C - Universidade Ceuma

UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
MARCIA BARROS ALVES
PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E
GENOTIPAGEM MOLECULAR
DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis
São Luís
2015
MARCIA BARROS ALVES
PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E
GENOTIPAGEM MOLECULAR
DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em Biologia Parasitária como parte dos requisitos
para a obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Orientadora: Profa. Dra. Cristina de Andrade
Monteiro
São Luís
2015
A474p
Alves, Márcia Barros.
Propriedades e fatores de virulência e genotipagem molecular de
isolados clínicos de Candida parapsilosis. / Márcia Barros Alves.
São Luís: UNICEUMA, 2015.
70 p.:il.
Dissertação (Mestrado) – Curso de Biologia Parasitária.
Universidade CEUMA, 2015.
1. Microssatélites. 2. Candida parapsilosis. 3. SADH. I. Monteiro,
Cristina de Andrade (Orientadora). II. Título.
CDU: 504.06
FOLHA DE APROVAÇÃO
MARCIA BARROS ALVES
PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E GENOTIPAGEM
MOLECULAR DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em
sessão pública realizada no dia
/
/
, considerou a candidata
(
) APROVADA
(
) REPROVADA
1) Examinador _____________________________________________________
2) Examinador ______________________________________________________
3) Examinador ______________________________________________________
4) Presidente (Orientador)______________________________________________
Dedico este trabalho a todos
que contribuíram para que ele fosse concretizado.
Agradeço
À Deus, que me deu forças para conseguir chegar até aqui apesar de todas as adversidades
e que sempre ouviu minhas preocupações nas horas em que eu não conseguia falar.
Aos meus pais, João Gualberto Alves e Helena Álvares Barros, que são responsáveis por
todas as coisas boas que já fiz na vida e ainda farei, pelo amor, carinho e por estarem ao meu
lado todo o tempo, incentivando e mostrando os melhores caminhos a serem tomados e apoiamme de todas as maneiras possíveis para que juntos alcancemos mais e mais objetivos de vida.
Ao meu irmão, Marcio Barros Alves, que é o grande torcedor da “maninha” dele, por
sempre ser solícito a ouvir meus problemas, minhas alegrias e até minha fúria.
Aos tios e primos, que mesmo de longe, acompanham-me, compartilhando a felicidade e
o orgulho que sentem com todas as minhas conquistas, mesmo as pequenas.
Ao meu namorado, amigo, companheiro, Rossini Carlos Silva Sousa, que deu amor,
carinho, atenção, acompanhou a minha vida acadêmica nos momentos bons e ruins, me fazendo
rir em dias de desânimo e ensinando a ser mais forte para não deixar a “peteca” cair e que, além
de incentivar, cobrava resultados também.
Às minhas amigas, Ellen Naianne da Silva Cantanhede, Pollyanna Lindoso Kromek,
Rafaella Cristine de Souza e Daniella Patrícia Brandão Silveira por desejarem o melhor para mim
e fazerem parte de todos os momentos (principalmente aqueles acompanhados de pizza, cinema,
refrigerante e risos).
A profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro (para mim, a teacher), a quem eu tanto
admiro como pessoa e como profissional e devo quase tudo o que aprendi para a vida profissional
porque acreditou em mim quando eu era apenas uma estudante de biologia, pela paciência e
dedicação na minha orientação.
Aos professores Dr. Lídio Gonçalves Lima Neto e Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim,
que foram co-orientadores, ajudando a solucionar problemas, discutindo, dando sugestões e, além
disso, ainda tentaram acompanhar o desenvolver das etapas do trabalho mesmo com todas as
ocupações que já tinham.
A Margareth Santos Costa Penha, por sempre me receber com um sorriso todos os dias e,
além de ter se tornado uma parceira, ajudou sempre de maneira solícita e com muito carinho.
A todos os meus colegas de “labuta”, em especial Iven Neylla Farias Vale Mendes,
Fernanda Costa Rosa, Laura, Patrícia Valéria Gomes Castelo Branco, Reinaldo Oliveira Araújo
Júnior e Willyson Richard Jardim Araújo, todos foram mais que meros colegas de pesquisa
ajudando aqui e ali e regando as muitas horas de testes no laboratório com risadas e brincadeiras
até quando o momento era de completo “aperreio”.
Aos colegas da química na UFMA, em especial Victor Eduardo de Araújo França, Afonso
Vilar Guimarães Pereira Júnior e Talita Cristina Raiol Carvalho, por esperarem por esse título
comigo só porque me acham legal, mas legais mesmo são eles.
Ao professor Thiago Azevedo Feitosa Ferro, por ajudar nos testes estatísticos e dar apoio
moral e incentivos para o futuro na pesquisa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa e Desenvolvimento do Maranhão (FAPEMA), pelo
financiamento e apoio à minha pesquisa.
“ O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo.”
Winston Churchill
LISTA DE FIGURA
Figura 1 Gel de agarose mostrando os perfis da reação PCR para a detecção de microssatélite
CP1 em isolados de C. parapsilosis stricto sensu .................................................................... 35
Figura 2 Gel de agarose mostrando a reação de PCR do gene SADH em isolados de C.
parapsilosis............................................................................................................................... 36
Figura 3 Gel de agarose mostrando o perfil de reação RFLP com enzima de restrição Ban I
.................................................................................................................................................. 37
Figura 4 Distribuição dos isolados estudados de acordo com as espécies do complexo C.
parapsilosis e os espécimes clínicos ........................................................................................ 38
Figura 5 Níveis de intensidade da capacidade de adesão a vidro de isolados de C.
parapsilosis...............................................................................................................................40
Figura 6 Lâmina de teste de adesão a vidro em isolados de C. parapsilosis............................ 40
Figura 7 Distribuição dos níveis de intensidade de adesão a vidro por espécimes clínicos dos
isolados de C. parapsilosis ....................................................................................................... 41
Figura 8 Distribuição da intensidade de formação de biofilme por C. parapsilosis ................ 43
Figura 9 Intensidade da capacidade de formação de biofilme dos isolados de C. parapsilosis em
relação aos espécimes clínicos ................................................................................................. 44
Figura 10 Intensidade da produção de hemolisina em isolados de C. parapsilosis ................. 46
Figura 11 Distribuição da produção de hemolisinas por C. parapsilosis de acordo com os
espécimes clínicos dos isolados................................................................................................ 47
Figura 12 Intensidade da produção de fosfolipases em C. parapsilosis................................... 49
Figura 13 Distribuição da produção de fosfolipases por espécimes clínicos de C.
parapsilosis...............................................................................................................................50
Figura 14 Intensidade de produção de proteinases por C. parapsilosis ................................... 51
Figura 15 Distribuição da produção de proteinases por espécimes clínicos de C. parapsilosis.
.................................................................................................................................................. 52
Figura 16 Distribuição de produção de catalase por espécimes clínicos de C. parapsilosis.... 54
Figura 17 Distribuição da capacidade de adesão e da formação de biofilme por espécimes
clínicos de C. parapsilosis ........................................................................................................ 55
Figura 18 Correlação positiva entre biofilme e adesão para os isolados de C. parapsilosis .... 56
Figura 19 Distribuição da produção de exoenzimas por sítios anatômicos de C. parapsilosis 56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Sequência dos iniciadores da região de microssatélites específicos para Candida
parapsilosis stricto sensu ......................................................................................................... 29
Tabela 2 Sequência dos iniciadores para região do gene SADH para C. metapsilosis e C.
orthopsilosis ............................................................................................................................. 29
Tabela 3 Classificação da formação de biofilme ...................................................................... 32
Tabela 4 Distribuição dos isolados de C. parapsilosis por espécimes clínicos. ....................... 37
Tabela 5 Distribuição dos níveis de capacidade de adesão a vidro pela espécie do complexo C.
parapsilosis............................................................................................................................... 42
Tabela 6 Distribuição das intensidades de formação de biofilme por espécie do complexo C.
parapsilosis............................................................................................................................... 45
Tabela 7 Distribuição dos níveis de produção de hemolisinas por espécie do complexo C.
parapsilosis............................................................................................................................... 48
Tabela 8 Distribuição das intensidades de produção de fosfolipases por espécie do complexo
C. parapsilosis .......................................................................................................................... 51
Tabela 9 Distribuição das intensidades de produção de proteinases por espécie do complexo C.
parapsilosis............................................................................................................................... 53
Tabela 10 Distribuição das intensidades de produção de catalase por espécie do complexo C.
parapsilosis............................................................................................................................... 54
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – graus Celsius ou graus centígrados
ALS – Agglutinin-Like Sequence
BCR- Biofilm and cell wall regulator
BHI – Brain Heart Infusion
CIA – Clorofórmio Álcool-Isoamílico
DNA – Ácido desoxirribonucleico
D.O.i- Densidade óptica do isolado
D.O.c- Densidade óptica do controle
EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid
EFG – Enhanced Filamentous Growth
EPA – Epithelial adhesion
HBECS- Células epiteliais bucais humanas
H.I.- Índice hemolítico
HPW- Hyphal wall protein
ITS- Internal transcribed sequence
NaCl- Cloreto de Sódio
pb – pares de bases
PBS – Phosphate buffered saline
PCR – Polimerase Chain Reaction
pH- potencial Hidrogeniônico
P.z.- Zona de precipitação
RAPD- Random amplication of polymorphic DNA
RFLP- Restriction fragment length polymorphism
SADH- Secondary alcohol dehydrogenase
SAP – Secreted Aspartic Proteinase
SDS – Sodium dodecyl sulfate
TE – Tris e EDTA
TL – Tampão de lise
TRIS – tampão TRIS
UFCs – Unidades formadoras de colônias
12
RESUMO
O gênero Candida é alvo de estudos desde a década de 40, sempre voltados para os aspectos
médicos como acontece até os dias de hoje. Em pacientes imunocomprometidos as espécies de
Candida se tornam um dos principais agentes causadores de infecções da corrente sanguínea,
estando inclusive, associadas ao uso de cateteres e dispositivos protéticos. Dentre as espécies
uma das mais frequentemente isolada é a Candida parapsilosis sendo considerada em geral a
segunda ou terceira espécie mais comum em isolados de culturas de sangue. De acordo com a
literatura vigente os três diferentes grupos de C. parapsilosis são considerados espécies
diferentes de acordo com o grau de variação de sequências de microssatélites, de modo que o
grupo I corresponde a Candida parapsilosis (stricto sensu), o grupo II é denominado Candida
orthopsilosis e o grupo III, Candida metapsilosis. Desse modo o presente trabalho fez a
identificação de isolados previamente identificados como C. parapsilosis, provenientes de
diferentes espécimes clínicos, por meio da análise de marcadores microssatélites e do gene
SADH e observou a associação destes com as propriedades e fatores de virulência para adesão,
formação de biofilme, produção de hemólise, fosfolipase, proteinase, catalase e gelatinase por
elas apresentados e o espécime clínico ao qual pertenciam. Foram analisados 57 isolados (28
de secreção vaginal e 29 de outros sítios, como urina, ponta de cateter, sangue e sítios
desconhecidos). Destes 54 foram identificados como C. parapsilosis stricto sensu, 1 como C.
metapsilosis e 2 como C. orthopsilosis. As espécies apresentaram variação intraespecífica para
os fatores e propriedades de virulência e foi encontrada uma correlação positiva entre adesão e
biofilme. Por fim, não foi encontrada associação entre os espécimes clínicos e a espécie dos
isolados, nem das espécies e os fatores e propriedades de virulência analisados.
Palavras-chave: Candida parapsilosis, microssatélites, SADH, identificação.
13
ABSTRACT
The genus Candida is the subject of studies since the 40s, always focused on the medical aspects
as it does to this day. In immunocompromised patients Candida species become one of the
leading causes of bloodstream infections, including being associated with the use of catheters
and prosthetic devices. Among species one of the most frequently isolated Candida parapsilosis
and is generally considered the second or third most common species isolated from blood
cultures. According to the current literature C. parapsilosis three different groups are
considered different species according to the degree of variation of microsatellite sequences, so
that the group I is Candida parapsilosis (sensu stricto), group II is named Candida orthopsilosis
and group III, Candida metapsilosis. Thus this work made the identification of previously
identified as C. parapsilosis isolates from different clinical specimens, through the analysis of
microsatellite markers and SADH gene and observed their association with the properties and
virulence factors for adhesion, biofilm, the haemolysis production, phospholipase, protease,
catalase, and gelatinase, and they present the clinical specimen to which they belonged. 57
isolates were analyzed (28 vaginal secretion and 29 other sites such as urine, catheter tip, blood
and unknown sites). Of these 54 were identified as C. parapsilosis stricto sensu, as C.
metapsilosis 1 and 2 as C. orthopsilosis. The species present intraspecific variation for virulence
factors and properties and found a positive correlation between adherence and biofilm. Finally,
no association was found between clinical specimens and species of isolated, or of species and
the factors and virulence properties analyzed.
Keywords: Candida parapsilosis, microsatellite, SADH, identification
14
Sumário
1.
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................15
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................................19
2.1 CANDIDA PARAPSILOSIS ............................................................................................................................. 19
2.2 FATORES E PROPRIEDADES DE VIRULÊNCIA.............................................................................................. 20
2.2.1
Enzimas hidrolíticas ...................................................................................................................... 21
2.2.2
Adesão ........................................................................................................................................... 22
2.2.3
Biofilme ......................................................................................................................................... 24
3. OBJETIVOS ..............................................................................................................................................27
3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................................... 27
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................................. 27
4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................................28
4.1 NATUREZA E OBTENÇÃO DOS ISOLADOS ...................................................................................................... 28
4.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ............................................................................................... 28
4.2.1 Extração de DNA genômico ............................................................................................................... 28
4.2.2 Amplificação por PCR das regiões de microssatélites e do gene SADH............................................. 28
4.2.3 RFLP do gene SADH .......................................................................................................................... 30
4.3 ANÁLISE DAS PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA ............................................................................ 30
4.3.1 Capacidade de Adesão a vidro ............................................................................................................ 30
4.3.2 Formação de biofilme ......................................................................................................................... 31
4.3.3 Produção de hemolisinas ..................................................................................................................... 32
4.3.4 Produção de fosfolipases ..................................................................................................................... 32
4.3.5 Produção de proteinases ...................................................................................................................... 33
4.3.6 Produção de catalase ........................................................................................................................... 33
4.3.7 Produção de gelatinase ........................................................................................................................ 33
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................................. 34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................................35
5.1 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ............................................................................................... 35
5.2 FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS .............................................................................................. 37
5.3 ADESÃO A VIDRO ......................................................................................................................................... 39
5.4 FORMAÇÃO DE BIOFILME ............................................................................................................................. 42
5.5 PRODUÇÃO DE EXOENZIMAS ........................................................................................................................ 46
5.5.1 Hemolisinas ........................................................................................................................................ 46
5.5.2 Fosfolipases ........................................................................................................................................ 48
5.5.3 Proteinases .......................................................................................................................................... 51
5.5.4 Catalase ............................................................................................................................................... 53
5.5.5 Gelatinase............................................................................................................................................ 55
5.6 CORRELAÇÕES ENTRE OS FATORES DE VIRULÊNCIA AVALIADOS ................................................................. 55
6. CONCLUSÕES .........................................................................................................................................57
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................................58
ANEXOS........................................................................................................................................................65
ANEXO A- PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA DA UNIVERSIDADE CEUMA ...................................... 66
ANEXO B- PROTOCOLOS DE SUBMISSÃO DO ARTIGO “PREVALÊNCIA DE CANDIDA SPP. EM AMOSTRAS DE
SECREÇÃO VAGINAL E SUA RELAÇÃO COM FATORES ASSOCIADOS À VULVOVAGINITE” ..................................... 69
ANEXO C- CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO VII CONGRESSO BRASILEIRO DE MICOLOGIA
.......................................................................................................................................................................... 70
15
1. Introdução
O gênero Candida é alvo de estudos desde a década de 40, sempre voltados para os
aspectos clínicos como acontece até os dias de hoje (SKINNER; FLETCHER, 1958; MOTA,
2007). Candida spp. desenvolvem um estado comensal em indivíduos saudáveis e nesse estado
não causam doenças podendo inclusive alcançar uma grande densidade populacional sem
desenvolver
qualquer
sintomatologia
(MOTA,
2007).
Porém,
em
pacientes
imunocomprometidos as espécies de Candida se tornam um dos principais agentes causadores
de infecções da corrente sanguínea, estando inclusive, associadas ao uso de cateteres e
dispositivos protéticos (SABINO et al., 2010).
As espécies do gênero Candida têm sido os agentes mais frequentemente isolados e
correspondem a cerca de 80% das infecções fúngicas de origem hospitalar. São consideradas a
quarta causa de infecção da corrente sanguínea, estando associadas a uma letalidade de 40%
(GERMAIN et al., 2001; TAMURA et al., 2007).
Em 1963 eram conhecidas cerca de cinco espécies de Candida consideradas de
importância médica: C. albicans, C. stellatoidea, C. parapsilosis, C. tropicalis e C.
guilliermondii. Estudos registraram mais de vinte espécies de Candida causadoras de infecções
(COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; BACELO, 2008). Dentre estas de interesse clínico, a
Candida albicans é a espécie frequentemente mais isolada de infecções superficiais e invasivas
em diferentes sítios anatômicos, apresentando grande potencial patogênico sendo, portanto,
bastante estudada (BACELO, 2008).
As candidemias continuam a ser um importante problema de saúde pública; estudos
recentes documentam um declínio em infecções bacterianas da corrente sanguínea associadas
à cateter, porém o mesmo não é observado em infecções causadas por espécies de Candida
associadas aos mesmos dispositivos médicos (SCHULMAN et al., 2011; CLEVELAND et al.,
2015). O tratamento em casos de candidíases tem se mostrado complicado devido ao aumento
relativo na proporção de isolados de Candida não albicans que demonstram muitas vezes uma
resistência
intrínseca
aos
agentes
antifúngicos
específicos
(SHIVAPRAKASHA;
RADHAKRISHNAN; KARIM, 2007; SHARMA et al., 2015). Dados epidemiológicos recentes
revelam uma mudança micológica quanto às espécies relacionadas à candidemia de C. albicans
para espécies de Candida não albicans, como C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C.
krusei (WISPLINGHOFF et al., 2004; GUPTA; GUPTA; VARMA, 2015).
16
Dentre estas espécies, uma das mais frequentemente isolada é a Candida parapsilosis,
como apontam estudos desenvolvidos em algumas instituições hospitalares na América Latina,
Canadá e Ásia, nos quais é considerada em geral a segunda ou terceira espécie mais comum em
isolados de culturas de sangue (PFALLER et al., 2000; BASSETI et al., 2006; LASKER et al.,
2006; SOUZA, 2007).
Diante da importância clínica apresentada pela Candida parapsilosis, nota-se a
importância do estudo dessa espécie que vem demonstrando cada vez mais expressiva em
infecções hospitalares. Inclusive, diferente das demais espécies de Candida, a C. parapsilosis
tem sido encontrada nas mãos de profissionais de saúde que instalam e mantêm os dispositivos
médicos, sugerindo uma rota potencial de transmissão (WENZEL; EDMOND, 2001; SABINO
et al., 2010).
Epidemiologicamente e clinicamente as características correspondentes a cada espécie
de Candida causadora de candidíase tem sido pobremente documentadas, uma vez que o
diagnóstico fenotípico delas é pouco confiável por esse motivo é que se torna importante a
identificação rápida e correta da espécie de Candida em laboratórios clínicos para o tratamento
de pacientes com candidemia (HAYS et al., 2011).
Os diagnósticos de Candida eram baseados em identificar se o isolado em questão era
Candida albicans ou Candida não albicans, para tanto era feita a identificação de C. albicans
através da formação de tubo germinativo em soro humano ou animal a 37 °C ou por meio de
testes de assimilação de carboidratos (MADHAVAN et al., 2011). Na tentativa de melhorar o
diagnóstico da espécie de Candida desenvolveram-se métodos laboratoriais menos laboriosos
e mais rápidos, como os meios cromógenos (consistem na mudança de cor do meio de acordo
com o pH produzido por cada espécie) e os métodos comerciais, baseados em assimilação de
carboidratos (ARRAM, 2008).
Há vários relatos e pesquisas que mostram identificação errada de várias espécies de
Candida quando os pesquisadores usam técnicas de identificação fenotípica (ROWEN et al.,
1999; REILLY et al., 1999; MOTA, 2007). Diante desse quadro era importante se desenvolver
estudos que pudessem trazer um diagnóstico confiável e rápido dessas leveduras e como
demonstraram os estudos de Xu et al. (2002) e Mota (2007), os métodos moleculares
mostraram-se como excelentes métodos de identificação de Candida spp.
A rápida identificação dos isolados envolvidos em infecções e a elucidação dos padrões
de diversidade genética são questões relevantes clinicamente, uma vez que esse conhecimento
pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento das
infecções (SABINO et al., 2010).
17
Com o avanço nos estudos de biologia molecular desenvolveram-se técnicas de
genotipagem molecular rápida para análises clínicas e epidemiológicas. Vários métodos de
tipagem molecular foram desenvolvidos para diferenciar isolados de C. albicans inicialmente,
fazendo uso, por exemplo, de cariotipagem eletroforética, uso de sondas específicas para a
espécie em análise de enzimas de restrição ou mesmo uso de métodos baseados em PCR
(SAMPAIO et al., 2003).
Hoje é empregada uma variedade de métodos moleculares baseados no DNA para
subtipagem de Candida spp., como os métodos baseados na análise de polimorfismo em
marcadores microssatélites (WISE et al., 2007). Microssatélites ou repetições em “tandem”
consistem em trechos de repetições de nucleotídeos únicas e dispersas pelo genoma e com um
alto nível de polimorfismo quando comparado com outros marcadores moleculares. Em
leveduras, os loci de microssatélites tem uma variação de tamanho considerável e isso faz deles
marcadores moleculares atrativos para vários de tipos de análises. O polimorfismo de
microssatélites manifesta-se como diferenças no comprimento alélico devido ao diferente
número de repetições únicas presentes em alelos que podem ser facilmente analisadas em
amplificações por PCR (SAMPAIO et al., 2005).
Candida parapsilosis emergiu na década de 1990 como uma das principais espécies
causadoras de candidemias, mas a sua incidência continua a aumentar e, ainda, a sua habilidade
em aderir a dispositivos, como implantes médicos, é similar àquela de Candida albicans,
conferindo-lhe grande resistência a agentes antifúngicos, levando a um real problema
terapêutico (HAYS et al., 2011). C. parapsilosis foi identificada pela primeira vez como agente
causador de um caso fatal em 1940, quando foi associada a endocardite (TROFA; GÁCSER;
NOSANCHUK, 2008). Nos últimos anos esta espécie além de ter um aumento de sua
prevalência, tem sido responsável por uma significante taxa de mortalidade em unidades de
tratamento hospitalar (CHICKERING, 2013).
Fisiologicamente, os isolados de C. parapsilosis são indistinguíveis, mas geneticamente
são relatados como uma espécie heterogênea. Vários estudos baseados em diversas análises
como RAPD (Random amplication of polymorphic DNA), análise com isoenzimas, análise de
nucleotídeos de ITS (Internal transcribed sequence), hibridização de DNA, apontam a espécie
como sendo composta por três grupos distintos, que seriam os grupos I, II e III (SABINO et al.,
2010).
18
Tavanti et al. (2005) propuseram que os três diferentes grupos de C. parapsilosis
fossem considerados espécies diferentes de acordo com o grau de variação de sequências de
microssatélites, de modo que o grupo I corresponderia a Candida parapsilosis (stricto sensu),
o grupo II seria denominado Candida orthopsilosis e o grupo III, Candida metapsilosis.
O uso de marcadores microssatélites para identificação de C. parapsilosis é vantajoso
porque permite a identificação até mesmo de micro-organismos com baixo grau de variação de
sequência (LASKER et al., 2006), permitindo uma identificação confiável. Além do que, cada
uma dessas espécies apresenta características diferentes quanto à virulência como sugerido por
Tavanti et al. (2007). No entanto, apesar da importância crescente do complexo de espécies C.
parapsilosis, poucos trabalhos avaliando a virulência in vitro destas espécies foram realizados
e pouco se sabe sobre as características da virulência que lhes permitem causar doenças
(SABINO et al., 2011).
19
2. Revisão bibliográfica
2.1
Candida parapsilosis
Candida parapsilosis é ubíquo na pele humana, sendo a segunda causa principal de
infecções fúngicas com morte (GÁCSER et al., 2007). Esta espécie é comumente relacionada
a cateter, hiperalimentação intravenosa e associada a candidemia devido à sua capacidade de
aderir e formar biofilmes sobre as superfícies de dispositivos intravasculares. Na verdade, C.
parapsilosis tem sido considerado um importante patógeno nosocomial, com manifestações
clínicas que incluem endoftalmite, endocardite, artrite séptica, peritonite e fungemia sendo
geralmente associada a procedimentos invasivos ou próteses (BARBEDO; SGARBI, 2010;
CANTÓN et al., 2011).
C. parapsilosis foi isolado pela primeira vez por Ashford (como uma espécie de Monilia
que era incapaz de fermentar maltose) a partir das fezes de um paciente com diarréia em Porto
Rico, em 1928. A espécie foi nomeada Monilia parapsilosis para distingui-lo do isolado mais
comum, Monilia psilosis, hoje conhecido como Candida albicans. Embora inicialmente
considerada não patogênica, C. parapsilosis foi identificada como sendo agente causador de
um caso fatal de endocardite em 1940 (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).
As células de C. parapsilosis exibem formas ovais, redondas e cilíndricas quando
crescidas em ágar Sabouraud dextrose, formam colônias brancas, cremosas, brilhantes,
homogêneas ou enrugadas. Diferente de C. albicans e C. tropicalis, que podem apresentar
múltiplas formas morfogenéticas, C. parapsilosis não forma hifas verdadeiras e pode se
apresentar em forma leveduriforme ou de pseudohifa (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK,
2008).
Diferente da C. albicans, a transmissão e a aquisição da infecção causada por C.
parapsilosis são principalmente exógenas e os isolados provenientes do ambiente são
frequentes fontes de infecção (SABINO et al., 2011).
Desde os anos 80, C. parapsilosis apresenta-se como um importante patógeno hospitalar
de fungemias, sendo responsável por 7% a 15% das candidemias na maioria das pesquisas
publicadas nos EUA e Europa. Sua ocorrência foi registrada como ainda maior em crianças e
recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva onde a prevalência de
candidemias por C. parapsilosis foi documentada entre as faixas de 17% a 50% dos casos
(COLOMBO; GUIMARÃES, 2003).
20
Desde 2005, C. parapsilosis é considerada um complexo de espécies, com três espécies
distintas, baseadas em critério genético: C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis
(HAYS et al., 2011).
Análise retrospectiva com base nos estudos moleculares indica que C. metapsilosis e C.
orthopsilosis representam de 1-10% das infecções / colonizações atribuídas a C. parapsilosis
em testes bioquímicos convencionais. Estudos relacionados ao potencial patogênico de isolados
pertencentes às três espécies do complexo de C. parapsilosis apontam C. metapsilosis como o
membro menos virulento do grupo (BERTINI et al., 2013). Segundo Gonçalves et al. (2010), a
prevalência das espécies de C. parapsilosis provenientes de 141 isolados de corrente sanguínea
testadas no Brasil representaram 88% de C. parapsilosis, 9% de C. orthopsilosis e 3% de C.
metapsilosis.
Embora
as
três
espécies
estejam
intimamente
relacionadas,
elas
diferem
acentuadamente em sua prevalência clínica, virulência e suscetibilidade aos antifúngicos. No
entanto, todas as três espécies são capazes de causar doenças graves com diversas manifestações
clínicas, incluindo a fungemia. Vários estudos epidemiológicos indicam que a maioria dos
casos associados ao complexo C. parapsilosis são causados por isolados de C. parapsilosis
stricto sensu e C. orthopsilosis é responsável por cerca de 1 a 10% dos casos, dependendo da
região geográfica, no entanto, C. orthopsilosis é mais frequentemente identificada do que C.
metapsilosis, apesar de ambas as espécies serem associadas com vários focos de infecção
(MIRHENDI et al., 2010; PRYSZCZ et al., 2014).
2.2
Fatores e propriedades de virulência
Fatores e propriedades de virulência bem como o mecanismo de defesa do hospedeiro
atenuada desempenham um papel crítico no desenvolvimento de infecções por Candida spp.
As enzimas hidrolíticas extracelulares das espécies de Candida facilitam a adesão e penetração
no tecido e, por conseguinte, invasão do hospedeiro. Além disso, a produção de biofilme é
conhecida por ser mais resistente a agentes antimicrobianos e de resposta imune, o que conduz
ao fracasso do tratamento (ATALAY et al., 2015).
Uma variabilidade notável da virulência foi observada para C. parapsilosis, tais como
a capacidade de formação de biofilme ou de produção de enzimas hidrolíticas (TAVANTI et
al., 2010).
21
2.2.1
Enzimas hidrolíticas
O estudo das enzimas hidrolíticas é mais frequentemente descrito em C. albicans, onde
se sabe que elas desempenham um papel central na patogenicidade da candidíase (BRANCO et
al., 2012). Enzimas hidrolíticas contribuem para os fatores de virulência em espécies de
Candida. As enzimas produzidas são hemolisina, proteinase, lipase e fosfolipase, fatores que
são responsáveis pela capacidade de invasão e proliferação de fungos causando a destruição
dos tecidos (RAMESH et al., 2011).
Capacidade hemolítica é um importante fator de virulência, onde a produção de
hemolisina e o rompimento de hemácias pelas mesmas levam os fungos do gênero Candida a
adquirirem ferro a partir de tecidos do hospedeiro, o qual é utilizado para o metabolismo,
crescimento e invasão durante a infecção. Em seres humanos, o ferro é encontrado em algumas
proteínas, incluindo hemoglobina (um componente de eritrócitos) (ROSSONI et al., 2013).
Estudos apontam que a produção de hemolisinas é regulada pela presença de glicose no meio
de crescimento e que C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis são capazes de produzir
hemolisinas in vitro em vários níveis (SILVA et al., 2011). Foi reportado em testes (LUO;
SAMARANAYAKE; YAU, 2001; MALCOK et al., 2009) que C. parapsilosis não exibem
hemólise em meios sem o acréscimo de 3% de glicose e mesmo com o acréscimo exibem apenas
alfa hemólise.
A produção de proteinases se dá em função da expressão de genes denominados
Secreted aspartyl proteinases (Saps). As proteinases facilitam a invasão e colonização de
tecidos dos hospedeiros pela ruptura das mucosas e degradam importantes proteínas de defesa
imunológica e estrutural, como albumina, hemoglobina, queratina, colágeno, mucina,
lactoferrina, lactoperoxidase e imunoglobulinas como as da classe IgA (BRANCO et al., 2012).
Para C. parapsilosis três genes SAP foram identificados (SAPP1-3), dos quais dois
permanecem pouco caracterizados. A isoenzima Sapp1 tem sido estudada para caracterização
bioquímica, a Sapp2 codifica uma proteinase funcional que constitui apenas 20% de Saps
isoladas e a expressão de genes SAPP1-3 varia em diferentes isolados clínicos de C.
parapsilosis (SILVA et al., 2011).
As fosfolipases atuam invadindo as células hospedeiras, provocando danos nos tecidos,
ruptura das membranas das células epiteliais e permitindo que as hifas penetrem para o
citoplasma (MATTEI et al., 2013). A atividade de fosfolipases é estudada em C. albicans
utilizando vários sistemas experimentais de virulência.
22
O papel das fosfolipases na patogênese de C. parapsilosis é menos clara e pouco
estudada (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008; SILVA et al., 2010). Resultados
contraditórios são relatados nas pesquisas, nas quais há atividade de fosfolipases em até 51%
dos isolados de C. parapsilosis, outras não apresentam esta atividade (TROFA; GÁCSER;
NOSANCHUK, 2008).
Outras duas importantes enzimas hidrolíticas produzidas por espécies do gênero
Candida são a gelatinase e a catalase. A gelatinase é também chamada de metaloendopeptidase
extracelular, é codificada pelo gene gelE e hidrolisa gelatina, colágeno, caseína, hemoglobina
e outros compostos bioativos (BRANCO et al., 2012). Também foi reportado que a gelatinase
secretada por C. albicans desempenha importante papel na degradação de matriz extracelular
córnea em testes em coelhos (ZHAI; XIE; DONG, 2007). Duarte et al. (2011) estudando o
aumento da expressão de queratinases e outras peptidases em C. parapsilosis mutantes
observou atividade de gelatinase a 60 kDA em zimogramas com substratos proteicos.
A catalase é um importante mecanismo enzimático usado por um micro-organismo
contra danos oxidativos (LINARES et al., 2006). O oxigênio é uma molécula indispensável no
metabolismo da maioria dos organismos aeróbicos, mas durante a fosforilação oxidativa nas
mitocôndrias (uma etapa da respiração celular) são geradas como subprodutos espécies reativas
de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio e superóxido, e estes degradam compenentes
celulares, como proteínas, lipídeos e DNA. Para reduzir a toxicidade das espécies reativas de
oxigênio os micro-organismos patogênicos possuem enzimas antioxidantes, como a catalase,
que decompõe peróxido de hidrogênio (NAKAGAWA, 2008).
Foi observado por Nakagawa (2008), que isolados de C. albicans sem produção de
catalase apresentam também a perda da habilidade para produção de hifas, sendo que a
produção de hifas está relacionada com o aumento da virulência das leveduras patogênicas. Nas
espécies de C. parapsilosis, os estudos de Miyasaka, Unterkircher e Shimizu (2008)
demonstraram variação na produção de catalase para esta espécie.
2.2.2
Adesão
A adesão dos micro-organismos para sediar as células e tecidos é o primeiro evento
necessário para a colonização inicial ou estabelecimento da infecção. Além disso, o contato de
superfície microbiana pode desencadear vários comportamentos celulares, incluindo a
formação de biofilme, o que também está fortemente associado com a candidose (DE PAULA
et al., 2014).
23
A adesão aos tecidos epiteliais facilita a colonização de biomateriais e a iniciação da
formação de biofilme, de modo que demonstra ser um importante fator de virulência. C.
parapsilosis adere a células epiteliais e biomateriais de maneira semelhante a C. albicans e essa
adesão pode ser reduzida por nistatina. Variações na adesão em isolados de pele são mais
comuns do que em isolados sistêmicos (PAMMI et al., 2013).
O processo de aderência é essencial para os membros do gênero Candida para
desenvolver o seu potencial patogênico, uma vez que se desencadeia o processo que leva à
colonização e permite a sua persistência no hospedeiro. Por exemplo, os isolados de Candida
relativamente mais patogênicos apresentam maior capacidade de aderência em células
epiteliais orais humanas (SPECIAN et al., 2013).
C. albicans tem um conjunto especializado de proteínas (adesinas) que medeiam a
adesão a outras células de C. albicans, outros micro-organismos, superfícies abióticas e células
do hospedeiro. A espécie C. albicans conta com adesinas ALS (agglutinin like sequence) que
são proteínas que formam uma família composta por oito membros (Als1-7 e Als9).
Das oito proteínas ALS, a adesina Als3 é especialmente importante para a expressão do
gene de adesão que regula o processo de infecção de células epiteliais bucais in vitro e infecção
vaginal in vivo e também contribuem para a formação de biofilme agindo como adesina
complementar (FRANÇOIS; DUNCAN; BERNHARD, 2013).
Atribuiu-se às adesinas o fenômeno de agregação celular como revelaram trabalhos
anteriores (KING; LEE; MORRIS, 1980). A adesão seguida de agregação celular tem sido
documentada em vários estudos envolvendo uma miríade de alvos biológicos. Quando C.
albicans encontra uma proteína ancorada, uma célula ou tecido, o fungo adere e então agrega
(KLOTZ; LIPKE, 2010).
Dados de bioinformática indicaram uma série de genes de adesinas específicas em C.
parapsilosis (SILVA et al., 2011). Estudos recentes comparam a atuação de alguns genes
relacionados à adesão entre C. albicans e C. parapsilosis. O produto do gene BCR1 (biofilm
and wall cell regulator) é um fator de transcrição conservado requerido na formação de biofilme
tanto em C. albicans quanto em C. parapsilosis. Alguns dos principais alvos de BCR1 em C.
albicans incluem genes que codificam adesinas e proteínas de parede celular (ALS1, ALS3,
HWP1 e genes relacionados) sugerindo que BCR1 está envolvido na fase inicial da adesão e
desenvolvimento de biofilme (DING et al., 2011).
24
Descrevendo uma análise do papel da BCR1 em C. parapsilosis, Ding et al. (2011)
mostraram que C. parapsilosis gera biofilmes in vivo em modelo de cateter em ratos e que
BCR1 é necessário para este processo, além disso demonstraram existir pouca sobreposição
entre os alvos de BCR1 nas duas espécies.
Colonização e infecção por C. parapsilosis são dependentes da capacidade do fungo
para aderir a células hospedeiras e tecidos, particularmente em superfícies mucosas. A adesão
a dispositivos médicos facilita a formação de biofilme e promove danos no hospedeiro. A
hidrofobicidade da superfície celular tem sido associada com a adesão inicial de C. parapsilosis
para superfícies e a produção de muco foi ligada a tendência de C. parapsilosis aderir a cateteres
de plástico (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).
Estudos retrospectivos indicam que se sabe pouco sobre as propriedades de virulência
das espécies Candida metapsilosis e Candida orthopsilosis e os seus papéis no estabelecimento
/ progressão da infecção (BERTINI et al., 2013).
2.2.3
Biofilme
Uma das principais propriedades de virulência das espécies de Candida associada à
patogenicidade é a sua capacidade de formar biofilme em dispositivos médicos implantados.
Os biofilmes são compostos de comunidades de micro-organismos associados com uma
superfície e embebidos numa matriz extracelular e acredita-se ser a forma principal de
crescimento de micro-organismos na natureza (HOLLAND et al., 2014).
São extremamente resistentes à terapia antimicrobiana e o tratamento geralmente
envolve a remoção do dispositivo infectado (HOLLAND et al., 2014). São cruciais ao
desenvolvimento das infecções, uma vez que servem de nichos aos agentes patogênicos e estão
associados a altos níveis de resistência a agentes antimicrobianos, de maneira que limitam a
penetração das substâncias através da matriz e protegem as células da resposta imune do
hospedeiro (TAMURA et al., 2007; SILVA et al., 2010).
A formação de biofilme de Candida começa com a aderência inicial de células das
leveduras à superfície de dispositivos médicos, seguido da formação de microcolônias e o
desenvolvimento de uma camada de hifas ou pseudohifas que se estende até o exterior. Isto é
acompanhado pela formação em torno da matriz extracelular de ambas as camadas de hifas e
pseudohifas das leveduras. O biofilme então se desenvolve como uma estrutura em três
dimensões e consiste em um denso trabalho das leveduras e de filamentos das células
profundamente
embebidas
na
(GEBREMEDHIN et al., 2014).
matriz
extracelular
composta
por
polissacrídeos
25
As infecções associadas a utilização de implantes médicos invasivos estão relacionadas
com a formação de biofilmes nesses dispositivos. O desenvolvimento de biofilme depende do
tipo e do número de células que aderem ao dispositivo e do tipo de superfície que o constitui.
A formação de biofilme inicia-se com a adesão microbiana seguida pela fase de maturação
(TAMURA et al., 2007). Essa formção em C. albicans foi bem caracterizada e ocorre em várias
etapas sendo constituído por uma camada compacta basal de células de levedura e uma camada
mais espessa de hifas menos compactas. Em contraste, C. parapsilosis não faz hifas verdadeiras
e os biofilmes são compostos de células de levedura e pseudohifas apenas. A capacidade de C.
parapsilosis para produzir biofilme também é altamente dependente do isolado (HOLLAND et
al., 2014).
Em geral, a formação de biofilme e o controle genético da formação do mesmo são
melhor conhecidos em C. albicans, indicando que a formação de biofilme começa com a ligação
de células individuais de levedura com a superfície e é seguida pela iniciação, onde
microcolônias e tubos germinativos são formados. Durante a maturação, a biomassa se expande
e se acumula na matriz extracelular. Após a dispersão, células de levedura são liberadas para o
meio. O passo inicial na adesão de C. albicans é controlada pelo fator de transcrição Efg1, um
regulador positivo da expressão da adesina Eap1 (PANNANUSORN et al., 2014).
A produção de biofilme em C. albicans está associada com a mudança dimórfica de
levedura para crescimento de hifas e a estrutura do biofilme formado envolve duas camadas
distintas. Em contraste, isolados de C. parapsilosis produzem quantitativamente menos
biofilme e estruturalmente menos complexo do que C. albicans. O fenótipo de pseudohifas em
C. parapsilosis, no entanto, produz mais biofilme e é mais invasivo em ágar do que os isolados
predominantemente sob a forma de levedura. O biofilme de C. parapsilosis pode ocorrer em
diversos dispositivos médicos, incluindo cateteres venosos centrais e periféricos, de
hemodiálise e cateteres de diálise peritoneal, dispositivos protéticos intracardíacos e
articulações protéticas. Como é um comensal da pele humana, o organismo pode entrar em
contato com o mesmo através de dispositivos médicos, antes ou durante o uso pelo paciente,
particularmente em ambientes de cuidados de saúde, onde lapsos de boa higiene das mãos pode
ocorrer (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).
A formação de biofilme de C. parapsilosis é iniciado com a adesão de células
individuais de levedura para a superfície, mesmo sob condições de crescimento, onde já seja
observada uma extensa aglutinação celular. Isto indica que a levedura expressa adesinas
específicas da superfície celular no início da formação de biofilme (PANNANUSORN et al.,
2014).
26
A matriz extracelular do biofilme de C. parapsilosis contém grandes quantidades de
hidratos de carbono com baixos níveis correspondentes a proteínas. O biofilme é facilmente
formado por isolados de C. parapsilosis cultivados em meio contendo alta concentração de
glicose e lípidos e pode ser associado com o aumento da prevalência deste organismo em
infecções da corrente sanguínea em pacientes que recebem nutrição parentérica (SILVA et al.,
2011).
Os aminoácidos estimulam a morfogênese de células de levedura para pseudohifas em
C. parapsilosis e isto pode explicar a alta incidência de infecções por C. parapsilosis em
neonatos sondados que recebem nutrição parenteral ricas em soluções de aminoácidos (PAMMI
et al., 2013).
A preferência seletiva da espécie para o plástico em dispositivos médicos é de particular
interesse assim como a formação de biofilme aumentando a capacidade de o organismo
colonizar cateteres intravenosos. Tal como C. parapsilosis, as duas espécies de Candida
recentemente identificadas (C. orthopsilosis e C. metapsilosis) também são capazes de formar
biofilme (SILVA et al., 2011).
27
3. Objetivos
3.1 Objetivo geral
Caracterizar fenotipicamente isolados de C. parapsilosis estudando seus fatores e
propriedades de virulência e geneticamente por meio de análise de marcadores microssatélites
e de PCR-RFLP do gene secondary alcohol dehydrogenase (SADH).
3.2 Objetivos específicos

Avaliar a aplicabilidade da técnica de genotipagem por marcadores
microssatélites e também do gene SADH para a diferenciação das espécies do
complexo C. parapsilosis;

Identificar os fatores e propriedades de virulência das espécies do complexo C.
parapsilosis;

Verificar a associação das espécies do complexo C. parapsilosis com os fatores
e propriedades de virulência por elas apresentados;

Analisar a existência de predileção das espécies do complexo C. parapsilosis
por algum sítio para colonização no ser humano.
28
4. Material e métodos
4.1 Natureza e obtenção dos isolados
Os isolados de Candida parapsilosis analisados foram previamente identificados pelo
sistema VITEK 2 (bioMérieux, Marcy-I´Etoile, France). Foram utilizados no trabalho vinte e
oito (28) isolados provenientes de secreção vaginal coletadas no Hospital da Mulher de São
Luís (CEP/UNICEUMA 267/10) e outros vinte e nove (29) espécimes clínicos diferentes,
recuperados em um laboratório particular da cidade de São Luís- MA e gentilmente cedidos
para a Micoteca do Laboratório de Micologia Médica do Núcleo de Doenças Endêmicas e
Parasitárias da Universidade Ceuma.
As culturas foram mantidas a -20ºC e recuperadas em meio ágar Sabouraud-dextrose
com cloranfenicol, a 37ºC por 24 horas. Foram então estocadas em caldo BHI (Brain Heart
Infusion- Difco) a 4ºC durante o período experimental (SAMBROOK et al., 2002). Os isolados
refrigerados foram renovados de 15 em 15 dias para preservação de suas propriedades, neste
mesmo meio de cultivo.
4.2 Identificação molecular dos isolados
4.2.1 Extração de DNA genômico
A extração foi realizada tomando-se como base a metodologia descrita por Raeder e
Broda (1985) e a partir desta foram feitas adaptações não descritas por estarem sob sigilo de
patente.
O DNA recuperado foi lavado em etanol 70% e ressuspendido em 40 µL de água
deionizada. A qualidade e quantidade de DNA obtido foram avaliadas visualmente em gel de
agarose a 0,8%.
4.2.2 Amplificação por PCR das regiões de microssatélites e do gene SADH
A seleção dos loci de microssatélites bem como a região de amplificação e o desenho
dos iniciadores para PCR seguiu o protocolo feito por Sabino et al. (2010), que buscaram no
DNA genômico de C. parapsilosis regiões contendo mais de 20 repetições de microssatélites
em busca de elevado grau de polimorfismo; a partir disto selecionaram a sequência de
microssatélites espécie específica para identificação de C. parapsilosis stricto sensu e
desenharam os iniciadores, por eles denominados CP1 em alusão a C. parapsilosis.
29
O par de iniciadores CP1 para identificação de C. parapsilosis stricto sensu,
previamente reconhecidos no Database do Sanger Institute, está de acordo com a tabela a
seguir:
Tabela 1 Sequência dos iniciadores da região de microssatélites específicos para Candida
parapsilosis stricto sensu
Microssatélite
Acesso
Sequência dos iniciadores
(Sanger
Repetição
motifs
Institute)
CP1
Cpara1131 FWD:5’ -AAAGTGCTACACACGCATCG-3’
h11.p1k
(AAG)27
REV: 5-GGCTTGCAATTTCATTTCCT-3’
Fonte: SABINO et al., 2010
A reação de amplificação por PCR foi feita com 25 ng de DNA genômico em um volume
de reação de 25 µL contendo tampão 1X PCR Master mix buffer (Promega); 0,25 µM de cada
iniciador (Invitrogen). No termociclador (Biorad) adotou-se o programa inicial de um préaquecimento de 95ºC por 2 minutos, seguido de 28 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 54ºC por
30 segundos, 72ºC por 1 minuto e mais uma fase de extensão final a 72ºC por 7 minutos.
Avaliou-se a reação de PCR visualmente por meio de gel de agarose 1%, corado com brometo
de etídio (10mg/mL) e visualizado em luz ultravioleta.
Para a identificação dos isolados de C. metapsilosis e C. orthopsilosis seguiu-se o
protocolo de Cantón et al. (2011), utilizando-se dois iniciadores para amplificação do gene
SADH, de acordo com a tabela 2, com posterior RFLP da sequência amplificada.
Tabela 2 Sequência dos iniciadores para região do gene SADH para C. metapsilosis e C.
orthopsilosis
Iniciadores
S1F
Sequência
5’- TTGATGCTGTTGGATTGT-3’
S1R
5’-CAATGCCAAATCTCCCAA-3’
Fonte: CANTÓN et al., 2011
30
A reação de amplificação foi realizada segundo o trabalho de referência (CANTÓN et
al., 2011) com adaptações na qual foram usadas um volume total de 25µL para a reação: 50 ng
de DNA genômico, tampão 1X PCR Master mix buffer (Promega) e 0,25 µM de cada iniciador
(Invitrogen). O programa adotado no termociclador (Biorad) contém uma fase de prévio
aquecimento de 95ºC por 1 minuto, 30 ciclos com 1 minuto de desnaturação a 95ºC, 1 minuto
e 30 segundos de hibridização dos iniciadores a 46ºC e 1 minuto e 30 segundos de extensão a
72ºC. Após essa fase, tem mais um ciclo adicional com 10 minutos a 72ºC para completar a
reação. A visualização do produto amplificado foi verificada por eletroforese em gel de agarose
1,2%, corado com brometo de etídio (10mg/mL) e visualizado em luz ultravioleta.
4.2.3 RFLP do gene SADH
O produto de amplificação obtido com a PCR para o gene SADH, com fragmentos de
716 pares de bases, foi digerido com a enzima de restrição Ban I (Promega), segundo as
recomendações do fabricante, em um volume de 20 µL contendo 12µL de produto amplificado
e 20 unidades da enzima. A reação foi incubada a 50ºC por 2 horas. O produto da digestão foi
separado em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio (10mg/mL) e visualizado em
luz ultravioleta. Na análise do produto digerido, os isolados de C. parapsilosis stricto sensu
apresentam um sítio de restrição, com fragmentos de 516 e 200 pares de bases, aqueles
pertencentes à espécie C. orthopsilosis não apresentam sítios de restrição e os isolados de C.
metapsilosis apresentam três sítios de restrição, com fragmentos de 416, 200 e 100 pares de
bases.
4.3 Análise das propriedades e fatores de virulência
Foram testadas as propriedade de virulência quanto às capacidades de adesão e produção
de biofilme dos isolados. Além disso, foram testadas as produções de exoenzimas como
hemolisinas, fosfolipases, proteinases, catalase e gelatinase por parte das mesmas.
4.3.1 Capacidade de Adesão a vidro
Para a análise da aderência a vidro, lamínulas de vidro redondas estéreis (Glasscyto)
foram colocadas em placas de microtitulação de 24 poços (TPP Zellkultur Testplatte 24F). Um
poço foi utilizado como controle recebendo apenas meio de cultura para se verificar a
integridade do meio. Os demais poços receberam 40µL de inóculo (106UFC/mL) além de 960
µL de BHI (Brain Heart Infusion – Acumedia Manufactures) suplementado com 6% de glicose.
31
As placas de microtitulação foram incubadas a 37°C durante 8 horas. Posteriormente, o
meio de incubação foi removido e as microplacas lavadas com água ultrapura para remover as
células não aderidas. As lamínulas foram coradas com 1% (v/v) de violeta cristal por cinco
minutos, posteriormente lavadas com água ultrapura estéril para remover o excesso de corante,
e colocadas sobre lâminas para visualização em microscopia óptica (NIKON Eclipse E100). O
experimento foi realizado em triplicata.
A classificação da capacidade de aderência a vidro foi feita por dois observadores, para
melhor certificação dos resultados, de acordo com a quantidade de células aderidas nas
lamínulas por campo, em um microscópio óptico, com aumento de 1000 vezes (BIASOLI;
TOSELLO; MAGARO, 2002; MENEZES et al., 2013).
Para análise dos resultado foram contadas as leveduras aderidas em cada lamínula, no
máximo de 70 campos, escolhidos aleatoriamente e em sentido unidirecional. Considerou-se
negativo quando não se observou nenhuma levedura por campo, num total de 70 campos
observados; fraco, quando houve de uma a 10 leveduras aderidas às lamínulas num total de 50
campos avaliados; moderada, quando houve mais que 10 leveduras aderidas em 30 campos; e,
forte quando houve mais de 25 leveduras aderidas em 20 campos analisados.
4.3.2 Formação de biofilme
Para os testes de formação de biofilme usou-se o método proposto por Shin et al. (2002)
com adaptações de Ferro et al. (2012). Foram colocados em microplacas de 96 poços 180 µL
de BHI suplementado com 6% de glicose e adicionados 20µL de suspensão do inóculo
(106UFC/ml) a cada poço em triplicata, incubados a 37°C por 24 horas. Após a incubação foi
removido o conteúdo dos poços, a microplaca foi lavada três vezes com água destilada estéril.
Foi adicionado 200 µL de água destilada a cada poço e 1% de violeta cristal para coloração e a
realização da leitura por espectrofotometria.
As leituras espectrofotométricas foram realizadas em 450 nm com uma leitora de
microplacas. Baseando-se na densidade óptica (D.O.i) produzida pelos isolados e tomando
como base o controle negativo (D.O.c) os isolados foram classificados de acordo com as
categorias representadas na Tabela 3. Cada isolado foi testado em triplicata, para evitar qualquer
discrepância nos valores de absorbância obtidos.
32
Tabela 3 Classificação da formação de biofilme
Classificação
Densidade
óptica
Não produtor
Produtor pobre
Produtor moderado
Produtor forte
D.O.i < D.O.c
D.O.c < D.O.i ≤ (2x D.O.c.)
(2x D.O.c) < D.O.i ≤ (4x D.O.c)
(4x D.O.c) < D.O.i
Fonte: O autor, 2015
4.3.3 Produção de hemolisinas
Para os testes de produção de hemolisinas foi usado o método de análise em placa
descrito por Branco et al. (2012). As leveduras em suspensão (3µL), preparadas em salina
0,85% comparada com escala de Mc Farland 0.5 (1 x 106 células/mL), foram inoculadas em
Ágar Sabouraud Dextrose (Difco), acrescido de 3% de glicose e 5% de sangue de carneiro
desfibrinado e permaneceram incubadas por 48 horas a 37ºC. A presença de um halo
transparente em torno da colônia indica a atividade hemolítica positiva. A intensidade da
produção do fator hemolítico foi estimada quantificando o diâmetro do halo mais a colônia em
centímetros em relação ao tamanho da colônia (índice hemolítico ou H.I.). Os isolados
hemolíticos foram classificados de acordo com o H.I. como positivos (H.I.<1,5 cm) ou
fortemente positivos (H.I.>1,5cm). Os experimentos foram feitos em triplicata e os resultados
foram dados como a média dos valores obtidos.
4.3.4 Produção de fosfolipases
Para os testes de fosfolipase foi usado o método em placa com gema de ovo descrito por
Price, Wilkinson e Gentry (1982) com modificações de D’Eça Jr. et al. (2011). O meio consiste
em ágar Sabouraud dextrose acrescido de 1M de cloreto de sódio; 0,5M de cloreto de cálcio e
2% de gema de ovo. O meio foi inoculado com 3µL de inóculo em salina 0,85%, comparado
com escala de McFarland 0.5 (1 x 10 6 células/mL). As placas de Petri foram incubadas a 37ºC
e o diâmetro das colônias e da área de precipitação mais a colônia foram medidos 7 dias após a
inoculação. Os experimentos foram feitos em triplicata. As medidas e cálculos da zona de
precipitação (Pz) da fosfolipase foram feitos de acordo com o descrito por Price et al. (1982), a
partir da média dos valores obtidos na triplicata, os coeficientes encontrados foram classificados
em 5 grupos: Pz = 1, negativo; Pz entre 0.9 e 0,99, fraco; Pz entre 0.80 e 0.89, moderado; Pz
entre 0.70 e 0.79, forte; Pz < 0.70, muito forte.
33
4.3.5 Produção de proteinases
Para análise de produção de proteinases usou-se o método de Aoki et al. (1990) com
modificações de D’Eça Jr. et al. (2011). O teste foi feito em placas com 140 mL do meio de
cultura ágar Sabouraud dextrose contendo 60 mL de solução composta por 0,04g de MgSO47
H2O; 0,5 g de K2HPO4; 1g de NaCl; 0,2g de extrato de levedura; 4g de glicose e 0,5g de BSA,
pH ajustado para 4,0 e esterilizada por filtração. As placas foram inoculadas com 3µL de salina
0,85 % contendo células de leveduras, comparada a escala de McFarland 0.5 (1 x 10
6
células/mL), e incubadas a 37ºC por 7 dias.
A atividade de proteinases foi medida e calculada de acordo com o método descrito por
Price, Wilkinson e Gentry (1982) em termos da proporção de diâmetro da colônia e a colônia
mais a zona de precipitação (Pz) das proteinases. Os testes foram feitos em triplicata e tirada a
média do valor de Pz, agrupando-se os coeficientes obtidos em 5 grupos: Pz =1, negativo; Pz
entre 0,9 e 0,99, fraco; Pz entre 0,80 e 0,89, moderado; Pz entre 0,7 e 0,79, forte e Pz < 0.70,
muito forte.
4.3.6 Produção de catalase
O teste de catalase foi feito segundo Trabulsi e Altherthum (2005) e Branco et al. (2012).
Os isolados de Candida foram transferidos para lâmina de microscópio e depois 1 gota (0,05
mL) de 3% de peróxido de hidrogênio foi adicionada e a imediata formação de bolhas na
superfície da lâmina corresponde a reação positiva para catalase, indicando a conversão de H2O2
em água e O2.
4.3.7 Produção de gelatinase
Para análise de presença de gelatinase foi usado o teste proposto por Kurtzman et al.
(1998) com modificações de Branco et al. (2012). Os isolados de Candida foram inoculados
em BHI e depois de incubados a 37ºC por 24 horas, os inóculos foram profundamente semeados
em tubos contendo 5 mL de uma solução de gelatina (Difco) a 12% preparada em tampão PBS
com pH 7,4. Depois de incubadas a 37ºC por 24 horas o teste é considerado positivo para
gelatinase quando ocorre a liquefação da gelatina.
34
4.4 Análise estatística
Os dados foram analisados com o programa estatístico BioStat 5.8.4 (versão 2009) de
AnalystSoft Inc. Inicialmente foram feitas tabelas de frequência das variáveis e posteriormente,
para os cruzamentos das variáveis classificatórias foi aplicado o teste do qui-quadrado de
independência (χ2). Depois aplicou-se o teste não paramétrico de correlação de Spearman. Em
todos os testes o nível de significância (α) aplicado foi de 5%, ou seja, considerou-se
significativo quando p<0,05.
35
5. Resultados e discussão
5.1 Identificação molecular dos isolados
A partir dos iniciadores CP1 foram identificados 41 isolados como C. parapsilosis
stricto sensu. Destas positivas, 8% dos isolados foram heterozigotos, ou seja, apresentaram
formação de duas bandas em gel de agarose 1% com tamanhos diferentes (de 290 e 270 pb) e
92% foram homozigotos, apresentando apenas uma banda correspondente a 290 pb, como se
pode observar na figura 1.
Figura 1 Gel de agarose mostrando os perfis da reação PCR para a detecção de microssatélite
CP1 em isolados de C. parapsilosis stricto sensu: L- DNA ladder 100 pb; 1, 4, 5, 6, 8, 9 e 10sangue; 2-ponta de cateter; 3 e 7- urina
L
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
290pb
300 pb
Fonte: O autor (2015)
Esses resultados obtidos eram esperados uma vez que os iniciadores aqui trabalhados
são espécie-específicos para C. parapsilosis stricto sensu (SABINO et al., 2010). Também
segundo os autores um ou dois fragmentos de PCR por locus são obtidos para cada isolado,
uma vez que C. parapsilosis é uma espécie diploide onde cada fragmento é atribuído para um
alelo. Assim os isolados que mostram dois produtos de PCR são considerados heterozigotos,
enquanto que aqueles que apresentam um único produto de amplificação são considerados
homozigotos.
36
Em Sabino et al. (2010), a análise de 233 isolados mostrou que 73% dos isolados
amplificados com CP1 foram heterozigotos, diferente dos resultados obtidos no presente
trabalho, sendo um resultado possível devido à grande variação na repetição da sequência de
microssatélites nos loci polimórficos.
O DNA dos 16 isolados restantes que não foram amplificados com os iniciadores para
o marcador CP1 foram submetidos a reações de amplificação para detecção do gene SADH
(Figura 2). O produto amplificado foi submetido a digestão enzimática com Ban I (Figura 3) e
então se observou que apenas 2 isolados apresentaram o perfil de digestão enzimática para as
espécies C. orthopsilosis e 1 isolado para C. metapsilosis, revelando que os iniciadores CP1
não foram capazes de identificar todas as C. parapsilosis stricto sensu no grupo analisado.
Figura 2 Gel de agarose mostrando a reação de PCR do gene SADH em isolados de C.
parapsilosis: L- DNA ladder 100 pb; 1- controle negativo; 2- isolado de sítios não identificado;
3 a 7- isolados de secreção vaginal
L
1
2
3
4
5
6
7
800 pb
700 pb
716 pb
Fonte: O autor (2015)
Sabino et al. (2010) relataram que o uso dos iniciadores CP1 constitui um método de
fácil execução, com alto poder discriminatório e ideal para estudos de identificação em larga
escala, porém o presente trabalho utilizando a mesma metodologia não conseguiu a
identificação de 16 isolados, sendo necessária a aplicação de outra metodologia para
identificação destes. Tavanti et al. (2007) e Cantón et al. (2011) relataram alta reprodutibilidade
e eficácia da técnica com o gene SADH para identificação de C. orthopsilosis e C. metapsilosis
em isolados inequivocadamente atribuídos a espécie C. parapsilosis.
37
Figura 3 Gel de agarose 2% mostrando o perfil de reação RFLP com enzima de restrição
Ban I: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9- C. parapsilosis stricto sensu; 5- C. orthopsilosis; 8- C.
metapsilosis; L- DNA ladder 100 pb
1
2
3
4
5
6
7
8
9
L
716pb
516pb
516pb
416pb
500pb
200pb
200pb
200pb
100pb
100pb
Fonte: Próprio autor (2015)
5.2 Frequência e distribuição dos isolados
Foram utilizados neste estudo 57 isolados recuperados a partir de espécimes clínicos de
sangue, ponta de cateter, urina, secreção vaginal e sítios com baixa frequência de isolados
organizados no grupo Outros (líquido ascítico, fezes e sítios desconhecidos) (Tabela 4).
Tabela 4 Distribuição dos isolados de C. parapsilosis por espécimes clínicos.
Espécimes clínicos
Número de isolados
n (%)
Sangue
8 (14)
Ponta de cateter
10 (17)
Urina
5 (9)
Secreção Vaginal
28 (49)
Outros
6 (11)
Total
57
38
Destes isolados trabalhados, 54 foram identificados molecularmente como sendo C.
parapsilosis stricto sensu, estando presente em todos os espécimes clínicos estudados, sendo
que todos os isolados de sangue, ponta de cateter e urina pertenciam a esta espécie e, ainda, 27
isolados de secreção vaginal e 4 isolados do grupo outros também foram pertencentes a mesma.
Apenas um isolado foi identificado como C. metapsilosis proveniente de um sítio não
identificado e dois isolados como C. orthopsilosis, sendo um provenientes de sítio não
identificado e um de secreção vaginal (Figura 4), não havendo relação estatística significante
entre a espécie e o sítio do isolado.
Figura 4 Distribuição dos isolados estudados de acordo com as espécies do complexo C.
parapsilosis e os espécimes clínicos
30
Número de isolados
Sangue
P.cateter
Urina
20
S.vaginal
Outros
10
0
C. parapsilosis
C. metapsilosis
Espécies
C. orthopsilosis
De acordo com os estudos de Tavanti et al. (2010) e Sabino et al. (2011), isolados de C.
parapsilosis stricto sensu são mais comuns que as outras duas espécies do complexo “psilosis”,
corroborando com os resultados obtidos neste trabalho que mostram que a maioria dos isolados
pertenciam a espécie de C. parapsilosis stricto sensu.
Resultados obtidos aqui também mostraram que alguns isolados previamente
identificados como C. parapsilosis eram na verdade pertencentes a espécies C. metapsilosis e
C. orthopsilosis. Os dados da epidemiologia global indicam que aproximadamente 10% das
infecções atribuídas a C. parapsilosis são relacionadas na verdade a C. orthopsilosis e C.
metapsilosis (CANTÓN et al., 2011; ROMEO et al., 2012).
39
As três espécies do complexo Candida parapsilosis são relatadas em manifestações
clínicas graves, como fungemias, diferindo na frequência e na suscetibilidade antifúngica, o
que confere importância na identificação da espécie causadora da enfermidade fungíca para o
tratamento de pacientes com candidíase invasiva, uma vez que estas espécies apresentam
diferenças na virulência, na patogenicidade e na sensibilidade às drogas (BRILHANTE et al.,
2014; PRYSZCZ et al., 2014; TRABASSO et al., 2015).
Atualmente, os dados epidemiológicos mundiais indicam que C. parapsilosis stricto
sensu representa de 70,7% a 95,6% do complexo “psilosis”, enquanto que C. orthopsilosis e C.
metapsilosis correspondem de 4,4% a 20,4% e 0 a 9,3%, respectivamente (CANTÓN et al.,
2011; ABI-CHACRA et al., 2013).
Quanto aos isolados pertencentes a C. orthopsilosis, Tavanti et al. (2007) reportaram
esta espécie como sendo apta a colonizar diferentes locais do corpo através dos isolados clínicos
obtidos a partir de sangue, unha, pele, urina e dispositivos intravenosos, assim como nos
achados neste estudo com dois isolados da referida espécie, cada um isolado de um sítio
anatômico diferente.
Zhu et al. (2015) encontraram uma prevalência de 77,8% de C. parapsilosis stricto sensu
em isolados de pacientes com candíase vulvovaginal, assim como neste estudo foi encontrada
uma prevalência de 96% em isolados de secreção vaginal para a referida espécie.
5.3 Adesão a vidro
O teste de adesão a vidro revelou que 88% dos isolados foram aderentes ao vidro,
demonstrando uma excelente capacidade de adesão do complexo de espécies de C. parapsilosis.
Dentre os isolados aderentes positivos, 38% foram fracamente aderentes, 25% tiveram
aderência moderada ao material testado e 25% foram fortemente aderentes (Figura 5). A figura
6 mostra um campo de leitura de duas lâminas com testes de adesão a vidro de C. parapsilosis,
revelando as células das leveduras aderidas dos isolados de secreção vaginal e urina.
40
Figura 5 Níveis de intensidade da capacidade de adesão a vidro de isolados de C. parapsilosis
% de isolados
40
30
20
10
0
Negativa
Fraca
Moderada
Intensidades de adesão
Forte
De acordo com Silva et al. (2010), os isolados de C. parapsilosis apresentaram
expressiva heterogeneidade na capacidade de adesão ao silicone, do mesmo modo que AbiChacra et al. (2013) testando a abilidade de adesão de espécies do complexo C. parapsilosis em
vidro e poliestireno observaram que todos os isolados foram capazes de aderir a ambas as
superfícies e o número de células aderidas variou bastante, mostrando uma típica capacidade
de adesão específica do isolado, corroborando com os resultados obtidos neste trabalho que
mostram também heterogeneidade quanto à intensidade na capacidade de adesão a vidro.
Figura 6 Lâmina de teste de adesão a vidro em isolados de C. parapsilosis. Aumento: 1000X.
A= isolado de secreção vaginal B= isolado de urina
A
B
Fonte: O autor (2015)
41
Analisando-se em relação ao sítio de origem, uma alta porcentagem (85%) dos isolados
de secreção vaginal, bem como as de urina (80%) mostraram uma capacidade de adesão a vidro
mais expressiva em relação àquelas provenientes de outros sítios. Os isolados provenientes de
ponta de cateter foram os que apresentaram maior porcentagem de adesão considerada fraca
(60%). Estatisticamente, não foi encontrada relação entre o sítio do isolado e a capacidade de
adesão ao vidro (χ² = 18,06; p= 0,02) (Figura 7).
Figura 7 Distribuição dos níveis de intensidade de adesão a vidro por espécimes clínicos dos
isolados de C. parapsilosis
100
% de isolados
80
Negativo
Fraco
Moderado
Forte
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
P. cateter Sangue
Espécimes clínicos
Outros
Todos os isolados das espécies de C. metapsilosis e C. orthopsilosis apresentaram fraca
adesão a vidro enquanto os isolados de C. parapsilosis stricto sensu apresentaram variação nas
capacidades de adesão (Tabela5).
42
Tabela 5 Distribuição dos níveis de capacidade de adesão a vidro pela espécie do complexo C.
parapsilosis
Espécie n (%)
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
7(13)
0
0
Fraca
19 (35)
1 (100)
2 (100)
Moderada
14 (26)
0
0
Forte
14 (26)
0
0
Total
54
1
2
Níveis de capacidade de
adesão a vidro
Negativo
C. parapsilosis
stricto sensu
Nos testes de Menezes et al. (2013) C. parapsilosis foi a espécie que apresentou a
segunda maior capacidade de adesão a vidro, apesar da diferença desta capacidade entre as
espécies testadas não ter sido significante. Ainda segundo estes autores a espécie foi a que
apresentou a maior variação em relação ao tipo de arranjo celular na adesão a vidro. É provável
que esta variação possa estar relacionada às espécies diferentes do complexo C. parapsilosis
entre os isolados testados.
Bertini et al. (2013), analisando as propriedade de adesão de isolados clínicos
pertencentes as espécies “psilosis” em modelo in vitro de coincubação com HBECs (células
epiteliais bucais humanas) mostraram que C. parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis
apresentam habilidades similares para adesão. Já isolados de C. metapsilosis mostraram baixa
habilidade para esta propriedade. Os resultados do presente trabalho indicaram que o potencial
de adesão de C. parapsilosis stricto sensu é variável e que os isolados de C. metapsilosis e C.
orthopsilosis apresentaram fraca capacidade de adesão, o que pode ser atribuído ao número
pequeno de isolados destas espécies identificadas.
5.4 Formação de biofilme
Os resultados para a formação de biofilme revelaram que 53% dos isolados foram
produtores com intensidade variando entre fraca (44%), moderada (7%) e forte (2%),
apresentando 47% dos isolados como negativos para a produção deste fator de virulência.
Entretanto a maioria dos isolados apresentou fraca produção neste teste, como ser pode observar
na figura 8.
43
Figura 8 Distribuição da intensidade de formação de biofilme por C. parapsilosis
50
% de isolados
40
30
20
10
0
Negativa
Fraca
Moderada
Forte
Intensidade de formação de biofilme
Quando se analisou a capacidade de formação de biofilme em relação ao sítio de origem
verificou-se que todos os isolados de urina foram negativos para esta capacidade, enquanto os
isolados de ponta de cateter apresentaram 10% dos isolados fortemente produtores, os isolados
de sangue foram em maioria negativos (87%). Os de secreção vaginal apresentaram em sua
maioria produção fraca (78%) de biofilme. Os isolados de secreção vaginal produziram mais
biofilme que dos demais sítios (χ²= 40, 4; p<0.0001).
A figura 9 ilustra os níveis de intensidade de formação de biofilme dos isolados em
relação ao sítio de origem.
44
Figura 9 Intensidade da capacidade de formação de biofilme dos isolados de C. parapsilosis
em relação aos espécimes clínicos
100
% amostras
80
Negativo
60
Fraco
Moderado
Forte
40
20
0
Sec. vag.
P. cateter Sangue
Urina
Espécimes clínicos
Outros
Chow, Linden e Bliss (2012) consideram que a estrutura do biofilme de isolados C.
parapsilosis é menos complexa do que a de isolados de C. albicans, mas C. parapsilosis
apresenta maior afinidade por materiais protéticos do que C. albicans. Tavanti et al. (2007;
2010) mostraram que os isolados clínicos de C. orthopsilosis e C. metapsilosis testados não
produziram biofilme e que C. parapsilosis stricto sensu possuem resultados variados para esta
produção.
Os dados relatados corroboram com os resultados encontrados no presente trabalho, pois
47% dos isolados trabalhados não foram produtores de biofilme e as que produziram mostraram
intensidades bem variadas de formação.
Resultados obtidos por Kumari et al. (2013) mostraram que, para isolados de secreção
vaginal, foram obtidas altas taxas de formação de biofilme com intensidade fraca para Candida
não-albicans, apresentando 46,8% de isolados de C. parapsilosis como fracamente produtores
de biofilme, corroborando com os resultados obtidos no presente trabalho.
Os isolados de C. parapsilosis stricto sensu apresentaram elevada variação entre as
intensidades de formação de biofilme, o isolado de C. metapsilosis teve fraca formação de
biofilme e os isolados de C. orthopsilosis foram ou negativo ou fraco formadores de biofilme
(Tabela 6).
45
Tabela 6 Distribuição das intensidades de formação de biofilme por espécie do complexo C.
parapsilosis
Espécies n (%)
Intensidades de
C. parapsilosis
formação de biofilme
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
stricto sensu
Negativa
26 (48)
0
1(50)
Fraca
23 (42)
1(100)
1(50)
Moderada
4 (8)
0
0
Forte
1 (2)
0
0
Total
54
1
2
Tavanti et al. (2007) não encontraram nenhum dos isolados clínicos de C. orthopsilosis
produzindo biofilme e os isolados de C. metapsilosis foram 95% negativos para a produção de
biofilme, enquanto que C. parapsilosis stricto sensu formou biofilme variando as intensidades,
resultados estes bem similares aos obtidos neste trabalho, embora um dos isolados de C.
orthopsilosis analisado tenha sido considerado fraco formador de biofilme.
Uma vez que biofilme é uma propriedade de virulência relacionada a adesão fúngica a
materiais protéticos e a proteção das células das leveduras, a falha na produção de matriz
extracelular poderia contribuir para a baixa frequência de isolados clínicos das espécies C.
orthopsilosis e C. metapsilosis.
Em contraste aos resultados relatados, Trevino-Rangel et al. (2015) obtiveram 40% dos
isolados clínicos de C. orthopsilosis como formadores de biofilme, sendo a espécie
predominantemente mais produtora , C. parapsilosis stricto sensu com a mais baixa formação
de biofilme e os isolados de C. metapsilosis tendo a produção média entre as duas outras
espécies. Estes resultados conflitantes podem ser atribuídos a metodologia utilizada para os
teste de identificação de formação e intensidade de formação de biofilme, como sugerido por
Trevino-Rangel et al. (2015) e também a origem geográfica dos isolados como encontrado por
Tavanti et al. (2010).
46
5.5 Produção de exoenzimas
5.5.1 Hemolisinas
A maioria dos isolados testados foi produtora de hemolisina (97%), variando entre
positivas e fortemente positivas, o que demonstra que estes isolados são em geral bons
produtores de hemolisina, como se pode observar na figura 10.
Figura 10 Intensidade da produção de hemolisina em isolados de C. parapsilosis
% de isolados
60
40
20
0
Negativo
Positivo
Fortemente Positivo
Produção de hemolisina
Os estudos quanto à atividade hemolítica para as espécies de Candida são relativamente
recentes, de maneira que ainda pouco se tem registro sobre a produção desse fator de virulência
para leveduras deste gênero (FAVERO et al., 2013).
Nos estudos de Luo, Samaranaya e Yau (2001), C. parapsilosis não apresentou atividade
hemolítica nos testes em placa, exceto com adição de glicose ao meio de ágar sangue, no qual
produziu alfa hemólise apenas; do mesmo modo os trabalhos de Rossoni et al. (2013), com uso
de isolados provenientes de cavidade oral de pacientes com HIV e Issa et al. (2011), com
isolados de cavidade oral e retal de pacientes infantis, que apresentaram resultados negativos
para hemólise em isolados de C. parapsilosis. Estes resultados divergem dos encontrados nesta
pesquisa, uma vez que 97% dos isolados foram produtores de hemolisinas.
Os resultados obtidos por Chin et al. (2013) revelaram C. parapsilosis stricto sensu e C.
orthopsilosis como sendo a 4ª e 5ª , respectivamente, maiores produtoras de atividade
hemolítica e que uma explicação possível para a diferença entre os índices hemolíticos nas
espécies de Candida é a existência de hemolisinas espécie-específicas.
47
Analisando a produção de hemolisina por C. parapsilosis de acordo com os espécimes
clínicos dos isolados, aqueles provenientes de secreção vaginal (61%) e urina (100%) destacamse como fortemente produtoras de hemolisinas e os isolados de urina foram significantemente
mais produtores de hemolisinas do que os isolados de sangue e outros (χ²= 23, 2; p= 0.0007)
(Figura 11).
Figura 11 Distribuição da produção de hemolisinas por C. parapsilosis de acordo com os
espécimes clínicos dos isolados. *- p<0.05 *
*
100
Negativo
Positivo
Fortemente Positivo
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
Sangue P.cateter
Espécimes clínicos
Outros
A atividade hemolítica em isolados de secreção vaginal é pouco explorada em estudos,
mas os dados obtidos nos teste de Oliveira et al. (2013), com isolados de mesma natureza,
revelaram 76, 9% de isolados de C. parapsilosis com atividade hemolítica, evidenciando um
possível potencial de adaptação para o estabelecimento de infecções no hospedeiro, caso uma
oportunidade seja estabelecida, uma vez que estes isolados apresentam habilidade para usar o
ferro como derivado de hemoglobina através da produção de fatores que possibilitam a lise de
eritrócitos.
Os resultados obtidos neste estudo detectaram significante atividade hemolítica para os
isolados de urina em relação aos demais sítios trabalhados, o que diverge dos registros
científicos, como os obtidos por Riceto et al. (2014) e Pakshir et al. (2013), os quais utilizando
em seus testes isolados clínicos do gênero Candida de vários sítios anatômicos, não
encontraram diferenças estatísticas nas atividades hemolíticas considerando os sítios
anatômicos para a espécie C. parapsilosis. Essa discordância pode ser atribuída ao número
amostral reduzido para isolados de urina.
48
Apenas dois isolados de C. parapsilosis stricto sensu foram registrados como não
produtores de hemolisinas, variando o número de isolados que se apresentaram como
produtores ou fortemente produtores de hemolisinas para esta espécie. Os isolados de C.
orthopsilosis demonstraram-se fortemente produtores de hemolisinas e C. metapsilosis foi
considerada como produtora (Tabela 7).
Tabela 7 Distribuição dos níveis de produção de hemolisinas por espécie do complexo C.
parapsilosis
Espécies n (%)
Produção de
C. parapsilosis
hemolisinas
stricto sensu
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
Negativo
2(4)
0
0
Positivo
28(52)
1(100)
0
Fortemente positivo
24(44)
0
2(100)
54
1
2
Total
Treviño-Rangel, González e González (2013), avaliando a atividade hemolítica de
isolados clínicos de espécies do complexo Candida parapsilosis, registraram que C.
orthopsilosis (87%) foi significantemente mais produtora de hemolisinas do que C. parapsilosis
stricto sensu (67%), resultado semelhante ao obtido neste trabalho.
5.5.2 Fosfolipases
Com relação à produção de fosfolipases, 95% dos isolados foram considerados
negativos. Apenas 3% dos isolados tiveram formação moderada e 2 % muito forte, como mostra
a figura 12.
49
Figura 12 Intensidade da produção de fosfolipases em C. parapsilosis
100
% de isolados
80
60
40
20
0
Negativo
Fraco
Moderado Forte
Produção de fosfolipases
Muito Forte
Na literatura são reportados resultados divergentes com relação à produção deste fator
de virulência para os isolados de C. parapsilosis (SILVA et al., 2011). De Luca et al. (2012)
detectaram em seus estudos significante produção de fosfolipases e proteinases por Candida
albicans, mas para isolados de C. parapsilosis não houve uma produção significante destas
enzimas, corroborando com os resultados obtidos neste trabalho, assim como também de
Brilhante et al. (2014) que observaram o mesmo em isolados do complexo Candida parasilosis
isoladas de animais.
A figura 13 mostra que apenas isolados de urina (20%) e de outra amostra proveniente
de sítio diverso (17%) apresentaram produção de fosfolipases moderada e muito forte,
respectivamente. Os isolados de urina apresentaram produção significativa de fosfolipases em
relação aos isolados de secreção vaginal e sangue (χ²= 19.55; p= 0.0002).
50
Figura 13 Distribuição da produção de fosfolipases por espécimes clínicos de C. parapsilosis.
*-p<0.05
*
*
100
Negativo
Fraco
Moderado
Forte
Muito forte
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
P. cateter Sangue
Espécimes clínicos
Outros
Pakshir et al. (2013) observaram que isolados de C. parapsilosis provenientes de
onicomicoses e lesões orais tiveram menos atividade enzimática para fosfolipases (16,08%) do
que C. albicans, uma vez que todos os isolados apresentaram produção de fosfolipases.
Os isolados que apresentaram atividade fosfolipásica foram aquelas pertencentes às
espécies C. parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis (Tabela 8), corroborando com os
resultados encontrados por Treviño-Rangel, González e González (2013) que obtiveram 67%
dos isolados clínicos de C. orthopsilosis apresentando atividade fosfolipásica, enquanto que
apenas 10% dos isolados de C. parapsilosis stricto sensu e nenhum isolado de C. metapsilosis
apresentaram este fator de virulência.
51
Tabela 8 Distribuição das intensidades de produção de fosfolipases por espécie do complexo
C. parapsilosis
Espécies n (%)
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
52(96)
1(100)
1(50)
0
0
0
2(4)
0
0
Forte
0
0
0
Muito Forte
0
0
1(50)
Total
54
1
2
Intensidade de produção
de fosfolipases
Negativo
Fraco
Moderado
C. parapsilosis
stricto sensu
5.5.3 Proteinases
Os isolados de C. parapsilosis foram, em sua maioria, não produtoras de proteinases,
apresentando 74% de isolados negativos. Os isolados produtores foram classificadas como forte
ou muito forte, como é mostrado na figura 14.
Figura 14 Intensidade de produção de proteinases por C. parapsilosis
% de isolados
80
60
40
20
0
Negativo
Fraco
Moderado Forte
Produção de proteinases
Muito Forte
52
Atalay et al. (2015) encontraram 44,4% de isolados de sangue de C. parapsilosis
produzindo proteinases, sendo a segunda espécie mais produtora, ficando atrás apenas de C.
albicans, divergindo dos resultados achados neste trabalho que registraram produção deste fator
de virulência em apenas 26% dos isolados.
Dentre os isolados produtores, observou-se que houve produção nos isolados de sangue,
ponta de cateter, secreção vaginal e urina, mas não houve diferenças estatísticas entre a
produção de proteinases e os espécimes clínicos estudados (χ²= 4.9; p= 0.18) (Figura 15).
Figura 15 Distribuição da produção de proteinases por espécimes clínicos de C. parapsilosis
100
Negativo
Fraco
Moderado
Forte
Muito Forte
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
P. cateter
Sangue
Espécimes clínicos
Outros
Tavanti et al. (2010) analisando 62 isolados de C. parapsilosis stricto sensu de diferentes
sítios anatômicos e provenientes de pacientes de diferentes países, como a Itália, Hungria,
Argentina e Nova Zelândia encontraram 66, 1% de isolados produtores de proteinases, mas a
maioria dos isolados produtores era proveniente da Itália e da Nova Zelândia, revelando uma
possível relação entre os fatores de virulência apresentados e a origem geográfica do isolado,
mas não foi detectada estatisticamente relação com o sítio anatômico, corroborando com os
achados neste estudo.
A produção de proteinases pelos isolados de C. parapsilosis stricto sensu foi encontrada
em 26% dos isolados, em 50% dos isolados de C. orthopsilosis e nenhum dos isolados de C.
metapsilosis (Tabela 9).
53
Tabela 9 Distribuição das intensidades de produção de proteinases por espécie do complexo
C. parapsilosis
Espécies n (%)
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
40 (74)
1(100)
1 (50)
Fraco
0
0
0
Moderado
0
0
0
Forte
9 (17)
0
0
Muito forte
5 (9)
0
1 (50)
54
1
2
Intensidade de produção
de proteinases
Negativo
Total
C. parapsilosis
stricto sensu
Treviño-Rangel, González e González (2013) não encontraram produção significativa
de proteinases em nenhuma espécie do complexo C. parapsilosis em isolados clínicos,
enquanto que Ge et al. (2011) encontraram 81 % de C. parapsilosis stricto sensu e 83,3% de C.
metapsilosis de isolados clínicos como capazes de produzir proteinases, não tendo sido
identificado entre os isolados usados no trabalho nenhum pertencente a espécie C. orthopsilosis,
resultados estes que divergem dos encontrados no presente estudo.
5.5.4 Catalase
Os isolados de C. parapsilosis foram, em sua maioria, produtores de catalase (88%).
Isolados de sangue apresentaram estatísticamente maior produção de catalase do que os isolados
de secreção vaginal (χ²= 27.44; p<0.0001). Este último sítio foi o único que apresentou isolados
negativos para a produção de catalase (25%) (Figura 16).
54
Figura 16 Distribuição de produção de catalase por espécimes clínicos de C. parapsilosis. ** p<0.0001
**
100
Negativo
Positivo
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec.vag.
Urina
Sangue
P.cateter
Espécimes clínicos
Outros
C. parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis apresentaram variação na produção de
catalase, com 89% de isolados positivos para a primeira espécie e 50% de isolados positivos
para a segunda espécie (Tabela 10).
Tabela 10 Distribuição das intensidades de produção de catalase por espécie do complexo C.
parapsilosis
Espécies n (%)
Produção de
C. parapsilosis
C. metapsilosis
C. orthopsilosis
catalase
stricto sensu
Positivo
48 (89)
1(100)
1(50)
Negativo
6 (11)
0
1(50)
54
1
2
Total
Abi-Chacra et al. (2013) obtiveram positividade na produção de catalase para todas as
espécies do complexo C. parapsilosis dos isolados clínicos (11 isolados) testados, divergindo
dos resultados obtidos neste estudo, o que pode estar relacionado ao número amostral.
55
De acordo com Linares et al. (2008), a atividade da catalase em Candida spp. está
relacionada com a redução da atuação da anfotericina B e protege o fungo contra danos
oxidativos. Todos os isolados de C. albicans testadas pelos autores foram produtoras de
catalase. Uma vez que a produção de catalase é conhecida por ser uma defesa importante das
espécies de Candida contra neutrófilos e basófilos (WYSONG et al., 1998), a ausência de
produção de catalase pode indicar uma redução da virulência do isolado.
5.5.5 Gelatinase
Todos os isolados de C. parapsilosis foram negativos para produção de gelatinase.
Corroborando com estes resultados, Ramesh et al. (2011) em seu trabalho com isolados de
Candida spp. de pacientes com HIV e tuberculose também não encontraram nenhum isolado
que fosse capaz de hidrolisar a gelatina.
5.6 Correlações entre os fatores de virulência avaliados
Comparando os fatores de virulência estudados, observou-se que os isolados de C.
parapsilosis foram melhor aderentes que formadores de biofilme (Figura 17). Há uma
correlação positiva pequena porém significante entre adesão e formação de biofilme, ou seja,
os isolados que formaram biofilme sempre apresentaram adesão de forma expressiva
(Spearman = 0.31, p=0.01- Figura 18), dado este não documentado em estudos anteriores sobre
o complexo C. parapsilosis.
Figura 17 Distribuição da capacidade de adesão e da formação de biofilme por espécimes
clínicos de C. parapsilosis
100
Adesão
Biofilme
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
Sangue
P. cateter
Espécimes clínicos
Outros
56
Figura 18 Correlação positiva entre biofilme e adesão para os isolados de C. parapsilosis
Produção de biofilme
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
Adesão
Com relação à produção de exoenzimas, todos os isolados foram produtores da maioria
delas, independente do sítio de origem. Entretanto, somente aqueles provenientes de urina
produziram todas as exoenzimas com exceção de gelatinase (Figura 19).
Na produção de fatores hemolíticos, os isolados de secreção vaginal foram os que
apresentaram uma forte produção de hemolisina, seguido pelos isolados de urina. Os isolados
de secreção vaginal também foram os mais produtores de proteinases e apenas 2 isolados de
urina foram produtores moderados de fosfolipase (Figura 19).
Figura 19 Distribuição da produção de exoenzimas por sítios anatômicos de C. parapsilosis
100
Hemólise
Fosfolipase
Proteinase
Catalase
% de isolados
80
60
40
20
0
Sec. vag.
Urina
Sangue
P. cateter
Sítios anatômicos
Outros
57
6. Conclusões
O presente trabalho conclui que:

Foram identificadas todas as espécies do complexo C. parapsilosis no grupo
amostral trabalhado, sendo que a prevalência de C. parapsilosis stricto sensu
foi a mais expressiva;

A técnica de identificação com o gene SADH mostrou-se mais eficiente que a
de marcadores microssatélites na identificação de espécies do complexo C.
parapsilosis.

As espécies de C. parapsilosis apresentam comportamento diferente quanto às
propriedades e fatores de virulência, demonstrando grande variação na
virulência em isolados pertencentes a mesma espécie;

Isolados de C. parapsilosis provenientes de urina foram os que apresentaram
maior quantidade de fatores de virulência e os isolados de secreção vaginal
foram os que apresentaram formação de biofilme superior aos demais sítios;

Encontrou-se correlação positiva dos isolados entre as propriedades de
virulência adesão e biofilme;

Não foi identificada associação entre espécie do complexo C. parapsilosis e o
sítio anatômico colonizado, nem das espécies e as propriedades e fatores de
virulência.
58
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65
ANEXOS
66
ANEXO A- Parecer do comitê de ética e pesquisa da Universidade CEUMA
Projeto: Isolamento, identificação, estudo dos fatores de virulência e sensibilidade a antifúngico
de isolados clínicos de Candida provenientes da flora vaginal de pacientes atendidas no
Hospital da Mulher- Anjo da Guarda
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68
69
ANEXO B- Protocolos de submissão do artigo “Prevalência de Candida spp. em amostras
de secreção vaginal e sua relação com fatores associados à vulvovaginite”
70
ANEXO C- Certificado de apresentação de trabalho no VII Congresso Brasileiro de Micologia