Transformação genética e suas aplicações em pesquisa e

GaTE Lab
Genomics and Transposable Elements
Transformação genética e suas
aplicações em pesquisa e
biotecnologia
Profa. Dra. Magdalena Rossi
Que é um organismo
geneticamente modificado
(OGM)?
•São aqueles que recebem um ou mais genes de
outro organismo e passam assim a expressar uma
nova característica de interesse.
•OGMs = melhoramento genético clássico.
-cruzamentos naturais ou forçados com seleção humana
(milho/teosinte?)
-introgressão de genes de espécies selvagens em S.
lycopersicum.
•OGMs= tão antigos quanto a agricultura
(mas não são produzidos por
transformação).
Que é um transgênico?
DNA
Genes de interesse:
existem na natureza, não são
”
“inventados nem “sintetizados”.
Célula:
animal, vegetal, bactéria, etc
Melhoramento genético:
“CLÁSSICO”
9 Característica de
interesse
9 Planta de interesse
9 Estabilidade da
informação transferida
“TRANSFORMAÇÃO
DIRETA”
9 Gene de interesse
9 Planta de interesse
9 Estabilidade da
informação
transferida
Ambos dependem da seleção das cultivares
para uso comercial em etapas subsequentes.
As transgênicas e o melhoramento genético
• Técnicas de transformação genética de
plantas:
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtos
transgênicos)
• Técnicas de transformação genética de
plantas:
– Agrobacterium (método biológico)
– Bombardeamento (método físico)
– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtos
transgênicos)
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledôneas,
mono) e Gimnospermas)
Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium)
A. tumefaciens
A. tumefaciens
(galha-da-coroa)
A. rhizogenes
Histórico
• 1907; descreve-se a doença
• 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium
• 1970; constata-se a correlação entre a doença
e um plasmídeo
• 1979; transferência de um fragmento de DNA
da bactéria para a célula vegetal
A.tumefaciens
tumefaciens
A.
• pTi
• tumor: tecido
mosaico!
• Porque forma o
tumor?
A. rhizogenes
• pRi
• raizes são clones
celulares
• porque surgem
raizes?
Uma interação peculiar ...
Agrobacterium
- Transfere um fragmento
de DNA, o T-DNA, do
plasmídio Ti no genoma
vegetal.
- Inserção em posição
aleatória dentro do
genoma.
- Induz a proliferação
celular originando
tumores ou raízes a partir
da célula transformada.
- As células vegetais
transformadas sintetizam
substâncias chamadas
opinas que são a fonte de
C e N das bactérias.
Organização de pTi ou pRi
síntese de opinas e oncogenes (síntese de
citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas)
Região
transferida
(transferência
do T-DNA:
genes de
virulência)
Borda
direita
Borda
esquerda
(conjugação
entre
agrobactérias
do solo)
200Kb
(catabolismo
de opinas)
(origem de replicação
e região de
incompatibilidade)
Transferência do T-DNA
Phenolics
detected by the
VirA/VirG two
component
sensor system.
Vir D1 & D2 cut
T-DNA at right
and left borders
and starts T-DNA
synthesis (VirC)
Vir Gene
expression
induced
Formation of T-complex
AGROBACTERIUM
T-DNA
Bacterial
Plasmid
VirA VirG
VirE2
VirD2 attaches to
exposed 5I end
Formation of T-Pilus (VirB and VirD4
PLANT CELL
Phenolics
Produced by
Wounded
Plant cell
Gall Formation!
T-DNA integrates into plant DNA
and gall production is initiated.
VIP1 associates with
the complex to target
it to the nucleus
VIP2 associates the
complex to
transcriptionally
active DNA
Transformação via Agrobacterium
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e
um marcador de seleção.
-Introdução da construção na bactéria.
-Introdução da construção na célula vegetal pela bactéria.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie
vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organização de pTi ou pRi
GENE DE INTERESSE + MARCADOR DE SELEÇÃO
Região
transferida
(transferência
do T-DNA:
genes de
virulência)
Borda
direita
Borda
esquerda
(conjugação
entre
agrobactérias
do solo)
200Kb
(catabolismo
de opinas)
(origem de replicação
e região de
incompatibilidade)
Transformação de explantes
T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantes
SEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Transformação de células
Células 3-4 dias em cultura liquido
Meio + antibióticos
para seleção
3 dias de cocultivo
4 ml
Replaqueamento em
meio seletivo
Após 7 dias
50 – 100 ul
1
Bactérias de 1-2
dias em cultura
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Transformação de células e seleção
Replaqueamento
em meio seletivo
Células que não cresceram
em meio seletivo
Células crescendo em
meio seletivo
Meio MS30 sólido Carb +
Vanc + Higro
U3B::GUS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
U3A3MR::GUS
U3A2MR::GUS
Controle -
O processo de regeneração:
Seleção de linhagens portadoras do gene
de interesse.
Transformação via bombardeamento
(canhão gênico)
-Obtenção da construção contendo o gene de
interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um
mecanismo físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da
espécie vegetal a ser transformada (cultura de
tecidos).
Transformação genética de plantas: bombardeamento
Prom
Gene de interesse
VETOR
Gene de interesse
+
Gene de resistência
para seleção de
transformantes
Diferênça com vetor de Agro!
Bombardeador
Partículas de tungstênio
carregando DNA
Bombardment
Transformação via eletroporação
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse
e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um método
físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da
espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Transformação genética de plantas: eletroporação
Prom
Gene de interesse
Gene de interesse
+
Gene de resistência para seleção de
transformantes
VETOR
E
E
D
F
• Técnicas de transformação genética de plantas:
– Agrobacterium (método biológico)
– Bombardeamento (método físico)
– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
–
–
–
–
Conhecer o padrão temporal de expressão de um gene (?)
Conhecer o padrão espacial de expressão de um gene (?)
Conhecer a resposta de um gene a diferentes estímulos
Estudar os genes envolvidos nos diferentes processos
fisiológicos (ex. resistência a patógenos, floração, etc)
• Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)