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UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
TAIRONE MACHADO
AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR) NO ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS
TECIDUAIS DE BOVINOS
Tubarão
2012
TAIRONE MACHADO
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências da Saúde, da
Universidade do Sul de Santa Catarina, como
requisito para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientador: Profa. Rosemeri Maurici da Silva, Dra.
Coorientadora: Profa. Maria Luiza Bazzo, Dra.
Tubarão
2012
TAIRONE MACHADO
Esta dissertação foi julgada adequada à
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde e aprovada em sua forma final pelo
Programa de Mestrado em Ciências da Saúde,
da Universidade do Sul de Santa Catarina.
Professora e Orientadora: Rosemeri Maurici da Silva, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina.
Professora: Anna Paula Piovezan, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina.
Professor: Leonardo de Lucca Schiavon, Dr.
Universidade Federal de Santa Catarina.
RESUMO
A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso e crônica, sendo que no Brasil
apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi avaliar o
rendimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) no isolamento de micobactérias em
amostras teciduais congeladas de bovinos. As amostras teciduais foram descongeladas e
semeadas em meios de cultura Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio, e outro contendo
glicerol por 42 dias a 37ºC. Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das
culturas, com primers específicos para M. tuberculosis e M. bovis. Foram analisadas 69
amostras teciduais de bovinos, das quais 81,2% constituíram-se de linfonodos. Tomando-se o
resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificou-se a presença de
micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%) pertencentes ao Complexo
Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%) identificadas como
Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela
cultura específica Ogawa-Kudoh com Piruvato e com descontaminação. O rendimento da
PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 em comparação com o padrão
áureo, foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36), especificidade de 98,1%
(IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,33-1,17), valor preditivo
negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de verossimilhança
positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido
acometido apresentou alta especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa
sensibilidade, sendo desejável a otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina
laboratorial.
Palavras-chave: Tuberculose. PCR. M. bovis.
ABSTRACT
Brazilian cattle herds have high morbidity rates due to bovine tuberculosis, which is a chronic
granulomatous disease. The aim of this study was to evaluate the performance of the
polymerase chain reaction (PCR) in the recovery of mycobacteria from frozen tissue samples
of cattle. The tissue samples were frozen-thawed and seeded into Ogawa-Kudoh culture
media, one containing sodium pyruvate and another containing glycerol for 42 days at 37° C.
Tissue samples and culture isolates with primers specific for M. tuberculosis and M. bovis
were subjected to PCR. In total, 69 tissue samples of cattle were analyzed, 81.2% of which
consisted of lymph nodes. Taking the combined results of cultures as the gold standard, the
presence of mycobacteria was identified in 17 (24.6%) tissue samples, of which 12 (70.6%)
belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTB complex), and 5 (29.4%) were
identified as nontuberculous mycobacteria (NTM). The best diagnostic yield was achieved by
Ogawa-Kudoh specific culture with Pyruvate and decontamination. The yield of PCR
performed on tissue samples with the hsp65 gene as the target compared with the gold
standard showed a sensitivity of 17.6% (95% CI: -0.005-0.36), specificity of 98.1% (95% CI:
0.94-1.02), positive predictive value of 75% (95% CI: 0.33-1.17), negative predictive value of
78.5% (95% CI: 0.68-1.19), and accuracy of 78.3%. The positive likelihood ratio was 9.18,
and the negative likelihood ratio was 0.8. The hsp65 PCR performed directly on the affected
tissue showed high specificity and positive predictive value, but low sensitivity. Optimization
of this technique is highly desirable, so it can be used for laboratory routine monitoring.
Keywords: Tuberculosis. PCR. M. bovis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma da metodologia utilizada...................................................................... 30
Figura 2 - Lesões macroscópicas em amostras teciduais hepáticas.......................................... 32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição das amostras teciduais analisadas de acordo com o sítio anatômico. . 32
Tabela 2 - Distribuição das micobactérias isoladas. ................................................................. 33
Tabela 3 - Distribuição dos resultados das culturas específicas em comparação com o padrão
áureo. ........................................................................................................................................ 33
Tabela 4 - Rendimento diagnóstico das culturas específicas em comparação com o padrão
áureo. ........................................................................................................................................ 34
Tabela 5 - Distribuição dos resultados da cultura de acordo com a amostra tecidual analisada.
.................................................................................................................................................. 34
Tabela 6 - Distribuição do resultado da PCR hsp65 em amostras teciduais, de acordo com o
padrão áureo. ............................................................................................................................ 35
LISTA DE SIGLAS
CMTB - Complexo M. tuberculosis
CTAB - cetyltrimethylammonium bromide
MAIS - Mycobacterium avium, M. intracelulareae, M. scrofulaceum
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MNT - Micobactérias não-tuberculosas
MTBC - M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. canettii, e M. microti
PNCEBT - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal
PNCTBB - Plano Nacional de Controle da Tuberculose e Brucelose Bovina
PPD – Derivado protéico purificado de Mycobacterium
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 10
2 O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA BRUCELOSE E
TUBERCULOSE ANIMAL..................................................................................................... 17
3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS ............................................................................................. 19
3.1 BACTERIOSCOPIA ........................................................................................................ 19
3.2 CULTURA E IDENTIFICAÇÃO ................................................................................... 19
3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) .................................................... 21
3.4 RENDIMENTO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS.................................................. 23
4 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 26
5 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 27
5.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 27
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................................... 27
6 MÉTODOS ............................................................................................................................ 28
6.1 METODOLOGIA LABORATORIAL ........................................................................... 28
7 ANÁLISE DOS DADOS ...................................................................................................... 31
8 RESULTADOS ..................................................................................................................... 32
9 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 36
10 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 422
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 43
ANEXOS .................................................................................................................................. 49
ANEXO A – Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
................................................................................................................................................ 500
ANEXO B – Instrução Normativa SDA n° 10, de 15 de janeiro de 2004 ............................. 533
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1 INTRODUÇÃO
As micobactérias são organismos que provavelmente, já existiam há milhões de
anos antes do surgimento dos primatas. Mycobacterium bovis, ou uma variante,
provavelmente infectou animais no período paleolítico. O homem não era o hospedeiro
natural e as primeiras infecções humanas ocorreram como eventos isolados, provavelmente
resultantes da ingestão de carne ou de leite infectados. Havia, no entanto, pequena
possibilidade da disseminação da doença nas comunidades humanas primitivas, devido à
dispersão da população e ao mínimo envolvimento pulmonar (VERONESI; FOCACCIA,
2010).
A agricultura, que iniciou há aproximadamente 7.000 anos (a.C.), propiciou o
surgimento de vilas e a domesticação de animais, sendo prática comum mantê-los no
pavimento inferior das moradias para seu aquecimento interno. Essas condições favoreceram
a disseminação de infecções entre os seres humanos, apesar de que a tuberculose não tenha
sido um problema significativo nas populações pré-históricas (DANIEL, 2006).
A doença podia ser encontrada na época paleolítica em virtude das características
da conformação dos grupos de caça e de coleta – os quais se constituíam como povos
nômades e dispersos, dificultando a disseminação do agente etiológico. Entretanto, a maior
concentração dos seres humanos no período Neolítico, começou a propiciar a difusão da
tuberculose (DANIEL, 2006).
A espondilite tuberculosa foi documentada em múmias egípcias datadas de 3.700
(a.C.), muito provavelmente causada por Mycobacterium bovis. Contudo, como a espécie
humana não é a hospedeira natural de Mycobacterium bovis, a doença provavelmente
apresentava menor virulência quando comparada àquela causada por Mycobacterium
tuberculosis (DANIEL, 2006; VERONESI, FOCACCIA, 2010).
Relatos da disseminação da tuberculose podem ser encontrados em textos gregos
e hindus, sendo que os primeiros a denominavam tisis (que significa debilitamento, desgaste),
cabendo a esses povos a descrição mais apurada da doença. Os textos atribuídos a Hipócrates
são assinalados como constituintes do melhor repertório de informações sobre o tema. O
filósofo deslocou a interpretação da enfermidade do domínio exclusivo dos princípios
religiosos, estabelecendo os fundamentos do raciocínio clínico sobre a doença basicamente
pelos seguintes sinais: tosse, expectoração, hemoptise e debilitamento (DANIEL, 1997).
Hipócrates estudou o aniquilamento progressivo que a doença causa no
organismo, descrevendo o desenvolvimento da doença e o tratamento utilizado na época, que
11
consistia basicamente da ingestão de mostarda, lentilhas, leite de vaca e de cabra adicionando
água, mel ou orégano. Como alimentos sólidos, recomendava carne de carneiro cozida e
pescados, sendo que os alimentos gordurosos e salgados eram tidos como os preferidos –
acrescia ainda o uso de vinho tinto. Galeno, partindo das observações de Hipócrates, foi um
dos pioneiros na recomendação do regime climático para os doentes (DANIEL, 1997).
Anteriormente à era bacteriana são numerosas as referências citando o perigo que
representa para o homem o consumo de carne de animais sofrendo de caquexia – e é muito
provável que nesta designação estivesse incluída a tuberculose bovina. Nos ensinamentos da
doutrina mosaica, encontra-se no Talmude, codificado em fins do século II, a proibição ao
povo hebreu de utilizar-se de carne de bovinos em cujos pulmões fossem encontradas lesões
ulcerativas. Em Munique, por volta de 1307 (d.C.), foi promulgada uma lei semelhante a do
Talmude, e em Leipzg, 1788, a morte de 12 estudantes foi atribuída à ingestão de carne de
animal tuberculoso (DANIEL, 2006; DANIEL, 1997; ABRAHÃO, 1998).
Em 1889, Theobald Swit isolou Mycobaterium bovis, e em 1902, Revenel obteve
a primeira prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem decorrente da
ingestão de alimentos. O isolado foi realizado em uma cultura pura dos bacilos presentes em
gânglios mesentéricos de uma criança falecida de meningite tuberculosa, no Hospital Infantil
da Filadélfia, tais bacilos foram inoculados em três bovinos, que em menos de 30 dias foram a
óbito. Os resultados da necropsia destes animais não deixaram dúvidas de que a causa da
morte foi tuberculose (DANIEL, 1997).
Em 1908, Mantoux institui o teste cutâneo para diagnóstico e, em 1931, Kuhnaus
verificou que a carne poderia transmitir a doença somente quando o animal era afetado por
uma tuberculose generalizada e neste caso, seria condenado durante a inspeção realizada nos
matadouros. Todavia, fabricantes gananciosos utilizavam as partes tuberculosas para o
preparo de salsichas que, quando consumidas sem tratamento térmico prévio, ofereciam
grande risco às pessoas (ABRAHÃO, 1998; AMANFU, 2006).
O homem, na tentativa de se relacionar com o ambiente, adquiriu hábitos
impróprios, os quais foram corrigindo-se ao longo das gerações. Conviver com animais ou em
ambientes insalubres sem a mínima condição de saúde possibilitou aos microrganismos
habitar outros organismos e provocar doenças. A tuberculose é uma doença dos seres
humanos que acomete os pulmões e outros órgãos que pode apresentar perfil de resistência
aos medicamentos – acredita-se ter sido introduzida através da cadeia alimentar e nas grandes
invasões à natureza (O’REILLY; DABORN, 1995).
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O gênero Mycobacterium contém, na atual classificação, 154 espécies e 13
subespécies (EUZÉBY, 2011). É constituído pelo M. leprae, pelas espécies do Complexo M.
tuberculosis (CMTB) e pelas micobactérias denominadas Micobactérias Não-Tuberculosas
(MNT) (BROSCH et al., 2002; McGRATH et al., 2010). Mycobacterium tuberculosis foi
batizado como bacilo de Koch em homenagem a este cientista ganhador do prêmio Nobel de
Medicina em 1905. As micobactérias se distribuíram amplamente pelo ambiente, no solo, na
água ou parasitando alguns animais intracelularmente, provocando doenças nos seres
humanos. Em países que apresentam carência alimentar, falta de saneamento básico e
ausência de orientação sanitária, a incidência da tuberculose é mais exacerbada, vitimando
inúmeras pessoas independentemente de classe econômica ou social (CAMPOS, 2006).
O indivíduo pode adquirir o bacilo e desenvolver a doença ao consumir água não
tratada, carne de animais não vacinados e sem avaliação dos órgãos de saúde responsáveis
pelos alimentos. Os bacilos também são encontrados no escarro das pessoas e animais
doentes, e sua transmissão ocorre pelas microgotículas que são expelidas ao falar ou tossir, e
instalam-se em lugares úmidos ao abrigo do sol. Desta forma, o confinamento dos animais é
um fator propício à instalação da doença (BRASIL, 2008).
No entanto, algumas precauções podem ser tomadas para evitar a doença, ferver o
leite e cozinhar os derivados da carne antes do consumo, é uma das formas de evitar a
transmissão da tuberculose, conhecida também como tísica consumptiva e peste branca.
(BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).
A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso crônico, sendo que
no Brasil apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos leiteiros. Essa enfermidade, por se
tratar de uma zoonose, é um problema de grandes proporções, pois acarreta prejuízos desde a
produção de leite até transtornos econômicos causados diretamente aos pecuaristas. A
população humana em geral é atingida através do consumo de leite cru, de subprodutos
lácteos produzidos in natura, e do contato com animais portadores de tuberculose (KANTOR;
RITACCO, 1994; CORREA, 1992).
No Brasil, o risco para a saúde pública de se contrair o agente pela ingestão de
produtos cárneos contaminados torna-se menor, devido à baixa incidência do agente em
tecidos musculares, e do hábito de não se comer carne crua no país. Porém, tal risco não deve
ser ignorado quando se leva em consideração o grande número de abates clandestinos, ou
mesmo o abate de animais descartados de rebanhos positivos em matadouros municipais que
não atendem as normas de inspeção exigidas pelo rigor da lei (BRASIL, 2008; ABRAHÃO,
1998).
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Em humanos, quando a contaminação se dá por ingestão, pode ocorrer uma
infecção inicial das amígdalas, prosseguindo então para as cadeias de linfonodos cervicais. A
lesão inicial não passa de uma amigdalite, entretanto, lesões supurativas podem ocorrer nas
cadeias cervicais, afetando linfonodos pré-auriculares, tonsilares e supraclaviculares, com
posterior envolvimento da pele sobrejacente. Tais lesões são comumente conhecidas como
scrofulodermia ou lupus vulgaris. O acometimento da tuberculose na região óssea e articular
também é comum, provocando lesões ósseas localizadas e artrite. Em crianças, é comum se
encontrar acometimento intestinal (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010).
Quanto ao acometimento pulmonar, resultados obtidos de estudos experimentais
demonstram que de um a cinco bacilos são capazes de produzir lesões pulmonares quando
atingem as vias aéreas inferiores, principalmente os alvéolos, por inalação de aerossóis.
Entretanto, estudos recentes demonstraram que a infecção intra-nasal em bezerros somente
ocorre se houver inoculação de cerca de 104 a 106 unidades formadoras de colônias. A maior
ocorrência da forma pulmonar da tuberculose bovina em indivíduos da área rural pode ser
explicada por tais resultados, sendo considerada uma doença ocupacional (BRASIL, 2008;
CAMPOS, 2006).
Médicos veterinários e trabalhadores de frigoríficos, que mantêm um contato
direto com o animal, também estão sujeitos à infecção pelo bacilo bovino devido à inalação
de aerossóis. Outra forma de infecção da tuberculose bovina em humanos é através do
acometimento cutâneo. A contaminação se dá pelo contato direto com carcaças contaminadas.
Dessa forma, as pessoas mais acometidas pela tuberculose são os magarefes, auxiliares de
inspeção e médicos veterinários. As lesões dessa infecção, na maioria das vezes são pouco
extensas e regressivas, manifestando-se na forma de pequenas pápulas, semelhantes a
verrugas, sendo conhecidas como butcher wart ou verruga do magarefe. (WHO, 1993;
COSIVI et. al., 1998).
A benignidade da tuberculose cutânea, provavelmente está relacionada à
resistência que os adultos possuem ao bacilo, e não à menor virulência do mesmo. Essas
lesões de mesma benignidade são encontradas nas mãos dos patologistas que praticam
autópsias sem a proteção de luvas, sendo neste caso, causadas pelo bacilo humano
(JULIANO, 2007).
Há evidências que tanto a resistência genética do hospedeiro a uma infecção por
M. bovis, quanto a influência de fatores fisiológicos e imunológicos, em animais e em
pessoas, interferem no curso da tuberculose. Entretanto, não há comprovação experimental
conclusiva que tais fatores possam interferir na infecção, pois esta pode ocorrer na infância e
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permanecer silenciosa, e em algum momento da fase adulta pode ocorrer manifestação dos
sintomas (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010).
Os testes de tuberculinização têm sido utilizados para diagnóstico de tuberculose
em bovinos há mais de um século. Estes testes avaliam respostas de hipersensibilidade
retardada, 72 horas após uma injeção intradérmica de tuberculina (PPD – derivado protéico
purificado de Mycobacterium). Atualmente, duas modalidades de testes são utilizadas: o teste
intradérmico simples, que utiliza apenas tuberculina bovina, e o teste intradérmico
comparado, que utiliza tuberculina bovina e aviária (BRASIL, 2008; JULIANO, 2007).
A tuberculinização comparada permite minimizar diagnósticos falso-positivos por
reações decorrentes de bactérias do complexo MAIS (Mycobacterium avium, M.
intracelulareae, M. scrofulaceum), que não são patogênicos para bovinos, porém são capazes
de desencadear reações positivas. Resultados falso-negativos podem ser observados em
diversas situações como: em infecções recentes (30 a 50 dias da infecção), nos casos de
anergia decorrente do acometimento generalizado (tuberculose miliar); no período de 42 a 60
dias entre testes; durante o período de 4 a 6 semanas pós-parto (no qual se observa uma
imunossupressão transitória) (RUGGIERO, 2007).
Apesar da grande variação da sensibilidade do teste de tuberculinização (68% a
95%, podendo ser menor em condições de campo), o mesmo vem sendo utilizado como
principal método de diagnóstico em programas de controle e erradicação da tuberculose
bovina em muitos países, inclusive no Brasil (BRASIL, 2008; RUGGIERO, 2007).
A tuberculose como zoonose, é preocupante principalmente nos países em
desenvolvimento, pois o conhecimento da doença é escasso e as medidas de controle
ineficientes. Por este motivo, é necessária maior preocupação por parte dos profissionais que
atuam no campo da Saúde Pública, em relação à infecção por M. bovis, especialmente com as
populações de risco, neste caso, os trabalhadores rurais que são os mais afetados, já que são
expostos ocupacionalmente (ABRAHÃO, 1998).
No entanto, existe outro agravante, a falta de diagnóstico efetivo que diferencie
cepas de M. bovis e M. tuberculosis. A provável explicação para essa falha seria a perda de
interesse epidemiológico, já que, após a obrigatoriedade da pasteurização do leite, o abate do
gado tuberculínico, e a confiança na eficácia da quimioterapia atual contra todos os tipos de
tuberculose, houve uma queda na incidência da doença. Entretanto, desde que a tuberculose
causada por M. bovis reapareceu em países nos quais ela estava praticamente erradicada, e
desde que a pirazinamida passou ser regularmente usada como um fármaco antituberculose de
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primeira linha – e M. bovis é naturalmente resistente a ela – existem razões para fazer a
distinção de ambas (ABRAHÃO, 1998; CHIMARA; FERRAZOLI; LEÃO, 2004).
A principal razão seria o fato de que casos de tuberculose humana relacionados
com M. bovis podem estar sendo tratados como tuberculose causada por M. tuberculosis em
todo o país. Como M. bovis é naturalmente resistente à pirazinamida, cepas multidrogaresistentes poderão ser geradas nestes tratamentos falhos, impedindo a cura do paciente,
tornando-o um potencial transmissor destas cepas resistentes a outras pessoas e animais e,
eventualmente, levando-os à morte (ABRAHÃO, 1998; CAMPOS, 2006; PARREIRAS,
2004).
O Brasil tem atualmente uma população bovina maior do que 190 milhões de
cabeças de gado. Dados recentes mostram nível de infecção entre 0,9% a 2,9%, dos quais
6,2% a 26,3% dos rebanhos possuem animais infectados, sem que essas taxas mostrem
diminuição da incidência. A taxa de animais abatidos encontrados com lesões em matadouros
é de aproximadamente 0,14%. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO, 2011).
Em países desenvolvidos, estima-se que as perdas econômicas decorrentes da
tuberculose afetem 10% da produtividade do gado leiteiro. No Brasil, as perdas na produção
leiteira chegam a 18%, com retardo da primeira lactação e diminuição do número e da
duração
das
lactações
(MINISTÉRIO
DA
AGRICULTURA
PECUÁRIA
E
ABASTECIMENTO, 2011; SABEDOT, 2009; COSIVI, 1998).
O bovino é definido como o hospedeiro verdadeiro da tuberculose bovina, mas
muitas espécies domésticas e silvestres também são susceptíveis à doença, entre elas o búfalo
e o bisão (O’REILLY; DABORN, 1995).
Mycobacterium tuberculosis apresenta-se com menor patogenicidade em bovinos,
sendo que a doença nessa espécie toma caráter autolimitante. Os animais infectados são a
principal fonte de contaminação, sendo a via orofaríngea a porta de entrada mais comum,
pastos e alimentos contaminados têm menor importância na transmissão da doença. O bovino
uma vez infectado, já é capaz de transmitir a doença a outros. O agente pode ser eliminado
pela respiração, pelo corrimento nasal, leite, fezes, urina, secreções vaginais e uterinas, e pelo
sêmen. No entanto, a ingestão de leite contaminado é a principal via de transmissão para
animais jovens, e também para o homem. Já a transmissão transplacentária é considerada
muito rara ou inexistente nos bovinos. As vias de transmissão menos comuns são a
intrauterina e o coito, através de sêmen contaminado (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).
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Quando a infecção se dá pelo trato respiratório (aerossóis), o pulmão é o órgão
primeiramente atingido, assim como os linfonodos regionais. Quando a infecção é pela via
digestiva, a lesão se dá no sítio de entrada, principalmente nos linfonodos faríngeos e
mesentéricos. No entanto, pode atingir praticamente todos os órgãos quando da generalização
do processo. Na primo-infecção pulmonar os bacilos vão se alojar no tecido promovendo uma
reação inflamatória, caracterizada como uma pneumonia. Desta forma, a doença se instala
basicamente nos pulmões, formando nódulos caseosos de tamanhos variados, em muitos
casos tomando todo o parênquima pulmonar e formando lesões cavitárias com expectoração
de material bacilífero. Através de uma reinfecção exógena ou endógena, pela recrudescência
da lesão, esta se torna necrosada, podendo atingir os tecidos vizinhos e se disseminar para
vários órgãos do indivíduo. Quando a resistência orgânica é baixa, acontece a disseminação
do agente pelo parênquima pulmonar, pela via aérea, ou pela via hematogênica, atingindo
linfonodos regionais e formando metástases em outros órgãos (VERONESI; FOCACCIA,
2010).
Neste sentido, ocorre no foco inicial uma infiltração celular, necrose de
caseificação e circunscrição da lesão, que pode evoluir para resolução e calcificação. Assim, a
presença de um nódulo calcificado, predominantemente no terço distal do lobo caudal, e/ou
aumento de volume do linfonodo regional denomina-se “complexo primário”. Os bacilos
podem permanecer nos linfonodos ou nos nódulos tuberculosos por longos períodos, se
multiplicando ou sob a forma latente (VERONESI; FOCACCIA, 2010; CAMPOS, 2006).
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2 O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA
BRUCELOSE E TUBERCULOSE ANIMAL
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), instituiu em
2001 o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal
(PNCEBT), o qual tem o objetivo de diminuir a incidência das duas zoonoses, bem como
reduzir o impacto econômico que causam (BRASIL, 2006).
Portanto, a tuberculose causada por Mycobacterium bovis, está disseminada por
todo o país e afeta tanto os bovinos como os bubalinos. No entanto, sua prevalência e
distribuição regional não estão bem caracterizadas. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA
PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; KANTOR; RITACCO, 1994).
Os objetivos específicos do programa consistem em baixar a prevalência e a
incidência de novos focos de tuberculose, criar um número significativo de propriedades
certificadas livres de tuberculose ou monitoradas, e que ofereçam ao consumidor produtos de
baixo risco sanitário (BRASIL, 2006).
São consideradas estratégias do programa:
• A capacitação de médicos veterinários tanto da rede oficial quanto da iniciativa
privada. Esses profissionais contribuirão para a solução de importantes problemas de
saúde pública e animal, através da integração do serviço veterinário oficial e privado, e
da constante melhoria do padrão dos serviços oferecidos aos pecuaristas e à população
em geral (BRASIL, 2006).
• Diagnóstico e o apoio laboratorial constante a laboratórios privados e oficiais. O
resultado será a normatização de exames no campo e em laboratórios, padronizando os
exames de diagnóstico e procurando sempre a atualização no caso do surgimento de
testes mais eficientes em relação aos recomendados (BRASIL, 2008).
• A certificação de propriedades livres e monitoradas – de responsabilidade do serviço
oficial – será realizada mediante diagnóstico por amostragem a qualquer momento em
propriedades certificadas e nos testes finais que conferem o certificado de
propriedades livres. Todas estas estratégias visam a promoção da educação sanitária,
na qual o MAPA considera essencial a necessidade de entendimento pelos pecuaristas
e consumidores da adesão ao Programa, considerando-o como um projeto da
sociedade brasileira, permitindo que as ações sanitárias sejam efetivamente aceitas e
cumpridas (BRASIL, 2006; BRASIL, 2008).
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A distribuição da tuberculose é mundial, apresentando alta prevalência nos países
em desenvolvimento devido à ausência de controle e erradicação eficientes, fazendo com que
os focos da doença se perpetuem. Nos países que implantaram programas de controle da
tuberculose animal ao longo do século passado, baseados em tuberculinização e sacrifício de
animais reagentes, o número de animais infectados foi reduzido drasticamente (ESSEY,
KOLLER, 1994; GORDEJO; VERMEERSCH, 2006). No Brasil, dados oficiais indicam a
prevalência média nacional de 1,3% de animais reagentes à tuberculina no período entre 1989
e 1998 (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).
A tuberculose bovina é responsável por graves perdas econômicas em outros
animais domésticos e de reconhecido perigo para a saúde humana, causando as mesmas
formas clínicas e lesões patológicas que M. tuberculosis. A prevalência da tuberculose
humana de origem animal tem diminuído nos países onde a pasteurização é obrigatória, ou
onde existem campanhas de combate à enfermidade bovina. Naqueles países onde ocorre o
costume de consumo de leite, seus derivados e carne, que passam por um processo de fervura
ou cozimento, a incidência da infecção por M. bovis tem sido mais baixa (GORDEJO;
VERMEERSCH, 2006).
As infecções causadas por M. bovis em bovinos, bubalinos, outras espécies
animais e também no ser humano se dá em 90% dos casos por via respiratória, a partir da
inalação de aerossóis contendo o microrganismo. O exame clínico e a baciloscopia do escarro
não permitem a diferenciação entre a infecção por M. bovis ou por M. tuberculosis no homem.
Essa diferenciação só é possível pelo isolamento e identificação do agente (RODRIGUES,
2008; BRASIL, 2008).
Portanto, a busca ativa realizada para a tuberculose humana é de suma
importância, pois, se estas pessoas residirem no meio rural e tiverem contato com animais,
certamente teremos animais infectados. Nessa hipótese, os animais deverão ser descartados ou
caso contrário, o foco persistirá e o tratamento humano não terá resposta positiva. O controle
da tuberculose bovina deve ser realizado por intermédio dos exames em bovinos e bubalinos,
controle da saúde dos trabalhadores, espécies animais que se encontram em cada propriedade,
e a utilização de instalações com boa ventilação e com exposição direta à luz solar. A
higienização deve ser realizada com desinfetantes apropriados, como hipoclorito de sódio,
fenol, formol cresol, dentre outros. O consumidor deve somente adquirir carne de
estabelecimentos que comercializem produtos com inspeção federal, estadual ou municipal
(BRASIL, 2006).
19
3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
3.1 BACTERIOSCOPIA
Nos indivíduos com suspeita de tuberculose pode-se colher escarro, lavado
gástrico, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano, urina, líquido articular, material de biópsia
ou outro material suspeito, que deverá ser submetido à coloração de Ziehl-Neelsen para a
procura de bacilos álcool-ácido-resistentes (BRASIL, 2008; FRÁGUAS, 2008).
Os bacilos da tuberculose são visualizados como bastonetes retos e finos com
aproximadamente 0,4 x 3 µm, que se coram em vermelho. A observação de BAAR nesses
materiais clínicos é uma evidência presuntiva de tuberculose, mas não definitiva, uma vez que
existem outros bacilos álcool-ácidos-resistentes (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).
3.2 CULTURA E IDENTIFICAÇÃO
Os materiais clínicos obtidos de sítios estéreis (como o líquor) podem ser
cultivados diretamente. O escarro é tratado, inicialmente, com hidróxido de sódio a 2% ou
com outros agentes bactericidas que eliminem a viabilidade dos microrganismos de
crescimento rápido, como bactérias e fungos de vias aéreas superiores. A seguir, o escarro
liquefeito é neutralizado e centrifugado, e o sedimento semeado (BRASIL, 2008). Podem ser
utilizados os seguintes meios de cultura (BRASIL, 2008):
a) Meios sintéticos simples – As micobactérias crescem em meios sintéticos simples, após
algumas semanas, a partir de inóculos grandes. A partir de inóculos pequenos, não há
crescimento nestes meios, devido à presença de quantidades mínimas de ácidos graxos.
b) Meios com ácido oleico e albumina – Podem sustentar a proliferação de pequenos
inóculos, principalmente se Tweens (ésteres hidrossolúveis de ácido graxos) estiverem
presentes (por exemplo, no meio de Dubos). Em geral, as micobactérias crescem em grumos
ou massas por causa da característica hidrofóbica da superfície celular. Os Tweens umedecem
a superfície, permitindo o crescimento difuso nos meios líquidos. O crescimento é quase
sempre mais rápido que em meios complexos.
c) Meios orgânicos complexos – Os inóculos pequenos, como no caso de material obtido de
pacientes, são cultivados em meios contendo substâncias orgânicas complexas, como gema de
ovo, soro animal e extratos de tecidos. Frequentemente, estes meios contêm penicilina ou
verde malaquita para inibir outras bactérias (por exemplo, meio de Löwenstein-Jensen).
20
Embora a diversidade de meios de cultura, no Brasil é adotada os meios a base de
ovo Löwenstein-Jensen ou Ogawa-Kudoh, com glicerol para cultivo de micobactérias em
geral e com piruvato para cultivo de M. bovis, além dos meios líquidos que compõem
sistemas automatizados como MGIT 960 (BRASIL, 2011).
As micobactérias são bacilos aeróbios estritos e obtêm energia a partir da
oxidação de muitos compostos simples de carbono. Desta forma, o aumento da concentração
de CO2 produzido durante seu metabolismo estimula o crescimento. As atividades
bioquímicas não são características, e a velocidade de crescimento é muito menor do que a
maioria das bactérias. O tempo de multiplicação do bacilo da tuberculose é de 12 horas a 25
horas, o que impõe a incubação dos meios inoculados a 37◦C, por até oito semanas. As formas
saprófitas de Mycobacterium tendem a crescer mais rapidamente, proliferam bem a 22◦C,
produzem mais pigmento e são menos álcool-ácido-resistentes que as formas patogênicas
(BRASIL, 2008; MARCHI, et. al., 2008). A identificação de micobactérias pode ser feita de
duas maneiras, com testes fenotípicos ou moleculares. A identificação fenotípica é muito
trabalhosa e implica na utilização de uma série de reações. Essa identificação para algumas
espécies é realizada da seguinte forma (BRASIL, 2008):
a) Observar o crescimento a cada cinco dias. Fazer coloração de Ziehl-Neelsen das
colônias para confirmação da propriedade do álcool-ácido-resistência.
b) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido em menos de cinco dias
(microrganismos de crescimento rápido), deve-se realizar a reação de arilsulfatase.
● Resultado fortemente positivo indica M. fortuitum;
● Resultado negativo ou fracamente positivo indica outras micobactérias desse grupo,
a serem identificadas pelas fermentações de açúcares (M. smegmatis, M. phlei).
c) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido acima de 15 dias
(microrganismos de crescimento lento), deve-se realizar a reação da niacina.
● Colônias rugosas com reação positiva, indicam M. tuberculosis.
● Colônias pequenas e planas com reação negativa, indicam M. bovis, cepa BCG, ou
micobactérias patogênicos para coelhos e cobaias.
● Colônias semiesféricas e lisas com reação negativa, devem ser subcultivadas a 37◦C
em dois tubos com meio de Löwenstein-Jensen, sendo um mantido na luz e o outro, enrolado
em papel de alumínio, mantido no escuro.
Se formar pigmento amarelo a laranja no tubo mantido na luz, e nenhum pigmento
no tubo mantido no escuro, identifica-se como M. kansaii.
21
Se formar pigmento amarelo a laranja no tubo mantido na luz e no tubo mantido
no escuro, identifica-se como micobactérias não patogênicas.
Se não formar nenhum pigmento na luz ou no escuro, identifica-se como
complexo M. avium-intracellulare.
3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Com a amplificação pela PCR é possível obter-se cópias de segmento(s) do
material genético em quantidade suficiente para detectar ou analisar a sequência de DNA que
é alvo do estudo (RICHELDI, 2006).
A PCR pode amplificar qualquer sequência específica de DNA, a partir de
amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais,
cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina) (PARREIRAS, et. al.,
2004; DE WIT, et. al., 1990).
Para a execução da técnica de amplificação pela PCR é necessário conhecer a
sequência do ácido nucléico que se deseja amplificar (sequência alvo ou sequência molde). A
amplificação será possível com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores ou primers,
constituídos de cerca de 18 a 25 nucleotídeos, que deverão hibridizar mas regiões
flanqueadoras da sequência que será amplificada. Para amplificação de um alvo DNA utilizase um par de primers (sense e reverse) que possibilita a amplificação de duas fitas. Ao
reconhecer o primer , a enzima DNA polimerase sintetiza uma cópia complementar,
obedecendo a informação contida na sequência de DNA que será replicada (sintetizada). Para
a síntese a enzima utiliza-se dos deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
adicionados à reação e que são os quatro componentes químicos da molécula de DNA
(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
Para o diagnóstico da tuberculose a PCR pode ser realizada no material biológico
coletado recentemente ou a partir de isolados do crescimento em meios de cultura. Desse
material deve-se extrair o DNA utilizando-se um dos diversos protocolos de extração
disponíveis. O importante é que se obtenha o DNA mais puro possível, livre da presença de
proteínas e inibidores (hemoglobina, EDTA, dentre outros). As técnicas de extração seguem
um critério metodológico básico que varia dependendo da amostra utilizada. Basicamente
utilizam-se substâncias desproteinizantes como, por exemplo, o fenol–clorofórmio, capazes
de desnaturar e retirar as proteínas que estão acopladas ao DNA. A adição posterior de etanol
fará com que o material genético precipite no tubo e que posteriormente seja solubilizado para
22
o uso na reação (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). A complexa parede celular, composta de
moléculas lipofílicas e polissacarídeos, torna as micobactérias resistentes à maioria dos
protocolos tradicionais de lise celular. A ruptura da parede bacteriana pode ser realizada por
processos mecânicos, enzimáticos ou químicos (AMITA et al., 2002; KÄSER et al., 2009). A
combinação de mais de um desses processos melhora a capacidade de detecção do DNA alvo,
conforme demonstrado por Nogueira e colaboradores (2012). Diversos são os protocolos de
DNA aceitos em Medicina Veterinária para a detecção de M. bovis e M. tuberculosis, dentre
eles destacam-se extrações enzimáticas isoladas ou combinadas, associação de enzima e
detergentes ou ultrassom, uso de colunas (QIAGEN) e a extração com CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide) (AMARO et al., 2008; HOSEK et al., 2006).
O terceiro passo da PCR consiste em preparar a mistura de reação, a qual contém
as substâncias necessárias para fazer novas cópias de DNA. Esta reação in vitro deve
mimetizar as condições de amplificação do DNA observadas in vivo, portanto, em um tubo
são colocados os seguintes itens: solução tampão para manter a mistura de reação no pH e
condições iônicas ideais para a reação, os deoxinucleotídeos, os primers, a enzima Taq–DNA
polimerase, e o DNA molde, extraído da amostra. (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
O quarto passo consiste na reação de amplificação em si, feita em um
termociclador que aquece e resfria a reação em vários ciclos consecutivos para amplificar o
DNA. Primeiramente, o tubo é aquecido a 94oC para que o DNA seja desnaturado (abertura
das fitas). Em seguida, a temperatura diminui para permitir a hibridização ou pareamento dos
primers às sequências complementares no DNA. A próxima etapa é a síntese das fitas de
DNA pela polimerase. Após diversos ciclos (geralmente em torno de 30 a 35 ciclos) o DNA
estará amplificado em milhões de cópias (SAMBROOK, RUSSEL, 2001).
Problemas técnicos podem surgir, o mais danoso é a contaminação da amostra
com material genético estranho que pode gerar cópias de DNA não relacionadas ao DNA que
está sendo investigado, sendo que seu resultado pode levar a conclusões erradas. Para
monitorar a possibilidade de riscos desse tipo deve-se realizar as reações com a utilização de
controles positivos e negativos; além da vigilância permanente do laboratório, com adoção de
técnicas universais de boas práticas em laboratórios de Biologia Molecular. O laboratório
deve ter áreas separadas para cada etapa do processo: preparo da amostra e extração de DNA,
preparo da mistura de reação (master mix), amplificação e análise do produto amplificado
(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
O passo final é a análise do amplificado (produto de reação) que pode ser
realizada por meio de gel de agarose ou de poliacrilamida, corados por brometo de etídio,
23
SYBR®, e outros corantes. Em qualquer uma delas o material amplificado é visualizado como
uma banda a ser analisada de acordo com o seu tamanho molecular (SAMBROOK; RUSSEL,
2001).
O sucesso do método de PCR na rotina de diagnóstico da tuberculose está na
dependência de uma série de parâmetros, tais como a qualidade do DNA, que deve estar livre
de contaminantes (os quais interferem na amplificação), na escolha correta dos primers para a
amplificação do material, assim como, no emprego de métodos de extração adequados,
especialmente para amostras paucibacilares (ARAÚJO et. al., 2005).
A distinção do gênero Mycobacterium pode ser realizada com primers gêneroespecíficos, que detectam as micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou ainda primers
espécie-específicos que reconhecem sequência de DNA de M. bovis. (PINSKI; BANAEI,
2008; RODRIGUEZ et. al., 1995).
3.4 RENDIMENTO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
O diagnóstico “in vivo” da tuberculose em bovinos é realizado principalmente
com o teste de tuberculina. Entretanto, este teste apresenta sensibilidade duvidosa,
apresentando resultados negativos em muitos casos posteriormente confirmados como
positivos,
e
vice-versa
(MINISTÉRIO
DA
AGRICULTURA
PECUÁRIA
E
ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2008; BRASIL, 2006).
Os testes diagnósticos de tuberculose rotineiramente utilizados em humanos como
a coloração pelo álcool ácido-resistência das amostras de secreções traqueais ou brônquicas, e
a cultura para micobactérias, apresentam limitações quando utilizadas para diagnóstico
animal. No primeiro caso, apesar de ser um teste rápido (menos de uma hora) apresenta baixa
sensibilidade e não permite a determinação da espécie bacteriana. No segundo caso, o teste
possibilita a determinação da espécie, mas devido ao lento crescimento das micobactérias
requer de 6 a 10 semanas (BRASIL, 2008).
Nas áreas de endemia, nas quais tuberculoses bovinas e humanas coexistem, é
muito importante distinguir as características entre M. bovis e M. tuberculosis para que se
possa fazer o monitoramento da dispersão de M. bovis entre animais, e destes para o homem
(ABRAHÃO,
1998;
MINISTÉRIO
DA
AGRICULTURA
PECUÁRIA
E
ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2006).
No entanto, a distinção entre espécies de micobactérias, especialmente àquelas do
complexo Mycobacterium tuberculosis - MTBC (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M.
24
caprae, M. canettii, e M. microti), é particularmente difícil devido a grande semelhança
morfológica, bioquímica, imunológica, e especialmente, genética entre estes microrganismos.
(NIEMANN et. al., 2000). Porém, algumas características podem ser observadas, M. bovis
apresenta um amplo espectro de hospedeiros, mas é primariamente um patógeno bovino. Por
outro lado, M. caprae ocorre naturalmente em caprinos, M. microti é usualmente isolado de
pequenos roedores, e M. tuberculosis é predominante em humanos (ABRAHÃO, 1998).
Neste sentido, uma série de testes clássicos baseados no crescimento, nas
características fenotípicas, e em testes bioquímicos tem sido utilizados tradicionalmente para
classificar os membros do complexo MTBC. Entretanto, estes testes em conjunto são lentos,
trabalhosos, imprecisos e não reproduzíveis. Tais técnicas, além de não serem accessíveis a
qualquer laboratório de análise, apresentam resultados ambíguos e de difícil interpretação
(BRASIL, 2008).
Apesar da eficiência da análise de alguns genes espécie-específicos para a
diferenciação de espécies de micobactérias não pertencentes ao complexo MTBC,
dificuldades têm sido encontradas para caracterizar inequivocamente espécies e subespécies
que compõem o complexo MTBC. Estes métodos apresentam algum potencial para
classificação de micobactérias, mas são limitados na sua capacidade de tipificação de isolados
(REHREN et. al., 2007).
Na tuberculose, o método de PCR, assim como outros métodos moleculares vêm
sendo empregados para a identificação e detecção do agente tanto em isolados de cultivos,
como em amostras clínicas. Dessa forma, o interesse pelos métodos moleculares tem se
intensificado devido às dificuldades encontradas no diagnóstico da doença em animais,
principalmente pelas limitações quanto à sensibilidade e especificidade do teste de reação
cutânea, e o longo período para confirmação da presença do agente pelos métodos
bacteriológicos de rotina (FRÁGUAS et. al., 2008).
Já o exame post mortem pode ser afetado pelo critério na inspeção da carcaça e os
sítios observados. O exame cuidadoso de pelo menos seis pares de linfonodos entre os de
cabeça (mandibulares, parotídeos e retrofaríngeos), toráxicos (mediastinais e bronquiais),
mesentéricos e da carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos, sacral e inguinal superficial),
bem como pulmão, fígado, baço, rim, úbere, e órgãos genitais, pode identificar até 95% dos
animais com lesões macroscópicas (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO, 2011; TAYLOR, et. al., 2007; BRASIL, 2006).
Para identificar o agente de reações tuberculínicas positivas em animais sem
lesões visíveis ao abate é necessário o exame bacteriológico de amostras congeladas enviadas
25
ao laboratório, principalmente linfonodos colhidos assepticamente. O cultivo para primoisolamento de M. bovis pode ser processado pelo método tradicional de Petroff ou pela
descontaminação com cloreto de hexadecilpiridino e semeadura em meios a base de ovo,
como Stonebrink, ou a base de ágar, como Middlebrook 7H11 e B83. Assim, o meio de
cultura mais recomendado para o primo-isolamento de M. bovis é o Stonebrink contendo
piruvato de sódio e não glicerina. O crescimento deste se dá após três a cinco semanas de
incubação. Dessa forma, o isolamento de M. bovis pode demorar até/ou mais de 12 semanas e,
a identificação da cepa isolada por métodos bioquímicos também é um processo lento.
(BRASIL, 2008).
No entanto, alguns animais, ainda que infectados, não respondem aos testes
tuberculínicos, isso porque, fatores como infecção recente, final de gestação e desnutrição
podem ocasionar falso-negativos aos testes. Animais em estado avançado de infecção também
podem manifestar o fenômeno de anergia, ou seja, ausência de reatividade cutânea à
tuberculina. Animais recém-infectados ocasionalmente não respondem ao teste tuberculínico,
sendo que nos bovinos a resposta aparece comumente após 30 a 50 dias da infecção. A
aplicação indevida da tuberculina interfere no resultado do teste. (MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2006).
26
4 JUSTIFICATIVA
Os dados de notificação oficial de tuberculose bovina no Brasil, no período de
1999 a 2009, indicam um percentual de prevalência de animais infectados de 1,3%.
(MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).
Em 2006, a ocorrência de tuberculose bovina no Brasil, com uma população
estimada em 198 milhões de bovinos, estava entre 0,9 a 2,9%, com 6,2% a 26,3% dos
rebanhos acometidos, sendo que neste mesmo período a taxa de identificação com inspeção
federal de animais abatidos em frigoríficos com lesões de tuberculose ficou em torno de
0,14% (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).
As perdas econômicas causadas pela tuberculose nos animais estão relacionadas
principalmente à baixa produtividade e à condenação de carcaças nos frigoríficos. Um animal
tuberculoso pode apresentar de 10 a 25% de queda na capacidade produtiva, além de ser uma
fonte de infecção para outros animais e para o homem (BRASIL, 2006).
Como a transmissão é predominantemente respiratória, o confinamento tem
particular importância na difusão da doença no rebanho, o que explica a maior prevalência no
gado leiteiro estabulado. Na medida em que a idade do rebanho aumenta, há menor
prevalência no gado de corte, pois são criados em sistema extensivo e abatidos precocemente,
sendo menor o tempo de exposição aos membros infectados do rebanho. Desta forma, o
tamanho do rebanho também é importante na transmissão da infecção. A tuberculose em um
rebanho é introduzida, principalmente, pela aquisição de animais infectados podendo se
propagar nos bovinos independentemente da idade, sexo e raça. (BRASIL, 2006).
Na tuberculose, o método de PCR, assim como outros métodos moleculares, vem
sendo empregado para a identificação e detecção do agente, tanto em isolados de cultivos
como em amostras clínicas. O interesse pelos métodos moleculares tem se intensificado
devido às dificuldades encontradas no diagnóstico da doença em animais – principalmente
pelas limitações quanto à sensibilidade e especificidade do teste de reação cutânea e o longo
período para confirmação da presença do agente pelos métodos bacteriológicos de rotina.
Neste sentido, para ter maior subsídio no combate da tuberculose bovina, é necessário que
técnicas diagnósticas mais rápidas e precisas sejam utilizadas, o que contribuiria sobremaneira
para um controle mais eficaz desta zoonose.
27
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
•
Avaliar o rendimento da PCR no isolamento de micobactérias em amostras teciduais
congeladas de bovinos.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Avaliar o rendimento (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor
preditivo negativo e acurácia) da PCR em tecido, comparando com cultura e
diagnóstico macroscópico;
•
Descrever o percentual de lesões causadas por M. tuberculosis, M. bovis e outras
micobactérias;
•
Comparar o rendimento da PCR em diferentes tecidos.
28
6 MÉTODOS
As amostras de tecido dos animais do presente trabalho foram provenientes de
propriedades rurais do estado de Santa Catarina e do Rio Grande do Sul.
As amostras foram oriundas de estabelecimentos cuja atividade principal é a
pecuária de corte, onde os animais são criados extensivamente, e não confinados, como ocorre
em estabelecimentos leiteiros.
Os animais, ao chegarem ao frigorífico (SIF- Serviço de Inspeção Federal), foram
submetidos às normas do RIISPOA (Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de
Produtos de Origem Animal), descritos nos Anexos A e B. (BRASIL, 2004).
Nos lotes de animais tuberculínicos, as amostras foram obtidas após o abate
normal. Esses animais são acompanhados por uma identificação que faz parte do PNCTBB
(Plano Nacional de Controle da Tuberculose e Brucelose Bovina). (MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).
Ao serem diagnosticadas macroscopicamente, as lesões de tuberculose na carcaça,
e/ou nas vísceras, foram submetidas aos critérios de julgamento preconizados no artigo 196
do RIISPOA (BRASIL, 2004).
As lesões identificadas macroscopicamente como tuberculose foram embaladas e
identificadas de acordo com o tecido acometido. As amostras ficaram congeladas a uma
temperatura de -18oC até a realização dos testes laboratoriais.
As amostras teciduais foram descongeladas e semeadas em meios de cultura
Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio e outro contendo glicerol por 42 dias a 37ºC.
Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das culturas, com primers
específicos para M. tuberculosis e M. bovis.(BRASIL, 2008).
6.1 METODOLOGIA LABORATORIAL
• Isolamento do microrganismo: os fragmentos de órgãos foram macerados em gral com
pistilo ou em tubos contendo pérolas de vidro com água destilada estéril até a formação de
uma suspensão homogênea. A suspensão foi utilizada para realização da cultura de
micobactérias (BRASIL, 2008).
• Cultura: as amostras foram descontaminadas com NaOH 4% durante 2 minutos e semeadas
em meio comercial com piruvato Ogawa-Kudoh (Laborclin) e em meio com glicerol Ogawa-
29
Kudoh (Laborclin) e incubadas à 37ºC durante 42 dias. Adicionalmente, amostras sem
descontaminação foram semeadas nos meios de cultura (BRASIL, 2008).
• Extração de DNA: o DNA das cepas isoladas foi extraído de acordo com Van Soolingen e
colaboradores (1991), utilizando-se o detergente CTAB. A extração do DNA diretamente do
tecido foi feita com o kit comercial Qiagen e seguiu as recomendações do fabricante.
• PCR: o DNA extraído foi amplificado em uma reação com 50µl de volume final contendo
1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 ρmoles de cada iniciador;
Tampão de Taq polimerase 1X (200mM Tris-HCl pH 8.4; 500mM KCl), Taq DNA
polimerase
recombinante
5U
(Invitrogen)
utilizando-se
os
iniciadores
JB21(5’-
TCGTCCGCTGATGCAAGTGC-3’) e JB22 (5’- CGTCCGCTGACCTCAAGAGAC-3’), e
10-100ng de DNA. (RODRIGUEZ et. al., 1995).
• Os outros alvos amplificados utilizaram os primers INS1 (5’CGT GAG GGC ATC GAG
GTG GC 3’) e INS2 (5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’) (VAN EMBDEN et al.,
1993) para a sequência de inserção 6110 (IS6110), e os primers Tb11 (5’ –
ACCAACGATGGTGTGTCCAT- 3’) e Tb12 (5’ –CTTGTCGAACCGCATACCCT- 3’)
(TELENTI et al., 1993), para amplificação do gene hsp65.
• As condições da amplificação em termociclador Mastercycle Personal® (Eppendorf) foram:
5 minutos a 94°C e 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 68°C, 1 minuto a 72°C e um
ciclo final de 10 minutos a 72°C.
Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose
1,5% corado com bromito de etídio (1µg/ml) e visualizados e fotografados sob iluminação
ultravioleta de 320ηm (HOEFER-MacroVue UV-20), utilizando-se um sistema de fotodocumentação de géis (DOC-PRINT® Biosystems). O tamanho do fragmento foi estimado
por comparação com marcador de peso molecular de 100 pb ladder.
Os primers JB21 e JB22, específicos para M. bovis, amplificam um produto de
495 pares de base (pb), os primers INS1 e INS2, específicos para o CTBM, amplificam um
produto de 244 pb, e os primers Tb11 e Tb12 amplificam um produto de 441 pb do gene
hsp65 presente no gênero Mycobacterium (RODRIGUEZ et al., 1995; VAN EMBDEN et
al.,1993; TELENTI et al., 1993).
A sequência metodológica utilizada encontra-se demonstrada na Figura 1.
30
Figura 1 - Fluxograma da metodologia utilizada.
Coleta da amostra
Laboratório
Processamento das Amostras
- Maceração do tecido (formação de
suspensão)
Semeadura da Suspensão
Extração de DNA
Meio de cultura Ogawa-Kudoh sem Piruvato
(direto do tecido)
Meio Ogawa-Kudoh com Piruvato (com e
Kit comercial Qiagen
sem descontaminação)
Incubação a 37°C – 28 dias
Extração de DNA
(colônias)
A partir da cultura positiva
Método enzimático CTAB
PCR (genes alvo para identificação)
-hsp65 (gênero Mycobacterium) – PRA-hsp65
- IS6110 (Complexo M. tuberculosis)
- JB (específico M. bovis)
Identificação da Espécie
Resultado das análises
Fonte: Elaboração do autor, 2012.
31
7 ANÁLISE DOS DADOS
Foram descritos os números absolutos e percentuais de lesões causados por M.
bovis, M. tuberculosis e outras micobactérias na amostra total e por tecido analisado.
Foi avaliado o rendimento (sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo,
valor preditivo positivo e acurácia) da técnica de PCR para a detecção de M. bovis e M.
tuberculosis, tomando-se como padrão-áureo a cultura. O rendimento foi avaliado para a
amostra total e por tecido analisado.
As amostras negativas em cultura foram consideradas como controles para fins
estatísticos.
Tomando-se como estimativa uma prevalência de 80% de M. bovis e/ou M.
tuberculosis, a menor sensibilidade do teste aceitável de 90%, com intervalo de confiança de
5%, estimou-se a amostra necessária em 69.
32
8 RESULTADOS
Foram analisadas 69 amostras teciduais de bovinos (Figura 1), das quais 81,2%
constituíram-se de linfonodos (Tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição das amostras teciduais analisadas de acordo com o sítio anatômico.
Sítio Anatômico
N
%
Linfonodo
56
81,2
Fígado
07
10,1
Pericárdio
02
2,9
Pulmão
02
2,9
Peritôneo
01
1,4
Pleura
01
1,4
Total
69
100
Figura 2 - Lesões macroscópicas em amostras teciduais hepáticas.
33
Tomando-se o resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificouse a presença de micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%)
pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%)
identificadas como Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). A distribuição das micobactérias
isoladas encontra-se demonstrada na Tabela 2.
Tabela 2 - Distribuição das micobactérias isoladas.
Micobactérias Isoladas
n
%
- Mycobacterium bovis
03
17,6
- Mycobacterium tuberculosis
09
52,9
Micobactérias Não Tuberculosas
05
29,4
Total
17
100
Complexo MTB
Os resultados obtidos nas culturas realizadas com e sem descontaminação, e
aquelas realizadas sem piruvato, tomando-se como padrão áureo o resultado final das culturas,
encontram-se demonstrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Distribuição dos resultados das culturas específicas em comparação com o padrão
áureo.
Culturas Específicas
Padrão Áureo
Negativo
Positivo
n(%)
n(%)
Ogawa-Kudoh Piruvato sem Descontaminação
Negativo
52(100)
16(94,1)
Positivo
-
1(5,9)
Negativo
52(100)
1(5,9)
Positivo
-
16(94,1)
Negativo
52(100)
9(52,9)
Positivo
-
8(47,1)
Ogawa-Kudoh Piruvato com Descontaminação
Ogawa-Kudoh sem Piruvato (com glicerol)
34
O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela cultura específica OgawaKudoh com Piruvato e com descontaminação (Tabela 4).
Tabela 4 - Rendimento diagnóstico das culturas específicas em comparação com o padrão
áureo.
Culturas
Sensibilidade Especificidade
Valor
Valor
Acurácia
(IC 95%)
Preditivo
Preditivo
(IC 95%)
Positivo
Negativo
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
Específicas
Ogawa-Kudoh
0,06
1,0
1,0
0,77
0,77
Piruvato sem
(-0,05-0,17)
(1,0-1,0)
(1,0-1,0)
(0,66-1,60)
(0,67-0,87)
Ogawa-Kudoh
0,94
1,0
1,0
0,98
0,99
Piruvato com
(0,83-1,1)
(1,0-1,0)
(1,0-1,0)
(0,94-1,0)
(0,96-1,0)
Ogawa-Kudoh sem 0,47
1,0
1,0
0,85
0,87
Piruvato
(1,0-1,0)
(1,0-1,0)
(0,76-1,1)
(0,79-0,95)
Descontaminação
Descontaminação
(0,23-0,71)
O tecido linfonodal apresentou o melhor percentual de amostras positivas, seguido
do tecido hepático (Tabela 5).
Tabela 5 - Distribuição dos resultados da cultura de acordo com a amostra tecidual analisada.
Cultura
Fígado
Negativa
n(%)
6(11,5)
Positiva
n(%)
1(5,9)
Linfonodo
40(76,9)
16(94,1)
Pericárdio
2(3,8)
-
Peritôneo
1 (1,9)
-
Pleura
1 (1,9)
-
Pulmão
2(3,8)
-
52
17
Amostra Tecidual
Total
35
O resultado da PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 de
acordo com o padrão áureo, encontra-se demonstrado nas Tabelas 6.
O rendimento alcançado foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36),
especificidade de 98,1% (IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,331,17), valor preditivo negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de
verossimilhança positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A prevalência de doença na
amostra analisada foi de 24,6%.
Tabela 6 - Distribuição do resultado da PCR hsp65 em amostras teciduais, de acordo com o
padrão áureo.
Padrão Áureo
PCR hsp65
(tecido)
Negativa
Negativo
n(%)
51(98,1)
Positivo
n(%)
14(82,4)
Positiva
1(1,9)
3(17,6)
52
17
Total
Quando a PCR hsp65 foi realizada diretamente nas culturas positivas, houve 14
resultados concordantes com o resultado da cultura (82,4%), e três resultados falso negativos
(17,6%).
A PCR IS6110 foi realizada diretamente nas culturas positivas e houve 12
resultados concordantes com o resultado da cultura (92,3%), e apenas um resultado falso
positivo (7,7%). Os mesmos resultados foram observados quando a PCR IS6110 foi realizada
diretamente nas amostras teciduais.
36
9 DISCUSSÃO
A necessidade de uma técnica laboratorial sensível e específica para o diagnóstico
etiológico das lesões teciduais macroscópicas observadas em abatedouros, motivou a
realização do presente estudo.
A maioria das amostras analisadas constituiu-se de linfonodos, seguidas de tecido
hepático. Os linfonodos devem ser avaliados com cuidado, visto que constituem-se em
barreiras regionais que atuam na defesa do organismo. É recomendado que pelo menos seis
pares de linfonodos entre os da cabeça (mandibulares, parotídeos e retrofaríngeos), torácicos
(mediastínicos e bronquiais), mesentéricos e da carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos,
sacral e inguinal superficial), sejam detalhadamente avaliados, assim como o tecido dos
pulmões, fígado, baço, rins, úbere e órgãos genitais, o que pode identificar até 95% dos
animais com lesões macroscópicas (CORNER, 1994; RADOSTITS; BLOOD; GAY, 1995).
Nas lesões macroscópicas causadas por micobactérias, invariavelmente a superfície de corte
da lesão apresenta-se com área central necrótica, rangendo ao contato com o instrumento
cortante utilizado, o que indica a presença de calcificação. Estes dados suportam o diagnóstico
presuntivo de doença causada por micobactérias no animal abatido (OLIVEIRA et al., 1986).
No presente estudo foram isoladas micobactérias em somente 24,6% das amostras
analisadas. Na inspeção realizada em abatedouros, diversas doenças como a actinobacilose,
piogranuloma estafilocócico, mucormicose, coccidioidomicose, pentastomíase, hidatidose
policística e alguns tumores, podem apresentar lesões que macroscopicamente assemelham-se
à tuberculose. Para realizar o diagnóstico diferencial entre a etiologia dessas lesões é
necessário que se realize o exame microbiológico e anatomopatológico (RIET - CORREA;
GARCIA, 2001). Desta forma, as amostras teciduais negativas para a presença de
micobactérias, porém com lesões macroscópicas, poderiam ter sido causadas por qualquer
agente dentre os acima citados. Uma classificação equivocada destas lesões como sendo
causadas por micobactérias tem implicações importantes em termos de saneamento e saúde
pública. Os microrganismos podem ser eliminados pelo ar exalado, através das fezes, do leite,
da urina, de secreções vaginais, e de secreções eliminadas por linfonodos periféricos
fistulizados. As micobactérias podem também ser eliminadas em sua forma viável no muco
nasal e naquele proveniente do aparelho respiratório, antes do aparecimento de qualquer lesão
visível. A inalação é o principal meio de transmissão, mas a transmissão através da ingestão
não pode ser negligenciada. A ingestão de microrganismos ocorre quando o material ingerido
encontra-se contaminado com fezes, porém, neste caso, uma grande quantidade de agentes
37
infectantes é necessária para que o contágio ocorra. Quando um animal com tuberculose entra
em contato com a água, a doença poderá ser transmitida até 18 dias após este contato, o
mesmo não ocorrendo quando a fonte de água é corrente (BLOOD; RADOSTITS, 1989). O
Mycobacterium bovis pode resistir por dois anos nas instalações, fezes, solos e pastagens, por
um ano na água e dez meses na carcaça. Portanto, programas sistematizados de desinfecção
dos locais onde ficam os animais, assume importância fundamental como ferramenta
complementar ao combate à doença. O agente pode ser destruído por desinfetantes como o
hipoclorito de sódio a 5%, fenol a 5%, formol a 7,5%, hipoclorito de cálcio a 5% com
exposição de três horas e, também, pode ser destruído por autoclavação, pasteurização lenta,
pasteurização rápida e fervura (BRASIL, 2001). Desta forma, a diferenciação das lesões
macroscópicas entre lesões causadas por micobactérias e por outros agentes etiológicos, é de
suma importância para que medidas corretas de controle sejam instituídas.
Dentre as micobactérias isoladas, 52,9% eram M. tuberculosis, seguida pelas
micobactérias não tuberculosas (29,4%). M. bovis foi o agente isolado com a menor
frequência. Por ser uma doença crônica e ter vários sinais clínicos causados pela localização
variada da infecção, a tuberculose é difícil de ser diagnosticada por meio de exame clínico.
Deve ser diferenciada das micobacterioses, de pneumonia por aspiração, reticulite traumática,
pleuropneumonia contagiosa crônica dos bovinos, doença do trato respiratório superior,
actinobacilose, leucose bovina e linfadenopatia (BLOOD; RADOSTITS, 1989). Os principais
reservatórios de infecção são humanos e bovinos, no entanto, marsupiais e suínos domésticos
infectados por M. bovis já foram encontrados. A prevalência da doença em tais reservatórios
influencia sua incidência em outras espécies (FRASER, 1991). Todas as espécies são
susceptíveis a tuberculose, incluindo a humana. Os bovinos infectados constituem a principal
fonte de infecção para outros bovinos, mas podem ser responsáveis por transmissão para
humanos, que ocorre por contato direto ou através de alimentos contaminados. A condição de
hospedeiros permanentes, e portanto reservatórios do agente, torna animais silvestres um fator
limitante para a erradicação da tuberculose bovina em alguns países (BLOOD; RADOSTITS,
1989).
No período de 1986 a 1996, segundo o MAPA, a prevalência de infecção por M.
bovis na população bovina do Brasil, variou de 0,9 a 1,7%, em 14 estados brasileiros
(ABRAHÃO, 1999). No período de 1989 a 1998, a prevalência média nacional de animais
infectados era de 1,3%. No sudeste do Brasil a prevalência estimada é de 6,8 a 32,0%
(LILENBAUM, 2000; BRASIL, 2001). No Pará, entre os anos de 1996 e 1997, foi descrita
uma prevalência de 7,7% em búfalos abatidos. Das alterações descritas, 72,1% era localizadas
38
e 27,9% generalizadas. As lesões presentes nas vias aéreas totalizaram 55,1%, seguidas do
conjunto cabeça-língua com 20,1%, carcaça 9,6%, cavidade abdominal 6,3%, e mama com
3,8% das alterações. Com relação aos agentes etiológicos das lesões 67,3% eram por
Mycobacterium bovis (FREITAS; GUERRA; PANETTA, 2001). Em Minas Gerais, de 1993 a
1997, a prevalência de tuberculose em bovinos abatidos foi de 0,7% (BAPTISTA et al.,
2004). Em 1999, um estudo realizado no Triângulo Mineiro e nas regiões do centro e sul de
Minas Gerais, detectou uma prevalência de animais infectados de 0,8%. Nas propriedades de
gado de corte, a prevalência de teste tuberculínico positivo foi de 5,0%, ao passo que nas
propriedades produtoras de leite esta prevalência aumentou para 15%, reforçando o fato de
que áreas leiteiras apresentam maior prevalência da doença por causa do confinamento do
rebanho (BRASIL, 2001).
Na Bahia cidade de Ilhéus, no ano de 2000, 21,7% dos estabelecimentos pecuários
existentes no município apresentavam testes de tuberculinização positivos, acreditando-se que
na maioria destas propriedades foram introduzidos animais adquiridos em outras propriedades
na própria região e em outros Estados (RIBEIRO et al, 2003). No município de Mossoró (Rio
Grande do Norte), no ano de 2002, foram diagnosticados 3,33% de animais reagentes à
tuberculina (OLIVEIRA et al., 2007). Em Passo Fundo no Rio Grande do Sul, em 2002, os
testes intradérmicos para diagnóstico da tuberculose indicaram que 1,5% dos animais testados
apresentaram reações positivas (POLETTO, 2004). Os dados acima descritos demonstram
uma distribuição do percentual de lesões causadas por micobactérias bastante heterogênea
quando são avaliados estados brasileiros em regiões distintas. Tais resultados podem ser
devido à características próprias das propriedades avaliadas, ou seja, predominantemente
leiteiras ou predominantemente de corte, ou na forma de avaliar as lesões e suas respectivas
técnicas.
Os dados obtidos neste trabalho também divergem daqueles obtidos em estudos
no Mato Grosso do Sul, onde setenta e duas amostras de carcaça com lesões sugestivas de
tuberculose foram selecionadas durante os procedimentos de inspeção de abate nos
matadouros. Destas, 23,6% apresentaram colônias sugestivas de micobactérias, que foram
confirmadas como apresentando bacilos álcool-ácido-resistentes pela coloração de ZiehlNeelsen. Através da reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos para
M. bovis, foram identificadas 76,5% das amostras contendo M. bovis (ARAÚJO, 2005). A
forma de seleção dos animais com lesões macroscópicas sofre influência direta do
profissional que as classifica, o que pode gerar discrepâncias entre os dados das diversas
regiões. Novamente torna-se clara a necessidade da correta identificação dos agentes
39
causadores das lesões. A tuberculose é uma zoonose de distribuição mundial, com alta
prevalência nos países em desenvolvimento e baixa nos desenvolvidos, devido a programas de
controle e erradicação, inspeção de carnes e pasteurização do leite. Desse modo, é essencial
investigar os pontos a serem melhorados na cadeia de controle da tuberculose bovina para que
a saúde pública seja assegurada.
De acordo com Blood e Radostits (1989), o primeiro passo para a erradicação da
tuberculose é a educação dos pecuaristas. Os criadores devem ser informados sobre o
significado econômico da doença, sua importância à saúde pública, manifestações e
necessidade das várias etapas num programa de erradicação, a qual deve ser compulsória, uma
vez que os esquemas voluntários sempre deixam focos de infecção.
O controle da tuberculose deve ser fundamentado na quebra da cadeia de
transmissão da doença. O controle e a posterior erradicação da tuberculose baseiam-se,
principalmente, na realização periódica da prova tuberculínica e no abate dos animais que
reagem positivamente (RIETCORREA et al, 2001; FRASER, 1991). Muito cuidado deve ser
tomado quando da aquisição de novos animais, evitando a introdução ou reintrodução da
infecção na propriedade (BRASIL, 2001). Da mesma forma, é importante que a saúde dos
trabalhadores da propriedade seja rotineiramente monitorada.
Acredita-se que os números apresentados pelo MAPA estejam muito abaixo da
realidade, dando uma noção limitada do problema. Esta afirmação está amparada no fato de
que há uma grande subnotificação dos animais tuberculina-positivos, e produção insuficiente
de tuberculina para todo rebanho nacional. Além disso, há poucos estudos com dados
atualizados sobre a saúde animal brasileira, principalmente em relação à tuberculose
(ABRAHÃO, 1999).
A tuberculose pode ser causada no homem pelo Mycobacterium tuberculosis,
MNT e Mycobacterium bovis, transmitidos direta ou indiretamente para outros homens e
animais (BAUER et al., 1992; BRASIL, 2004). Mesmo quando causada por este agente,
apresenta-se com as mesmas formas clínicas e lesões patológicas do Mycobacterium
tuberculosis. (PARDI et al., 2001).
Nos casos de lesões macroscópicas típicas de tuberculose em bovinos, o agente
mais frequentemente isolado era Mycobacterium bovis (CASTRO; NEMOTO, 1972;
CORREA; CORREA, 1982). Várias micobactérias não tuberculosas vêm sendo isoladas de
linfonodos de bovinos, dentre elas: Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum,
Mycobacterium gordonae, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium intracellulare, e
40
Mycobacterium terrae (LANGENEGGER et al., 1981). Esta tendência também foi observada
nos dados aqui apresentados.
Tabosa e colaboradores (1996) avaliando carcaças com lesões semelhantes à
tuberculose,
observaram
que
apenas
5
das
32
amostras
apresentaram
lesões
microscopicamente características de tuberculose. Na inspeção realizada em frigoríficos,
diversas doenças (actinobacilose, actinomicose, entre outras) apresentaram lesões semelhantes
à tuberculose, e sua diferenciação necessita de exames complementares (RIET-CORREA;
GARCIA, 2001; MÉNDEZ, 2001).
O teste considerado padrão áureo para a confirmação da tuberculose bovina é a
cultura. Porém, o isolamento de micobactérias em cultura, a partir de amostras teciduais, é um
processo muito lento, sendo necessários aproximadamente 10 a 100 organismos viáveis,
número geralmente encontrado em um estado avançado da doença. Isto torna a cultura uma
técnica com excelente rendimento, porém pouco factível na prática diária, porque os
resultados precisam ser obtidos de forma mais rápida para que as ações sanitárias sejam
efetivas (ROMERO et al., 1999).
No presente trabalho, a cultura no meio Ogawa-Kudoh, com piruvato e com
descontaminação apresentou o melhor rendimento, com sensibilidade de 94%, especificidade
de 100% valor preditivo positivo de 100%, valor preditivo negativo de 98% e acurácia de
99%. Tais resultados demonstram a cultura como uma técnica de excelente rendimento e
adequada para comparação quando trata-se de estudos que avaliam a utilização de novas
técnicas, tais como as que envolvem a biologia molecular. Além disso, estes resultados
apontam que pode ser importante a inclusão de meios de cultivo com piruvato de sódio, além
daqueles com glicerol, para o diagnóstico da tuberculose humana, especialmente para
amostras oriundas de pacientes que residem em áreas agrícolas ou que têm contato
profissional com bovinos.
Entre 2005 e 2006, 8.121 espécimes clínicos enviados ao Laboratório de
Micobactérias do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho/Instituto de Doenças do
Tórax, no Rio de Janeiro, foram inoculados em meio Löwenstein-Jensen contendo glicerol e
piruvato. Desses espécimes, 79 isolados de micobactérias tiveram crescimento somente em
meio com piruvato, sendo selecionados para a identificação presuntiva de Mycobacterium
bovis. Embora a tuberculose bovina tenha sido identificada no Brasil, não existem dados
disponíveis sobre tuberculose humana causada por M. bovis no país. A falta de notificação
talvez se deva ao fato de que poucos laboratórios de micobactérias utilizam meios de cultura
contendo piruvato rotineiramente (SOBRAL et al., 2011).
41
Quando a PCR hsp65 foi realizada diretamente nas culturas positivas, houve 14
resultados concordantes com o resultado da cultura (82,4%), e três resultados falso-negativos
(17,6%). Porém, a realização da PCR diretamente do tecido com o alvo hsp65, resultou em
alta especificidade e valor preditivo positivo, mas baixa sensibilidade. Estes resultados podem
ser o reflexo da prevalência de micobactérias na amostra analisada (24,6%), haja vista que a
sensibilidade é uma propriedade dos testes diagnósticos diretamente relacionada à prevalência
do evento. Estes resultados não configuram o teste em questão como um teste útil para a
triagem, mas sim para a confirmação do agente etiológico de forma mais rápida do que na
cultura. Há ainda que se considerar a possibilidade de otimização na preparação das amostras
teciduais a serem submetidas à técnica de PCR, uma vez que as culturas evidenciaram
crescimento do microrganismo.
A PCR IS6110 foi realizada diretamente nas culturas positivas e houve 12
resultados concordantes com o resultado da cultura (92,3%), e apenas um resultado falsopositivo (7,7%). Os mesmos resultados foram observados quando a PCR IS6110 foi realizada
diretamente nas amostras teciduais.
A alta especificidade da técnica de PCR é demonstrada por outros autores, que
concluíram ser um exame útil e rápido para o diagnóstico da tuberculose bovina
(GARBACCIO, CATALDI, 2010; POROCA et al., 2009). Da mesma forma, constitui-se em
técnica rápida e que permite diferenciar os diferentes agentes do CMTB (PARSONS et al.,
2002).
Os resultados aqui apresentados apontam para a necessidade de otimizar a
sensibilidade da técnica, para que ela possa ser utilizada na rotina laboratorial, corroborando
com a afirmação de Ruggiero et al. (2007), de que ainda não dispomos de um ensaio sensível
para o diagnóstico da tuberculose em bovinos, que possa ser implementado na rotina
laboratorial.
42
10 CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente estudo foram isoladas micobactérias em 24,6% das amostras
analisadas, as quais apresentavam lesões macroscopicamente identificadas, o que evidencia a
necessidade de comprovação anatomopatológica e/ou microbiológica para o diagnóstico
etiológico destas lesões.
O M. bovis foi a micobactéria isolada com a menor frequência, demonstrando a
importância do M. tuberculosis e das MNT em termos de saúde pública.
A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido acometido apresentou alta
especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa sensibilidade, sendo desejável a
otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina laboratorial.
43
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49
ANEXOS
50
ANEXO A – Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal
Destino de Carcaças com Tuberculose no Departamento de Inspeção Final.
Artigo 196: Tuberculose – A condenação total deve ser feita nos seguintes casos:
1 – Quando no exame “ante – mortem” o animal estava febril;
2 – Quando a tuberculose é acompanhada de anemia ou caquexia;
3 – Quando se constatarem alterações tuberculosas nos músculo, nos tecidos intramusculares,
nos ossos (vértebras) ou nas articulações e, ainda, nos gânglios linfáticos que drenagem a linfa
dessas partes;
4 – Quando ocorrerem lesões caseosas concomitantemente em órgãos torácicos e abdominais
com alteração de suas serosas;
5 – Quando houver lesões miliares de parênquima ou serosas;
6 – Quando as lesões forem múltiplas, agudas e ativamente progressivas, considerando-se
processo nestas condições quando há inflamação aguda nas proximidades das lesões, necrose
de liquefação ou presença de tubérculos jovens;
7 – Quando existir tuberculose generalizada;
Parágrafo 1o – A tuberculose é considerada generalizada quando além das lesões dos
aparelhos respiratórios, digestivos e seus gânglios linfáticos, são encontradas lesões em um
dos seguintes órgãos: baço, rins, útero, ovário, testículos, cápsulas suprarrenais, cérebro e
medula espinhal ou suas membranas. Tubérculos numerosos uniformemente distribuídos em
ambos os pulmões, também evidenciam generalização.
Parágrafo 2o – A rejeição parcial é feita nos seguintes casos:
1 – Quando partes da carcaça ou órgão apresentem lesões de tuberculose;
2 – Quando se trate de tuberculose localizada em tecidos imediatamente sob a musculatura
como a tuberculose da pleura e peritônio parietais; neste caso a condenação incidirá não
apenas sobre a membrana ou parte atingida, mas também sobre a parede torácica ou
abdominal correspondente;
3 – Quando parte da carcaça ou órgãos se contaminarem com material tuberculoso, por
contato acidental de qualquer natureza;
4 – As cabeças com lesões tuberculosas devem ser condenadas, exceto quando correspondem
a carcaças julgadas em condições de consumo e desde que na cabeça as lesões sejam
discretas, calcificadas ou encapsuladas, limitadas no máximo a dois gânglios, caso em que
51
serão consideradas em condições de esterilização pelo calor, após remoção e condenação dos
tecidos lesados;
5 – Devem ser condenados os órgãos cujos gânglios linfáticos correspondentes apresentem
lesões tuberculosas;
6 – Intestino e mesentério com lesões de tuberculose são também condenados, a menos que as
lesões sejam discretas, confinadas a gânglios linfáticos e a respectiva carcaça não tenha
sofrido qualquer restrição; nestes casos os intestinos podem ser aproveitados como envoltório
e a gordura para fusão, depois de remoção e condenação dos gânglios atingidos.
Parágrafo 3o – Após esterilização pelo calor podem ser aproveitadas as carcaças com
alterações de origem tuberculosa, desde que as lesões sejam discretas, localizadas,
calcificadas ou encapsuladas e estejam limitadas a gânglios ou gânglios e órgãos, não
havendo evidência de uma invasão recente do bacilo tuberculoso, através do sistema
circulatório e feita sempre remoção e condenação das partes atingidas. Enquadram-se neste
parágrafo os seguintes casos:
1 – Quando houver lesão de um órgão linfático cervical e de dois grupos ganglionares
viscerais de uma só cavidade orgânica, tais como: gânglios cervicais, brônquicos e
mediastinais ou então gânglios cervicais e hepáticos e mesentéricos;
2 – Nos gânglios cervicais, um único grupo de gânglios viscerais e num órgão de uma só
cavidade orgânica, tais como: gânglios cervicais e brônquicos e no pulmão ou então nos
gânglios cervicais e hepáticos e no fígado;
3 – Em dois grupos de gânglios viscerais e num órgão de uma única cavidade orgânica, tais
como: nos gânglios brônquicos e mediastinais e nos pulmões ou nos hepáticos e mesentéricos
e no fígado;
4 – Em dois grupos de gânglios viscerais da cavidade torácica e num único grupo da cavidade
abdominal ou então num só grupo de gânglios linfáticos viscerais da cavidade torácica e em
dois grupos da cavidade abdominal, tais como: gânglios brônquicos, mediastinais e hepáticos,
ou então nos brônquicos, hepáticos e mesentéricos;
5 – Nos gânglios linfáticos cervicais, num grupo de gânglios viscerais em cada cavidade
orgânica, tais como: cervicais, brônquicos e hepáticos;
6 – Nos gânglios cervicais e num grupo de gânglios viscerais em cada cavidade orgânica, com
focos discretos e perfeitamente limitados no fígado, especialmente quando se trata de suínos,
pois as lesões tuberculosas do fígado são nesta espécie consideradas primárias e de origem
alimentar.
52
Parágrafo 4o – Carcarças que apresentem lesões de caráter mais grave e em maior
número do que as assinaladas no parágrafo anterior, não se enquadrando, porém, nos casos
enumerados para condenação total, a juízo da Inspeção Federal poderão ser utilizadas para
preparo de gorduras comestíveis, desde que seja possível remover as partes lesadas.
Parágrafo 5o – O aproveitamento condicional, por esterilização pelo calor, pode ser
permitido, depois de removidas e condenadas as partes ou órgãos alterados, em todos os
demais casos. Quando não houver no estabelecimento industrial instalações apropriadas para
a esterilização pelo calor, tais casos são considerados de rejeição total.
Parágrafo 6o – Em nenhuma hipótese e seja qual for a natureza da lesão tuberculosa,
as carcaças correspondentes poderão servir para comércio internacional.
53
ANEXO B – Instrução Normativa SDA n°° 10, de 15 de janeiro de 2004
O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA , PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere
o art. 15, inciso do Decreto 4.629, de 21 de março de 2003, tendo em vista o disposto no art.
2°, da Instrução Normativa n° 2, de 10 de janeiro de 2001.
Considerando o estabelecido no Capítulo X, do Regulamento Técnico do Programa
Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal, aprovado pela
Instrução Normativa SDA n° 06, de 8 de janeiro de 2004, e o que consta do Processo n°
21000.010257/2003-09, resolve:
Art. 1° Estabelecer as normas de habilitação de médicos veterinários do setor privado
para atuação junto ao Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose Animal – PNCEBT para fins de execução de atividade previstas no Regulamento
do Programa, referentes de testes diagnósticos de brucelose e tuberculose e participação no
processo de certificação de estabelecimento de criação livres ou monitorados para brucelose e
tuberculose bovina e bubalina.
Art. 2° A solicitação de habilitação deverá ser feita pelo médico veterinário
interessado, na Unidade Local do serviço de defesa sanitária animal do(s) Estado(s) onde irá
atuar. O serviço estadual a documentação exigida e encaminhará o processo ao Chefe do
Serviço de Sanidade Animal da Delegacia Federal de Agricultura da Unidade Federativa. O
ato de habilitação será efetuado pela Delegacia Federal de Agricultura da Unidade Federativa
correspondente.
Art. 3° A habilitação terá validade dentro da(s) Unidade(s) Federativa(s) de atuação
do médico veterinário para a(s) qual (is) foi habilitado.
Art. 4° A habilitação será gratuita.
Art. 5° Para obter a habilitação o médico veterinário deverá:
I – Estar em situação regular com o Conselho Regional de Medicina Veterinária
da(s) Unidade(s) Federativa(s) de atuação;
II – Apresentar à Unidade Local do serviço de defesa sanitária animal da(s)
Unidade(s) Federativa(s) de atuação certificado registrado de participação e aprovação em
Curso de Treinamento em Métodos de Diagnóstico e Controle da Brucelose e Tuberculose
Animal e de Noções em Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis, reconhecido pelo
Departamento de Defesa Animal;
54
III – Possuir infra-estrutura e material adequados à execução dos testes de
diagnósticos para tuberculose, conforme discriminação a seguir:
Para o diagnóstico de tuberculose: pelo menos duas seringas multidose próprias para
tuberculinização de bovídeos, calibradas para 0,1ml e equipadas com agulhas apropriadas
para inoculação intradérmica, cutímetro específico para teste de tuberculinização, tuberculinas
PPD aviária e bovina, aparelho para tricotomia , ferro para marcação de animais reagentes
positivos, formulários para emissão de testados.
Art. 7° O médico veterinário habilitado deverá:
I – Cumprir o Regulamento Técnico do PNCEBT e outras normas complementares
estabelecidas pelo Departamento de Defesa Animal;
II – Fornecer informações relacionadas com esse Programa e apresentar uma via dos
atestados de realização de testes de tuberculose à Unidade Local do serviço oficial de defesa
do Município onde se encontra a propriedade atendida, com periodicidade mensal;
III – Apresentar relatório de utilização de antígenos e tuberculinas, com
periodicidade mensal, ao serviço oficial de defesa sanitária animal onde os mesmos foram
adquiridos;
IV – Registrar as informações dos testes de tuberculose em formulário próprio, que
poderá ser solicitado a qualquer momento pelo serviço oficial de defesa sanitária animal.
Art. 8° A habilitação poderá ser suspensa;
I – A pedido do serviço de defesa sanitária animal do Estado ou pela Delegacia
Federal de Agricultura da Unidade Federativa, em caso de descumprimento do Regulamento
Técnico do PNCEBT, ou de outras normas estabelecidas em legislação sanitária do Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e, nesse caso, o médico veterinário somente poderá
requerer nova habilitação depois de decorrido um ano da suspensão que, a critério do serviço
oficial, poderá ou não ser reconhecido, considerando principalmente a irregularidade
cometida;
II – Por interesse próprio, e, nesse caso, o médico veterinário poderá requerer nova
habilitação a qualquer momento, cumprindo as formalidades preventivas nesta Instrução
Normativa.

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