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HemosIL® ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503 FRANÇAIS - Révision de la notice 10/2012 Utilisation Pour la détermination chromogénique de l’activité du facteur VIII dans les plasmas humains citratés.1 Ceci inclut, l’identification d’une déficience en facteur VIII, la surveillance des patients sous thérapie supplétive ainsi que l’estimation des potentialités des concentrés de facteur VIII.2 Principe Le facteur VIII est une protéine plasmatique de haut poids moléculaire, cofacteur du facteur IXa lors de l’activation du facteur X en Xa.3 La déficience en facteur VIII est responsable d’un grave trouble hémorragique, l’hémophilie A. Il existe un rapport inverse entre la gravité de cette pathologie et la concentration en facteur VIII. Les patients atteints d’hémophilie A sont généralement classés en trois catégories sur la base de leur activité en facteur VIII, à savoir: < 0,01 UI/mL = hémophilie sévère 0,01 à 0,04 UI/ ml = hémophilie modérée 0,05 à 0,25 UI/mL = hémophilie mineure.4 En présence d’ions calcium et de phospholipides, le facteur X est activé en facteur Xa par le facteur IXa. Cette activation est fortement stimulée par le facteur VIII, qui joue ici un rôle de cofacteur. La mise en oeuvre de quantités optimales de Ca2+, de phospholipides et de facteur IXa, plus un excès de facteur X, se traduira par une relation linéaire entre la vitesse d’activation du facteur X et la quantité de facteur VIII. Le facteur Xa hydrolyse le substrat chromogène, libérant le groupe chromophore pNA. La coloration est ensuite mesurée à 405 nm. La quantité de facteur Xa générée, et donc l’intensité de la coloration, est proportionnelle à l’activité du facteur VIII dans l’échantillon. Afin d’éviter l’hydrolyse du substrat chromogène par la thrombine formée, on ajoute en même temps que le substrat l’inhibiteur synthétique de la thrombine.5-7 Facteur IXa, Ca2+, Phospholipide 1. Facteur X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Facteur Xa Facteur VIII Facteur Xa 2. Substrat −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptide + pNA Zone de dosage 0-1,5 UI/mL 0-0,05 UI/mL Echantillons/contrôles/standards dilués 50 µl 50 µl Mélanger et incuber à 37°C pendant 3-4 minutes 3-4 minutes Réactif facteur (préincuber à 37°C) 50 µl 50 µl Mélanger et incuber à 37°C pendant 2 minutes 4 minutes Substrat chromogène (préincuber à 37°C) 50 µl 50 µl A. Méthode cinétique: lire la densité optique à 405 nm entre 30 et 120 secondes B. Méthode en point final: procéder comme décrit ci-dessous. Mélanger et incuber à 37°C pendant 2 minutes 10 minutes Acide acétique à 20% ou acide citrique à 2% 50 µl 50 µl Mélanger Lire l’absorbance à 405 nm par rapport au tampon de travail. Si possible, lire et soustraire l’absorbance à 490 nm afin de compenser les interférences dues à la microplaque. c. Méthode en tube Utiliser 200 µl au lieu de 50 µl pour toutes les étapes de pipetage. d. Nombre de dosages par trousse Méthode en microplaque: 120Méthode en tube: 30 e. Calcul Soustraire l’absorbance du blanc échantillon de l’absorbance (A) à 405 nm pour chacun des standards. Sur une feuille de papier millimétré, reporter en ordonnée la valeur de l’absorbance par minute (ΔA/mn) ou de l’absorbance (A) pour chacun des standards et en abscisse la valeur de la concentration en facteur VIII correspondante (ΔA/mn ou A en ordonnée et UI/mL de facteur VIII en abscisse) Relier les points en traçant la droite la mieux ajustée. Les échantillons sont évalués sur la base de cette courbe de calibrage. Droite d’étalonnage Un exemple de droite d’étalonnage type (méthode sur microplaque) est présenté ci-dessous: Normal range. End-point method in microplate Composition 0.8 Le coffret ELECTRACHROME Factor VIII (Facteur VIII) contient: S Chromogenic substrate (Réf. 4973050310): 1 flacon de 6 ou 7 ml de S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA•2HCl (7,7 mg/ flacon), d’inhibiteur synthétique de la thrombine I-2581 (0,2 mg/flacon) et de mannitol comme stabilisant. B Buffer (Réf. 4973050330): 2 flacons de 24 ml de tampon Tris 0,025 mol/l (solution mère), pH 7,9, force ionique 0,08 contenant du polybrène, du NaCl et de la sérum albumine bovine. PRECAUTIONS: Contient des produits d’origine bovine. Les animaux sources ont été déterminés comme indemnes d’ESB. Les animaux sources ont été l’objet d’une inspection des services sanitaires vétérinaires ante et post mortem et déterminés comme indemnes de tout agent infectieux ou contagieux. Cependant, ce matériel doit être manipulé et considéré comme potentiellement infectieux. Classification risque: Aucune Phrases risque: Aucune Phrases sécurité: Aucune Ce produit est à usage diagnostique in vitro. Préparation Chromogenic substrate: Dissoudre le contenu du flacon avec 6 ml (Méthode en microplaque et Méthode en tube, ACL 8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 7 ml (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.8 Replacer le capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit. Conserver le réactif à 15-25°C pendant 10-30 minutes et retourner le flacon pour mélanger doucement le contenu avant utilisation. Factor reagent: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 3 ml (Méthode en microplaque et Méthode en tube, ACL 8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 3,5 ml (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.8 Replacer le capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit. Conserver le réactif à 15-25°C pendant 10-30 minutes et retourner le flacon pour mélanger doucement le contenu avant utilisation. Buffer: Tampon de travail - diluer la solution mère en mélangeant 1 volume de solution mère avec 9 volumes (Méthode en microplaque et Méthode en tube, ACL 8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 7 volumes (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.8 Le flacon contenant cette solution de travail doit être clairement identifié. NOTE: Les réactifs ne sont pas interchangeables entre lots. Conservation et stabilité du réactif Conservés à 2-8°C, les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur les flacons. Substrat chromogène - Stabilité après reconstitution, 1 mois à 2-8°C dans le flacon d’origine. Réactif facteur - Stabilité après reconstitution, 12 heures à 2-8°C, 2 semaines à -30°C ou 1 mois à -70°C dans le flacon d’origine. Eviter le stockage à -20°C. Tampon (Tampon de travail) - Stabilité après dilution, 1 mois à 2-8°C. Pour une stabilité optimale, conserver les réactifs à 2-8°C dans le flacon d’origine entre chaque utilisation. ATTENTION: Eliminer la solution de substrat si elle présente une coloration jaune. A 405 nm Factor reagent (Réf. 4973050320): 2 flacons de 3 ou 3,5 ml d’une préparation contenant du facteur IXa bovin (0,3 U/flacon), du facteur X (2,7 UI/flacon) et de la thrombine (1 NIH-U/flacon) colyophilisés avec du CaCl2 (40 µmol/ flacon) et des phospholipides (0,2 µmol/flacon). 0.4 Procédures de test/Instrument 25 µl 2000 µl 0.2 0.1 0 0 0 0.5 1 Limites de la méthode et substances interférant avec celle-ci 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 f. Résultats Les valeurs d’absorbances des points de la droite d’étalonnage doivent se trouver dans les limites suivantes: Standard Courbe normale 0-1,5 UI/mL 0,0 UI/mL 1,0 UI/mL Courbe basse 0-0,05 UI/mL 0 UI/mL 0,05 UI/mL Méthode en microplaque Absorbance Méthode Méthode cinétique en point final <0,06 <0,12 0,16-0,32 0,33-0,63 Méthode cinétique <0,14 0,38-0,74 Méthode en tube Absorbance Méthode en point final <0,21 0,58-1,11 <0,02 0,02-0,05 <0,04 0,04-0,11 <0,18 0,17-0,44 <0,32 0,29-0,76 II. Méthode d’analyse ELECTRA® Préparation des étalons et des réactifs 1. Préparer le plasma de référence et les contrôles comme indiqué dans les notices correspondantes. L’analyseur diluera automatiquement les points de la courbe d’étalonnage. 2. Placer les réactifs et le plasma de référence comme indiqué ci-dessous. a. ELECTRA paramétrage instrument Instrument Protocole E1600C 4 Nombre de canaux 4 Substrat 1 5 4 Réactif facteur Substrat Réactif facteur E1800C E1400C 4 Type de réactif Pompe Position n° pompe B Couleur éch. therm Transp. Volume de réactif (µl) 75 F Transp. 75 1 B Transp. 75 4 F Transp. 75 Type d’échantillon Tampon de travail Plasma de réf. Tampon de travail Plasma de réf. Position réactif princ. A Vol. d’échantillon (µl) 50 B 50 A 50 B 50 NOTE: Se reférer au mode d’emploi spécifique de l’instrument ELECTRA pour des informations complémentaires. Calculs: les valeurs des patients sont calculées automatiquement à partir de la droite d’étalonnage et les résultats du facteur VIII sont indiqués en activité (UI/mL). b. Droite d’étalonnage ELECTRA Un exemple de droite d’étalonnage type (méthode d’analyse ELECTRA) est présenté ci-dessous. Type de graphique: linéaire/linéaire Type de courbe: linéaire Dilution de l’échantillon: 1/62 0.60 1:52 0.50 A B S / M I N 1:62 0.40 0.30 1:124 0.20 Valeurs attendues Les valeurs normales de cette étude ont été obtenues en utilisant le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII. Méthode N Valeurs (unités) Méthode en microplaque 61 50 - 200 (% activité (M=28, F=33; âgés de 21 à 55 ans) Du fait qu’un grand nombre de variables peuvent affecter les résultats, nous recommandons à chaque laboratoire d’établir ses propres valeurs normales. Caractéristiques et performances Précision: Les résultats suivants donnent le coefficient de variation (CV %) obtenu pour trois activités en facteur VIII différentes, déterminées par la méthode en microplaques. Chaque laboratoire doit établir ses propres données relatives à la précision de la méthode. Moyenne FVIII Intra-séries Inter-séries Concentration CV % n=42 CV % n=6 N=7 1,0 UI/mL 2,4% 2,1% 0,25 UI/mL 2,6% 5,9% 0,03 UI/mL 3,0% 3,9% Lors d’études complémentaires, la précision intra-séries a été évaluée au cours d’essais multiples en utilisant le réactif ELECTRACHROME Facteur VIII. Les résultats obtenus sont les suivants: ACL 8000/9000/10000 Facteur VIII Moyenne (UI/mL) 0,90 0,39 0,07 CV (%) 5,15 6,06 4,57 ACL Futura/ACL Advance Moyenne (UI/mL) CV % (Intra-séries) CV % (Total) Valeur haute 1,97 1,70 1,90 Valeur haute 3,67 1,73 3,97 Valeur normale 0,99 1,62 3,52 Valeur normale 0,42 3,59 5,41 Valeur basse 0,05 2,51 2,86 Valeur basse 0,01 2,84 4,55 ELECTRA Moyenne (UI/mL) CV % (Intra-séries) CV % (Total) Plasma normal de référence, titré 0,80 2,72 2,68 Plasma anormal de référence, titré 0,25 2,15 2,43 Corrélation: Les dosages font apparaître une corrélation significative avec le Coatest Facteur VIII. ELECTRACHROME FVIII (Méthode en tube) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (microplaques) r=0,96 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ACL) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900) r=0,98 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest) Dans une étude complémentaire, comparant les résultats obtenus avec le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII utilisé sur un analyseur ACL 9000 à ceux obtenus avec le même coffret sur un analyseur ELECTRA 1400C, le coefficient de corrélation était de 0,98. UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C) Linéarité: 20 40 60 80 100 120 % c. Nombre de dosages par trousse sur analyseur ELECTRA Facteur VIII jusqu’à 60 III. Méthode d’analyse sur les analyseurs de coagulation IL Prendre contact avec le représentant local I.L. pour des informations relatives à chacune des applications disponibles. a. Nombre de dosages par trousse sur les analyseurs ACL 8000/9000/10000 Facteur VIII 110 tests (approx.) b. Nombre de dosages par trousse sur les analyseurs ACL Futura/ACL Advance Facteur VIII 120 tests (approx.) Recueil des spécimens et préparation Au moment du prélèvement, le patient doit être au repos et non stressé. 9 parts de sang fraîchement prélevé sont collectées avec 1 part de citrate trisodique.9 Le plasma doit être séparé des cellules le plus tôt possible et testé dans les 30 minutes. Si la réalisation du test n’intervient pas tout de suite, conserver le plasma à -20°C durant une semaine au maximum ou à -70°C durant un an au maximum. Les échantillons ne doivent pas être stockés dans un congélateur à dégivrage automatique, ni être décongelés et recongelés avant le dosage. Durant le transport les échantillons congelés doivent être conservés dans la glace. Se référer au document NCCLS H21-A3 ou au document GEHT (STV, numéro spécial, 1-40, 1998) pour plus d’informations sur le prélèvement des échantillons, leur manipulation et leur stockage.9 NOTE: Des pertes d’activité en facteur VIII de près de 20% peuvent se produire lors de la congélation et de la décongélation, surtout si le plasma est congelé lentement. ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503 La courbe normale donne une linéarité de la méthode de 0,05-1,5 UI/mL et la courbe basse de 0,005-0,05 UI/mL (Méthode en microplaque et tube). La courbe normale donne une linéarité de la méthode de 0,10-1,2 UI/mL et la courbe basse de 0,00-0,10 UI/mL (ACL 8000/9000/10000). La courbe haute donne une linéarité de la méthode de 0,38-3,82 UI/mL, la courbe normale de 0,09-1,5 UI/mL et la courbe basse de 0,011-0,135 UI/mL (ACL Futura/ACL Advance). La linéarité est de 0,00-1,2 UI/mL sur l’analyseur ELECTRA. Sensibilité: Analyseur Valeur haute Valeur normale Valeur basse Méthode en microplaque N/A 0,36 2,4 (mAbs/min pour 1 UI/dl d’activité FVIII) ACL Futura/ACL Advance 0,035 0,035 0,306 (mAbs/min pour 1 UI/dl d’activité FVIII) Limite de détection: Analyseur Valeur haute Valeur normale Valeur basse Méthode en microplaque et tube UI/mL N/A 0,05 0,005 ACL Futura/ACL Advance UI/mL 0,09 0,09 0,005 ITALIANO - Revisione dell’inserto 10/2012 Conservazione e stabilità dei reagenti Kit con substrato cromogenico per la determinazione fotometrica dell’attività del Fattore VIII nel plasma umano citratato.1 Permette il rilevamento delle carenze di Fattore VIII, il controllo dei pazienti in terapia sostitutiva e la valutazione dell’attività dei concentrati di Fattore VIII.2 I reagenti sigillati sono stabili a 2-8°C fino alla data di scadenza stampata sull’etichetta del flacone. Substrato cromogenico- Stabilità dopo la ricostituzione: 1 mese a 2-8°C nel flacone originale. Reagente fattori - Stabilità dopo la ricostituzione: 12 ore a 2-8°C, 2 settimane a -30°C o 1 mese a -70°C nel flacone originale. Non conservare a -20°C. Tampone (tampone di lavoro) - Stabilità dopo la preparazione: 1 mese a 2-8°C. Al termine dei cicli lavorativi si consiglia di conservare i reagenti a 2-8°C nel flacone originale per una migliore stabilità. NOTA: Non utilizzare il substrato se la soluzione presenta un colore giallo. Principio del metodo Il Fattore VIII è una proteina plasmatica ad alto peso molecolare che agisce come co-fattore del Fattore IXa nell’attivazione da Fattore X a Fattore Xa.3 Una carenza di Fattore VIII causa una grave malattia della coagulazione: l’emofilia A. La gravità di questo disturbo emorragico è inversamente correlata alla concentrazione del Fattore VIII. Pazienti affetti da emofilia A sono in genere classificati, sulla base dell’attività del Fattore VIII, in tre categorie: <0,01 UI/mL (emofila grave); 0,01-0,04 UI/mL (emofilia moderata); 0,05-0,25 UI/mL (emofilia leggera).4 In presenza di ioni calcio e di fosfolipidi, il Fattore X viene attivato a Fattore Xa dal Fattore IXa. Questa attivazione è fortemente stimolata dal Fattore VIII che agisce come co-fattore. Usando quantità ottimali di Ca2+, fosfolipidi, Fattore IXa, ed un eccesso di fattore X, la velocità di attivazione del Fattore X risulta correlata linearmente alla quantità di Fattore VIII presente. Il Fattore Xa idrolizza il substrato cromogenico facendo così liberare il gruppo cromoforo pNA. Si misura quindi il colore sviluppato a 405 nm. Il Fattore Xa così generato, e quindi l’intensità del colore, sono proporzionali all’attività del fattore VIII presente nel campione. L’idrolisi del substrato cromogenico ad opera della trombina formatasi può essere evitata aggiungendo al substrato un inibitore sintetico della trombina.5-7 Fattore IXa, Ca2+, Fosfolipidi 1. Fattore X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Fattore Xa Fattore VIII Fattore Xa 2. Substrato −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptide + pNA Composizione Il kit ELECTRACHROME Factor VIII è composto da: S Chromogenic substrate (Nr. Cat. 4973050310): 1 flacone da 6 o 7 mL di substrato cromogenico liofilizzato S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl (7,7 mg/flacone) con aggiunta di un inibitore sintetico della trombina I-2581 (0,2 mg/flacone) e di mannitolo. Factor reagent (Nr. Cat. 4973050320): 2 flaconi da 3 o 3,5 mL di reattivo Fattore IXa bovino (0,3 U/flacone) con aggiunta di Fattore X (2,7 UI/flacone) e di trombina (1 UNIH/flacone) co-liofilizzati con CaCl2 (40 µmol/flacone) e fosfolipidi (0,2 µmol/flacone). B Buffer (Nr. Cat. 4973050330): 2 flaconi da 24 mL di tampone concentrato Tris 0,025 mol/L, pH 7,9, forza ionica 0,08 con aggiunta di Polibrene, NaCl e di albumina bovina serica. ATTENZIONE: Simbolo di pericolo: nessuno Frasi di rischio: nessuno Consigli di prudenza: nessuno Contiene materiale di origine bovina, ottenuto da animali che non hanno mostrato sintomi di BSE né in vita né dopo la morte. Ciò nonostante il materiale dovrebbe essere trattato come potenzialmente infetto. Per uso diagnostico in vitro. Preparazione Chromogenic substrate: Sciogliere il contenuto del flacone con 6 mL (tecniche in micropiastra e provetta e sistemi ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 7 mL (sistemi ELECTRA) di acqua distillata.8 Chiudere con il tappo e miscelare delicatamente. Assicurarsi della completa ricostituzione del prodotto. Mantenere il reagente a 15-25°C per 10-30 minuti e miscelare nuovamente prima dell’uso. Factor reagent: Sciogliere il contenuto di ciascun flacone con 3 mL (tecniche in micropiastra e provetta e sistemi ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 3,5 mL (sistemi ELECTRA) di acqua distillata.8 Chiudere con il tappo e miscelare delicatamente. Assicurarsi della completa ricostituzione del prodotto. Mantenere il reagente a 15-25°C per 10-30 minuti e miscelare nuovamente prima dell’uso. Buffer: Diluire con acqua distillata8 la quantità necessaria di tampone concentrato 1:10 (1+9) (tecniche in micropiastra e provetta e sistemi ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 1:8 (1+7) (sistemi ELECTRA). Identificare come tampone di lavoro. NOTA: Lotti diversi di reagenti non sono tra loro intercambiabili. Calibrazione Per ogni nuovo numero di lotto di ELECTRACHROME Fattore VIII è necessaria una curva standard. Per la preparazione degli standard, utilizzare il Plasma di Riferimento Normale e diluirlo con il tampone di lavoro come riportato in tabella. Alcuni standard devono essere diluiti due volte. Miscelare delicatamente per inversione le provette di plastica durante le varie fasi di preparazione e di diluizione degli standard di calibrazione. Per valori di Fattore VIII inferiori a 0,05 UI/mL (pazienti con emofilia A), utilizzare l’intervallo basso. NOTA: Il test dovrebbe essere effettuato entro 30 minuti dalla preparazione o dallo scongelamento dei campioni. a. Preparazione degli standard Pre-diluizione Fattore VIII Plasma Tampone di lavoro UI/mL (µL) (µL) Intervallo normale 1,42 25 0 1,00 25 0 0,50 100 100 0,25 50 150 0 0 0 Intervallo basso 0,050 100 1900 0,024 50 2000 0,012 25 2000 0,006 25 4000 0 0 0 Diluizione finale Fattore VIII Plasma pre-diluito Tampone di lavoro UI/mL (µL) (µL) Intervallo normale 1,42 0 1400 1,00 0 2000 0,50 25 2000 0,25 25 2000 0 0 2000 Intervallo basso 0,050 25 2000 0,024 25 2000 0,012 25 2000 0,006 25 2000 0 0 2000 Metodo I. Tecniche in micropiastra e provetta a. Diluizione dei campioni e dei controlli Campioni/controlli 25 µL Tampone di lavoro 2000 µL Miscelare bene b. Metodo in micropiastra Aggiungere nei pozzetti della micropiastra: Intervallo di misura 0-1,5 UI/mL 0-0,05 UI/mL Campioni/controlli/standard diluiti 50 µL 50 µL Miscelare e incubare a 37°C per 3-4 minuti 3-4 minuti Reagente fattori (pre-riscaldato a 37°C) 50 µL 50 µL Miscelare e incubare a 37°C per 2 minuti 4 minuti Substrato cromogenico (pre-riscaldato a 37°C) 50 µL 50 µL A. Metodo cinetico: leggere il ΔA/min a 405 nm per 30 - 120 secondi. B: Metodo end-point: procedere come segue: Miscelare e incubare a 37°C per 2 minuti 10 minuti Acido acetico al 20% o acido citrico al 2% 50 µL 50 µL Miscelare Leggere l’assorbanza contro il tampone di lavoro a 405 nm. Se possibile, leggere e sottrarre l’assorbanza a 490 nm per compensare le differenze esistenti nel materiale dei pozzetti delle micropiastra. c. Metodo in provetta Usare 200 µL invece di 50 µL in tutte le fasi di pipettamento. d. Determinazioni per kit Tecniche in micropiastra: 120 Tecniche in provetta: 30 e. Calcoli Sottrarre i valori di assorbanza (A) dei bianchi a quelli degli standard. Riportare su carta millimetrata la variazione nell’assorbanza per minuto (ΔA/min) o l’assorbanza (A) degli standard rispetto alla loro concentrazione di fattore VIII. Riportare ΔA/min o A sull’asse Y e le UI/mL di fattore VIII sull’asse X. Tracciare una linea retta con i punti ottenuti. I campioni vanno determinati sulla base di questa curva standard. Curva standard Un esempio di una tipica curva standard secondo il metodo della micropiastra è mostrato qui sotto. Normal range. End-point method in microplate 0.8 Low range. End-point method in microplate 0.4 0.6 A 405 nm Utilizzo E Bilirubine 30 mg/dl (300 mg/l) 8 mg/dl (80 mg/l) La précision et la corrélation de ces résultats sont obtenues en utilisant un lot spécifique de réactifs et de contrôles. (Dil) 0.00 0 Les résultats du test Facteur VIII ne sont pas affectés par l’héparine jusqu’à 1 UI/mL. Aucune interférence médicamenteuse n’a été rapportée. Aucune interférence sur les analyseurs ACL Futura et ACL Advance jusqu’à: Hémoglobine Triglycérides Valeurs normales et valeurs hautes 275 mg/dl 923 mg/dl (9,23 g/l) Valeurs basses 27 mg/dl 400 mg/dl (4 g/l) Dans une étude complémentaire, comparant les résultats obtenus avec le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII utilisé sur un analyseur ACL Futura à ceux obtenus avec le coffret IL Test Facteur VIII et le réactif TCA-SP, le coefficient de corrélation était de 0,99. UI/mL FVIII (ACL Futura) = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (IL Test FVIII et TCA-SP) 1:245 0.10 Les contrôles normaux et anormaux sont recommandés pour un programme de contrôle de qualité complet.10 Le laboratoire doit utiliser des plasmas de contrôle appropriés, dont la concentration en facteur VIII a été évaluée et se situe dans les limites de la droite d’étalonnage. Le plasma de contrôle normal (systèmes de Coagulation IL) et les plasmas normal et anormal de référence, titrés (ELECTRA) sont spécifiques à ce programme. Chaque laboratoire doit établir sa propre moyenne et déviation standard et son programme de contrôle de qualité afin de vérifier l’état de fonctionnement de son système analytique. Les contrôles doivent être analysés au minimum toutes les 8 heures en concordance avec une bonne pratique de laboratoire. Se référer au mode d’emploi de l’instrument pour des informations complémentaires. Se reporter à Westgard et al pour l’identification et la résolution des contrôles hors limites.11 Les résultats de facteur VIII sont reportés en UI/mL. 1,0 UI/mL de FVIII est équivalent à 100% de FVIII. Se référer au mode d’emploi de l’instrument pour des informations complémentaires. FVIII, IU/mL FVIII, IU/mL Contrôle de qualité Résultats 0 1.5 Non fournis avec la trousse, ils doivent faire l’objet d’une commande séparée. 1. Plasma normal de référence titré (ELECTRA) ou équivalent. Utiliser des numéros de lots différents pour la courbe d’étalonnage et le contrôle. 2. Plasma de calibration (systèmes de Coagulation IL). 3. Plasma anormal de référence titré (ELECTRA) ou équivalent. 4. Contrôle normal (systèmes de Coagulation IL), code produit 0020003120 / 0020003110. 5. Témoins appropriés étalonnés par référence à un Standard International pour le facteur VIII (systèmes de Coagulation IL). 6. Acide acétique à 20 % ou acide citrique à 2 % (méthode en point final). 7. Solution de nettoyage (ACL 8000/9000/10000), code produit 0009831700. 8. Photomètre, 405 nm (et 490 nm pour la procédure sur microplaque). 9. Microplaques* ou semi microcuvettes (1 cm). 10. Centrifugeuse à 2000 x g. 11. Bain Marie à 37°C ± 0,2°C. 12. Pipettes calibrées avec une précision de 1 % (ou mieux). 13. Tubes à essai en plastique. 14. Agitateur. 15. Chronomètre. 16. Vortex. 17. Papier millimétré. 18. Eau déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent. *NOTE: Ne pas utiliser de microplaques pour « coating ». A 405 nm I. Méthode en microplaque et Méthode en tube a. Dilution des échantillons et des contrôles Echantillons/contrôles Tampon de travail Bien mélanger b. Méthode en microplaque Ajouter dans les puits de la microplaque 0.3 0.2 Etalonnage Générer une courbe d’étalonnage à chaque changement de lot de réactif ELECTRACHROME Facteur VIII. Utiliser le Plasma normal de référence titré pour préparer les étalons. Ce dernier doit être dilué avec le tampon de travail afin d’obtenir les ratios correspondants. Certains standards devront être dilués deux fois avec le tampon de travail. Mélanger doucement dans un tube en plastique entre et après chaque dilution. Pour les taux de facteur VIII en dessous de 0,05 UI/mL (patients atteints d’hémophilie A), utiliser la courbe basse. NOTE: Le test doit être réalisé dans les 30 minutes qui suivent le prélèvement ou la décongélation des échantillons de plasma. Préparation des étalons Prédilution Facteur VIII Plasma Tampon de travail UI/mL (µl) (µl) Courbe normale 1,42 25 0 1,00 25 0 0,50 100 100 0,25 50 150 0 0 0 Courbe basse 0,050 100 1900 0,024 50 2000 0,012 25 2000 0,006 25 4000 0 0 0 Dilution finale Facteur VIII Plasma prédilué Tampon de travail UI/mL (µl) (µl) Courbe normale 1,42 0 1400 1,00 0 2000 0,50 25 2000 0,25 25 2000 0 0 2000 Courbe basse 0,050 25 2000 0,024 25 2000 0,012 25 2000 0,006 25 2000 0 0 2000 0.4 0.6 A 405 nm E Low range. End-point method in microplate Matériel requis mais non fourni 0.4 0.3 0.2 0.1 0.2 0 0 0 0.5 1 1.5 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 FVIII, IU/mL FVIII, IU/mL f. Risultati I valori di assorbanza della curva standard dovrebbero rientrare nei seguenti limiti: Standard Intervallo normale 0-1,5 UI/mL 0,0 UI/mL 1,0 UI/mL Intervallo basso 0-0,05 UI/mL 0 UI/mL 0,05 UI/mL Metodo in micropiastra Assorbanza Metodo Metodo cinetico end-point <0,06 <0,12 0,16-0,32 0,33-0,63 Metodo cinetico <0,14 0,38-0,74 <0,02 0,02-0,05 <0,04 0,04-0,11 <0,18 0,17-0,44 Metodo in provetta Assorbanza Metodo end-point <0,21 0,58-1,11 <0,32 0,29-0,76 Symbols used / Verwendete Symbole / Símbolos utilizados / Symboles utilisés / Simboli impiegati / Símbolos utilizados / Anvendte symboler / Använda Symboler / In Vitro Diagnostic Medical Device In Vitro Diagnostikum Dispositif medical de diagnostique in vitro Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositivo médico para utilização em diagnóstico in vitro Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik In vitro diagnostisk medicinsk produkt Batch code Chargenbezeichnung Codigo de lote Code du lot Codice del lotto Número de lote Batchkoden Tillverkningskod Use by Verwendbar bis Fecha de caducidad Utiliser jusque Utilizzare entro Data límite de utilização Anvendelsesdato Användning Temperature limitation Zulässiger Temperaturbereich Limite de temperatura Limites de température Limite di temperatura Límite de temperatura Temperaturbegrænsning Temperatur gräns Consult instructions for use Gebrauchsanweisung beachten Consulte las instrucciones de uso Consulter les instructions d’utilisation Consultare le istruzioni per l’uso Consultar as instruções de utilização Se instruktion før brug Ta del av instruktionen före användning Control Kontrollen Control Contrôle Controllo Controlo Kontrol Kontroll Biological risks Biologisches Risiko Riesgo biológico Risque biologique Rischio biologico Risco biológico Miljø oplysninger Biologiska risker Manufacturer Hersteller Fabricante Fabricant Fabbricante Fabricado por Producent Tillverkare Authorised Representative in the European Community Bevollmächtigter in der Europäischen Union Representante autorizado en la Comunidad Europea Mandataire dans la Communauté européenne Mandatario nella Comunità Europea Representante autorizado Repræsentant i det Europaeiske Faellesskab Auktoriserad representant in vitro. Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA) Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy) 303358 R2 10/2012 HemosIL® ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503 ITALIANO - Revisione dell’inserto 10/2012 II. Metodo ELECTRA® Preparazione dei Reagenti e degli Standard 1. Preparare il plasma di riferimento e i controlli come indicato nei rispettivi inserti. Lo strumento prepara automaticamente i diversi standard di calibrazione. 2. Disporre i reagenti e il plasma di riferimento come indicato di seguito. a. Impostazione degli strumenti ELECTRA Strumento Protocollo n. canali test E1600C 4 4 Substrato 1 B Chiaro Volume reagente (µl) 75 5 F Chiaro 75 4 Reagente fattori Substrato 1 B Chiaro 75 Reagente fattori 4 F Chiaro 75 E1800C E1400C 4 Tipo reagente Pompa Fessura n. Radiatore Tipo reagente Posizione Vol. campione campione PRR (µl) Tampone di lavoro Standard FVIII A 50 B 50 Tampone di lavoro Standard FVIII A 50 B 50 NOTA: Fare riferimento alle istruzioni del manuale per il Modello ELECTRA utilizzato. Calcoli: i valori dei pazienti vengono calcolati automaticamente dal confronto con la curva standard. I risultati di Fattore VIII sono espressi in UI/mL. b. Curva standard ELECTRA Un esempio di una tipica curva standard su ELECTRA è mostrato qui sotto. Tipo di grafico: lineare/lineare Tipo di curva: lineare Diluizione campione: 1:62 0.60 1:52 0.50 A B S / M I N 1:62 Precisione: Qui di seguito sono riportati i valori dei coefficienti di variazione (CV %) di tre plasmi con livelli diversi di concentrazione di fattore VIII determinati con il metodo della micropiastra. Ogni laboratorio dovrebbe determinare i propri valori dei coefficienti di variazione. Media FVIII Nella serie Tra giorni Concentrazione CV % n=42 CV % n=6 N=7 1,0 UI/mL 2,4% 2,1% 0,25 UI/mL 2,6% 5,9% 0,03 UI/mL 3,0% 3,9% In ulteriori studi la precisione del kit ELECTRACHROME Fattore VIII è stata verificata eseguendo numerosi test. Qui di seguito sono riportati i valori ottenuti: ACL 8000/9000/10000 Media Fattore VIII (UI/mL) 0,90 0,39 0,07 CV (%) 5,15 6,06 4,57 ACL Futura/ACL Advance Media (UI/mL) CV % (nella serie) CV % (Totale) Intervallo alto 1,97 1,70 1,90 Intervallo alto 3,67 1,73 3,97 Intervallo normale 0,99 1,62 3,52 Intervallo normale 0,42 3,59 5,41 Intervallo basso 0,05 2,51 2,86 Intervallo basso 0,01 2,84 4,55 ELECTRA Media (UI/mL) CV % (nella serie) CV % (Totale) Plasma di Riferimento Normale 0,80 2,72 2,68 Plasma di Riferimento Anormale 0,25 2,15 2,43 Correlazione: I test qui di seguito riportati mostrano una buona correlazione con Coatest Fattore VIII: ELECTRACHROME FVIII (Metodo Manuale) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (Metodo in micropiastra) r=0,96 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ACL 100-7000) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900) r=0,98 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest) In un ulteriore studio clinico sono state comparate le prestazioni del test ELECTRACHROME Fattore VIII su ACL 9000 con quelle di ELECTRA 1400C ottenendo un coefficiente di correlazione di 0,98. UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C) In un ulteriore studio clinico sono state comparate, su ACL Futura, le prestazioni del test ELECTRACHROME Fattore VIII con quelle del kit IL Test Fattore VIII (con l’impiego del reattivo APTT-SP) ottenendo un coefficiente di correlazione di 0,99. UI/mL FVIII (ACL Futura) = = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (kit IL Test Fattore VIII con reattivo APTT-SP) I risultati dei test di precisione e di correlazione sono stati ottenuti usando uno specifico lotto di reagenti e controlli. Materiali necessari ma non forniti I seguenti prodotti non sono forniti insieme al kit e devono essere ordinati separatamente. 1. Plasma di Riferimento Normale (sistemi ELECTRA) o equivalente. Utilizzare lotti di numeri distinti per il controllo e la curva standard. 2. Plasma Calibrante (sistemi ACL). 3. Plasma di Riferimento, Anormale (sistemi ELECTRA) o equivalente. 4. Controllo normale (sistemi ACL), codice prodotto 0020003110. 5. Controlli titolati rispetto a uno Standard Internazionale per il FVIII (sistemi ACL). 6. Acido acetico al 20% o acido citrico al 2% (solo per il metodo end-point). 7. Soluzione detergente (ACL 8000/9000/10000), codice prodotto 0009831700. 8. Spettrofotometro 405 nm (e 490 nm per procedimento su micropiastra). 9. Micropiastra* o cuvette semi-micro (1 cm). 10. Centrifuga, 2000 x g. 11. Dispositivo di riscaldamento, 37 ± 0,2°C. 12. Pipette graduate con una precisione pari almeno all’1%. 13. Provette in plastica. 14. Agitatore. 15. Cronometro. 16. Miscelatore Vortex. 17. Carta millimetrata. 18. Acqua distillata.8 *NOTA: Non utilizzare micropiastre per coating. Per un completo programma di controllo di qualità si raccomanda l’uso di plasmi normali e patologici.10 Utilizzare plasma di controllo appropriati con valori accertati di fattore VIII nell’intervallo della curva standard. Il Controllo normale (sistemi di coagulazione ACL) e i Plasmi di Riferimento Normale e Anormale (sistemi ELECTRA) sono indicati per questo programma. Ogni laboratorio dovrà stabilire i propri valori medi e le deviazioni standard per ogni controllo ed individuare le corrette procedure di analisi. I controlli dovranno essere analizzati almeno una volta ogni 8 ore in accordo con le esigenze del laboratorio. Consultare il Manuale dell’Operatore dello strumento per ulteriori informazioni. Per l’identificazione e la risoluzione di situazioni particolari, fare riferimento all’articolo di Westgard et al.11 0.30 1:124 1:245 0.10 Prestazioni I campioni vanno raccolti da paziente mantenuto a riposo prima del prelievo. Aggiungere a nove parti di sangue fresco venoso una parte di trisodio citrato.9 Il plasma deve essere separato immediatamente dalle cellule e analizzato entro 30 minuti. In alternativa il plasma puó essere conservato a -20°C per una settimana o a -70°C per un anno. I campioni non devono essere conservati in frigoriferi a sbrinamento automatico e non vanno scongelati e ricongelati prima dell’analisi. I campioni congelati devono essere trasportati in ghiaccio secco. Per informazioni aggiuntive sulla preparazione, il trattamento e la conservazione dei campioni fare riferimento al documento NCCLS H21-A3.9 ATTENZIONE: durante il congelamento e lo scongelamento dei campioni l’attività di Fattore VIII può diminuire del 20%, in particolare se il plasma viene congelato lentamente. Controllo di qualità 0.40 0.20 Preparazione dei campioni Risultati I risultati dei pazienti sono riportati in UI/mL e 1,0 UI/mL di FVIII è equivalente ad un’attività di FVIII del 100%. Riferirsi al Manuale dell’Operatore per ulteriori informazioni. (Dil) Limitazioni/sostanze interferenti 0.00 0 20 40 60 80 100 I risultati del fattore VIII non sono influenzati da livelli di eparina fino a 1 UI/mL. Non è stata riscontrata alcuna interferenza da altri farmaci. Non si sono rilevate interferenze su ACL Futura/ACL Advance per valori fino a: Emoglobina Trigliceridi Intervallo normale e intervallo alto 275 mg/dL 923 mg/dL Intervallo basso 27 mg/dL 400 mg/dL 120 % c. Determinazioni per kit su sistemi ELECTRA Fattore VIII fino a 60 III. Metodo per sistemi di coagulazione ACL Per le metodiche e le procedure di lavoro contattare il personale IL. a. Determinazioni per kit su sistemi ACL 8000/9000/10000 Fattore VIII 110 determinazioni (ca.) b. Determinazioni per kit su sistemi ACL Futura/ACL Advance Fattore VIII 120 determinazioni (ca.) Bilirubina 30 mg/dL 8 mg/dL Valori attesi Utilizzando il kit ELECTRACHROME Fattore VIII è stato determinato il seguente intervallo di riferimento: Metodo N Intervallo (unità di misura) Metodo in micropiastra 61 50 - 200 Attività % (M=28, F=33; età compresa tra 21 e 55 anni) A causa delle numerose variabili che possono influenzare i risultati, ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo di riferimento. ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503 Resumo e Príncipio O factor VIII é uma proteína plasmática de elevado peso molecular que serve como cofactor do factor IXa na sua activação de factor X a factor Xa.3 A deficiência de factor VIII causa um problema hemorrágico grave, hemofilia A. A gravidade desta patologia hremorrágica é inversamente relacionada com a concentração do factor VIII. Os doentes com hemofilia A são geralmente classificados de acordo com a sua actividade em factor VIII, em 3 categorias: <0,01 UI/mL = grave, 0,01-0,04 UI/mL = moderada e 0,05-0,25 UI/mL = hemofilia ligeira.4 Na presença de iões cálcio e de fosfolípidos, o factor X é activado a factor Xa pelo factor IXa. Esta activação é grandemente estimulada pelo factor VIII que actua como cofactor nesta reacção. Ao utilizar quantidades óptimas de Ca2+, fosfolípidos, factor IXa e excesso de factor X, a velocidade de activação do factor X é linearmente relacionada com a quantidade de factor VIII. O factor Xa hidrolisa o substrato cromogénico, e liberta o grupo cromóforo, para-Nitroanilina (pNA). A cor é lida fotometricamente a 405 nm. O factor Xa gerado, e portanto a intensidade da cor, é proporcional à actividade do factor VIII na amostra. A hidrólise do substrato cromogénico pela trombina é prevenida pela adição de um inibidor sintético da trombina, juntamente com o substrato.5-7 Factor IXa, Ca2+, Fosfolípidos 1. Factor X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Factor Xa Factor VIII Factor Xa 2. Substrato −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptido + pNA Composição O kit ELECTRACHROME Factor VIII é composto por: S Chromogenic substrate (Núm. Cat. 4973050310): recipiente 1 x 6 ou 7 mL de substrato cromogénico liofilizado S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl (7,7 mg/recipiente), Inibidor da Trombina sintético I-2581 (0,2 mg/ recipiente) e manitol como estabilizador. E Factor reagent (Núm. Cat. 4973050320): recipientes 2 x 3 ou 3,5 mL de uma preparação que contém Factor bovino IXa (0,3 U/recipiente), Factor X (2,7 UI/ recipiente) e Trombina (1 NIH-U/recipiente) coliofilizada com CaCl2 (40 µmol/recipiente) e fosfolípidos (0,2 µmol/recipiente). B Buffer (Núm. Cat. 4973050330): recipientes 2 x 24 mL de Tampão Tris 0,025 mol/L (solução concentrada), pH 7,9, força iónica 0,08 com polibrene, NaCl e albumina de soro bovino. AVISOS E PRECAUÇÕES: Classe de risco: nenhuma Frases de risco: nenhuma Frases de segurança: nenhuma Contém material de origem bovina. Todos os animais dadores eram oriundos de manadas isentas de BSE. Todo o gado foi inspeccionado ante e post-mortem por um veterinário e aparentemente não estavam infectados nem continham material contagioso. No entanto, o material deve ser tratado como potencialmente infeccioso. Para uso em diagnóstico in vitro. Preparação Chromogenic substrate: Dissolver o conteúdo do recipiente em 6 mL (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste, ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou 7 mL (Método ELECTRA) de água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).8 Fechar o recipiente e homogeneizar suavemente. Verificar se o produto fica completamente dissolvido. Conservar o reagente entre 15 e 25°C durante 10-30 minutos. Misturar suavemente invertendo o recipiente, antes de utilizar. Factor reagent: Dissolver o conteúdo de cada recipiente em 3 mL (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste, ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou 3,5 mL (Método ELECTRA) de água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).8 Fechar o recipiente e homogeneizar suavemente. Verificar se o produto fica completamente dissolvido. Conservar o reagente entre 15 e 25°C durante 10-30 minutos. Misturar suavemente invertendo o recipiente, antes de utilizar. Buffer: (Solução concentrada) - diluída pela mistura de 1 volume de solução concentrada com 9 volumes (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste, ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou 7 volumes de água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).8 Identifique como tampão de trabalho. NOTA: Os reagentes não são inter-comutáveis entre lotes. Conservação e estabilidade do reagente Os reagentes fechados, que ainda não foram utilizados, são estáveis até ao final do prazo de validade, que consta no rótulo, desde que conservados entre 2-8°C. Substrato cromogénico - Estabilidade depois da reconstituição: 1 mês a 2-8°C dentro do recipiente original. Reagente factor - Estabilidade depois da reconstituição: 12 horas a 2-8°C, 2 semanas a -30°C ou 1 mês a -70°C dentro do recipiente original. Evite a conservação a -20°C. Tampão de trabalho - Estabilidade depois da sua preparação: 1 mês a 2-8°C. Para obter uma estabilidade óptima retire os reagentes do aparelho e conserve-os entre 2-8°C, nos recipientes originais. NOTA: Rejeite se a solução de substrato, surgir amarela. Calibração É necessária uma curva padrão para cada novo n° de lote de ELECTRACHROME Factor VIII. Para preparação dos lotes, use Plasma de Referência Analisado-Normal. Dilua com tampão de trabalho para atingir os seguintes rácios. Alguns padrões serão diluídos 2 vezes, com tampão de trabalho. Misturar suavemente por inversão em tubos de teste plásticos entre e depois das diluições. Para níveis de factor VIII abaixo de 0,05 UI/mL (Hemofília A doentes), deve ser usado o intervalo baixo. NOTA: O teste deve realizar-se no espaço de 30 minutos, após colheita da amostra e preparação ou descongelamento das amostras de plasma. Preparação dos Padrões Diluição primária Plasma de Referência Analisado-Normal Tampão de Factor VIII Amostra primária trabalho UI/mL (µL) (µL) Gama normal 1,42 25 0 1,00 25 0 0,50 100 100 0,25 50 150 0 0 0 Limite baixo 0,050 100 1900 0,024 50 2000 0,012 25 2000 0,006 25 4000 0 0 0 Diluição secundária Plasma da Diluição Tampão de Factor VIII Primária trabalho UI/mL (µL) (µL) Gama normal 1,42 0 1400 1,00 0 2000 0,50 25 2000 0,25 25 2000 0 0 2000 Limite baixo 0,050 25 2000 0,024 25 2000 0,012 25 2000 0,006 25 2000 0 0 2000 Método de ensaio I. Métodos de Microplaca e de tubo de Teste a. Diluição das Amostras teste e Controlos Amostra/controlo 25 µL Tampão de trabalho 2000 µL Misture bem b. Método da Microplaca Adicionar aos poços da Microplaca: 0.8 0.4 0.6 0.3 A 405 nm Para a determinação fotométrica da actividade do factor VIII em plasma humano citratado.1 Inclui a detecção da deficiência no factor VIII, monitorização de doentes em terapêutica de substituição e para estimar a potência dos concentrados do factor VIII.2 La curva standard è lineare nei seguenti intervalli: - metodo manuale e in micropiastra: 0,05-1,5 UI/mL (intervallo normale) e 0,005-0,05 UI/mL (intervallo basso) - ACL 8000/9000/10000: 0,10-1,2 UI/mL (intervallo normale) e 0,00-0,10 UI/mL (intervallo basso) - ACL Futura/ACL Advance: 0,38-3,82 UI/mL (intervallo alto), 0,09-1,5 UI/mL (intervallo normale) e 0,011-0,135 UI/mL (intervallo basso) - ELECTRA: 0,00-1,2 UI/mL. Sensibilità: Sistema Intervallo alto Intervallo normale Intervallo basso Metodo in micropiastra N/A 0,36 2,4 (mAbs/min per 1 UI/dl di attività FVIII) ACL Futura/ACL Advance 0,035 0,035 0,306 (mAbs/min per 1 UI/dl di attività FVIII) Limite di rilevabilità: Sistema Intervallo alto Intervallo normale Intervallo basso Metodo in micropiastra N/A 0,05 0,005 e provetta UI/mL ACL Futura/ACL Advance UI/mL 0,09 0,09 0,005 PORTUGUÊS - Revisão do folheto 10/2012 Intervalo do ensaio 0-1,5 UI/mL 0-0,05 UI/mL Amostras diluídas/controlos/padrões 50 µL 50 µL Misturar e incubar a 37°C durante 3-4 minutos 3-4 minutos Reagente factor (pré- aquecimento a 37°C) 50 µL 50 µL Misturar e incubar a 37°C durante 2 minutos 4 minutos Substrato cormogénico (pré- aquecimento a 37°C) 50 µL 50 µL A. Método cinético: Ler ΔA/min a 405 nm durante 30 - 120 segundos. B: Método End-point: Proceder como descrito a seguir: Misturar e incubar a 37°C durante 2 minutos 10 minutos Ácido acético 20% ou ácido citríco 2% 50 µL 50 µL Misturar Leia a absorvância contra um branco de tampão de trabalho a 405 nm. Se possível leia e subtraia a absorvância a 490 nm, para compensar as diferenças causadas pelo material, dos poços das Microplacas. c. Método do Tubo de Teste Use 200 µL em vez de 50 µL para todas as etapas de pipetagem. d. Determinações/kit Método de Microplaca: 120 Método de tubo de Teste: 30 e. Cálculos Subtraia as respectivas actividades do branco nos padrões, a partir das suas absorvâncias (A) a 405 nm. Faça um gráfico das alterações na absorvância por minuto (ΔA/min) ou absorvância (A) para os padrões em relação à sua concentração em factor VIII em papel de gráfico linear. Trace o gráfico ΔA/min ou A no eixo Y e o factor VIII UI/mL no eixo X. Ligue os pontos padrão com a linha direita, que melhor se ajuste. A avaliação das amostras baseia-se na curva padrão. Curva Padrão Em baixo está um exemplo de uma curva padrão típica (Método da Microplaca): f. Resultados Low range. Normal range. End-point method in microplate End-point method in microplate A 405 nm Aplicação Prevista Linearità: 0.4 0.1 0 0 0 0.5 1 Limitações/interferências 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 FVIII, IU/mL FVIII, IU/mL Os valores de absorvância para a curva padrão devem estar dentro dos seguintes limites: Padrão Gama normal 0-1,5 UI/mL 0,0 UI/mL 1,0 UI/mL Limite baixo 0-0,05 UI/mL 0 UI/mL 0,05 UI/mL Método da Microplaca Absorvância Método Método cinético End-point <0,06 <0,12 0,16-0,32 0,33-0,63 Método cinético <0,14 0,38-0,74 <0,02 0,02-0,05 <0,04 0,04-0,11 <0,18 0,17-0,44 E1600C 4 4 Substrato 5 F Claro 4 Reagente fator Substrato 1 B Claro 75 Reagente fator 4 F Claro 75 4 Núm de Ranhura bomba de bomba 1 B Bomba D.T.C. Claro Tampão de trabalho Plasma de Ref. Características técnicas <0,32 0,29-0,76 A 50 B 50 NOTA: Consulte o Manual de referência para o modelo específico do aparelho ELECTRA, para obter instruções. Cálculos: Os valores dos doentes são normalmente automaticamente calculados, por comparação com a curva padrão e resultados do factor VIII são expressos em UI/mL. b. Curva Padrão ELECTRA A seguir está um exemplo de uma curva padrão típica (Método ELECTRA): Tipo de gráfico: Linear/Linear Tipo de curva: Linear Diluição da Amostra: 1:62 c. Determinações/kit nos Sistemas ELECTRA 0.60 1:52 0.50 A B S / M I N 1:62 0.40 0.30 1:124 0.20 1:245 0.10 0.00 20 40 Precisão: Os dados seguintes mostram o coeficiente de variação (CV%) para 3 diferentes concentrações plasmáticas de factor VIII, conforme determinado pelo Método da Microplaca. Cada laboratório deve estabelecer os seus dados de precisão. Média Factor VIII (Intra-série) (Dia para dia) Concentração CV% n=42 CV% n=6 N=7 1,0 UI/mL 2,4% 2,1% 0,25 UI/mL 2,6% 5,9% 0,03 UI/mL 3,0% 3,9% Em estudos adicionais, a precisão foi avaliada, intra e na totalidade (de análise para análise e de dia para dia) do ELECTRACHROME Factor VIII, ao longo de vários ensaios. Obtiveram-se os seguintes dados: ACL 8000/9000/10000 Média Factor VIII (UI/mL) 0,90 0,39 0,07 CV (%) 5,15 6,06 4,57 ACL Futura/ACL Advance Média (UI/mL) CV% (Intra-série) CV% (Total) Intervalo alto 1,97 1,70 1,90 Intervalo alto 3,67 1,73 3,97 Intervalo normal 0,99 1,62 3,52 Intervalo normal 0,42 3,59 5,41 Intervalo baixo 0,05 2,51 2,86 Intervalo baixo 0,01 2,84 4,55 ELECTRA Média (UI/mL) CV% (Intra-série) CV% (Total) Plasma de Referência 0,80 2,72 2,68 Analisado-Normal Plasma de Referência 0,25 2,15 2,43 Analisado-Anormal Correlação: Os ensaios mostram uma forte correlação com o ensaio Coatest Factor VIII: ELECTRACHROME FVIII (Método do Tubo de Teste) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (Método da Microplaca) r=0,96 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ACL 100-7000 ou ACL Classic) r=0,97 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest) ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900) r=0,98 n=25 UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest) Em estudos adicionais comparando o desempenho do ensaio ELECTRACHROME Factor VIII num ACL 9000 versus o ELECTRA 1400C, o ceficiente de correlação obtido foi de 0,98. UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C) Em estudos adicionais comparando o desempenho do ensaio ELECTRACHROME Factor VIII num ACL Futura versus o ensaio IL Test Factor VIII com o reagente APTT-SP, o coeficiente de correlação obtido foi de 0,99. UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (ensaio IL Test FVIII com o reagente APTT-SP) Estes resultados de precisão e de correlação foram obtidos utilizando lotes específicos, de reagente e de controlo. Lineariedade: (Dil) 0 Bilirrubina 30 mg/dL 8 mg/dL Efectuou-se um estudo de intervalo normal de valores com o kit ELECTRACHROME Factor VIII. Método N Intervalo (unidades) Método da Microplaca 61 50 - 200 actividade % (M=28, F=33; com idades entre 21 a 55 anos) Devido a várias variáveis que podem afectar os resultados, cada laboratório deve estabelecer os seus intervalos de valores normais. Volume Tipo de reagente Posição Volume amostra reagente de amostragem PPR (µl) (µl) 75 Tampão de A 50 trabalho 75 Plasma de Ref. B 50 Núm de canais E1800C E1400C Tipo de reagente Protocolo de teste Não existe interferência nos resultados do factor VIII causada por níveis de heparina até 1 UI/mL. Não foi notificada nenhuma interferência causada por fármacos. Não existe interferência nos Sistemas ACL Futura/ACL Advance, até aos seguintes valores: Hemoglobina Triglicéridos Intervalo normal e intervalo alto 275 mg/dL 923 mg/dL Intervalo baixo 27 mg/dL 400 mg/dL Valores Esperados Método do Tubo de Teste Absorvância Método End-point <0,21 0,58-1,11 II. Método ELECTRA® Preparação dos Reagentes e dos Padrões 1. Prepare o plasma de referência e os controlos como indicado nas respectivas circulares de instruções. O aparelho prepara automaticamente os pontos das curvas padrões individuais 2. Coloque os reagentes, e o plasma de referência, conforme indicado abaixo. a. Programação do Utilizador do aparelho ELECTRA Aparelho Para realizar um programa completo de Controlo de Qualidade, recomenda-se a utilização dos controlos normais e anormais.10 Devem ser utilizados, os plasmas de controlo adequados, com valores titulados para o Factor VIII no intervalo da curva padrão. Os controlos da IL adequados para este programa são o Controlo Normal (Sistemas de Coagulação da IL) e o Plasma de Referência Analisado- Normal e Anormal (ELECTRA). Cada laboratório deve estabelecer a sua própria média e desvio padrão e deve efectuar um programa de controlo de qualidade para monitorizar os seus resultados. Os controlos devem ser analisados uma vez em cada turno de 8 horas, de acordo com a norma vigente no Laboratório. Ver Manual do Operador para mais informações. Consultar a publicação de Westgard e col. para identificar e solucionar situações anormais do Controlo de Qualidade.11 Os resultados do factor VIII são expressos em UI/mL. 1,0 UI/mL de FVIII é equivalente a 100% FVIII. Para mais informações consultar o Manual do Operador do Aparelho. 0 1.5 Controlo de Qualidade Resultados 0.2 0.2 Este kit não inclui os produtos abaixo mencionados, pelo que deverão ser pedidos em separado: 1. Plasma de Referência Analisado-Normal (ELECTRA) ou equivalente. Utilize diferentes n° de lote para a curva padrão e controlo. 2. Plasma de Calibração (Sistemas de Coagulação da IL). 3. Plasma de Referência Analisado-Anormal (ELECTRA) ou equivalente. 4. Controlo Normal (Sistemas de Coagulação da IL), Núm. Cat. 0020003120 / 0020003110. 5. Plasmas de controlo adequados, com valores titulados de acordo com os Padrões Internacionais de Factor VIII (Sistemas de Coagulação da IL). 6. Ácido acético 20% ou ácido cítrico 2% (Método end-point). 7. Solução de limpeza (ACL 8000/9000/10000), Núm. Cat. 0009831700. 8. Fotómetro, 405 nm (490 nm para o procedimento com Microplaca). 9. Microplaca* ou cuvetes semi-micro (1 cm). 10. Centrífuga, 2000 x g. 11. Dispositivo de aquecimento, 37°C ± 0,2°C. 12. Pipetas calibradas com uma exactidão de 1% ou melhor. 13. Tubos de teste plásticos. 14. Misturador. 15. Cronómetro. 16. Misturador Vortex. 17. Papel de gráfico linear. 18. Água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS). *NOTA: não utilize microplacas que se destinam a revestimento. 60 80 100 120 % Factor VIII até 60 III. Método nos Sistemas de Coagulação IL Contacte o seu representante local IL para as instruções relativas à aplicação. a. Determinações/kit nos Sistemas ACL 8000/9000/10000 Factor VIII 110 testes (aprox.) b. Determinações/kit nos Sistemas ACL Futura/ACL Advance Factor VIII 120 testes (aprox.) Recolha e preparação da amostra Os doentes devem estar em repouso e sem stress, antes da recolha. Adicionar nove partes de sangue extraído recentemente por punção venosa a uma parte de citrato trissódico.9 O plasma devem ser separado das céluas o mais cedo possível e o teste deve ser realizado no intervalo de 30 minutos. Se o plasma não for analisado imediatamente, conserve a -20°C durante o máximo de uma semana ou a -70°C, durante o máximo de 1 ano. Não conserve num frigorifico auto-descongelante. Não descongele ou recongele as amostras antes de utilizar. No transporte, as amostras congeladas têm de ser mantidas em gelo seco. Para efectuar a recolha, o manuseamento e a conservação da amostra devem seguir-se as recomendações referidas no documento H21-A3 da NCCLS.9 NOTA: As perdas que atingem cerca de 20%de actividade do factor VIII podem ocorrer durante a congelação e a descongelação, especialmente se o plasma for congelado lentamente. A curva padrão é linear no intervalo normal a partir de 0,05-1,5 UI/mL e no intervalo baixo a partir de 0,005-0,05 UI/mL (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste). A curva padrão é linear no intervalo normal a partir de 0,10-1,2 UI/mL e no intervalo baixo a partir de 0,00-0,10 U/mL (ACL 8000/9000/10000). A curva padrão é linear no intervalo alto a partir de 0,38-3,82 UI/mL, no intervalo normal a partir de 0,09-1,5 UI/mL e no intervalo baixo a partir de 0,011-0,135 UI/mL (ACL Futura/ACL Advance). A curva padrão é linear no intervalo a partir de 0,00-1,2 UI/mL (ELECTRA). Sensibilidade: Sistema Intervalo alto Intervalo normal Intervalo baixo Método da Microplaca N/A 0,36 2,4 (mAbs/min por 1 UI/dL de actividade FVIII) ACL Futura/ACL Advance 0,035 0,035 0,306 (mAbs/min por 1 UI/dL de actividade FVIII) Limite de detecção: Sistema Intervalo alto Intervalo normal Intervalo baixo Métodos de Microplaca N/A 0,05 0,005 e de tubo de Teste UI/mL ACL Futura/ACL Advance UI/mL 0,09 0,09 0,005 Materiais necessários mas não fornecidos Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA) Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy) 303358 R2 10/2012 ELECTRACHROME™ FVIII 49730503 Printed Insert Sheet: Revision: Issued: C.O.: LANGUAGES FRENCH ITALIAN PORTUGUESE TECHNICAL SPECS PAPER: SIZE: PRINT: PRINT COLOR: 303358 R2 10/2012 431014 White paper, 50-60 g/m2 weight. 11 x 17" (280 x 432 mm.). Front/Back. Front - Top band Green Pantone 382 U, all remaining type in black. Back - All type in black. Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA) Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy) 303358 R2 10/2012
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