Hepatitis C (anti-HCV)

Hepatitis C (anti-HCV)
ELISA
Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a determinação
de anticorpos contra o vírus da hepatite C
SIGNIFICADO CLÍNICO
O vírus da hepatite C é causador de 90% das hepatite não-A
não B que é transmitido pela via parenteral, sendo os principais grupos de risco os hemofílicos, hemodializados, usuários de drogas e homossexuais. A principal característica da
enfermidade, produzida por este vírus é que 50% dos infectados podem desenvolver hepatite crônica.
O diagnóstico da infeção se realiza baseado na detecção dos
anticorpos anti-HCV. É muito importante a sua deteção não
só para o diagnóstico da infeção mas também para o controle
de unidades de doadores em bancos de sangue e para distinguir de outras hepatites crônicas de etiologia desconhecida.
INSTRUÇÕES DE USO
Tampão de Lavagem: para usar, diluir 1+4 com água destilada (uma parte de Tampão de Lavagem concentrado com
mais quatro partes de água destilada). A baixa temperatura
os componentes do reagente podem precipitar, em tal caso,
colocar em banho-maria a 37oC uns minutos misturando logo
por inversão.
Diluente de Amostras: pronto para uso. A cor do Diluente de
Amostra pode ter variações segundo o lote a ser utilizado
sem que afete a capacidade de reação de mesmo.
Microplaca sensibilizada, Conjugado, Revelador A e B,
Stopper e Controles Positivo e Negativo: prontos para uso.
FUNDAMENTOS DO MÉTODO
A amostra se dilue no suporte onde se encontra imobilizada
uma mistura de antígenos sintéticos e recombinantes contendo seqüências de zonas antigênicas das proteínas estruturais (core) e não estruturais (NS3, NS4 e NS5) do HCV*. Se
as amostras de soro contem os anticorpos específicos, estes formarão um complexo com os antígenos e permanecerão unidos ao suporte. A fração que não ficou unida é descartada pela lavagem, logo após são acrescentados anticorpos
anti-imunoglobulina humana conjugado com peroxidase. Se
é produzida a reação no primeiro estágio do processo, se
unirá ao conjugado. Logo após uma nova lavagem deve se
acrescentar o substrato enzimático e o cromegênio. No caso
da união do conjugado aparecerá uma coloração azul clara. A
reação pode ser bloqueada com ácido sulfúrico, mudando a
cor de azul claro para amarelo.
PRECAUÇÕES
- Todas as amostras de pacientes devem ser manipuladas
como se fossem capazes de transmitir infecção. Os controles encontram-se inativados. No entanto, devem ser usados como se tratando de material infectado.
- Os soros controles foram examinados para antígenos de
superfície da hepatite B (HBsAg) e vírus da imunodeficiência humana (HIV) encontrando-se não reativos.
- A microplaca encontra-se sensibilizada com antígenos sintéticos e recombinantes de HCV. Pode-se descartar qualquer possibilidade de contaminação con a mesma.
- Todos os materiais empregados no ensaio devem ser destruídos a fim de assegurar a inativação dos agentes patogênicos. O método recomendado para este procedimento é
autoclavar durante 1 hora a 121oC. Os líquidos de dejeto
podem ser desinfetados com hipoclorito de sódio (concentração final 5%) durante no mínimo 60 minutos.
- Não misturar reagentes de diferentes kits e lotes.
- Não usar reagentes de outra origem.
- As microplacas devem ser incubadas em estufa. Não usar
banho-maria. Deve-se evitar abrir a estufa durante este processo.
- Evitar que vapores de hipoclorito provenientes dos recipientes para dejetos biológicos entrem em contato com a microplaca, já que o hipoclorito afeta a reação.
- Os reagentes são para uso “in vitro”.
- Evitar o contato do ácido sulfúrico com a pele ou mucosas.
- Evitar derramar os líquidos e a formação de aerosóis.
REAGENTES FORNECIDOS
Microplaca sensibilizada: microplaca de tiras removíveis
com cubetas contendo antígenos sintéticos e recombinantes
de hepatite C, imobilizados.
Conjugado: anti-imunoglobulina humana (cabra) conjugados
com peroxidase.
Revelador A: peróxido de hidrogênio 60 mmol/l em tampão
citrato 50 mmol/l pH 3,2.
Revelador B: tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mol/l em ácido
clorídrico 0,1 N.
Stopper: ácido sulfúrico 2 N.
Tampão de Lavagem concentrado: cloreto de sódio 1,4 M
em tampão fosfatos 100 mM e tensioativo não iônico 0,1 g/l.
Diluente de Amostras: albumina bovina em solução fisiológica tamponada com tampão fosfatos pH 7,2.
Controle Positivo: diluição de soro inativado contendo anticorpos contra HCV.
Controle Negativo: diluição de soro não reativo inativado.
*Pat. pend.
ESTABILIDADE E INSTRUÇÕES DE
ARMAZENAMENTO
Os Reagentes Fornecidos são estáveis sob refrigeração (2-10oC)
até a data do vencimento indicada na embalagem. Não congelar.
Tampão de Lavagem: é estável 3 mêses a temperatura ambiente.
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Microplaca sensibilizada: as tiras de cubetas com antígeno imobilizado são fornecidas fechadas no vácuo e com dessecante. Não abrir o envoltório até o momento de uso, nem
antes que esteja a temperatura ambiente, pois ao contrário
se favorecerá a humectação do conteúdo. As tiras de cubetas
não utilizadas devem ser conservadas na embalagem com o
dessecante, fechado com fita auto-adesiva e a 2-10oC. As
tiras conservadas nestas condições podem ser utilizadas nos
3 meses posteriores desde que não se ultrapasse a data de
vencimento do kit.
AMOSTRA
Soro ou plasma
a) Coleta: obter soro da maneira usual. Não devem ser usadas amostras inativadas pelo calor. Vide LIMITAÇÕES DO
PROCEDIMENTO.
b) Aditivos: não são necessários para soro. Ao empregar
plasma poderá ser utilizado qualquer anticoagulante de uso
corrente na prática transfusional.
c) Substâncias interferentes conhecidas: a hemólise, hiperlipemia e outras causas de turbidez podem ser causa de
resultados errôneos. Estas amostras devem ser clarificadas
por centrifugação.
d) Estabilidade e instruções de armazenamento: as amostras não diluídas podem ser conservadas durante 7 dias entre
2-10oC. Para conservação por períodos mais prolongados devem ser congelados a -20oC ou temperaturas menores. Evitar
os congelamentos e descongelamentos reiterados. Existem
evidências que mostram que os congelamentos sucessivos
podem ser causa de resultados errôneos.
Se as amostras precisam ser transportadas, embalar de acordo com as especificações legais relativas ao envio de materiais infecciosos.
MATERIAL NECESSÁRIO (não fornecido)
- Micropipetas para medir os volumes indicados.
- Relógio alarme ou cronômetro.
- Estufa a 37oC.
- Espectrofotômetro para leitura de microplacas.
- Lavadora de microplacas.
CONDIÇÕES DE REAÇÃO
- Longitude de onda primária: 450 nm
- Longitude de onda secundária (bicromática): 620 nm
- Calibração do instrumento: levar a zero o espectrofotômetro
com Branco de Reagente, processado da mesma forma que
uma determinação, mas omitindo a colocação da amostra.
- Tempo de reação: variável conforme o procedimento selecionado.
- Temperatura de reação: 37 ± 2oC e temperatura ambiente
(18-25oC).
- Volume de amostra: 10 ul
PROCEDIMENTO
I- TÉCNICA COM REVELADORES SEPARADOS
Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente
antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve
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ser completada sem interrupção.
Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3
Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as
amostras e/ou Controles sobre o Diluente de Amostras,
deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do
líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensando na cubeta
para assegurar a correta homogeneização.
Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar:
Diluente de Amostras
D
CP
CN
200 ul
200 ul
200 ul
Controle Positivo
-
10 ul
-
Controle Negativo
-
-
10 ul
10 ul
-
-
Amostra
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos após pipetadas as amostras
em cada tira. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar em estufa 30 ± 2 minutos
a 37 ± 2oC. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de
cada cubeta desprezando-o em um recipiente para dejetos biológicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na
continuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (preparado conforme as instruções de uso da pág. 1) empregando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada lavagem o líquido deve ser descartado no recipiente com
hipoclorito. Empregar lavador automático. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual,
invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre
papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão
nas laterais maiores do suporte, para evitar a caída das
tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta:
Conjugado
50 ul
50 ul
50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. No procedimento manual, para
evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante 30 ± 2
minutos em estufa a 37 ± 2oC. Após, aspirar o líquido das
cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e
lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual,
invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre
papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão
sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída
das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta respeitando a orden dos reagentes:
Revelador A
50 ul
50 ul
50 ul
Revelador B
50 ul
50 ul
50 ul
Pode-se colocar 1 gota de cada Revelador, utilizando o
frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. Incubar 30 ± 2 minutos a tem-
peratura ambiente (18-25oC), após adicionar:
Stopper
50 ul
50 ul
50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a
450 nm ou bicromática a 450/620 nm.
II-TÉCNICA COM REVELADORES PRÉ-MISTURADOS
Levar os reagentes e amostras a temperatura ambiente
antes de iniciar a prova. Uma vez iniciada a análise deve
ser completada sem interrupção.
Processar simultaneamente 2 Controles Positivos (CP), 3
Negativos (CN) e os Desconhecidos (D). Ao dispensar as
amostras e os Controles sobre o Diluente de Amostras,
deve assegurar-se de colocar os mesmos no centro do
líquido e não sobre as paredes ou o fundo da cubeta. Enxaguar a pipeta com o Diluente dispensando na cubeta
para assegurar uma correta homogeneização.
Nas cubetas a utilizar da microplaca colocar:
D
CP
CN
200 ul
200 ul
200 ul
Controle Positivo
-
10 ul
-
Controle Negativo
-
-
10 ul
10 ul
-
-
Diluente de Amostras
Amostra
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos após pipetadas as amostras
em cada tira. No procedimento manual, para evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar em estufa 30-35 minutos
a 37 ± 2oC. Após, aspirar cuidadosamente o líquido de
cada cubeta desprezando-o em um recipiente para dejetos biológicos que contenha hipoclorito de sódio a 5%. Na
continuação, lavar 5 vezes com Tampão de Lavagem (preparado conforme as instruções de uso da pág. 1) empregando aproximadamente 300 ul/vez/cubeta. Após cada lavagem o líquido deve ser descartado no recipiente com
hipoclorito. Empregar lavador automático. Ao finalizar a
última lavagem, eliminar completamente o líquido residual, invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a
mão nas laterais maiores do suporte, para evitar a caída
das tiras de cubetas. Após adicionar em cada cubeta:
Conjugado
50 ul
50 ul
50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. No procedimento manual, para
evitar a evaporação, cobrir a placa e incubar durante 20-25
minutos em estufa a 37 ± 2oC. Após, aspirar o líquido das
cubetas, desprezando-o no recipiente com hipoclorito e
lavar conforme se indicou anteriormente. Ao finalizar a última lavagem, eliminar completamente o líquido residual,
invertendo a microplaca e batendo-a várias vezes sobre
papel absorvente, exercendo uma leve pressão com a mão
sobre as laterais maiores do suporte, para evitar a caída
das tiras de cubetas. Após adicionar una mistura de partes iguais de Revelador A + Revelador B (estável 24 horas):
Reveladores misturados
100 ul
100 ul
100 ul
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. Incubar 20-25 minutos a temperatura ambiente (18-25oC), após adicionar:
Stopper
50 ul
50 ul
50 ul
Pode-se colocar 1 gota, utilizando o frasco gotejador fornecido.
Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 10 segundos. Ler em espectrofotômetro a
450 nm ou bicromática a 450/620 nm.
ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL
A cor da reação é estável durante 30 minutos, portanto os
resultados devem ser observados durante este período.
CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO DA CORRIDA
A prova é considerada válida se cumpridas simultaneamente
as seguintes condições:
a) As leituras de pelo menos 2 dos 3 Controles Negativos
corrigidas contra o Branco de Reagente devem ser menores
ou iguais a 0,150 D.O.
b) A leitura média dos Controles Positivos corrigida deve ser
maior ou igual a 0,600 D.O.
Se uma ou ambas as condições não se cumprirem, repetir a
prova.
Para ambos os casos lembrar que as leituras obtidas dependerão da sensibilidade do aparelho empregado.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
A presença ou ausência de anticorpos anti-HCV é determinada
pela relação da absorbância da amostra com o valor Cut-off.
Cut-off = CN + 0,150 D.O.
onde CN: média das leituras do Controle Negativo.
Zona de indeterminação: Cut-off ± 10%
Amostras Não Reativas: são consideradas aquelas com
absorbâncias menores que o limite inferior da zona de indeterminação.
Amostras Reativas: são consideradas aquelas com absorbâncias maiores que o limite superior da zona de indeterminação.
Amostras Indeterminadas: são consideradas aquelas com
absorbâncias que caem dentro da zona de indeterminação.
Estas amostras devem ser ensaiadas novamente.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Vide Substâncias interferentes conhecidas em AMOSTRA.
- Constituem causas de resultados errôneos:
Lavagem incorreta das cubetas de reação.
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Contaminação cruzada de amostras Não Reativas com anticorpos procedentes de uma amostra Reativa.
Contaminação da solução cromogênica com agentes oxidantes (cloro, etc.).
Contaminação do Stopper.
Conservação inadequada das tiras de cubetas não utilizadas.
Utilizar banho-maria para a incubação.
Contaminação do Tampão de Lavagem diluído: recomendase conferir a limpeza dos frascos onde é preparado e armazenado. Se for observada turbidez ou precipitação na preparação, despreza-lo.
- Um resultado negativo não exclue a possibilidade de exposição ou infecção pelo HCV.
- Ocasionalmente, ao realizar leituras bicromáticas, podem
obter-se absorbâncias negativas que não interferem na determinação, isto porque algumas amostras podem resultar
com leituras abaixo do Branco de Reagente.
- Não utilizar amostras inativadas pelo calor já que podem
obter-se resultados falsos positivos.
Certifique-se que o sistema de lavagem que está sendo usado aspire totalmente o conteúdo e que o volume da solução
de lavagem dispensada seja regular.
- Tam, A.W. et. al. - Virology 185:120-131 (1991).
- Rodriguez, R.et.al. - Proceedings V Forum on AIDS, Hepatitis
and other blood-borne diseases - Atlanta (1992) pág.89.
- Lorenzo ,L.E.; Rojkín, L.F.; Riezu, R.; García-Granero, M.;
Borrás F.; Berasain, C.; Prieto, J. - Clin Chem. 39/6:1252
(1993).
- Berasain, C.; García-Granero, M.; Riezu-Boj, J.; Civeira, M.;
Prieto, J.; Borrás-Cuesta, F. - J. Hepatol. 18:80-84 (1993)
- Rojkín, L.F. - Libro de resúmenes del VII Congreso Argentino
de Farmacia y Bioquímica, Buenos Aires, pág. 28, 1996.
- Lorenzo, L.E.; Rojkín, L.F.; Carlomagno, A.E.; Gariglio, R.C.
- Clin. Chem. 41/56:S90, 1995.
- Rojkín, L.F.; Felcaro, M.V.; Lorenzo, L.E.; Rey, J.; Tomeo,
J.A. - Libro de resúmenes XII Congreso Latinoamericano de
Bioquímica Clínica - Setiembre 1995, Buenos Aires - Argentina, pág.108, Abs, 175.
PERFORMANCE
a) Sensibilidade: em un estudo realizado com diferentes
paneis comerciais, internacionais, obtiveram-se os seguintes
resultados:
- Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel (PHV 205), Boston
Biomedica, Inc.: foram dectadas 23 das 23 amostras positivas.
- Anti-HCV Low Titer Performance Panel (PHV 103), Boston
Biomedica, Inc.: foram detectadas 12 das 14 amostras positivas.
- Worldwide HCV Performance Panel (WWHV 301), Boston
Biomedica, Inc.: foram detectadas 17 das 18 amostras positivas.
- Panel 2 HCV, Q Panel Assessoria & Controle de Qualidade:
foram detectadas 7 das 7 amostras positivas.
Em outro estudo realizado com 62 amostras com sorologia
positiva segundo outros métodos ELISA utilizados como referência, foram detectadas 61 amostras.
b) Especificidade: em um estudo realizado com 386 amostras de soros e plasmas provenintes de bancos de sangue e
consultórios externos, a especificidade estimou-se em 99,5%.
Em uma população de 108 pessoas hospitalizadas e ambulatórias, encontrou-se uma especificidade de 98,1%.
PARÂMETROS PARA ANALISADORES AUTOMÁTICOS
Vide as adaptações específicas para cada tipo de analisador,
que deverão ser solicitadas ao setor Marketing da Wiener lab.
APRESENTAÇÃO
- Kit para 96 determinações (Cód. 1483251).
REFERÊNCIA
- Merrifield, B. - Science 232:341 (1986).
- Engvall, E. - Methods in Enzymology 70:419 (1980).
- Oubiña, J. - Rev. Arg. de Transf. XVII/1:35 (1991).
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Importador exclusivo
Labinbraz Comercial Ltda.
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