Artigo - Plasmídeos suicidas e Contenção de Organismos

PROCITROPICOS - Programa Cooperativo de Investigación e Innovación Agrícola para los Trópicos Suramericanos
Artigo - Plasmídeos suicidas e Contenção de Organismos Transgênico (Em
Português)
Categoria : Procitropicos Informa
Publicado por Monica em 03/3/2015
Compilado e organizado por Daniel Epifânio Marques, Keiny Wallace Santos (alunos do Curso de
Licenciatura em Biologia da UEA/CEST) e Afonso Celso Candeira Valois (Professor-Orientador)
Introdução
Na medida em que os organismos geneticamente modificados (OGM) ou transgênicos vão
encontrando um maior número de aplicações, tanto na indústria como em biorradiação e na
agricultura, torna-se cada vez mais urgente encontrar soluções práticas, eficientes e econômicas
para impedir sua disseminação descontrolada na natureza, onde pode vir a causar algum tipo de
impacto negativo, mesmo que ainda desconhecido até o momento.
A partir de então, tem-se assistido a um progresso espantoso, nunca imaginado, da aplicação de
ferramentas biotecnológicas. Através da engenharia genética fragmentos específico de DNA que
codificam funções de interesses são cortados e inseridos nos chamados vetores de clonagem
(geralmente plasmídeos e vírus) e após a transformação genética, esses genes passam a se
expressar em outros organismos.
A engenharia genética possibilita a transferência e expressão de material hereditário entre os mais
diferentes organismos, passando a utilizar diferentes hospedeiros de vetores de expressão dos mais
variados genes que hoje estão sendo produzidos por processo fermentativo. O resultado foi a
produção, a partir de bactérias geneticamente modificadas, de hormônio de origem humana: a
insulina e o hormônio de crescimento.
OGM e Biossegurança
Ao longo das conquistas, o cotidiano tem possibilitado aos pesquisadores novas descobertas
utilizando os OGM para a melhoria das condições de vida do ser humano, mas correndo o risco de
acontecerem impactos ambientais e perda de controle sobre esses organismos, que podem escapar
do domínio humano e causar desastres de médio e longo prazo.
Uma limitação adicional que se agrava é a falta de controle sobre a transferência de material
genético de um organismo para outro, fenômeno corriqueiro, principalmente entre bactérias através
de processos como: conjugação, tradução e transformação (Stotzky, 1989; Lorenz & Wackernagel,
1993).
O sucesso da transformação genética responsável pela transferência horizontal de material
genético entre diferentes espécies de bacterianas foi recentemente comprovado. A célula
Escherichia coli demonstra ser portadora de um plasmídeo conjugativo capaz de transferir com alta
frequência esse plasmídeo para células de Saccharomyces cerevisiae.
O Desenvolvimento do Sistema de Contenção de OGM
O objetivo absoluto do sistema biológico de contenção de OGM consiste na eliminação de
determinada população introduzidas nos ecossistemas, uma vez que sua função já foi completada.
Existem duas abordagens diferentes que se apresentam para o estabelecimento desses sistemas
de confinamento: 1º) Um mecanismo passivo baseado na delimitação da linhagem, tornando-a
capaz de sobreviver muito tempo fora das condições de laboratório. Ex: construção da linhagem
mutante X1776 de Escherichia coli, que para a construção da parede celular, necessita do ácido
diaminopimélico, molécula raramente encontrada na natureza; 2º) Um mecanismo ativo, pelo qual o
tempo de vida da linhagem seja controlado através da indução proposital de uma proteína letal,
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sendo que seu desenvolvimento é normal até ao momento em que ela comete suicídio, chamado de
“Terminator Technology”. Ex: nas plantas transgênicas elas contêm um sistema genético adicional
que, em resposta ao estímulo externo desencadeado por atuação do ser humano, provoca sua
esterilidade. Tais sistemas suicidas de contenção biológica poderiam ser, portanto como uma
solução alternativa para a situação de impasses causados pela crescente disseminação de OGM no
meio ambiente.
Poder-se-ia dar obrigatoriedade para que todo organismo transgênico contivesse um mecanismo
de autodestruição programada, que pudesse ser acionado em determinadas condições, de modo a
provocar a sua morte.
Principais Características dos Sistemas Suicidas
1 – Estabilidade; 2 – Regulação da Expressão Gênica – Promotores; 3 – Proteínas Assassinas.
Estabilidade A estabilidade da informação clonada é um dos fatores mais importantes para o
sucesso do sistema suicida, com genes que codificam proteínas tóxicas e permanentemente vivem
nas células. Consequentemente, há o uso de plasmídeos epissomais, podendo se perder durante o
crescimento em ambientes fora do laboratório. Nesse caso, os vetores mais indicados são aqueles
capazes de inserir cromossomos nas células hospedeiras, como os plasmídeos integrativos e os
transposons.
Regulação da Expressão Gênica –
Promotores De importância crucial para a construção de um sistema suicida eficaz é a regulação
da expressão dos genes assassinos. Durante a escolha do promotor de transcrição para esses
genes se deve considerar cuidadosamente, os mecanismos de repressão da expressão do gene
letal. É muito importante que haja vazamento da expressão do gene clonado para manter a
vitalidade da cultura e também para evitar o aparecimento de indivíduos resistentes na população.
Diferentes situações indesejáveis podem ocorrer: 1º) A ocorrência de seleção de células
resistentes à atividade da proteína assassina, em decorrência de mutações ocorridas no próprio
gene letal ou no seu promotor, ou ainda no alvo de ação da proteína em questão; 2º) A célula, ao
identificar a presença de um gene cujo produto lhe é tóxico, pode desenvolver mecanismos de
inativação desse gene, como, por exemplo, através da pesada metilação das regiões promotoras;
3º) A proteína ser altamente tóxica e matar a célula antes do momento adequado, mesmo quando
presente em baixas concentrações. Em laboratórios, o controle eficaz da expressão gênica pode ser
facilmente obtido, existindo vários promotores disponíveis (Molin et al., 1993). Uma limitação
encontrada é a identificação da expressão dos genes no ambiente, porque a maioria das células fica
a maior parte do tempo em ressonância.
Mecanismo de Controle Químico
Este tipo de controle baseia-se na indução da expressão do gene assassino através da adição de
determinados compostos, por exemplo, o IPTG (β-D-tiogalactopironosídeo), que foram
utilizados para a construção dos primeiros sistemas suicidas (Molin, et al., 1987; Bej et al., 1988).
Outra opção consiste em relacionar o sistema suicida a um repressor, cuja expressão seja
facilmente induzida apenas em condições laboratoriais.
Mecanismo de Controle Físico
A contenção de microrganismos recombinantes por um sistema de controle físico baseia-se no
clássico sistema de expressão de E. coli, com o grupo de promotores do fago lambda regulado pelo
repressor cI (Sussman & Jacob,1962).
O isolamento de uma variante termossensível permitiu o desenvolvimento do sistema de expressão
regulado pela temperatura. Mecanismo de Controle por Estresse Através da ativação de genes
específicos, os microrganismos desenvolvem respostas adaptativas a estas condições
extremamente desfavoráveis, que inclui mudanças de morfologia, fisiologia, esporulação,
desenvolvimento de resistência à temperatura e outros fatores. Mecanismo de Ativação
Recombinacional Trata-se de sistemas suicidas baseados na resolvase do plasmídeo RP4, uma
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recombinase sítio-específica, cuja função normal é de reparar multímeros de moléculas de
plasmídeos através de recombinação ao nível de uma sequência de DNA conhecida como sítio res.
Mecanismo de Controle Estocástico
A indução estocástica da expressão gênica consiste num modo de controle mais relevante para a
população do que para a célula individual; exemplo é o uso de promotores investíveis responsáveis
pelo fenômeno de variação de fase das fimbrias de tipo 1 de E. coli (Freitag et al., 1985). Proteínas
Assassinas Para o desenvolvimento de sistema de contenção, do tipo suicida, é primeiramente
necessário identificar genes que codifiquem proteínas cujo alvo de ação seja estruturas essenciais
da célula, tai como, a membrana celular, ribossomos, ácidos nucleicos etc.
Proteínas que Alteram as Funções da Membrana Celular São proteínas tóxicas que afetam a
morfologia das células, tornando-as transparentes devido à perda de substâncias celulares
relacionada à desestabilização da membrana celular, resultando na parada da respiração (Gerdes et
al., 1986ª).
Nucleases
Apesar do sucesso dos sistemas suicidas utilizando proteínas da família Gef, uma séria limitação
ainda persiste do ponto de vista da biossegurança: a liberação do material genético para o
ambiente, mesmo depois da morte da célula, uma vez que as proteínas Gef atuam na membrana,
acabando por liberar o conteúdo celular para o meio. Proteínas que Interferem na Síntese Proteica
Uma possibilidade para o estabelecimento de sistemas suicidas consiste no aproveitamento de
genes cujos produtos bloqueiam o processo celular de síntese de proteínas.
A colina E3-RNAse, codificada pelo gene colE3, é responsável por uma clivagem especifica do
RNA ribossômico 16S numa região extremamente conservada entre todos os organismos, sendo
inativada pela formação de um complexo com a proteína de imunidade E3, codificada pelo gene
imm3 (Diaz et al., 1994). Foi construído um sistema, no qual o gene colE3 está localizado num
plasmídeo promíscuo e o gene imm3 inserido dentro do cromossomo da célula hospedeira, de tal
modo que a probabilidade de cotransferência de ambos para outra bactéria é extremamente baixa.
Assim, ocorrendo a transferência do plasmídeo portador do gene colE3 para uma outra bactéria não
portadora do gene imm3, esta seria inativada. Uma família de toxinas de plantas extensivamente
estudada e que já foi utilizada como suicida para células do sistema nervoso (Pangalos et al., 1991;
Contestabile & Stirpe, 1993; Robert et al., 1993), consiste das proteínas conhecidas como RIP
(ribosome inactivating proteins), capazes de danificar ribossomos de eucariotos (Frankel et al., 1990;
Stirpe et al., 1992). A maioria delas apresenta-se em forma de cadeias simples (RIP do tipo I) ou
cadeias duplas ligadas covalentemente (RIP do tipo II).
Ricina é a mais estudada. Trata-se de uma proteína heterodimérica encontrada em sementes de
mamona (Ricinus communis), que apresenta a cadeia A (RTA) ligada à cadeia B (RTB) através de
uma ponte dissulfídica (Olsnes & Pihl, 1982). Estreptavidina A estreptavidina, uma proteína
tetramérica codificado pelo gene stv de Streptomyces avidinii (Argaraña et al., 1986), tem como alvo
de ação o metabolismo do carbono, ao nível de oxidação do carbono, sequestrando um grupo
postético essencial, a D-biotina ou vitamina H. A ação letal da estreptavidina advém da ligação
irreversível que ela realiza com a D-biotina.
A morte celular resulta da consequente inativação de carboxilases, descarboxilases e
transcarboxilases dependentes de biotinas (Fall, 1979). A inativação destas enzimas bloqueia o
primeiro passo da biossíntese de ácidos graxos e afeta a gliconeogênese, o metabolismo dos
aminoácidos, o ciclo de Klebs etc.
Exemplos de Sistemas Suicidas Os plasmídeos desenvolvidos
por Molin e colaboradores constituem os primeiros sistemas de suicidas descritos na literatura.
Subsequentemente, uma série de diferentes sistemas foi desenvolvida, sempre utilizando a
expressão controlada de um gene cujo produto é tóxico para a célula. PLASMÍDEO PNWL7
(MOLIN ET AL., 1987) O gene hok do plasmídeo R1 foi clonado de maneira a ter a sua expressão
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controlada pelo promotor ptrp de E. coli.
Este promotor é reprimido quando as células de E. coli são cultivadas em presença de triptofano, o
qual forma um complexo repressor ativo com o repressor trpR. De fato, a indução de células de E.
coli portadora deste plasmídeo em fase exponencial de crescimento acarreta a sua rápida
inativação, embora 0,1% das população sobreviva.
Os sobreviventes foram analisados e, como não se encontraram mutações do gene hok, os
autores atribuíram a sobrevivência a uma quantidade limitante de proteína Hok. Como uma possível
solução, os autores propõem que seja removida do plasmídeo uma sequência atenuadora do ptrp.
PLASMÍDEO PLKP26 (MOLIN ET AL.,1987) Com o intuito de verificar se o fenômeno também se
aplicaria para bactérias Gram-positivas, o gene hok foi clonado sob o controle do promotor plac no
plasmídeo bi-funcional E. coli – Bacillus subtilis pSI-1. A indução do promotor neste caso é efetuada
por adição de IPTG. O tratamento com IPTG de células de B. subtilis portadora do plasmídeo
resultante pLKp26 levou à morte imediata cerca de 75% da população. PLASMÍDEO PSM910
(KLEMM ET AL., 1995)
Este sistema suicida baseia-se na expressão, ao acaso, do gene gef, promovida pelo promotor
fimA de E. coli. O promotor fimA consiste de um segmento de DNA que pode ser invertido e que
determina a expressão periódica da fíbria do tipo 1 de E. coli. A inversão do promotor fimA é
controlada em trans através dos produtos de genes regulatórios fimB e fimE (Klemm, 1986), os
quais agem antagonicamente. O plasmídeo PSM910 contém uma cópia dos genes fimB e FimE,
além do gene gef sob o controle do promotor fimA. A fusão foi inserida no transposon Tn5 que, por
sua vez, foi inserido no plasmídeo pSUP202, um derivado de pBR325 mobilizável por conjugação.
Quando as células transformadas com o plasmídeo PSM910 são cultivadas em meios ricos, não se
nota diferença na taxa de crescimento em relação às células-controle.
Entretanto, em meios pobres ou em fase estacionária, as células portadoras do plasmídeo vão
morrendo exponencialmente, enquanto as células-controle permanecem num platô ao longo de duas
semanas. PLASMÍDEO PBAP19H (BEJ ET AL, 1988) Este plasmídeo foi desenvolvido como
alternativa apresentados por Molin et al (1987), sendo que a sua característica diferencial é o
promotor plac de E. coli, relativamente mais forte, reprimido pelo repressor LacI e indutível por
adição de IPTG ao meio de cultivo. O fragmento contendo o gene hoc do plasmídeo pPR633 foi
clonado sob o controle do promotor plac no vetor pTZ19, que é portador do gene de resistência à
carbenicilina. Só se conseguiram transformantes quando se empregaram linhagens portadoras do
gene lacIp, que codifica o repressor LacI em excesso, 10 vezes mais do que lacI.
A adição do IPTG no inicio da fase exponencial de crescimento de células transformadas pelo
plasmídeo pBAP19h induz rapidamente o gene hok; o efeito letal se manifesta 1-2 horas após a
adição do IPTG. O problema deste sistema foi o grande número de sobreviventes, devido à alta
instabilidade do plasmídeo. PLASMÍDEO PKGR (RECORBET ET AL., 1993) Este sistema
combina o uso de cassete nptI-SacR-B, que é induzido por sacarose, e a sua integração no
cromossomo de E. coli, visando estabilizar as funções que acarretarão a morte celular.
O cassete nptI-SacR-B (Ried & Collmer, 1987) confere sensibilidade à sacarose em bactérias
Gram-negativas. A atividade da enzima levanosacarase, uma enzima codificada pelo gene sacB da
Bacillus subtilis, a transcrição da qual é induzida na presença de sacarose, resulta na síntese de
quantidades letais de levano, cujo acúmulo no periplasma causa a lise celular (Gay et al., 1985).
Para evitar a perda do plasmídeo na ausência pressão seletiva, o cassete nptI-SacR-B foi intregado
no cromossomo da E. coli.
A integração foi obtida pelo emprego do plasmídeo pKGR sem a origem de replicação. O vetor não
replicado traz o cassete suicida flanqueado por sequências-alvo (tdb) do cromossomo de E. coli,
além do gene cet que confere resistência ao cloranfenicol. A integração cromossomal do cassete
pode utilizar um simples evento de crossing over, que provoca a integração completa do vetor ao
nível do gene tdb. Um segundo evento de recombinação entre as sequências duplicadas do
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gene-alvo, permitirá a excisão completa do vetor ou uma excisão parcial, levando apenas à perda do
marcador cat. Em comparação ao controle, o crescimento das linhagens portadores do vetor
integrado foi inibido após duas horas à adição de sacarose, mostrando a indução do gene sacR-B.
Após a adição de sacarose, enquanto as células de controle continuavam a crescer
exponencialmente, as culturas do transformante apresentaram lise celular.
A eficiência do sistema suicida foi de 99,9% obtida na ausência de seleção por antibiótico. Das
células que sobreviveram à indução pela sacarose, 96% eram resistentes ao cloranfenicol,
indicando que inserção cromossômica continuava presente, apesar da pressão letal. PLASMÍDEO
PSK360 (KNUDSEN ET AL., 1995) Uma das principais causas da ineficiência dos sistemas suicidas
é a inativação do gene assassino, provocada pela ocorrência de mutações, seguida de uma rápida
seleção e predominância dos mutantes na população. Como resultado, uma fração considerável de
células sobrevive, mesmo após a indução do sistema suicida.
Knudsen & Karlström (1991) verificaram que a taxa de mutação de uma única função suicida
baseada no gene relF de E. coli sob o controle do promotor lac atingiu 10- por célula por geração.
Buscando contornar esta situação, esses pesquisadores construíram um sistema de contenção
baseado em dois plasmídeos contendo a mesma função suicida ou funções suicidas duplicadas
num mesmo plasmídeo. PLASMÍDEO PAH12 (AHRENHOLTZ ET AL., 1994)
Diferentemente dos sistemas descritos até agora, que se baseiam na clonagem de genes que
codificam proteínas tendo por alvo a parede celular, nesse trabalho foi utilizada uma nuclease como
agente suicida. O gene nuc de Serratia marcescens codifica uma potente nuclease secretada pela
célula de atividade inespecífica contra RNA e DNA. O plasmídeo pAH12 é portador do gene nuc
deletado na sua região amino terminal que codifica o peptídeo-sinal da enzima, sob regulação do
promotor pL do lambda.
Para o controle da expressão gênica, a linhagem de E. coli hospedeira é portadora da mutação
cI857, que codifica um repressor termossensível do promotor pL. Nesta construção genética, a
morte celular ocorre quando as células são incubadas a 42ºC, uma vez que o repressor pL é inativo
e o gene nuc que passa a ser expresso. Quando transferido de 28ºC para 42ºC, em fase
exponencial de crescimento, as células contendo o plasmídeo pAH12 apresentaram sobrevivência
de apenas 2x10-. PLASMÍDEO PWWO (ROCHEL ET AL., 1995) Os plasmídeo TOL de
Pseudomonas putida contêm genes envolvidos no catabolismo de toluenos, xilenos e
hidrocarbonetos via benzoatos e toluatos.
A transcrição deste operon requer o produto do gene regulatório xyLS que, na presença de
3-metilbenzoato (3MB), ou outros efetores alquilaromáticos, ativa a transcrição a partir do promotor
Pm, o promotor geral desta via. Nesse trabalho foi construído um sistema suicida baseado em dois
vetores: um que carrega, além do gene xyLS, o gene lacI ( que codifica o repressor do operon
lactose), sob o controle do promotor Pm, e outro, que compreende a fusão entre o promotor Plac
(reprimido pela proteína LacI) e o gene gef, o qual codifica a função de morte. PLASMÍDEOS
PCC-SO5/PRO-ILP (SZAFRANSKI ET AL., 1997) A função da morte neste sistema baseia-se na
ligação irreversível que a estreptavidina com a D-biotina (Weber et al.,1989).
A morte celular resulta da ausência da biotina livre e da inibição direta de uma série de enzimas
que requerem a biotina para a sua atividade (Fall. 1979). Szafranski et al, (1997) empregaram a
estreptavidina como agente suicida num sistema desempenhado para que espécies transgênicas de
bactérias do solo Pseudomonas putida sofressem inativação assim que terminassem de degradar os
poluentes aromáticos desejados. Visando aumentar a eficiência do sistema suicida, a expressão do
gene stv, que codifica a estreptavidina, foi colocada sob duplo controle, efetivando através da
transformação da bactéria com dois diferentes plasmídeos especialmente construídos, pCC-s05 e
pRO-ilp. O plasmídeo pCC-s05 é portador do gene stv, lacI e xylS, enquanto o plasmídeo pRO-ilp é
portador do gene da RNA polimerase e da lisozima do bacterófago T7. PLASMÍDEO PUBNUC
(BALAN, 1999) Balan (1999) construiu um sistema suicida para leveduras, baseado no sistema
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inicialmente desenvolvido para bactérias por Ahrenholtz et al, (1994). Embora as leveduras sejam
utilizadas industrialmente para produção de uma grande quantidade de produtos heterólogos, ainda
não existiam sistemas de contenção descritos para este microrganismo eucariótico, visando sua
liberação para o ambiente após a fermentação nas dornas.
A ideia, portanto, foi de construir um plasmídeo suicida para Saccharomyces cerevisiae que fosse
ativa somente ao fim do processo fermentativo. Para tal, o gene nuc de Serratia marcescens, sem
região codificadora peptídeo-sinal, foi clonado sob a regulação do promotor híbrido da levedura
ADH2/GAPDH. Este sistema é o que apresenta maior grau de contenção. Por outro lado, este
sistema de suicida poderia também ser aproveitado para a produção de Proteína de Célula Única
(SCP) de leveduras, permitindo a obtenção de massa proteica já destituída de ácidos nucleicos,
representando um avanço tecnológico considerável, já que o principal impedimento do uso de SCP
para a alimentação humana é o seu alto teor de ácido nucleico.
Impedimentos Relacionados aos Sistemas Suicidas
Dentre os fatores que limitam a eficiência dos sistemas suicidas, destacam-se o aparecimento de
mutações que tornam a célula insensível à proteína assassina e a seleção nas populações de
células com tal fenótipo. O fenótipo sobrevivente pode resultar principalmente de mutação no próprio
gene letal, no seu promotor ou ainda em outros genes que inativem a função destes.
Quando as mutações ocorrem no próprio gene letal, transferindo-se o plasmídeo para outra célula,
pode-se facilmente identificar a limitação. Uma maneira interessante de contornar o efeito das
mutações consiste em duplicar o sistema suicida. Para contornar a limitação da repressão
incompleta que a maioria dos promotores apresenta, a introdução de circuitos regulatórios
envolvendo além do controle ao nível de transcrição e outro ao nível de tradução, como aquele
descrito por Szafranski et el, (1997) pode aumentar notavelmente a eficiência do sistema suicida.
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