maiores
11
investigações sobre o tema. Os resultados apresentados nesse estudo sugerem que
a contaminação do leite caprino por S. aureus e espécies coagulase negativas pode
estar associadas a práticas higiênicas inadequadas ou pasteurização ineficiente.
12
100
90
80
70
60
50
REP-PCR
40
30
REP-PCR
I
72.7
47.2
II
81.8
61.8
90.2
79.4
96.0
77.2
58.6
94.2
88.3
34.5
84.9
72.9
91.7
70.5
90.0
III
56.3
82.4
AMOSTRA
ORIGEM
TIPO DE AMOSTRA
CM36b
Monteiro
leite cru
P6M3
Monteiro
swab de mão
Secreção de pele (Humano)
S. haemolyticus
NS8
Sumé
leite cru
P3S8
Sumé
tanque pulmão
P8S2
Sumé
swab de mão
CC1
cabaceiras
leite cru
CC2a
cabaceiras
leite cru
CC10
cabaceiras
leite cru
NS9
Sumé
leite cru
NS9
Sumé
leite cru
NM10
Monteiro
leite cru
NS8
Sumé
leite cru
NS4
Sumé
leite cru
PS9
Sumé
leite pasteurizado
NS4
Sumé
leite cru
P6M3
Monteiro
swab de mão
CCC03
cabaceiras
leite cru
CCC03
cabaceiras
leite cru
NM11
Monteiro
leite cru
ATTCC25923 ATCC 25923
66.6
85.7
Orofaringe (Humano)
S. auricularis
Lesão de pele (Humano)
S. aureus (b)
S. aureus (a)
Orofaringe (Humano)
S. saprophyticus
Nasal suíno
Staphylococcus spp.
PS03
Sumé
leite pasteurizado
PS03
Sumé
leite pasteurizado
PS03
Sumé
leite pasteurizado
NM12
Monteiro
leite cru
NM12
Monteiro
leite cru
NS03
Sumé
leite cru
NS03
Sumé
leite cru
NM11
Monteiro
leite cru
NM11
Monteiro
leite cru
CPM04
Monteiro
leite pasteurizado
CPM04
Monteiro
leite pasteurizado
CCM04
Monteiro
leite cru
NS03
Sumé
leite cru
CM30
Monteiro
leite cru
76.9
IV
73.5
66.7
29.1
ATCC 25923
Infecção nosocomial (Humano) S. aureus (c)
47.3
83.3
77.9
90.9
76.0
89.5
80.8
73.7
V
86.7
Figura 1. Dendrograma gerado a partir da análise de perfis moleculares obtidos por REP-PCR em
Staphylococcus coagulase positivos isolados de leite cru e pasteurizado, mão de manipulador e equipamento de
usinas de beneficiamento de leite de cabra em Monteiro, Sumé e Cabaceiras
13
100
90
80
70
60
REP-PCR
50
40
REP-PCR
88.9
I
83.3
66.7
AMOSTRA
ORIGEM
TIPO DE AMOSTRA
P3S10
Sumé
tanque de pulmão
P6S4
Sumé
leite pasteurizado
P3S10
Sumé
tanque pulmão
p6s4
Sumé
mão de manipulador
Infecção nosocomial (Humano)
S. aureus (c)
Orofaringe (Humano)
S. auricularis
S. aureus (a)
S. aureus (b)
NS8
Sumé
leite cru
P6S2
Sumé
swab de mão
NM3
Monteiro
leite cru
ATTCC25923
ATCC 25923
ATCC 25923
PM11
Monteiro
leite pasteurizado
P6M11
Monteiro
swab de mão
P6M11
Monteiro
swab de mão
PM11
Monteiro
leite pasteurizado
PM12
Monteiro
leite pasteurizado
P7S9
Sumé
swab de mão
P7S9
Sumé
swab de mão
CS22
Sumé
leite cru
NS2
Sumé
leite cru
P2M3
Monteiro
tanque de expansão
P8M3
Monteiro
swab de mão
CCC03
cabaceiras
leite cru
CPC03
cabaceiras
leite pasteurizado
CC8
cabaceiras
leite cru
NS9
Sumé
leite cru
Nasal suíno
Staphylococcus spp.
Monteiro
swab de mão
Orofaringe (Humano)
S. saprophyticus
PS4
Sumé
leite pasteurizado
CM29
Monteiro
leite cru
CC6
cabaceiras
leite cru
CCC02
cabaceiras
leite cru
CC7
cabaceiras
leite cru
P8S4
Sumé
leite pasteurizado
CM35
Monteiro
leite cru
CM36a
Monteiro
leite cru
CC2b
cabaceiras
leite cru
CPC03
cabaceiras
leite pasteurizado
P2M3
Monteiro
tanque de expansão
P2S9
Sumé
tanque de expansão
P2S9
Sumé
tanque de expansão
PM10
Monteiro
leite pasteurizado
PM10
Monteiro
leite pasteurizado
CPC02
cabaceiras
leite pasteurizado
CS23
Sumé
leite cru
NM3
Monteiro
leite cru
PS08
Sumé
leite pasteurizado
CCC02
cabaceiras
leite cru
CPC02
cabaceiras
leite pasteurizado
CS29
Monteiro
leite cru
Secreção de pele (Humano)
S. haemolyticus
57.5
85.7
76.9
II
73.5
91.7
87.1
III
79.8
70.2
66.1
55.5
IV
84.2
64.2
62.9
93.3
85.2
V
69.0
94.1
60.9
85.6
VI
88.9
46.4
75.3
VII
69.3
VIII
77.8
77.8
IX
73.2
62.3
58.2
X
83.3
67.0
42.7
90.9
XI
84.5
P8M3
56.2
85.7
83.3
XII
38.5
71.4
88.9
33.1
66.7
64.9
66.7
XIII
Figura 1. Dendrograma gerado a partir da análise de perfis moleculares obtidos por REP-PCR em
Staphylococcus coagulase negativo isolado de leite cru e pasteurizado, mão de manipulador e equipamento de
usinas de beneficiamento de leite de cabra em Monteiro, Sumé e Cabaceiras
14
5. Conclusões
A manipulação do leite e a contaminação residual em equipamentos são
importantes vias de contaminação do leite de cabra.
A genotipagem por Rep-PCR e a presença de Staphylococcus aureus ST 133
no leite de cabra cru e pasteurizado indicam que a contaminação do leite de cabra
por Staphylococcus spp.está associada primariamente a microrganismos de origem
de origem láctea caprina.
A presença de isolados geneticamente similares de leite cru e leite
pasteurizado pode indicar falhas no processo de pasteurização.
6. Referências bibliográficas
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persistence and in effect on somatic cell count and milk yield in dairy goats. Journal
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goat milk. Foodborne Pathogens and Disease, v. 10, n. 2, p. 126–130, 2013.
15
MØRK, T. et al. Comparison of Staphylococcus aureus genotypes recovered from
cases of bovine, ovine, and caprine mastitis. Journal of Clinical Microbiology, v.
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<http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.ht
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SMYTH, D. S. et al. Molecular genetic typing reveals further insights into the diversity
of animal-associated Staphylococcus aureus. Journal of Medical Microbiology, v.
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SPANU et al. Population structure of Staphylococcus aureus isolated from bulk tank
goat’s milk. Food Pathogens and Disease, v. 10, n. 4, p. 310-315, 2013.
SZALUŚ-JORDANOW, O. et al. PFGE and AFLP genotyping of Staphylococcus
aureus subsp. anaerobius isolated from goats with Morel’s disease. Archives of
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n. 2, p. 342–349, 1999.
VANDENESCH, F. et al. Identification and ribotypes of Staphylococcus caprae
isolates isolated as human pathogens and from goat milk. Journal of Clinical
16
Capitulo II
Staphylococcus spp. multiresistentes isolados de queijo caprino
Staphylococcus spp. multiresistentes isolados de queijo de leite de cabra
RESUMO
A emergencia de patógenos resistentes a antimicrobianos em alimentos tem
despertado interesse da comunidade científica internacional, pois as causas desse
fenômeno ainda são desconhecidas. O objetivo desse estudo foi avaliar a
similaridade genética e identificar a capacidade de produção de biofime e
enterotoxinas em Staphylococcus spp. isolados de queijo coalho produzido com leite
de cabra cru e pasteurizado em diferentes queijarias nos estados do Ceará, Paraíba
e Rio Grande do Norte. A resistência antimicrobiana pelo de método Kirby-Bauer
identificou 43 fenótipos de resistência distribuídos entre Staphylococcus coagulase
positiva (12) e Staphylococcus coagulase negativos (65) isolados de queijo fabricado
com leite de cabra. Os resultados demonstraram níveis elevados de resistência
antimicrobiana, principalmente a β- lactâmicos, em Staphylococcus isolados de
queijo coalho fabricados a partir de leite de cabra, cru e pasteurizado, em queijarias
do Rio Grande do Norte, Ceará e Paraíba. Não foi identificado MRSA dentre os
isolados e a freqência de genes enterotoxigênicos foi bastante baixa, sendo
identificados apenas os genes seg e sei em Staphylococcus coagulase positivo. Os
isolados apresentaram baixo potencial de produção de biofilme quando avaliados
por três métodos distintos. A elevada similaridade genética e de perfil de resistência
observadas entre isolados de áreas geográficas diferentes pode indicar a existência
de linhagens associadas ao leite de origem caprina. Dessa forma, a elevada
resistência a antimicrobianos observada no Estudo sugere a necessidade de
investigação de fatores associados a produção do leite.
Palavras-chave: antimicrobiano, fingerprinting, qualidade de leite e segurança
alimentar
18
ABSTRACT
The emergence of antimicrobial-resistant pathogens in foods has aroused the
interest of the international scientific community, because the causes of this
phenomenon are still unknown. The aim of this study was to evaluate the genetic
similarity and identify the capacity of biofime e enterotoxins in Staphylococcus spp.
isolated from curd cheese produced with raw goat milk and pasteurized at different
dairies in the states of Ceará, Paraíba and Rio Grande do Norte. Antimicrobial
resistance by Kirby - Bauer method identified 43 resistance phenotypes distributed
among
coagulase-positive
staphylococci
(12)
and
coagulase-negative
Staphylococcus (65) isolated from cheese made from goat milk. The results showed
high levels of antimicrobial resistance , especially β - lactam antibiotics in
Staphylococcus aureus isolates from curd cheese made from goat milk, raw and
pasteurized dairy products in the Rio Grande do Norte, Ceará and Paraíba. MRSA
was not identified among the isolates and the frequency of enterotoxigenic genes
was very low, being only identified genes sec and sei know in Staphylococcus
coagulase positive. Isolates showed low potential for biofilm production when
assessed by three different methods. The high genetic similarity and resistance
profile observed among isolates from different geographical areas may indicate the
existence of strains associated with caprine milk. Thus, the high antimicrobial
resistance observed in the study suggests the need for research on factors
associated with milk production
Keywords: antimicrobial, fingerprinting, milk quality e food safety
19
1. Introdução
A emergência de bactérias resistentes a antimicrobianos em sistemas de
produção de alimentos tem gerado grande preocupação, mas pouco se conhece
sobre o perfil de resistência antimicrobiana em Staphylococcus presentes em
produtos lácteos. Staphylococcus aureus estão entre os principais microrganismos
responsáveis por infecções causadas pelo consumo de alimentos, principalmente
leite e seus derivados. O grande temor é de que o consumo de alimentos contendo
patógenos resistentes possa limitar opções de tratamento em caso de infecções
humanas ou mesmo que ocorra disseminação de genes de resistência entre
microrganismos de diferentes gêneros. Recentemente,
o envolvimento
de
Staphylococcus spp. resistentes à meticilina em alimentos em surtos de doenças de
origem alimentar (CRAGO et al 2012) demonstra a necessidade de caracterização
de Staphylococcus em sistemas de produção de alimentos.
A importância dos Staphylococcus está associada à capacidade de alguns
isolados produzirem enterotoxinas (LYRA et al. 2013; AKINEDEN et al. 2008;
MORANDI et al. 2007; CREMOSI et al. 2006). Enterotoxinas estafilocócicas
produzidas por Staphylococcus aureus são toxinas com atividade superantigênica
apontadas como a causa mais comum de intoxicação alimentar no mundo
(ARGUDIN et al. 2010; KÉROUANTON et al. 2007; CHENG CHIANG et al. 2008).
Embora a produção de genes enterotoxigenicos em Staphylococcus spp. seja
determinante para intoxicação estafilocócia de origem alimentar, outros fatores de
patogenicidade podem ter um papel chave e contribuírem decisivamente na
ocorrência de Staphylococcus spp. em derivados lácteos e no risco desses
microrganismos causarem agravo à saúde
Nesse contexto, a produção de biofilme tem sido associada à capacidade de
manutenção de Staphylococcus no ambiente de produção e resistência a
desinfetantes e agentes antimicrobianos (STEWART E COSTERTON, 2001;
SIMÕES et al. 2010).
O biofilme é uma estrutura formada em superfícies de
equipamentos pela produção de diversas proteínas da classe das adesinas,
incluindo a adesina polissacaridica intercelular (PIA), codificada pelo operon ica.
Uma questão chave, que necessita ser melhor compreendida é se a resistência de
Staphylococcus em biofilme deve-se primariamente a menor penetração da droga no
20
biofilme, em função de uma fator de proteção mecânico, ou se há maior resistência
de Staphylococcus associados aos biofilmes.
Há uma carência de informações sobre fatores de patogenicidade
associados a Staphylococcus resistentes a antimicrobianos em leite e derivados
lácteos de origem caprina. Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar a
similaridade genética e identificar a capacidade de produção de biofime e e
enterotoxinas em Staphylococcus spp. isolados de queijo coalho produzido com
leite de cabra cru e pasteurizado em diferentes queijarias nos estados do Ceará,
Paraíba e Rio Grande do Norte
Staphylococcus spp. (n =81) obtidos a partir de 43 queijos coalho fabricados
com leite de cabra cru e pasteurizados foram selecionados no banco de
microrganismos do laboratório de Avaliação de Produtos de Origem Animal
CCA/UFPB para avaliação do perfil de resistência fenotípica antimicrobiana.
Os queijos fabricados com leite cru (28) e pasteurizados (15) foram obtidos
em três, uma e cinco queijarias nos estados do Ceará, Paraíba e Rio grande do
Norte, respectivamente. Entre todas as queijarias, uma de cada estado produziu
queijos fabricados com leite pasteurizado.
As amostras cedidas por laticínios foram obtidas embaladas a vácuo
enquanto que as amostras de queijos fabricados com leite cru foram doadas pelos
fabricantes, envolvida em papel alumínio ou plástico filme.
Inicialmente, diluições seriadas do queijo foram preparadas em água
peptonada a 0,1% a partir de uma diluição inicial composta pela mistura de uma
alíquota de 25 gramas da amostra em 225 mL de água peptonada a 1% e
homogeneizada em Stomacher (Marconi, Brasil) durante 60 segundos.
O isolamento de Staphylococcus spp. foi realizado em ágar Baird Parker
(Himedia, Índia) suplementado com telurito e gema de ovo, de acordo com as
recomendações de BENNETT E LANCETTE, (2001). A partir de cada diluição uma
aliquota de 0,01 mL foi espalhada na superfície do ágar e as placas incubadas por
48 horas a 37ºC em estufa bacteriológica.
21
As colônias com coloração negra ou cinza, bordas lisas, providas ou não de
halo foram semeadas em ágar triptona de soja suplementado com 0,06% de extrato
de levedura (TSAYE, Himedia, Índia) e posteriormente a incubação durante 18-24
horas a 37ºC. Colônias com características de Staphylococcus spp. foram
submetidas aos testes de gram, catalase e coagulase.
O teste de sensibilidade in vitro a antimicrobianos foi realizado pela técnica
de difusão em disco descrita por Kirby-Bauer. As colônias foram semeadas em ágar
triptona de soja com extrato de levedura (TSAYE) e incubadas a 37ºC por 24 horas
para a obtenção de colônias isoladas.
A quantidade de células inoculadas no ágar Mueller Hinton foi ajustada com
a diluição de 2 a 3 colônias em 2 mL de solução salina a 0,85% e a turbidez ajustada
para a concentração de 1,5 x 108 UFC/mL que corresponde a 0,5 na escala de Mc
Farland.
A suspensão bacteriana foi espalhada em todas as extensões na superfície
do ágar Mueller-Hinton com um swab estéril. Para o antibiograma foram utilizados
antimicrobianos (CECON, Brasil) recomendados pelo Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2012) para testes de susceptibilidade antimicrobiana em
Staphylococcus spp., representados pela Oxacilina (1µg), Penicilina G (10 UI),
Sulfazotrim (25 µg), Tetraciclina (30 µg), Norfloxacina (10 µg), Gentamicina (10 µg),
Eritromicina (15 µg), Clorofenicol (30 µg), Amicacina (30 µg), Ampicilina (10 µg),
Cefalotina (30 µg) e Clindamicina (2 µg).
A cepa ATTCC (25923) de Staphylococcus aureus foi utilizada como
controle positivo.
Os discos de antibióticos foram retirados para uso trinta minutos antes do
uso e distribuídos nas placas 5 minutos após o inoculo. As zonas de inibição em
torno de cada disco foram aferidas com paquímetro digital após 18-24 horas de
incubação a 37ºC.
Os dados de resistência foram interpretados de acordo com
as
recomendações do fabricante dos discos de antibiograma e CLSI, (2012).
De acordo com o resultado do antibiograma, resultado do teste de coagulase
e a origem do isolado, 32 Staphylococcus spp. foram selecionados para a detecção
22
da produção de biofilme em ágar vermelho congo, aderência em microplacas de
poliestireno, pesquisa dos gene ica-D, mec-A, fem-A, blaZ, sea, seb, sec, sed, see,
seg, sei e seh. Os mesmos isolados foram submetidos a REP-PCR com o primer
RW3A.
Os isolados foram semeados na superfície do ágar vermelho congo (1L de
caldo BHI, 0,8g de corante vermelho congo e 36 gramas de sacarose) pela técnica
de esgotamento em estria e incubados a 35ºC por 24horas, de acordo com a
metodologia descrita por FREEMAN et al. (1989).
A cepa de Staphylococcus aureus 25923 foi utilizada como controle positivo e
a leitura das placas realizada após 24 horas de incubação em estufa bacteriológica.
As características das colônias foram avaliadas ainda, após 48 e 72 horas de
incubação a temperatura ambiente.
Uma escala de três cores foi adotada para a interpretação da coloração das
colônias em ágar vermelho congo: vermelho, bordo e preto. As colônias de
coloração negras e rugosas produzidas por Staphylococcus spp. foram consideradas
como produtores de biofilme e como não produtoras as colônias avermelhadas.
O estudo de biofilme em microplaca foi realizado de acordo com
CHRESTENSEN et al. (1985). Staphylococcus spp. foi cultivado no ágar triptona de
soja suplementado com 0,06% de extrato de levedura (TSAYE) e incubados a 37ºC
por 18-24h. Em seguida, uma suspensão bacteriana foi preparada em solução salina
a 0.85% a partir de 2 a 3 colônias isoladas e o ajuste da quantidade de células
realizado em aparelho Turbidimetro para a concentração de 0.5 na escala de
McFarland (1,5 x 108 UFC/mL).
Um volume de 20µL de cada suspensão bacteriana foi distribuído em seis
poços de uma microplaca de 96 poços de poliestireno, previamente preenchida com
180 µL de caldo triptona de soja suplementado com 1% de glicose. Após incubação
por 18h a 37ºC, as células não aderentes foram removidas cuidadosamente dos
23
poços e a placa submetida a três lavagens sucessivas com 200 µL de solução
salina.
A fixação da massa aderente foi realizada com 150 µL de metanol em
temperatura ambiente por 30 minutos. Após o descarte do metanol, as placas foram
invertidas sobre papel aderente por aproximadamente 30 minutos e submetidos à
coloração com 150 µL de cristal violeta a 1% por 1 minuto. Em seguida, as placas
foram lavadas em água destilada e secas a temperatura ambiente por 30 minutos.
A absorbância foi determinada a 450nm em leitor de placas (Bio-rad, Brasil).
Poços contendo apenas caldo TSB com glicose foram utilizados como controle
negativo do teste. O teste foi repetido nas mesmas condições em outro espaço de
tempo não relacionado.
As colônias foram consideradas como produtoras de biofilme no teste de
microplacas de acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo cálculo da ODC
(média do caldo não inoculado + 3x o desvio padrão do controle positivo – ATTCC
25923) e da OD (média da massa produzida por cada isolado – ODC), ambos os
valores obtidos conforme (Stepanovic et al. 2007). Desta forma, quando a OD 450 ≤
0,05= não produtor; (0,05˂OD450≤0,1) = fraco produtor; (0,1˂OD450≤0,2)= produtor
moderado; (0,2˂OD450)=forte produtor.
O DNA dos isolados de Staphylococcus spp. foi extraído pelo método de
Fenol: Clorofórmio: Álcool isoamílico, descrito por FRITSCH et al. (1989).
Staphylococcus spp. semeados em caldo triptona de soja suplementado com 0,06%
de extrato de levedura, incubados sob agitação por 18-24 horas foram utilizados na
fase inicial da extração.
Uma alíquota de 1,5 mL de caldo foi centrifugada por 15 minutos, a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e a massa de células bacterianas no fundo do tubo foi
diluída em 500 µL tampão TE 10:1, 10 µL de lisozima (Research Organics, U. S. A)
na concentração de 10mg/ml e 10 µL de proteinase K a 5mg/ml. A solução foi
submetida à temperatura de 60ºC em agitação mecânica durante um período
overnight.
Em seguida, 100 µL do Tampão STE (2,5% de SDS; 10mM Tris-HcL, pH
8,0; 0,25M de EDTA) foram adicionados ao tampão de lise. A solução foi novamente
24
incubada por 15 minutos nas condições anteriormente relatadas. Decorrido o tempo,
a solução foi incubada a temperatura ambiente por 5 minutos e depois por 5 minutos
no gelo.
A reação foi neutralizada com 130 µL de acetato de amônio a 7,5M e
mantida no gelo por 15 minutos. Após este período as amostras foram centrifugadas
por 8 minutos e aproximadamente 400 µL do sobrenadante foi transferido para outro
tubo.
O sobrenadante foi misturado com igual volume de fenol:clorofórmio:álcool
isoamílico 25:24:1 (LGC biotecnologia, Brasil) e centrifugado por 5 minutos.
Aproximadamente 400 µL de sobrenadante contendo o DNA foram transferidos para
um novo microtubo.
O DNA foi precipitado com 420 µL de etanol absoluto a -20ºC por 24 horas.
A solução foi centrifugada, o sobrenadante foi descartado e os tubos invertidos
sobre uma folha de papel toalha por 30 minutos. Após este procedimento, o DNA foi
recuperado em 30 µL de água deionizada autoclavada.
µL.
A presença do gene ica-D foi avaliada com modificações conforme
ARCIOLA et al. (2001) e SZWEDA et al. (2012). A reação foi preparada por uma
mistura de tampão 1x concentrado, 4mM de MgCl2, 1 U de Taq polimerase (Life, E.
U. A. ), 0,2mM de DNTPs (Life, E. U. A.), 0,4µM de cada primer (Life, E. U. A.) e
100 ng de DNA em um volume final de 25 µL.
A amplificação foi realizada em termociclador TC-3000 (TECHNE, Reino
Unido) nas condições de desnaturação inicial de 94ºC por 4 minutos, seguidos de 30
ciclos com anelamento inicial a 94ºC/4 minutos, 56ºC/30 segundos e 72ºC/1minuto.
Uma extensão final foi realizada a 72ºC por 10 minutos.
2.6 Pesquisa de genes enterotoxigênicos.
As reações de PCR foram realizadas para pesquisa dos genes
enterotoxigênicos sea, seb, sec, sed, see, seg, seh e sei, com os primers
25
recomendados por JOHNSON et al. (1991) e BLAIOTA et al. (2004) com
modificações nas condições de reação.
Para cada conjunto de reação, uma cepa padrão de Staphylococcus aureus
foi utilizada como controle positivo ou negativo: ATCC 13565 (sea), ATCC
14458(seb), ATCC 19095(sec), ATCC 23235 (sed), ATCC 27664 (see), ATCC 19095
(seg) e ATCC 19095 (seh e sei).
Os amplificados foram obtidos em reações de PCR com volume final de
25µL e cada reação de PCR foi preparada por uma mistura dos seguintes reagentes:
tampão 1X concentrado, 2 mM de MgCl2, 200µM de cada dNTPs, 1U de Taq
polimerase, 0.4µM de cada Primer e 100ng de DNA molde.
A amplificação foi realizada a partir de um ciclo inicial de 95°C por 3 minutos
seguidos por 30 ciclos com etapas de desnaturação a 94°C/ 60 segundos,
anelamento a 50°C/60 segundos e uma extensão a 72°C/ 2 minutos. Uma extensão
final foi realizada a 72ºC por 5 minutos.
As
mesmas
condições
de
reação
e
amplificação
dos
genes
enterotoxigênicos foram utilizadas para a pesquisa do gene fem A e o primer
escolhido conforme MEHROTRA et al. (2000). A escolha do primer para pesquisa do
gene mec A foi realizada conforme JONAS et al. (1999) e os amplificados obtidos
conforme ADALETI et al. (2007), com modificações.
A cepa padrão utilizada como controle positiva foi a Staphylococcus aureus
ATTCC 25923.
O termociclador obedeceu a uma programação de desnaturação inicial de
94ºC por 5 minutos seguidos por 30 ciclos com desnaturação de 94ºC/30 segundos,
53ºC/30 segundos e 72ºC/ 30 segundos. Uma extensão final de 72ºC por 10 minutos
finalizou a amplificação.
A escolha do primer para a pesquisa do gene blaz foi realizada conforme
HANAA et al. (2011). O aparelho obedeceu a uma programação de desnaturação
inicial de 94ºC por 4 minutos seguidos por 35 ciclos com desnaturação de 94ºC/60
segundos, 55ºC/60 segundos e 72ºC/60 segundos. Uma extensão final de 72ºC por
10 minutos finalizou a amplificação.
26
2.8 Genotipagem
Cada reação de PCR preparada com uma mistura de tampão 1x
concentrado, 3,5 mM de MgCl2, 1µM de primer RW3A, 200 µM de DNTP, 1U de taq
polimerase e 100 ng de DNA em um volume final de 25µL.
Staphylococcus aureus ATTCC 25923 foi utilizada como controle positiva
das reações.
O primer Rw3A e as condições de PCR foram utilizados conforme VAN DER
ZEE et al. (1999), com modificações. A amplificação foi realizada em termociclador
com uma desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos seguidos por 30 ciclos com
94ºC/1 minuto, 50ºC/1 minuto e 72ºC/2 minutos. Uma extensão final foi realizada a
Para todos os géis gerados nos estudos moleculares, as condições de
eletroforese e coloração foram às mesmas.
A eletroforese foi realizada a 70 V em tampão TAE 1x concentrado (LGCBiotecnologia, Brasil). Um volume de 10 µL de cada amplificado foi aplicado nos
poços do gel.
Antes da aplicação, o amplificado foi misturado a 2 µL do tampão de
O tamanho dos fragmentos observados no DNA de isolados de
Staphylococcus spp. foi conferido pela aplicação de marcadores moleculares de
100pb e 1kb (Amresco, Canadá) nos géis de agarose a 1,5%.
utilizando se produto comercial (Gel red, Biotium) 3x concentrado, de acordo com as
A presença e ausência de bandas foram utilizadas como critério para avaliar
a similaridade entre Staphylococcus spp. e gerar uma matriz de similaridade pelo
Software BioNumerics versão 7.1 da Applied Maths. O coeficiente de similaridade de
Dice a 2% foi utilizado para gerar a matriz de similaridade e o agrupamento obtido
pelo método de UPGMA (Unweighted Pair Group Method, Arithmetic Mean).
Um grupo controle de perfis genotípicos Staphylococcus spp. não
relacionados com os isolados do estudo foram inseridos junto as amostras no
dendrograma.
27
D = Índice discriminatório
N = O número total de isolados na populacional bacteriana
S = O numero total de genótipos observados
Nj = O número total de isolados dentro do genótipo j
A concordância entre os métodos utilizados para avaliar a produção de
biofilme foi cálculado pelo índice Kappa. O índice foi interpretado de acordo com
Altman (1991) como pobre (<0,2), razoável (0,21 a 0,40), moderado (0,41 a 0,60),
bom (0,61 a 0,80) e muito bom (0,81 a 1).
Os dados de resistência foram avaliados por estatística não-paramétrica
pelo teste do qui-quadrado a 0,05% de significância pelo programa estatístico SAS
versão 9.3.
As frequências de resistência de Staphylococcus aos antimicrobianos
avaliados no presente estudo são mostradas na Tabela 1. As maiores frequências
de resistência foram observadas em relação à penicilina 66 (81,5%), ampicilina 60
(74%), oxacilina 51 (63%), amicacina 36 (44,4 %), clindamicina 26 (32,1%),
cefalotina 26 (32,1%), gentamicina 25 (30,8%), norfloxacina 17 (21%), eritromicina
14 (17,3 %), tetraciclina 9 (11,1%), sulfazotrim 2 (2,5%) e cloranfenicol 1 (1,2%).
28
Tabela 1. Resistência a antimicrobianos em Staphylococcus (n=81) isolado de leite
cabra produzido com leite pasteurizado ou cru nos Estados do Ceará, Paraíba e Rio
Grande do Norte.
Queijo Elaborado com Leite
pasteurizado
Queijo Elaborado com Leite cru
Antimicrobiano
Penicilina
Ampicilina
Oxacilina
Amicacina
Clindamicina
Cefalotina
Gentamicina
Norfloxacina
Eritromicina
Tetraciclina
Sulfazotrim
Cloranfenicol
Resistência
absoluta
Resistência
Intermediária
Resistência
absoluta
Resistência
Intermediária
41 (83,6%)
40 (81,6%)
31 (63,2%)
23 (47%)
20 (40,8%)
16 (32,6%)
17 (34,6%)
13 (26, 5%)
10 (20%)
5 (10,2%)
0
1 (2%)
0
0
1 (2%)
4 (8,2%)
16 (32,7%)
8 (16,3%)
5 (10,2%)
16 (32,7%)
18 (36,7%)
4 (8,1%)
2 (4%)
5 (10,2%)
25 (78,1%)
20 (62,5%)
20 (62,5%)
13 (40,6%)
6 (18,7%)
10 (31,3%)
8 (25%)
4 (12,%)
4 (12,5%)
4 (12,5%)
2 (6,3%)
0
0
0
0
5 (15,6%)
8 (25%)
3 (9,4%)
9 (28,1%)
8 (25%)
17 (53,1%)
3(9,4%)
0
2 (6,3%)
A Tabela 2 mostra a distribuição dos fenótipos de resistência de
Staphylococcus spp. isolados de queijos de cabra produzidos com leite cru ou
pasteurizado nos Estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Ceará no Nordeste do
Brasil. Um total de 43 fenótipos distintos foram observados.
Os resultados do
antibiograma pelo método de disco-difusão mostrou que 100% (49) e 90,6% (30) dos
isolados de leite cru e pasteurizado foram resistentes a antimicrobianos,
respectivamente. Mutiresistência, ou seja, resistência a três ou mais classes de
drogas, foi identificada em 53 (64,2%) isolados, o que pode ter ocorrido inicialmente
devido a hiperprodução de β-lactamases associadas a outros mecanismos de
resistência, diferentes do gene blaZ . A combinação de mecanismos de resistência
diferentes
também
explicaria
uma
associação
positiva
ocorrida
entre
multirresistência e a baixa frequência do gene blaZ entre os isolados (P>0,05).
Os genes blaZ e fem A foram observados em apenas 3 (9,4%) e 2 (6,3 %)
isolados, respectivamente. Nenhum isolado foi positivo para gene mec-A.
29
Tabela 2. Perfil de resistência a antimicrobianos em Staphylococcus spp. (n=81) isolados de queijos fabricados com leite de cabra
nos Estados do Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte
Staphylococcus coagulase positiva
(SCP = 15)
Staphylococcus coagulase negativa
(SCN= 66)
Perfil fenotípico
Perfil fenotípico
Origem do
isolado
n.
Leite cru
Leite
pasteurizado
TOTAL
49
R
49
(100%)
Até duas classes
0
Acima de duas classes
AmiAmpCliGenOxaPen
AmiAmpCflCliGenOxaPen (2)
Até duas classes
Eri
Nor
Cli (3)
Pen (2)
AmpPen (6)
AmpNor
PenNor
32
30
(90,6%)
Oxa
Pen (2)
AmpPen
AmpPenTet
AmiAmpCflCliGenOxaPentetNor
AmiAmpCflEriGenOxaPen
AmiCflCliGenOxaPen
AmiAmpCflOxaPen
AmiCliGenOxaPen
AmiCliCloEriTet
Amp (2)
AmpPen (2)
OxaPen
AmpOxaPen
81
75
4
8
11
AmiAmpCflCliGenOxaPenTet (2)
AmiAmpCflCloGenOxaPenNor
AmiAmpCflCliGenOxaPenNor
AmiAmpCflGenOxaPenNor (2)
AmiAmpCflCliGenOxaPen
AmiAmpCliGenOxaPenNor
AmiAmpCliEriOxaPenNor
AmiAmpCliGenOxaPen (6)
AmiAmpCflEriOxaPen (2)
AmpEriOxaPenNor (3)
AmpCflCliOxaPen
AmpCflEriOxaPen
AmiAmpCliOxaPen
AmpCliEriOxaPen
AmpEriPenTetNor
AmiAmpCflOxaPen (2)
AmiAmpCflOxaPen
AmpCliOxaPen
AmpCflOxaPen
AmpCliTet
GenOxaTet
AmiAmpOxaPen
AmiOxaPenNor (2)
AmpCflOxaPen (3)
AmpCflEriOxa
AmiAmpCflCliEriOxaPen
AmiAmpCliGenOxaPenTet
AmiAmpCflOxaPenSut
AmiAmpGenOxaPen
30
30
Com base no perfil de resistência apresentado pelos 81 isolados analisados,
32 foram utilizados para avaliação de produção fenotípica de biofilme e investigação
de genes associados à resistência (blaZ, fem A, mec A), produção de biofilme (icaD) e enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seh, sei e seg). Dos 32 isolados
avaliados, 5 (15,6%) foram positivos para o teste MtP. Dos isolados positivos para
MtP, apenas 1 (3,1%) apresentou o gene ica-D e 1 (3,1%) foi positivo para o método
ACR. Dos 10 isolados positivos pelo método CRA, apenas um foi positivo para o
gene ica-D. Esses resultados explicam o fato da concordância entre os métodos MtP
e PCR-icaD ter sido considerada pobre (K=0,2) e indicam que o método CRA é
bastante limitado na identificação de produção de biofilme em Staphylococcus spp.
(K=0,07). O biofilme é uma estrutura complexa, composta de polissacarídeos e
proteínas, cuja formação envolve a participação de diversos genes que induzem a
formação de biofilme a partir de condições ambientais favoráveis (RODE et al.
2007). Os genes do operon ica estão relacionados à produção de um polissacarídeo
envolvido na adesão de células bacterianas as superfícies (GOTZ, 2002). A baixa
concordância entre a presença de ica-D e a produção de biofilme em microplaca
sugere a existência de outros mecanismos independentes do operon ica. De fato, a
produção de biofilme pode ser afetada pela disponibilidade de nutrientes
(MORETRO et al. 2003) ou ainda pela atividade de genes reguladores da atividade
dos genes do ica-operon (O’GARA, 2007). De acordo com SCHLEGELAVÁ et al.
(2008), Staphylococcus aureus ica-operon negativo podem produzir biofilme por
mecanismos ica-independentes.
Dentre os 32 isolados avaliados, apenas um 1 (3,1%) foi positivo para os
genes seg e sei. São escassas as informações sobre perfil enterotoxigênico de
Staphylococcus spp. em queijo de leite caprino. Ressalta-se que a baixa frequencia
observada pode estar associada à predominância de Staphylococcus coagulase
negativos, pois alguns estudos indicam que a frequência de genes enterotoxigênicos
é menor nas espécies coagulase negativas do que em Staphylococcus coagulase
positivos e que a competição com outras bactérias no queijo possam suprimir o
crescimento de Staphylococcus spp. enterotoxigenicos (SCHELIN et al. 2011). O
isolado positivo identificado nesse estudo, com presença simultânea dos genes seg
e sei, foi também positivo ao teste da coagulase e para o gene ica-D, além de
demonstrar forte aderência em microplaca. Apesar de ter sido detectada associação
31
positiva (p˂0,05) entre a presença de genes enterotoxigênicos seg e sei e produção
de biofilme pelos métodos MtP e ica-D, a baixa ocorrência de Staphylococcus
coagulase positivos na investigação limita a discussão desses achados, uma vez
que a associação significativa pode ter ocorrido apenas em função do isolado ser
coagulase positivo.
A importância de Staphylococcus spp. isolados em alimentos para a saúde
pública está relacionada ao fato de que algumas espécies produzem fatores de
virulência como o biofilme que pode proteger as células bacterianas da ação de
antibióticos, proteger o patógeno de células do sistema de defesa do organismo ou
facilitar a permanecia do microrganismos em ambientes (YAO et al. 2005), sobretudo
em ambientes de produção e processamento de alimentos. No presente estudo, no
entanto,um número reduzido de isolados resistentes a antimicrobianos apresentou
genes enterotoxigênicos ou capacidade de produção de biofilme.
A Figura 1 apresenta um dendrograma gerado a partir da genotipagem por
RepPCR de Staphylococcus spp. (n=32) isolados de queijo coalho fabricado com
leite cru e pasteurizado em queijarias da Paraíba (1), do Ceará (3) e Rio Grande do
Norte (4). Um total de 30 genótipos foram identificados e o método apresentou poder
discriminatório elevado (valor D=0,97). O método Rep-PCR utilizando os primers
RW3A demontrou ser eficiente na discriminação de Staphylococcus de origem
alimentar. Quatro agrupamentos principais (clusters) foram obtidos considerando
coeficiente de similaridade total.
A análise dos genótipos produzidos indica não ter havido agrupamento por
local (queijaria) ou mesmo região (Estado de origem das amostras). Por outro lado,
houve agrupamento de isolados com perfiis de resistência similares. Assim, os
isolados multiresistentes foram agrupados nos clusters B e C, indepententemente da
queijaria ou Estado de origem.
Um isolado de queijo (ST 1425, cluster B) apresentou similaridade elevada
com um isolado de infecção nosocomial em humanos (S. aureus C), do mesmo
Estado. Esses resultados podem indicar a possibilidade de contaminação do queijo
por Staphylococcus patogênicos e reforçam a necessidade de investigação dos
perigos associados à contaminação microbiológica dos produtos lácteos de origem
caprina. De maneira geral, no entanto, os isolados de queijo não apresentaram
32
similaridade genética com Staphylococcus isolados de infecções em humanos, os
quais foram agrupados nos clusters A e B.
Staphylococcus coagulase negativa do cluster C apresentaram o mesmo
perfil molecular e foram isolado em queijos fabricados com leite cru e pasteurizado,
em queijarias do Ceará e Rio Grande do Norte.
O cluster D foi composto por isolados apresentando perfil de resistência a
um número menor de drogas quando comparado a outros clusters.
A presença isolados apresentando perfil genético e de resistência
antimicrobiana similares, originados de diferentes queijarias de três Estados
diferentes da região Nordeste, indicam a possibilidade existência de linhagens de
Staphylococcus adaptados à espécie caprina e os achados de resistência
antimicrobiana ligados a fatores associados aos sistemas de produção de leite.
33
85.7
73.3
A
55.0
43.7
87.5
68.6
64.8
80.0
63.8
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
REP-PCR
40
35
REP-PCR
Identificação
leite para fabricação
coagulase +
Lesão de pele (humano)
coagulase +
Nasal suíno
coagulase (-)
leite cru
coagulase (-)
leite cru
S. haemolyticus
coagulase +
Secreção de pele (humano)
S. aureus
S. aureus (a)
coagulase +
S. saprophytiucs
S. saprophyticus
coagulse +
Orofaringe (humano)
St. 1424
PB
Coagulase (+)
St. 1425
PB
Coagulase (+)
S. aureus (C)
S. aureus (c)
coagulase +
Infecção nosocomial (huma.
Key
Estado
S. aureus (B)
S. aureus (b)
genes
Staphylococcus spp.
Staphylococcus spp.
St. 0901
RN
Blaz
St. 0906
RN
Blaz
S. haemolyticus
IcaDBlazFem
ATCC 25923
75.0
94.7
56.9
87.5
79.9
90.9
76.4
30.6
64.1
49.8
B
88.9
85.3
perfil antimicrobiano
queijaria
1
AmpPen
2
leite pasteurizado
AmpPen
1
leite pasteurizado
AmiAmpCflEriGenOxaPen
1
ATCC 25923
St. 0928
RN
fem
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCliGenOxaPen
3
St. 0914
RN
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCliGenOxaPen
2
St. 0919
RN
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCliGenOxaPen
2
St. 0909
RN
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCliGenOxaPen
2
St. 1427
PB
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmiAmpCliGenOxaPen
1
St. 1029
CE
Coagulase (+)
leite pasteurizado
AmiAmpCflCliGenOxaPen.
1
St. 1042
CE
Coagulase (+)
leite cru
AmiAmpCliCflOxaPen
2
St. 1421
PB
Coagulase (+)
leite pasteurizado
AmiCflCliGenOxaPen
1
St. 1028
CE
Coagulase (+)
leite pasteurizado
St. 1032
CE
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmiAmpOxaPen
1
St. 1037
CE
Coagulase (+)
leite pasteurizado
AmiAmpCflOxaPen
1
St. 1041
CE
Coagulase (+)
leite cru
AmiAmpCliCflOxaPen
2
St. 0925
RN
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCflOxaPen
3
St. 1030
CE
Coagulase (+)
leite pasteurizado
Oxa
1
St. 1044
CE
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCflEriOxaPen
3
St. 1046
CE
coagulase (-)
leite cru
AmpCflOxaPen
3
St. 1048
CE
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCflEriOxaPen
3
St. 1050
CE
coagulase (-)
leite cru
AmpCflEriOxaPen
3
St. 1054
RN
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmpCflEriOxaPen
6
St. 1056
RN
coagulase (-)
leite pasteurizado
6
St. 1058
RN
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmpOxaPen
6
St. 0951
PB
coagulase (-)
leite pasteurizado
1
St. 0903
RN
coagulase (-)
leite cru
AmiAmpCflOxaPenNor
1
S. auricularis
S. auricularis
coagulase +
Orofaringe (humano)
St. 1060
RN
coagulase (-)
leite pasteurizado
Amp
6
St. 1062
RN
coagulase (-)
leite pasteurizado
OxaPen
6
St. 0931
RN
coagulase (-)
leite cru
St. 1039
CE
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmiAmpCflOxaPenSut
1
St. 1423
PB
coagulase (-)
leite pasteurizado
AmpPen
1
IcaDSegSeiFem
1
45.8
98.3
71.4
C
43.8
64.1
55.1
70.6
64.2
56.1
D
94.7
3
Figura 1. Dendrograma gerado a partir da análise de perfis moleculares obtidos por REP-PCR em Staphylococcus spp. isolado em queijo
coalho fabricado com leite de cabra cru e pasteurizado em queijarias dos estados do Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte.
34
5. Conclusão
Staphylococcus
spp.
apresentando
níveis
elevados
de
resistência,
principalmente a β- lactâmicos, estão amplamente distribuídos em queijo coalho
fabricados a partir de leite de cabra, cru e pasteurizado, em queijarias do Rio Grande
do Norte, Ceará e Paraíba. Houve maior frequência de resistencia à clindamicina em
isolados de queijo produzido com leite cru quando comparado ao leite pasteurizado.
Não foi identificado MRSA dentre os isolados e a freqência de genes
enterotoxigênicos foi bastante baixa, sendo identificados apenas os genes seg e sei
em Staphylococcus coagulase positivo. Os isolados apresentaram baixo potencial de
produção de biofilme quando avaliados por três métodos distintos. A elevada
similaridade genética e de perfil de resistência observadas entre isolados de áreas
geográficas diferentes pode indicar a existência de linhagens associadas ao leite de
origem caprina. Dessa forma, a elevada resistência a antimicrobianos observada no
Estudo sugere a necessidade de investigação de fatores associados a produção do
leite
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38
Capitulo III
Vias de contaminação de Staphylococcus spp. na linha de produção de
queijo coalho caprino
Vias de contaminação de Staphylococcus spp. na linha de produção de queijo
coalho caprino
RESUMO
A identificação de pontos de contaminação por Staphylococcus spp em queijos
produzidos com leite de cabra é importante do ponto de vista da segurança
alimentar. O objetivo desse estudo foi avaliar a ecoepidemiologia da contaminação
do queijo coalho elaborado com leite caprino por Staphylococcus através da
genotipagem. Adicionalmente, investigou-se o perfil de resistência antimicrobiana e
a presença de fatores de patogenicidade. As espécies de Staphylococcus
identificadas nos pontos foram predominantemente coagulase negativas. Entre as
espécies coagulase positiva foram observadas a presença de S. aureus, S hyicus e
S. intermedius. A resistência antimicrobiana pelo método de Kirby Bauer identificou
26 fenótipos de resistência distribuídos entre Staphylococcus spp. isolados da mão
dos manipuladores, utensílios, leite cru, leite pasteurizado, soro e queijos com 24 e
30 dias de fabricação. Os resultados demonstraram níveis elevados de resistência
antimicrobiana, principalmente a β-lactamicos. Dos isolados avaliados, 8 (14,3%)
foram positivos para Mtp, 2 (3,5%) para ica-D-PCR e 2 (3,5%) para ACR. Não houve
concordância entre os métodos para a identificação da produção de biofilme. A
presença de genes de virulência foi identificada em 31(55,4%) isolados. A presença
de mais de um gene de virulência foi observado em 12 (21,4%) isolados. Não houve
similaridade genética entre isolados de queijo e Staphylococcus spp. de outros
pontos da produção de queijo. Entretanto, a similaridade com isolados das mãos de
manipuladores distintos confirma a importância dos mesmos na contaminação de
queijos por Staphylococcus spp.
Palavras-chave: antibiótico, genotipagem, marcadores moleculares e pontos
críticos de controle
40
ABSTRACT
The identification of Staphylococcus spp contamination in cheeses made from goat's
milk is important from the point of view of food security. The aim of this study was to
evaluate the contamination ecoepidemiology cheese curd made with goat milk
Staphylococcus through genotyping. Additionally, we investigated the antimicrobial
resistance profile and the presence of pathogenicity. The species identified in points
were predominantly Staphylococcus coagulase negative. Among the coagulasepositive species were observed the presence of S. aureus, S. hyicus and S.
intermedius. Antimicrobial resistance by the method of Kirby Bauer identified 26
profile of the resistance phenotypes distributed among Staphylococcus spp. isolated
from the handlers' hands, utensils, bulk tank milk, pasteurized milk and cheese at 24
hours and 30 days of manufacture. The results showed high levels of antimicrobial
resistance, especially β - lactams. Isolates were positive for Mtp (8; 14.3% ), for icaD-PCR (2; 3.5 %) and for ACR (2; 3.5 %). There was no agreement between the
methods for the identification of biofilm production . The presence of virulence genes
was identified in 31 ( 55.4%) isolates. The presence of more than one virulence gene
was found in 12 (21.4%) isolates. There was no genetic similarity among isolates of
cheese and Staphylococcus spp. from cheese production. However, the similarity
with isolates from the hands of manipulators distinct confirms their importance in
contamination of cheese by Staphylococcus spp.
Keywords: antibiotic, critical control points, genotyping and molecular markers
41
1. Introdução
A ubiquidade dos Staphylococcus e as inúmeras possibilidades de
contaminação do leite caprino durante o seu processamento tornam comum à
presença desses microrganismos no queijo. Adicionalmente, mecanismos de
patogenicidade contribuem para sua capacidade de permanecer no ambiente de
produção e nas superfícies de equipamentos. Dentre esses mecanismos, destaca-se
a capacidade de produção de biofilme, tornando os microrganismos resistentes a
ação de sanitizantes e contribuindo para sua disseminação no leite pasteurizado e
em derivados lácteos.
A formação de biofilme em superfícies envolve a aderência, o acumulo de
células de Staphylococcus spp. em múltiplas camadas e estágios de disseminação.
Nas fases de colonização e disseminação, os microrganismos aparecem na forma
planctônica ao passo que no biofilme são caracterizadas como um aglomerado de
células (YAO et al. 2005) que podem ser liberados pelo fluxo continuo do leite de
cabra sobre a superfície dos equipamentos nas usinas de beneficiamento.
O biofilme é uma estrutura formada na superfície de equipamentos que pode
colaborar com a disseminação de Staphylococcus enterotoxigenicos. Entretanto,
alguns autores têm relatado que as mãos e outras superfícies de manipuladores são
as principais fontes de contaminação de derivados lácteos por Staphylococcus
produtores de enterotoxinas (HOLECKOVÁ et al. 2002).
Staphylococcus enterotoxigenicos contaminam principalmente queijos de
cabra produzidos em pequenas propriedades leiteiras (AKINEDEN et al. 2008).
Apesar das Boas Práticas de Fabricação (BPFs) representarem alternativa eficiente
na redução da contaminação estafilocócica na linha de produção de queijos, tanto
artesanais quanto industriais, surtos de doenças atribuídas aos Staphylococcus
ocorrem em todo o mundo (KÉROUANTON et al. 2007). A melhor compreensão da
dinânima da contaminação, através da identificação das principais fontes da bactéria
pode representar avanço significativo para que medidas eficientes de recudão e
controle da contaminação estafilocócica possam ser alcançados.
O objetivo do presente estudo foi estudar a ecoepidemiologia da
contaminação do queijo coalho elaborado com leite caprino por Staphylococcus
através da genotipagem dos isolados obtidos em diferentes períodos e pontos do
42
sistema de produção. Adicionalmente, investigou-se o perfil de resistência
antimicrobiana e a presença de fatores de patogenicidade nos isolados.
As coletas foram realizadas em uma usina de beneficiamento de leite de
cabra localizada no município de Amparo no Cariri paraibano. As amostras foram
adquiridas durante os meses de setembro de 2011, fevereiro e março de 2012.
Amostras de leite cru (27), leite pasteurizado (3), porções de coalho inicial e
coalho final (6), soro do leite (3), Swabs de mão do manipulador (4), tanque de
recepção do leite (3), tanque de pasteurização (3), swabs de utensílios (20),
seladora (3), queijos com 24 horas (3) e 30 dias (3) de fabricação. As amostras
foram transportadas em caixa isotérmica com gelo ao laboratório de Avaliação de
Produtos de Origem Animal na Universidade Federal da Paraíba (CCA/UFPB).
As amostras de leite cru foram obtidas individualmente em tubos cônicos de
50 mL (tipo Falcon) a partir de latões selecionados aleatoriamente na plataforma de
recepção. Uma alíquota de igual volume de leite foi retirada do tanque após a
pasteurização e do soro liberado durante a fabricação dos queijos.
O coalho inicial formado uma hora após a adição de ingredientes para a
coagulação e a massa final foram armazenadas em embalagens plásticas estéreis
tipo Whirl-Pak. Uma amostra de queijo para análise com 24 horas de fabricação foi
adquirida envolvida em plástico de polietileno e a amostra para análise com 30 dias,
depois de embalada a vácuo.
Amostras de Swabs das mãos de manipuladores e utensílios foram
coletadas e armazenadas em tubos com 5mL de água peptonada a 0,1%. Swabs
umedecidos em água peptonada a 0,1% foram friccionados nos quatro lados de
cada equipamento e armazenados em 10 mL da mesma solução. Para cada lado, de
um mesmo equipamento, um swab foi utilizado em um espaço delimitado por um
molde de 25 cm2, totalizado um espaço de 100 cm2. Os swabs foram friccionados
nas superfícies avaliadas antes do inicio do processo de produção de queijo coalho
43
com leite de cabra pasteurizado e as demais amostras coletadas ao longo de todas
as etapas de produção.
2.2 Isolamento de Staphylococcus spp
Diluições seriadas da coalhada e do queijo foram preparadas em água
peptonada a 0,1% a partir de uma diluição inicial composta pela mistura de uma
alíquota de 25 gramas da amostra em 225 mL de Citrato de Sódio a 2% e
homogeneizada em Stomacher (Marconi, Brasil) durante 60 segundos. A diluição
das amostras de leite e soro foram realizadas pela mistura consecutiva de 1 mL da
amostra em 9 mL de água peptonada a 0,1%.
O isolamento de Staphylococcus spp. foi realizado em ágar Baird Parker
(Himedia, Índia) suplementado com telurito e gema de ovo, de acordo com as
recomendações de BENNETT E LANCETTE, (2001). A partir de cada diluição uma
aliquota de 0,01 mL foi espalhada na superfície do ágar e as placas incubadas por
48 horas a 37ºC em estufa bacteriológica. O liquido diluente dos swabs de
equipamentos, utensílios e mãos de manipuladores foi semeado diretamente na
superfície do meio de cultura pela técnica de esgotamento e incubadas sob as
mesmas condições de temperatura.
As colônias com coloração negra ou cinza, bordas lisas, providas ou não de
halo foram semeadas em ágar triptona de soja suplementado com 0,06% de extrato
de levedura (TSAYE) e posteriormente a incubação durante 18-24 horas a 37ºC.
Colônias com características de Staphylococcus spp. foram submetidas aos testes
de gram, catalase e coagulase. Os isolados obtidos foram armazenados a -20ºC em
caldo triptona de soja suplementado com 0,06% de extrato de levedura (TSBYE) e
2% de glicerol.
Um total de 93 isolados de Staphylococcus spp. foram selecionados entre as
bactérias armazenadas no banco de microrganismos do laboratório de Avaliação de
Produtos de Origem Animal (CCA/UFPB) e submetidos ao teste de sensibilidade
antimicrobiana. Entre os microrganismos, 79 isolados foram submetidos à
determinação da concentração inibitória mínima por microdiluição por sistema semiautomático e identificação das espécies de Staphylococcus spp.
Isolados de Staphylococcus spp. (56) foram submetidos ao teste da
concentração a pesquisa de genes de virulência e a genotipagem por Rep-PCR com
44
RW3A. Os microrganismos foram escolhidos de acordo com os resultados dos
testes de coagulase, sensibilidade antimicrobiana e a origem dos microrganismos.
2.3.1 Método de disco difusão
O teste de sensibilidade in vitro a antimicrobianos foi realizado pela técnica
de difusão em disco descrita por Kirby-Bauer. As colônias foram semeadas em ágar
triptona de soja com extrato de levedura (TSAYE) e incubadas a 37ºC por 24 horas
para a obtenção de colônias isoladas.
A quantidade de células inoculadas no ágar Mueller Hinton foi ajustada com
a diluição de 2 a 3 colônias em 2 mL de solução salina a 0,85% e a turbidez ajustada
para a concentração de 1,5 x 108 UFC/mL que corresponde a 0,5 na escala de Mc
Farland.
A suspensão bacteriana foi espalhada em todas as extensões na superfície
do ágar Mueller-Hinton com um swab estéril. Para o antibiograma foram utilizados
antimicrobianos (CECON, Brasil) recomendados pelo Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2012) para testes de susceptibilidade antimicrobiana em
Staphylococcus spp., representados pela Oxacilina (1µg), Penicilina G (10 UI),
Sulfazotrim (25 µg), Tetraciclina (30 µg), Norfloxacina (10 µg), Gentamicina (10 µg),
Eritromicina (15 µg), Clorofenicol (30 µg), Amicacina (30 µg), Ampicilina (10 µg),
Cefalotina (30 µg) e Clindamicina (2 µg).
A cepa ATTCC (25923) de Staphylococcus aureus foi utilizada como
controle positivo.
Os discos de antibióticos foram retirados para uso trinta minutos antes do
uso e distribuídos nas placas 5 minutos após o inoculo. As zonas de inibição em
torno de cada disco foram aferidas com paquímetro digital após 18-24 horas de
incubação a 37ºC.
Os dados de resistência foram interpretados de acordo com as
recomendações do fabricante dos discos de antibiograma e CLSI, (2012).
45
2.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima por microdiluição
A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida em 79 isolados de
Staphylococcus spp. em sistema semi-automatizado (Micro Scan, Siemens
Healthcare, cidade). As cepas de Staphylococcus spp. inoculados em um painel
desidratado para microrganismos gram-positivos (pos combo painel tipo 33) e
incubados por 24 horas a 37ºC foram identificadas de acordo com as
recomendações descritas no encarte do produto.
A concentração inibitória mínima foi interpretada a partir dos pontos de corte
obtidos para antibióticos associados a inibidores de β lactamase, Ampicilina com
Sulbactan, Amoxilina com Ácido Clavulanato, Trimetropim com sulfametoxazol e
outros
antibióticos
distribuídos
Clindamicina,
Ciprofloxacina,
Nitrofurantoina,
Levofloxacina,
individualmente:
Daptomicina,
Linezolid,
Ampicilina,
Eritromicina,
Moxifloxacina,
Ceftriaxona,
Gentamicina,
Oxacilina,
Penicilina,
Rifampina, Sirnecid, Tetraciclina e Vancomicina.
Os isolados foram semeados na superfície do ágar vermelho congo (1L de
caldo BHI, 0,8g de corante vermelho congo e 36 gramas de sacarose) pela técnica
de esgotamento em estria e incubados a 35ºC por 24horas, de acordo com a
metodologia descrita por FREEMAN et al. (1989).
A cepa de Staphylococcus aureus 25923 foi utilizada como controle positivo
e a leitura das placas realizada após 24 horas de incubação em estufa
bacteriológica. As características das colônias foram avaliadas ainda, após 48 e 72
horas de incubação a temperatura ambiente.
Uma escala de três cores foi adotada para a interpretação da coloração das
colônias em ágar vermelho congo: vermelho, bordo e preto. As colônias de
coloração negras e rugosas produzidas por Staphylococcus spp. foram consideradas
como produtores de biofilme e como não produtoras as colônias avermelhadas.
46
O estudo de biofilme em microplaca foi realizado de acordo com
CHRISTENSEN et al. (1985). Staphylococcus spp. foi cultivado no ágar triptona de
soja suplementado com 0,06% de extrato de levedura (TSAYE) e incubados a 37ºC
por 18-24h. Em seguida, uma suspensão bacteriana foi preparada em solução salina
a 0.85% a partir de 2 a 3 colônias isoladas e o ajuste da quantidade de células
realizado em aparelho Turbidimetro para a concentração de 0.5 na escala de
McFarland (1,5 x 108 UFC/mL).
Um volume de 20µL de cada suspensão bacteriana foi distribuído em seis
poços de uma microplaca de 96 poços de poliestireno, previamente preenchida com
180 µL de caldo triptona de soja suplementado com 1% de glicose. Após incubação
por 18h a 37ºC, as células não aderentes foram removidas cuidadosamente dos
poços e a placa submetida a três lavagens sucessivas com 200 µL de solução
salina.
A fixação da massa aderente foi realizada com 150 µL de metanol em
temperatura ambiente por 30 minutos. Após o descarte do metanol, as placas foram
invertidas sobre papel aderente por aproximadamente 30 minutos e submetidos à
coloração com 150 µL de cristal violeta a 1% por 1 minuto. Em seguida, as placas
foram lavadas em água destilada e secas a temperatura ambiente por 30 minutos.
A absorbância foi determinada a 450nm em leitor de placas (Bio-rad, Brasil).
Poços contendo apenas caldo TSB com glicose foram utilizados como controle
negativo do teste. O teste foi repetido nas mesmas condições em outro espaço de
tempo não relacionado.
As colônias foram consideradas como produtoras de biofilme no teste de
microplacas de acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo cálculo da ODC
(média do caldo não inoculado + 3x o desvio padrão do controle positivo – ATTCC
25923) e da OD (média da massa produzida por cada isolado – ODC), ambos os
valores obtidos conforme (STEPANOVIC et al. 2007). Desta forma, quando a OD450
≤ 0,05= não produtor; (0,05˂OD450≤0,1) = fraco produtor; (0,1˂OD450≤0,2)= produtor
moderado; (0,2˂OD450)=forte produtor.
47
O DNA dos isolados de Staphylococcus spp. foi extraído pelo método de
Fenol: Clorofórmio: Álcool isoamílico, descrito por FRITSCH et al. (1989).
Staphylococcus spp. semeados em caldo triptona de soja suplementado com 0,06%
de extrato de levedura, incubados sob agitação por 18-24 horas foram utilizados na
fase inicial da extração.
Uma alíquota de 1,5 mL de caldo foi centrifugada por 15 minutos, a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e a massa de células bacterianas no fundo do tubo foi
diluída em 500 µL tampão TE 10:1, 10 µL de lisozima (Research Organics, U. S. A)
na concentração de 10mg/ml e 10 µL de proteinase K a 5mg/ml. A solução foi
submetida à temperatura de 60ºC em agitação mecânica durante um período
overnight.
Em seguida, 100 µL do Tampão STE (2,5% de SDS; 10mM Tris-HcL, pH
8,0; 0,25M de EDTA) foram adicionados ao tampão de lise. A solução foi novamente
incubada por 15 minutos nas condições anteriormente relatadas. Decorrido o tempo,
a solução foi incubada a temperatura ambiente por 5 minutos e depois por 5 minutos
no gelo.
A reação foi neutralizada com 130 µL de acetato de amônio a 7,5M e
mantida no gelo por 15 minutos. Após este período as amostras foram centrifugadas
por 8 minutos e aproximadamente 400 µL do sobrenadante foi transferido para outro
tubo.
O sobrenadante foi misturado com igual volume de fenol:clorofórmio:álcool
isoamílico 25:24:1 (LGC biotecnologia, Brasil) e centrifugado por 5 minutos.
Aproximadamente 400 µL de sobrenadante contendo o DNA foram transferidos para
um novo microtubo.
O DNA foi precipitado com 420 µL de etanol absoluto a -20ºC por 24 horas.
A solução foi centrifugada, o sobrenadante foi descartado e os tubos invertidos
sobre uma folha de papel toalha por 30 minutos. Após este procedimento, o DNA foi
recuperado em 30 µL de água deionizada autoclavada.
µL.
48
A presença do gene ica-D foi avaliada com modificações conforme
ARCIOLA et al. (2001) e SZWEDA et al. (2012). A reação foi preparada por uma
mistura de tampão 1x concentrado, 4mM de MgCl2, 1 U de Taq polimerase (Life, E.
U. A. ), 0,2mM de DNTPs (Life, E. U. A.), 0,4µM de cada primer (Life, E. U. A.) e
100 ng de DNA em um volume final de 25 µL.
A amplificação foi realizada em termociclador TC-3000 (TECHNE, Reino
Unido) nas condições de desnaturação inicial de 94ºC por 4 minutos, seguidos de 30
ciclos com anelamento inicial a 94ºC/4 minutos, 56ºC/30 segundos e 72ºC/1minuto.
Uma extensão final foi realizada a 72ºC por 10 minutos.
2.7 Pesquisa de genes enterotoxigênicos.
As reações de PCR foram realizadas para pesquisa dos genes
enterotoxigênicos sea, seb, sec, sed, see, seg, seh e sei, com os primers
recomendados por JOHNSON et al. (1991) e BLAIOTA et al. (2004) com
modificações nas condições de reação.
Para cada conjunto de reação, uma cepa padrão de Staphylococcus aureus
foi utilizada como controle positivo ou negativo: ATCC 13565 (sea), ATCC
14458(seb), ATCC 19095(sec), ATCC 23235 (sed), ATCC 27664 (see), ATCC 19095
(seg) e ATCC 19095 (seh e sei).
Os amplificados foram obtidos em reações de PCR com volume final de
25µL e cada reação de PCR foi preparada por uma mistura dos seguintes reagentes:
tampão 1X concentrado, 2 mM de MgCl2, 200µM de cada dNTPs, 1U de Taq
polimerase, 0.4µM de cada Primer e 100ng de DNA molde.
A amplificação foi realizada a partir de um ciclo inicial de 95°C por 3 minutos
seguidos por 30 ciclos com etapas de desnaturação a 94°C/ 60 segundos,
anelamento a 50°C/60 segundos e uma extensão a 72°C/ 2 minutos. Uma extensão
final foi realizada a 72ºC por 5 minutos.
As
mesmas
condições
de
reação
e
amplificação
dos
genes
enterotoxigênicos foram utilizadas para a pesquisa do gene fem A e o primer
escolhido conforme MEHROTRA et al. (2000). A escolha do primer para pesquisa do
49
gene mec A foi realizada conforme JONAS et al. (1999) e os amplificados obtidos
conforme ADALETI et al. (2007), com modificações.
A cepa padrão utilizada como controle positiva foi a Staphylococcus aureus
ATTCC 25923.
O termociclador obedeceu a uma programação de desnaturação inicial de
94ºC por 5 minutos seguidos por 30 ciclos com desnaturação de 94ºC/30 segundos,
53ºC/30 segundos e 72ºC/ 30 segundos. Uma extensão final de 72ºC por 10 minutos
finalizou a amplificação.
A escolha do primer para a pesquisa do gene blaz foi realizada conforme
HANAA et al. (2011). O aparelho obedeceu a uma programação de desnaturação
inicial de 94ºC por 4 minutos seguidos por 35 ciclos com desnaturação de 94ºC/60
segundos, 55ºC/60 segundos e 72ºC/60 segundos. Uma extensão final de 72ºC por
10 minutos finalizou a amplificação.
2.9 Genotipagem
Cada reação de PCR preparada com uma mistura de tampão 1x
concentrado, 3,5 mM de MgCl2, 1µM de primer RW3A, 200 µM de DNTP, 1U de taq
polimerase e 100 ng de DNA em um volume final de 25µL.
Staphylococcus aureus ATTCC 25923 foi utilizada como controle positiva
das reações.
O primer Rw3A e as condições de PCR foram utilizados conforme VAN DER
ZEE et al. (1999), com modificações. A amplificação foi realizada em termociclador
com uma desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos seguidos por 30 ciclos com
94ºC/1 minuto, 50ºC/1 minuto e 72ºC/2 minutos. Uma extensão final foi realizada a
Para todos os géis gerados nos estudos moleculares, as condições de
eletroforese e coloração foram às mesmas.
A eletroforese foi realizada a 70 V em tampão TAE 1x concentrado (LGCBiotecnologia, Brasil). Um volume de 10 µL de cada amplificado foi aplicado nos
poços do gel.
Antes da aplicação, o amplificado foi misturado a 2 µL do tampão de
50
O tamanho dos fragmentos observados no DNA de isolados de
Staphylococcus spp. foi conferido pela aplicação de marcadores moleculares de
100pb e 1kb (Amresco, Canadá) nos géis de agarose a 1,5%.
utilizando se produto comercial (Gel red, Biotium) 3X concentrado, de acordo com as
A presença e ausência de bandas foram utilizadas como critério para avaliar
a similaridade entre Staphylococcus spp. e gerar uma matriz de similaridade pelo
Software BioNumerics versão 7.1 da Applied Maths. O coeficiente de similaridade de
Dice a 2% foi utilizado para gerar a matriz de similaridade e o agrupamento obtido
pelo método de UPGMA (Unweighted Pair Group Method, Arithmetic Mean).
Um grupo controle de perfis genotípicos Staphylococcus spp. não
relacionados com os isolados do estudo foram inseridos junto as amostras no
dendrograma.
D = Índice discriminatório
N = O número total de isolados na populacional bacteriana
S = O numero total de genótipos observados
Nj = O número total de isolados dentro do genótipo j
A concordância entre os métodos utilizados para avaliar a produção de
biofilme foi cálculado pelo índice Kappa. O índice foi interpretado de acordo com
ALTMAN, (1991) como pobre (<0,2), razoável (0,21 a 0,40), moderado (0,41 a 0,60),
bom (0,61 a 0,80) e muito bom (0,81 a 1).
Os dados de resistência foram avaliados por estatística não-paramétrica
pelo teste do qui-quadrado a 0,05% de significância pelo programa estatístico SAS
versão 9.3.
51
As espécies de Staphylococcus spp. identificadas na linha de produção de
queijo coalho fabricado com leite de cabra indicam a predominância de espécies
coagulase negativas S. saprophyticus (18,99%), S. hominis var hominis (17,72%), S.
lugdunensis (12,66%), S cohnii var. cohnii (10,13%), S. epidermidis (7,59%), S sciuri
(5,06%), S. warneri (3,80%), S. cohnii-urea (2,53%), S. auriculares (1,27%), S.
capitis (1,27%) e S. haemolyticus (1,27%). As principais espécies coagulase
positivas identificadas foram S. aureus (8,86%), S. hyicus (7,59%) e S. intermedius
(1,27%). Staphylococcus aureus foi identificado da mão do queijeiro, na peneira
plástica, em duas amostras de leite cru e coalhada final.
As frequências de resistência em Staphylococcus coagulase positivos e
negativos, isolados de pontos da linha de produção de queijo coalho, aos
antimicrobianos avaliados pelo método de disco-difusão estão apresentadas na
Tabela 1. Em Staphylococcus coagulase positivos, as maiores frequências de
resistência foram observadas para penicilina, oxacilina, norfloxacina e clindamicina.
Todos os Staphylococcus coagulase positiva foram sensíveis a ampicilina e ao
cloranfenicol. As maiores frequencias de resistência em Staphylococcus coagulase
negativos foram observadas para penicilina (39,5%), ampicilina (35,8%), oxacilina
(17,2%), eritromicina (14,8%), norfloxacina (13,5%), clindamicina (9,8%), cefalotina
(8,6%), amicacina (7,4%), cloranfenicol (6,2%). gentamicina (4,9%), tetraciclina
(4,9%) e sulfazotrim (3,7%).
A resistência antimicrobiana a pelo menos um antimicrobiano foi observada
em 15 (16,1%) isolados e a resistência fenotípica a pelo menos um β-lactâmico foi
observada em 13 (13,9%) isolados. Considerando os isolados resistentes (n=46), 26
perfis fenotípicos de resistência foram observados (Tabela 2). Resistência a
antibióticos de duas ou mais classes foi observada em 17 (38,6%) isolados. Dois
isolados apresentando resistência aos 12 antimicrobianos e foram identificados em
leite pasteurizado.
Considerando a origem das amostras, Staphylococcus spp. resistentes
foram identificados no leite cru (10/21; 47,6%), no leite pasteurizado (5/7; 71,4%), na
coalhada (5/9; 55,5%), no soro (4/4; 100%) em queijos com 24 e 30 dias de
fabricação (5/12; 71,4%), mão de manipulador (5/6; 83,3%), utensílios (10/27; 37%)
e equipamentos (2/7; 28,5%).
52
Tabela 1. Frequências de resistência avaliadas pelo método de disco-difusão em
Staphylococcus coagulase positivos e negativos isolados de pontos da linha de
produção de queijo coalho fabricado com leite de cabra pasteurizado
Antimicrobiano
Penicilina
Ampicilina
Oxacilina
Eritromicina
Norfloxacina
Clindamicina
Cefalotina
Amicacina
Cloranfenicol
Gentamicina
Tetraciclina
Sulfazotrim
Staphylococcus coagulase positivos
(SCP)
Resistência
Resistência
absoluta
Intermediária
2 (16,6%)
0
0
0
2 (16,6%)
0
0
1 (8,3%)
0
2 (16,6%)
0
2 (16,6%)
1 (8,3%)
0
1(8,3%)
0
0
0
0
1 (8,3%)
1 (8,3%)
1(8,3%)
0
1 (8,3%)
Staphylococcus coagulase negativos
(SCN)
Resistência
Resistência
absoluta
Intermediária
32 (39,5%)
0
29 (35,8%)
0
14 (17,2%)
8 (9,8%)
12 (14,8%)
6 (7,4%)
11 (13,5%)
3 (3,7%)
8 (9,8%)
18 (22,2%)
7 (8,6%)
0
6 (7,4%)
4 (4,9%)
5 (6,2%)
3 (3,7%)
4 (4,9%)
5 (6,1%)
4 (4,9%)
3 (3,7%)
3 (3,7%)
3 (3,7%)
Tabela 2. Perfis de resistência a antimicrobianos em Staphylococcus spp. (n=93)
isolado de pontos da linha de produção de queijo coalho fabricado com leite de
cabra pasteurizado
Origem da
amostra
n.
Resistência
Mão de
manipuladores
6
5
(83,3%)
Equipamento
7
2
(28,5%)
Perfil genotípico
Até duas classes
Pen (2)
AmpPen
AmpCliEriPen
AmpOxaPenSutNor
AmpPen
Gen
0
27
10
(37%)
Eri
Amp
Oxa (2)
AmpPen
OxaPen (2)
Leite cru
21
10
(47,6%)
Pen
Amp
AmiAmp
EriPen
AmpCliPen
AmpCliCloOxa
AmpCloPenNor (2)
AmiAmpCflGenOxaPen
AmpCflCliEriOxaPenTetNor
Leite pasteurizado
7
5
(71,4%)
Pen
EriPen
AmpEriOxaPen
AmiAmpCflCliCloEriGenOxaPenSutTetNor
(2)
soro
4
4
(100%)
Coalhada
9
5
(55,5%)
Amp (3)
PenNor
AmpPenNor
0
queijo
12
5
(71,4%)
Pen (2)
AmpEri
CflOxaNor
AmpPenTetNor
TOTAL
93
46
11
15
Utensilio
AmpPen (2)
OxaPen
AmpCloPenNor
AmiCflCliOxaPen
AmiAmpCflCliOxaPenNor
AmpEriPen
53
A Tabela 3 apresenta os valores de concentração inibitória mínima de 79
isolados de Staphylococcus ssp. obtidos em diferentes pontos da linha de produção
de queijo coalho elaborado com leite de cabra. Todos os isolados foram resistentes
a ampicilina e susceptíveis a amoxilina com clavulanato, gentamicina e
moxifloxacina. As maiores frequências de resistência foram observadas para
penicilina (32; 40,5%), oxacilina (25; 31,7%), eritromicina (14; 17,7%), clindamicina
(13; 16,5%) e daptomocina (9; 11,4%).
Os isolados apresentaram frequências baixas de resistência a ampicilina
associada ao sulbactan (5; 6,33%), tetraciclina (5; 6,3%), levofloxacina (5; 6,3%),
sinercid (2; 2,5%), nitrofurantoína (2; 2,5%), linezolid (2; 2,5%), ceftriaxona (3; 3,8%),
rifampina (3; 3,8%) e vancomicina (5; 6,3%).
Os
resultados
mostram
resistência
antimicrobiana
elevada
para
Staphylococcus spp isolados de linha de produção de queijo de cabra tipo coalho, o
que pode ser reflexo da ocorrência de isolados resistentes no leite caprino. Sabe-se
que Staphylococcus apresentando multiresistência, incluindo espécies coagulase
negativas, podem colonizar a superfície da pele de caprinos, prevalecem em
infecções ocorridas na glândula mamária e consequentemente no leite produzido
(CHU et al. 2012). A partir do leite contaminado, S. aureus e outras espécies podem
disseminar para outros ambientes de produção e contribuem com a permanência de
Staphylococcus spp. no processamento de derivados lácteos (SOARES et al. 2011).
A ampla presença de Staphylococcus spp. resistentes a antibióticos β-lactâmicos no
leite caprino, em queijos e na mão de manipuladores de alimentos, observada no
presente estudo, podem representar um risco a saúde pública (ABULREESH E
ORGANJI, 2011). Isso porque microrganismos multirresistentes de origem animal
contribuem com a resistência em microrganismos de origem humana e surgem
principalmente a partir do uso de antibióticos em animais (LEVY E MARCHALL, et al.
2004). Durante a produção de alimentos muitos fatores podem contribuir com a
resistência em microrganismos (McENTIRE et al. 2006). De acordo com Resch et al.
(2008), em Staphylococcus coagulase negativos, os mecanismos de resistência
associados a alimentos podem ser diferentes dos mecanismos de Staphylococcus
patogênicos de natureza clínica, e surgem como resultado de uma resistência
intrínseca ou de genes de resistência ainda não conhecidos.
54
Tabela 3. Concentração inibitória mínima de Staphylococcus spp. (n=79) de pontos
da linha de produção de queijo coalho fabricado com leite de cabra pasteurizado
Antibióticos
Ponto de
MIC 50%
MIC 90%
Número de
corte
isolados
(µg/mL)
resistentes
(%)
≥ 32/16
≤ 8/4
8/4
5
6,3
Ampicilina
≥ 0,5
≤2
4
79
100
Amocilina/ K. clavulanato
≥ 8/4
≤ 4/2
4/2
79
0
Ceftriaxona
≥ 64
≤8
8
3
3,8
Clindamicina
≥4
0,5
4
13
16,5
Ciprofloxacina
≥4
≤1
1
3
3,80
Daptomocina
>1
≤ 0,5
4
9
11,4
Eritromicina
≥8
≤ 0,5
>4
14
17,7
Nitrofurantoína
≥ 128
≤ 32
32
2
2,5
Gentamicina
≥ 16
≤4
4
79
0
Levofloxacina
≥8
≤1
1
5
6,3
Linezolid
≥4
≤2
2
2
2,5
Moxifloxacina
≥8
≤ 0,5
0.5
79
0
Oxacilina
≥ 0.5
≤ 0,25
0,5
25
31,7
Penicilina
≥ 0,25
0,12
>8
32
40,5
Rifampina
≥4
≤1
1
3
3,8
Sinercid
≥4
≤ 0,5
0.5
2
2,5
≥ 4/76
≤ 0,5/9,5
0,5/9,5
4
5,0
≥ 16
≤4
4
5
6,3
≥ 32
0,5
2
5
6,3
Ampicilina/Sulbactan
Trimetropim/
sulfametoxazol
Tetraciclina
Vancomicina
A manutenção desses isolados no ambiente de produção pode estar
relacionada à capacidade dos isolados produzirem biofilme. Do total de isolados
avaliados, 8 (14,3%) foram positivos para MtP, 2 (3,5%) para o icaD-PCR e 2 (3,5%)
para o CRA. Os resultados de concordância mostraram que ambos os métodos
fenotípicos foram limitados na identificação de biofilme (K<0,2). Associações entre a
presença do gene icaD e outros genes de virulência, ou ainda a resistência
antimicrobiana não foram observadas na analise estatística. O que pode ser
explicada pela baixa frequência do gene icaD em relação aos outros genes
estudados.
De acordo com TANG et al. (2013) o padrão de produção fenotípica de
biofilme pode ser influenciado pela atividade de genes envolvidos na produção de
55
proteínas adesinas, nucleases e hemolisinas. Staphylococcus spp. positivos para a
presença de genes de virulência podem ser disseminados na produção de leite
devido a formação de biofilme por Staphylococcus spp. nas superfícies de
equipamentos e ambientes. Considerando que a produção de biofilme dá-se
também pela atividade de outros genes diferentes dos genes do ica-operon e que
ocorre principalmente em S. aureus (CUCARRELA et al. 2004; RODE et al. 2007),
não podemos descartar a possibilidade de o padrão fenotípico apresentado pelas
espécies,
encontradas
na
mão
do
manipulador
e
do
queijo,
não
seja
verdadeiramente de um microrganismo produtor de biofilme.
A Tabela 4 apresenta a distribuição de Staphylococcus spp. positivos para a
presença dos gene ica-D, enterotoxigênicos e de resistência em 57,1% (32) de
espécies de Staphylococcus spp. isolados em pontos da linha de produção de queijo
coalho fabricado com leite de cabra. De acordo com análise estatística realizada,
não foi possível identificar associação entre os fatores investigados (genes
enterotoxigênicos, capacidade de produção de biofilmes e resistência).
A produção de biofilme pode contribuir com a disseminação de
Staphylococcus enterotoxigenicos no leite e em queijo. Pelo menos um gene
enterotoxigênico foi observado em 18 (32,1%) isolados. A presença dos genes sea
(3; 5,4%), seb (1; 1,8%), sec (4; 7,1%), seg (3; 5,4%), seh (3, 5,4%) e sei (5, 8,9%)
foi observada em Staphylococcus spp. isolado de mão de manipulador, leite cru e
pasteurizado, queijo, utensílios e equipamentos. A presença do gene em isolados
obtidos de diversas amostras, inclusive mão do manipulador, indica que medidas de
controle devem ser implementadas, pois a pasteurização é um tratamento térmico
que não elimina toxinas estafilocócicas no leite (BARTOLOMEOLI et al. 2009).
Outras combinações da presença de genes foram observadas em
Staphylococcus spp. (Ica-D/fem A/ sec) isolado de leite cru, Staphylococcus aureus
(ica-D/fem A) de leite cru, S hominis e S. cohnii (seh/sei) de coalhada e leite
pasteurizado, S. cohnii (sea/seb/seg) de leite pasteurizado e S. epidermidis
(seg/sei/mec A/) em queijo com 24 horas de fabricação. O gene sei foi observado
em Staphylococcus spp. de queijo com 24 horas de fabricação.
A presença dos genes fem A (3; 5,4%) e mec A (2; 3,6%) foi observada em
poucos isolados. Por outro lado, 25 (44,6%) foram positivos para o gene blaZ.
56
O gene blaZ é responsável pela produção de β- lactamases (CHAMBERS et
al. 2009) e a frequência encontrada nesse estudo justifica a correlação estatitistica
com os pontos avaliados (p>0,05).
Tabela 4. Presença de genes associados a fatores de virulência em Staphylococcus
spp. (n=56) isolado de pontos da linha de produção de queijo coalho fabricado com
leite de cabra pasteurizado
Ponto de origem
Número de
isolados
Isolados
positivos
Genes
mão de manipulador
7 (71,4%)
5
blaZ (3)
sec, seg e blaZ
sea e blaZ
tanque de pasteurização
2 (100%)
2
blaZ
bacia de plástica
seladora
recipiente dos dessoradores
dessorador de plástico
2 (100%)
1 (100%)
2 (50%)
1 (100%)
2
1
1
1
blaZ
blaZ
Seg, sei, mec A e blaZ
Sec, seh e blaZ
mesa de aço inoxidável
2 (50%)
1
blaZ
lira de aço inoxidável
1 (100%)
1
blaZ
faca
2 (50%)
1
blaZ
panela de alumínio
1 (100%)
1
peneira de plástico
3 (100%)
3
leite pasteurizado
6 (100%)
6
blaZ
blaZ
sea e blaZ
sec e blaZ
Blaz (3)
Sei e blaZ
Sea, seb e seg
Seh e sei
leite cru
6 (33,3%)
2
coalhada inicial
3 (66,6%)
2
coalhada final
1 (100%)
1
queijo 24 horas
3 (66,6%)
2
blaZ
ica-D e fem A
ica-D, sec e fem A
Fem A
Seh e sei
blaZ
seg, sei e mec A
sei
0
queijo 30 dias
soro
prensa de aço inoxidável
tanque de recepção do leite
forma plástica
geladeira de maturação
balde plástico
TOTAL
PERCENTUAL POSITIVO
6
2
1
1
1
1
1
56
100%
Negativo
0
0
0
0
0
0
32
57.1%
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
S. saprophyticus
S. warneri
S. aureus
S. cohnii
S. sciuri
S. hominis
S. hyicus
S. saprophyticus
S. sciuri
S. saprophyticus
S. saprophyticus
S. cohnii
S. hyicus
S. hominis
S.cohnii
S. hyicus
S. saprophyticus
S. lugdunensis
S. aureus
S. sciuri
s. cohnii
S. haemoliticus
S. hominis
S. aureus
Staphylococcus
spp.
S. hominis
S. aureus
S. epidermidis
Staphylococcus
spp.
Staphylococcus
spp.
S. saprophyticus
S. warneri
S. saprophyticus
S. lugdunensis
S. saprophyticus
S. saprophyticus
S. lugdunensis
A Figura 1 mostra o dendrograma construído a partir da genotipagem em
Staphylococcus spp. isolado de leite de cabra cru, leite de cabra pasteurizado,
57
coalhada, soro, queijo, mão de manipulador, utensílios e equipamentos envolvidos
na fabricação de queijo coalho em uma usina de beneficiamento no cariri paraibano.
O método de Rep-PCR utilizando primer RW3A apresentou poder discriminatório
elevado (valor D=0,99). Considerando uma similaridade de 70% pôde-se observar a
formação de treze clusters distintos e 59 genotipos. Houve uma tendência de
agrupamento por espécie. No entanto, a Rep-PCR foi capaz de discriminar isolados
de uma única espécie.
De forma geral, todos os clusters apresentaram isolados obtidos de
diferentes fontes. Os resultados da genotipagem indicam a presença de isolados
geneticamente semelhantes, pertencentes à espécie S. saprophyticus da mão de
manipuladores e de queijo com maturação de 30 dias (Cluster C, Figura 3). Esses
resultados
demonstram
a
importância
do
manipulador
como
fonte
de
Staphylococcus no produto final. Outras espécies identificadas de queijo, como S.
epidermidis e S. aureus, não apresentaram similaridade com demais isolados
avaliados.
Identificou-se Staphylococcus aureus semelhantes obtidos do leite cru,
peneira e da coalhada final, indicando a possibilidade de falha no processo de
pasteurização ou contaminação cruzada pós-pasteurização.
Os resultados indicam relação clocal entre isolados obtidos de diferentes
amostras de equipamentos, ratificando a importância das práticas de higiene e
desinfecção sobre a qualidade microbiológica final do queijo.
58
66.7
92.3
55.2
82.9
77.2
A
68.0
50.5
94.7
91.5
80.2
71.6
B
43.1
83.3
66.7
54.8
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
REP-PCR
40
35
30
REP-PCR
Origem
Identificação
mão 01
Staphylococcus hominis
leite cru
Staphylococcus spp.
leite cru
leite cru
tanque de captação do leite na usina
S. lugdunensis
queijo 24 horas
Staphylococcus spp.
SEI
leite pasteurizado
S. cohnii
Blaz
bacia
S. hyicus
Blaz
panela de aluminio
S. hyicus
Blaz
bacia
S. hyicus
Blaz
coalho após adição dos ingredientes
S. haemolyticus
SEI/Blaz
peneira
S. aureus
SEC/Blaz
leite cru
S. aureus
coalhada final
S. aureus
Blaz
peneira
S. lugdunensis
SEA/Blaz
S. sciuri
Blaz
mão 01
Staphylococcus spp.
Genes
Blaz
Swab da geladeira - maturação de que. S. saprophyticus
91.2
88.1
94.7
78.9
C
72.4
90.0
81.8
67.9
41.3
80.1
queijo 30 dias
S. saprophyticus
queijo 30 dias
S. saprophyticus
queijo 30 dias
S. saprophyticus
queijo 30 dias
S. saprophyticus
MÃO 01
S. saprophyticus
Blaz
MÃO 02
S. saprophyticus
Blaz
dessorador
S. saprophyticus
SEC/SEH/Blaz
S. saprophyticus
Blaz
prensa de aço inoxidável
S. saprophyticus
peneira
S. saprophyticus
Blaz
seladora
S. saprophyticus
Blaz
faca (ponto de corte)
S. hominis homin
Blaz
S. aureus (b)
Nasal suíno
Staphylococcus spp.
queijo 24 horas
S. aureus
queijo 30 dias
Staphylococcus spp.
Infecção nosocomial (humano)
S. aureus (c)
Orofaringe (humano)
S. saprophyticus
60.3
D
76.9
50.7
71.4
F
76.9
48.4
67.6
85.7
61.3
82.4
56.2
G
H
64.3
37.4
I
76.2
47.8
70.6
83.9
64.7
82.8
J
59.9
78.6
72.1
37.1
56.7
L
66.4
78.3
M
66.1
50.0
29.5
N
76.9
55.8
L
57.1
94.1
ATCC 25923
leite cru
Staphylococcus spp.
S. aureus (a)
Ica-D/SEC/femA
formas
S. saprophyticus
mão 01
Staphylococcus warneri
Blaz
leite cru
S. aureus
Ica-D/femA
faca (ponto de corte)
S. cohnii
leite pasteurizado
S. cohnii
SEH/SEI
mão 02
S. cohnii
SEA/Blaz
S. cohnii
S. hominis homin
Blaz
lira para corte da coalhada
S. hyicus
Blaz
MÃO 02
S. aureus
SEC/SEG/Blaz
balde preto
S. lugdunensis
S. hominis homin
queijo 30 dias
Staphylococcus spp.
soro
S. warneri
leite pasteurizado
S. cohnii
SEA/SEB/SEG
queijo 24 horas
S. epidermidis
SEG/SEI/MecA
Orofaringe (humano)
S. auricularis
soro
S. warneri
S. sciuri
SEG/Mec /Blaz
leite pasteurizado após adds do coalho Staphylococcus sciuri
Blaz
coalhada
S. hominis homin
FemA
coalhada
S. hominis homin
SEH/SEI
coalhada
S. hominis homin
Secreção de pele (humano)
S. haemolyticus
leite pasteurizado
S. cohnii
Blaz
Figura 1. Dendrograma gerado a partir da análise de perfis moleculares obtidos por REP-PCR
em Staphylococcus spp. isolado de leite cru e pasteurizado, utensílios, equipamentos, mão de
manipulador e queijo coalho fabricado com leite de cabra pasteurizado
59
5. Conclusão
Staphylococcus coagulase negativa multirresistentes colonizam diversos
pontos na linha de processamento de queijo coalho produzido com leite de cabra,
incluindo o queijo pronto para consumo com 24 horas e 30 dias de fabricação.
Genes
de
resistência
e
enterotoxigênicos
estão
presentes
em
Staphylococcus aureus e em Staphylococcus coagulase negativo isolado de pontos
da produção de queijo coalho elaborado com leite de cabra.
Considerando os pontos avaliados, a REP-PCR mostrou perfis moleculares
distintos para os isolados no estudo. Staphylococcus spp. de espécies identificadas
em queijos não foram similares a outras espécies observadas em outros pontos
avaliados. Por outro lado, Staphylococcus saprophyticus identificados em mãos de
manipuladores diferentes foram similares a isolados do queijo coalho.
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63
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A produção de leite de cabra é uma atividade economicamente importante
para a agricultura familiar desenvolvida em algumas regiões do Nordeste,
principalmente para a região do cariri paraibano. Produtos fabricados com leite de
cabra com características regionais podem atuar como uma estratégia de marketing
para incentivar o consumo de queijos, por consumidores de paladar refinado.
Alguns atributos como a qualidade microbiologia do leite de cabra pode
interferir na transformação do leite em outros produtos como queijos, ou ainda
tornar-se prejudicial à saúde humana, do ponto de vista da segurança alimentar.
Desta forma, métodos de genotipagem rápidos e de baixo custo podem ser
utilizados na identificação de pontos críticos de controle na produção de leite de
cabra e derivados.
A partir da análise de perfis de similaridade gerados pela REP-PCR com
Rw3A será possível traçar medidas de controle simples que possam garantir um leite
de cabra com melhor qualidade, do ponto vista microbiológico, e que atenda aos
padrões requeridos para a produção de um alimento seguro.
Staphylococcus spp. com potencial para a produção de enterotoxinas e para
resistência antimicrobiana estão amplamente distribuídos no ambiente de produção
de queijos produzidos com leite de cabra pasteurizado, e portanto, medidas de
controle devem ser providenciadas.
A mão dos manipuladores, utensílios e equipamentos são fontes importantes
na disseminação de microrganismos resistentes principalmente a antibióticos βlactâmicos do grupo das penicilinas. Igualmente, Staphylococcus spp. produtores de
biofilme estão presentes na linha de produção de queijo de cabra. Contudo, os
mecanismos pelos quais a estrutura do biofilme pode ser produzida em superfícies
envolvidas na produção de queijos fabricados com leite de cabra necessitam ser
investigados.
Os fatores de patogenicidade em Staphylococcus spp. favorecem a
colonização, adaptação e disseminação do microrganismo em tecidos e ambientes.
Dessa forma, a presença de Staphylococcus spp. em distintos pontos da produção
de queijo coalho são relevantes para a saúde pública visto que apresentam genes
de virulência que até então eram atribuídos apenas a Staphylococcus aureus.
64
ANEXO
Descrição dos oligonucleotídeos utilizados na identificação dos fatores de virulência
e na genotipagem de Staphylococcus spp.
Oligonucleotídeos
iniciadores
Tamanho
Sequência
do
Referência
fragmento
ATGGTCAAGCCCAGACAGAG
ica-D
sea
seb
sec
sed
see
seg
seh
sei
CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA
TTGGAAACGGTTAAAACGAA
GAACCTTCCCATCAAAAACA
TCGCATCAAACTGACAAACG
GCAGGTACTCTATAAGTGCC
GACATAAAAGCTAGGAATTT
AATCGGATTAACATTATCC
CTAGTTTGGTAATATCTCCT
TAATGCTATATCTTATAGGG
TAGATAAAGTTAAAACAAGC
TAACTTACCGTGGACCCTTC
AATTATGTGAATGCTCAACCCGATC
AAACTTATATGGAACAAAAGGTACTAGTTC
CAATCACATCATATGCGAAAGCAG
CATCTACCCAAACATTAGCACC
CTCAAGGTGATATTGGTGTAGG
AAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTC
198pb
(2012)
120pb
478pb
257pb
317 pb
170 pb
642 pb
GCTTGACCACTTTTATCAGC
CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAAA
(1991)
Blaiotta et al.
(2004)
com
modificações
577pb
Vesterholm517 pb
Nielsen et al.
(1999)
GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA
mec A
Johnson et al.
376 pb
AAGAGATTTGCCTATGCTTC
blaz
Szweda et al.
Jonas et al.
310 pb
(1999)
Adaleti et al.
(2007)
AAAAAAGCACATAACAAGCG
Fem A
GATAAAGAAGAAACCAGCAG
Mehrotra et al.
132pb
(2000)
Blaiota et al.
(2004)
Rw3A
TCGCTCAAAACAACGACACC
-
Van Der Zee et
al. 1999
65

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