BIO-FLASH ® BIO-FLASH Syphilis

BIO-FLASH ®
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
®
BIO-FLASH Syphilis
3000-8602
100 testes
BIO-FLASH Syphilis é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos, totalmente
automatizado, para a determinação qualitativa de anticorpos IgG e IgM contra Treponema pallidum em
soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH.
Sumário
A sífilis é uma doença causada por infecção pela bactéria espiroqueta Treponema pallidum, geralmente
transmitida por contato sexual. No entanto, ela também pode ser transmitida de forma congênita através da
passagem pela placenta do T. pallidum ao feto e por transfusão sanguínea. A sífilis progride em estágios e pode
se tornar uma infecção crônica se não for tratada. A sífilis é caracterizada por episódios de doença ativa
interrompida por períodos de latencia. Estima-se que o período de incubação varia entre 10 e 90 dias (três
semanas em média). As manifestações clínicas precoces (estágios primário e secundário) envolvem
principalmente as superfícies da pele e mucosas, embora a sífilis secundária seja uma doença sistêmica. O
diagnóstico serológico da sífilis é realizado demonstrando-se a presença de níveis significativos de anticorpos
específicos do T. pallidum na amostra de soro/plasma do paciente. A sífilis apresenta diversas manifestações
1
clínicas, o que torna os testes de laboratório um aspecto muito importante do diagnóstico.
Os testes sanguíneos são divididos em testes treponêmicos e não treponêmicos. Os testes não treponêmicos
incluem os testes do VDRL (Venereal Disease Research Laboratory, laboratório de pesquisa de doenças
venéreas) e RPR (Rapid Plasma Reagin, reagina plasmática rápida). Podem ocorrer resultados falso-positivos em
testes não treponêmicos com algumas infecções virais tais como varicela e sarampo, assim como com linfoma,
tuberculose, malária, endocardite, doenças do tecido conjuntivo e gravidez.
Testes treponêmicos como o TPHA (hemaglutinação do Treponema pallidum) ou FTA-Abs (teste de absorção de
anticorpos treponêmicos fluorescentes), ELISA e recentemente o CLIA são mais específicos. Os testes de
anticorpos treponêmicos geralmente se tornam positivos entre duas e cinco semanas depois da infecção inicial.
Além dos antígenos recombinantes imunodominantes p15, p17 e p47, o BIO-FLASH Syphilis incorpora uma
proteína recombinante adicional (Patente dos Estados Unidos US7700727B2) que aumenta a sensibilidade.
Princípio
Quando as micropartículas paramagnéticas do BIO-FLASH Syphilis são misturadas e incubadas com a amostra,
se esta apresentar anticorpos específicos contra o T. pallidum, estes se ligarão aos antígenos específicos de
T. pallidum que recobrem as micropartículas. Uma separação magnética seguida por uma etapa de lavagem é
realizada para eliminar resíduos da amostra. Imediatamente depois, se adiciona um traçador que consiste em
anticorpos anti-IgM e anti-IgG anti-humanos marcados com isoluminol que se unirão aos anticorpos específicos
contra T. pallidum capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e
lavagem, adicionam-se os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. A luz emitida é medida como
unidades relativas de luz (URL) pelo luminômetro do BIO-FLASH. As URLs são diretamente proporcionais à
concentração de anticorpos específicos para T. pallidum na amostra.
O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC)
para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no
instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit
separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica
para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos
calibradores.
Esquema da reação:
Ativadores
(Triggers)
URL
Partícula magnética
Amostra
Traçador
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
Emissão de luz
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BIO-FLASH ®
Componentes
Cartucho de reagentes
O kit BIO-FLASH Syphilis contém um cartucho de reagentes para 100 determinações (REF 3000-8602).
NOTA: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE 000762992-0001)
Composição do cartucho de reagentes:
O cartucho está composto por 4 frascos que contêm:
A.
1 frasco cilíndrico de suspensão de micropartículas
revestida com antígenos recombinantes purificados de
T. pallidum. Contém < 0,1% de azida sódica.
B.
1 frasco de tampão de ensaio. Contém 0,15% de
ProClin 950 e 0,214% de Triton X-100.
C.
1 frasco opaco de traçador que consiste em anticorpo
monoclonal murino anti-IgG humana e anti-IgM
humana marcado com isoluminol. Contém < 0,1% de
azida sódica.
D.
1 frasco de diluente de amostra. Contém 0,15% de
ProClin 950.
Preparação
Veja a figura seguinte.
Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las
para voltar a ressuspendê-las.

Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de
espuma. As bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas.

Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o
cartucho até que as micropartículas se ressuspendam totalmente.

Se as micropartículas não se ressuspenderem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO
UTILIZE O CARTUCHO.

Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e
retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte.

Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa
perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma
vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto.

Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento.

Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos
periódicos.
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BIO-FLASH ®
Precauções
Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO.
Uso exclusivo por profissionais.
A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente
explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água.
ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO.
Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante.
Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos.
ATENÇÃO: O componente B contém ProClin 950 e Triton X-100. O componente D contém ProClin 950.
Advertências de perigo
H317: Pode provocar uma reação alérgica cutânea.
Recomendações de prudência
P280: Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial.
P302+P352: SE ENTRAR EM CONTATO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes.
P333+P313: Em caso de irritação ou erupção cutânea: Consulte um médico.
P363: Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar.
P501: Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com as regulações locais/regionais/nacionais/internacionais.
Coleta e conservação das amostras
Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (Li-Heparina, tubos com
gel separador de Li-Heparina, Na-Heparina, Na-Citrato, EDTA, CPD, CPDA, K-Oxalato e ACD). Outros
anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes líquidos como Na-citrato
exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração nas amostras dos pacientes. As amostras não
devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas
diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e
a conservação das amostras.
Soro
As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8°C durante 10 dias. Para um período de tempo mais longo,
devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. As amostras podem ser
congeladas/descongeladas no máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja
bolhas nas amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise.
Plasma
As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8°C durante 10 dias. Para um período de tempo mais longo,
devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. Descongelar o plasma a 37°C. Descongelar as
amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas
amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise.
Volume de amostra
O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH Syphilis varia em função do tipo
de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 50 µL mais o volume morto, que é de 200 µL se é utilizada
a copa de amostra recomendada (REF3000-8209).
Outros materiais
Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado.
REF 3000-8603
BIO-FLASH Syphilis Calibrators (Calibradores)
REF 3000-8604
BIO-FLASH Syphilis Controls (Controles)
Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação.
Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio
BIO-FLASH Syphilis está incluída nos códigos de barras dos frascos.
Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos.
Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes
de processar amostras, calibradores ou controles:
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REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas)
Nota: O desenho da cubeta está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Ativadores)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema)
Instrumento / procedimento de teste
No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio.
Calibração
O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes.
No entanto, a Curva de Calibração de Trabalho (CCT) é necessária para todos os testes. A CCT é específica para cada
lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles saiam
fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento.
Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT.
Controle de qualidade
Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois controles. Os controles
BIO-FLASH Syphilis negativo e positivo foram desenhados para esse programa. Os controles devem ser
analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se de que os resultados dos controles se
encontram dentro dos limites de aceitação, já que, se não for assim, pode ser indicativo de resultados não válidos,
ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Neste caso, verifique todos os resultados obtidos desde
a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão. Pode ser necessário recalibrar o
instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para identificação e resolução de
situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al.4
Conservação e estabilidade
Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do
cartucho se forem conservados a 2-8°C em posição vertical.
Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8°C é
de 5 semanas.
Interpretação de resultados
A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de
Calibração de Trabalho guardada. Os resultados do BIO-FLASH Syphilis são expressos em S/CO (sinal da
amostra/valor de corte). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da
quantidade de anticorpo presente. A determinação de anticorpos anti-Treponema pallidum utilizando o ensaio
BIO-FLASH Syphilis é interpretada como segue:


As amostras com resultado < 1,00 S/CO são consideradas não reativas (negativas).
As amostras com resultado ≥ 1,00 S/CO são consideradas reativas (positivas).
As amostras com resultado inicialmente reativo devem ser reanalisadas por duplicado. Um resultado
repetidamente positivo é indicativo de infecção de sífilis. Amostras com concentração de anticorpos contra
T. pallidum acima de 200,00 S/CO são informadas como >200,00 S/CO.
Limitações
O resultado de uma amostra individual não é suficiente para o diagnóstico da sífilis. Portanto, os
resultados do BIO-FLASH Syphilis devem ser utilizados em conjunção com outros dados como, por exemplo, a
sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas e toda a informação adicional relevante.
Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por T. Pallidum. Como em todos os
ensaios imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam.
Resultados esperados
Acredita-se que a sífilis infectou 12 milhões de pessoas em 1999, com mais de 90% dos casos no mundo em
2
desenvolvimento. Ela afeta entre 700 mil e 1,6 milhão de gestantes por ano, resultando em abortos espontâneos,
3
natimortos, e sífilis congênita. Na África subsaariana, a sífilis contribui com aproximadamente 20% dos óbitos
perinatais. No mundo desenvolvido, as infecções de sífilis estiveram em declínio até os anos 1980 e 1990 devido
ao uso muito difundido de antibióticos. Desde 2000, as taxas de sífilis vêm aumentando nos EUA, Reino Unido,
Austrália e Europa, principalmente entre homens que mantêm relações sexuais com homens. Isso é atribuído a
2
práticas sexuais inseguras.
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2
Na China e na Rússia tem ocorrido um aumento nas taxas entre os heterossexuais desde a década de 1990. A
sífilis aumenta o risco de transmissão do HIV de duas a cinco vezes e a coinfecção é comum (30-60% em vários
2
centros urbanos).
4
A prevalência global foi estimada em cerca de 36,4 milhões de pessoas em 2008.
Características funcionais
NOTA: Os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a
estes dados.
Especificidade
A avaliação de especificidade se baseou no teste de um total de 3010 amostras de sangue de doadores do
Banc de Sang i Teixits de Catalunya (Espanha), incluindo soro e plasma-EDTA. Além disso, também foram
avaliadas 300 amostras de soro não selecionadas, da rotina de um laboratório hospitalar em Barcelona (Espanha),
e 50 amostras de mulheres grávidas. As amostras repetidamente reativas foram novamente testadas usando
outros ensaios comerciais. Os resultados de especificidade são mostrados na seguinte tabela:
Amostras
testadas
n
Positivas
Negativas
Especificidade
n
n
% (IC 95%)
Doadores de sangue
3010
0
3009*
100,0 (99,9 a 100,0)
Pacientes hospitalizados não selecionados
300
7**
293
100,0 (98,7 a 100,0)
Mulheres grávidas (incluindo multíparas)
50
0
50
100,0 (92,9 a 100,0)
*Uma amostra foi inconclusiva no reteste com BIO-FLASH Syphilis e não foi usada nos cálculos
**As 7 amostras reativas com BIO-FLASH Syphilis também foram reativas com outros ensaios comerciais
Sensibilidade
A sensibilidade foi avaliada testando amostras positivas confirmadas para anticorpos anti-T. pallidum. As amostras
foram obtidas do banco de sangue e do Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Os resultados de sensibilidade são
mostrados na tabela seguinte:
Amostras
testadas
n
Amostras positivas confirmadas para sífilis
200
Positivas
Negativas
Sensibilidade
n
n
% (IC 95%)
200
0
100,0 (98,2 a 100,0)
Avaliação externa
Uma avaliação externa foi realizada no Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Espanha) com um total de
500 amostras de rotina de prospecção de sífilis (não selecionadas). As amostras foram caracterizadas pelo
método ARCHITECT Syphilis TP e testadas com BIO-FLASH Syphilis.
ARCHITECT Syphilis TP
BIO-FLASH
Syphilis
NEG
POS
Total
NEG
POS
Total
431
0
431
3
65
68
434
65
499*
*Uma amostra foi inconclusiva no segundo teste com ARCHITECT Syphilis TP
Resultados inconclusivos não foram usados nos cálculos. Foram os seguintes os resultados de sensibilidade
relativa, especificidade relativa e concordância global:
N
499
Sensibilidade relativa
Valor
IC 95%
95,6% 87,6% a 99,1%
Especificidade relativa
Valor
IC 95%
100,0% 99,1% a 100,0%
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
Concordância global
Valor
IC 95%
99,4% 98,3% a 99,9%
3000-8602_R00_05.2014_por.docx
BIO-FLASH ®
As amostras reativas de ARCHITECT Syphilis TP e/ou BIO-FLASH Syphilis foram testadas com RPR e TPHA de
acordo com os critérios de algoritmo dos testes de rotina seguidos no laboratório. As 3 amostras que deram
positivo para ARCHITECT Syphilis TP mas negativo para o BIO-FLASH Syphilis foram classificadas pelo
laboratório como resultados inconclusivos, já que o RPR e TPHA reportaram resultados negativos.
Consenso sobre o
algoritmo de sífilis
BIO-FLASH
Syphilis
NEG
POS
Total
NEG
POS
Total
431
0
431
0
65
65
431
65
496*
*4 amostras foram inconclusivas segundo os critérios do algoritmo
Foram os seguintes os resultados de sensibilidade relativa, especificidade relativa e concordância global:
N
496
Sensibilidade relativa
Valor
IC 95%
100,0% 94,5% a 100,0%
Especificidade relativa
Valor
IC 95%
100,0% 99,1% a 100,0%
Concordância global
Valor
IC 95%
100,0% 99,3% a 100,0%
Precisão
A precisão intra-ensaio e a total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as
diretrizes CLSI EP05-A2. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte:
Controle negativo
Controle positivo
Amostra negativa
Amostra próxima ao valor de corte
Amostra positiva
Média (S/CO)
0,30
3,10
0,48
0,83
5,41
Intra-ensaio
0,009 SD
1,7% CV
0,018 SD
1,8% CV
1,7% CV
Total
0,011 SD
2,8% CV
0,024 SD
2,6% CV
2,6% CV
Reprodutibilidade
A reprodutibilidade entre lotes e entre instrumentos foi avaliada usando 50 amostras. Os resultados estão
resumidos na tabela seguinte:
n
50
50
Pendente
Valor
IC 95%
1,02
1,00 a 1,04
0,95
0,93 a 0,97
Intersecção
Valor
IC 95%
-0,01
-0,06 a 0,04
-0,01
-0,08 a 0,03
R
IC 95%
Lote 2 vs. Lote 1
0,974 a 0,991
Instrumento 2 vs. Instrumento
0,994 a 0,998
1
Interferências
Segundo avaliado pelas diretrizes CLSI EP7-A, os resultados do BIO-FLASH Syphilis não são afetados pelas
seguintes substâncias potencialmente interferentes:
Substância potencialmente interferente
Hemoglobina
Bilirrubina indireta
Bilirrubina direta
Triglicérides
Fator reumatoide
Concentração
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1300 mg/dL
800 UI/mL
Valor
0,985
0,997
% Interferência
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reatividade cruzada
Foram analisadas com o ensaio BIO-FLASH Syphilis 104 amostras positivas para condições que potencialmente
poderiam produzir reação cruzada. Considera-se que ocorre uma reação cruzada quando o diagnóstico muda de
negativo a positivo. As amostras reativas foram analisadas com ensaios comerciais para confirmar a positividade.
Os resultados estão resumidos na tabela seguinte:
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
3000-8602_R00_05.2014_por.docx
BIO-FLASH ®
Reação cruzada potencial
LES (Lúpus eritematoso sistêmico)
ANA (anticorpos antinucleares)
RF (fator reumatóide)
Usuários de drogas
Anticorpos heterófilos
Mulheres grávidas (multíparas incluídas)
Vacinados de gripe
Paraproteína G e M
anti-EBV (vírus Epstein-Barr)
anti-HSV-1 e HSV-2 (vírus Herpes simplex 1 e 2)
anti-VZV (vírus da varicela zoster)
anti-caxumba
anti-sarampo
anti-rubéola
Anti-toxoplasma (Toxoplasma gondii)
anti-CMV (Citomegalovírus humano)
anti-HAV (vírus da hepatite A)
HBsAg (antígeno de superfície da hepatite B)
anti-HCV (vírus da hepatite C)
anti-HEV (vírus da hepatite E)
anti-HIV (vírus da imunodeficiência humana)
anti-HTLV (vírus linfotrópico T humano)
anti-PV B19 (parvovírus B19)
Esquistossomose
E. coli (organismo no qual os vetores foram induzidos)
Vírus da febre do Oeste do Nilo
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Candida albicans
Doença de Lyme
Doença de Chagas
Concordância
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
6/6
3/3
6/6
3/3
6/6
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
5/5
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
Sensibilidade analítica
A sensibilidade analítica obtida foi < 0,02 UI/mL. Foi determinada ao interpolar o valor de corte do ensaio na linha
de regressão obtida testando diluições em série do 1º Padrão Internacional da OMS para plasma sifilítico humano
IgG e IgM (código NIBSC: 05/132).
Painéis comerciais
Os seguintes painéis comerciais foram analisados com BIO-FLASH Syphilis: Zeptometrix Mixed Titer Syphilis
Panel (K-ZMC002), SeraCare-BBI Diagnostics Syphilis Mixed Titer Performance Panel (PSS202(M)) e
SeraCare-BBI Diagnostics Syphilis Seroconversion Panel (PSS901-1.2). Para os dois painéis mistos (mixed), o
BIO-FLASH Syphilis demonstrou 100% de concordância com a maioria dos métodos relacionados em suas
respectivas instruções de uso. Para o painel de seroconversão (seroconversion), os resultados obtidos foram
equivalentes a outros imunoensaios CLIA comerciais.
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
3000-8602_R00_05.2014_por.docx