b - USC

Transcrição

b - USC

UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
LEANDRO DE ANDRADE HOLGADO
ESTUDO DA REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA PELA
MEMBRANA DE LÁTEX EM ASSOCIAÇÃO COM
MEDULA ÓSSEA
Bauru
2009
UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
LEANDRO DE ANDRADE HOLGADO
Estudo da Regeneração Óssea Guiada pela
membrana de látex em associação com medula
óssea
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de
Pós-graduação como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Biologia Oral, Área de Concentração:
Biologia Oral, sob orientação da Profª.
Drª. Ângela Mitie Otta Kinoshita.
Bauru
2009
Holgado, Leandro de Andrade
H731e
Estudo da regeneração óssea guiada pela
membrana de látex em associação com medula óssea
/ Leandro de Andrade Holgado -- 2009.
102f.
Orientadora: Profa. Dra. Ângela Mitie Otta
Kinoshita.
Dissertação (Mestrado em Biologia Oral) Universidade Sagrado Coração - Bauru - SP.
1. Medula óssea. 2. Regeneração Tecidual
Guiada. 3. Reparo ósseo. 4. Membranas Oclusivas. 5.
Látex. I. Kinoshita, Ângela Mitie Otta. II. Título.
Dedico este trabalho à minha família:
Aos meus amados pais, Atilano e Vilma, meus maiores
exemplos de devoção, que me ensinaram os importantes valores
da vida. De meu pai, levo a honestidade, a perseverança e a
dedicação que sempre forjaram seu caráter. De minha mãe,
carrego o amor, o carinho e a proteção, e sua grande dedicação
e renúncia incondicionais aos seus filhos. Vocês são meu porto
seguro;
À minha noiva Iza, que sempre esteve ao meu lado, mesmos
nos períodos mais turbulentos, oferecendo-me todo seu amor,
carinho e compreensão, tornando minha jornada menos penosa.
A você todo meu amor, o seu sacrifício será recompensado.
Amo-te;
Ao meu irmão Gustavo, meu amigo e companheiro de toda a
vida, pelo incentivo e apoio a mim dispensados, obrigado pela
força nos momentos de crise, nossas conversas sempre me deram
a segurança necessária para seguir em frente.
Agradecimentos Especiais
À minha orientadora Professora Doutora Ângela Kinoshita, pela
orientação, paciência e extrema doação para a realização deste
trabalho, pela amizade e confiança em mim depositada, por todas essas
qualidades que resumem a essência do verdadeiro professor;
Ao Professor Doutor Spencer Luiz Marques Payão, não só pela coorientação deste trabalho, mas pela amizade, confiança e dedicação e
por toda sua contribuição cientifica;
À coordenadora do curso de Pós Graduação em Biologia Oral da
USC, Professora Doutora Leda Aparecida Francischone, pela seriedade
de seu trabalho, pela dedicação e atenção a mim dispensadas tornando
possível a conclusão desta etapa;
Ao Professor Doutor Sérgio Augusto Catanzaro Guimarães, pelo
exemplo de pesquisador e professor, que nortearam meus passos para
a vida acadêmica, por todos os ensinamentos transmitidos, os quais
levarei por toda minha vida profissional e pelo ser humano fantástico
que tive o privilégio do convívio e de enriquecimento do meu saber.
Com toda minha admiração e respeito.
Agradecimentos
À Professora Doutora Mariza Akemi Matsumoto, pela dedicação,
atenção, carinho e pela amizade. Pelo caráter e profissionalismo que
sempre foram sua característica, por guiar meus passos desde meus
tempos de graduação, pelo exemplo de mestre e amor à pesquisa;
Aos Professores do Programa de Mestrado em Biologia Oral, pelos
conhecimentos e experiências transmitidos, pela amizade e pelo
carinho;
À Professora Doutora Patrícia Pinto Saraiva, e o Professor Doutor
João Cleber Theodóro de Andrade, pela sua grande contribuição para
minha formação acadêmica, pelos ensinamentos transmitidos do dia-adia de um professor;
Ao Professor e colega Gustavo Campos Belmonte, pela grande
ajuda para a realização deste experimento, pelo apoio e incentivo em
mim depositados;
Ao Departamento de Física e Matemática da FFCLRP-USP pelo
fornecimento dos animais e ao Professor Doutor Oswaldo Baffa por
disponibilizar o laboratório de Ressonância Magnética para realizar parte
deste trabalho;
Ao Professor Doutor Marcello Henrique Nogueira-Barbosa pelas
imagens de Tomografia Computadorizada e ao Professor Doutor Paulo
Mazzoncini de Azevedo Marques (FMRPUSP) e Eduardo Alvarez
Ribeiro (FFCLRP-USP) pelo apoio acerca dos experimentos com
imagens tomográficas e pelo software de volumetria utilizado neste
trabalho;
Ao Professor Doutor Carlos F. O. Graeff (FC-UNESP) pelo apoio
neste trabalho, no fornecimento dos animais e por disponibilizar as
membranas de látex;
Ao meu estimado amigo e companheiro de curso, Lucas Trevizani
Rasmussen, pela parceria e motivação, pela troca de experiência que
enriqueceram meus conhecimentos.
A todos os colegas do curso de Pós-graduação em Biologia Oral,
Renato Martins, Fabrício Farina, José Júlio, Eliane Tiemi, pela amizade
sincera e sólida que se criou durante este período.
Aos colegas que tornaram possível a execução deste trabalho,
Tatiana Peixoto Telles de Sousa, Cibele Ereno, Leonardo Marques,
Juliana Ferreira Floriano, Lee Chen Tzu, Gustavo Caviquioli, Rúbia
Morais e Cláudia Bighetti. A vocês todo meu carinho e respeito.
Ao responsável pelo Biotério da Universidade Sagrado Coração e
amigo, Sérgio Henrique Pereira Moura, pelo apoio e eficiência no trato
com os animais durante a realização deste trabalho;
À Maira Cristina Rondina Couto (Departamento de Histologia), e
Wilson Aparecido Orcini (Departamento de Biologia Molecular e
Morfometria), pelo suporte técnico laboratorial, profissionalismo e
colaboração com este trabalho;
Aos colegas Renato Victor de Oliveira, Leandro Soeiro Nunes
(Mestrado Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial) e Ângelo Menuci
Neto (Mestrado em Implantologia), pela oportunidade de participar de
seus experimentos que vieram a acrescentar na minha formação;
A todos os funcionários da PRPPG, em especial a Ângela Moraes,
Edson Alves dos Santos e Ricardo Luiz Penteado Borgo, que com sua
extrema dedicação e paciência tornaram mais tranqüila a minha
passagem pelo curso;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo auxílio à minha pesquisa, por meio de concessão de
bolsa de estudos;
Enfim, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho.
“Se eu fui capaz de ver mais
longe é porque estava de pé
nos ombros dos gigantes”
Isaac Newton
RESUMO
Vários métodos têm sido estudados na tentativa de minimizar o tempo de reparo
ósseo, bem como propiciar tratamentos menos invasivos a fim de reduzir os índices
de morbidade relacionados a grandes procedimentos reconstrutivos. O transplante
de células da medula óssea é uma alternativa ao enxerto ósseo autógeno, já que
essas células possuem um potencial osteogênico, por serem constituídas de célulastronco mesenquimais, as quais podem se diferenciar em células produtoras de
tecido ósseo. Este trabalho consiste da avaliação do uso da membrana oclusiva de
látex natural, derivado da Hevea brasiliensis, em associação com medula óssea
autógena como forma de estimulo à regeneração óssea. Para tanto, defeitos ósseos
cirúrgicos bilaterais com 10mm de diâmetro foram confeccionados em crânio de
coelhos. Foram utilizados 30 animais, divididos em 2 grupos, e os períodos de
estudo foram de 7 (n=6), 20 (n=12) e 60 (n=12) dias. No grupo 1, um dos defeitos foi
tratado com membrana de latex e o outro com medula óssea associada à membrana
de latex. No grupo 2, um dos defeitos foi tratado com coágulo sanguíneo e o outro
com medula óssea. Após os períodos de estudo, os animais foram eutanasiados e
os resultados definidos através de análises microscópicas, histomorfométricas,
radiográficas e volumetria por tomografia computadorizada. As fotomicrografias das
amostras relativas ao tratamento com medula e membrana 60 dias após cirurgia
demonstram um estágio mais avançado da regeneração óssea em relação aos
demais tratamentos, com a formação de uma ponte óssea recobrindo toda extensão
do defeito. As análises quantitativas de osso neoformado por histomorfometria e
volumetria por tomografia computadorizada confirmam este resultado, com
resultados estatisticamente significativos (P<0,05) utilizando o teste ANOVA seguido
do teste Tukey para comparação entre as médias.
Palavras chave: Medula óssea, Regeneração Tecidual Guiada, Membranas
Oclusivas, Látex.
ABSTRACT
Some methods have been studied as an attempt to minimize the time of bone repair,
as well as less-invasive treatments in order to reduce the morbity associated to great
reconstructive procedures. The transplant of bone marrow cells is an alternative to
the use of autogenous bone graft. These cells have osteogenic potential due to the
presence of mesenchymal stem cell that can differentiate in bone tissue cells. This
work consists of the evaluation of the treatment with natural latex membrane,
derivative of the Hevea brasiliensis, as an occlusive barrier, associated with
autogenous bone marrow as a technique for stimulus of bone regeneration. Bilateral
surgical bone defects with 10mm of diameter were made in rabbit skull. 30 animals,
divided in 2 groups were used. The periods of study were 7 (n=6), 20 (n=12) and 60
(n=12) days. In the animals of Group 1, one of the defects was treated with latex
membrane and the other with autogenous bone marrow associate to the latex
membrane. In the animals of Group 2, one of the defects was treated with blood clot
and the other with autogenous bone marrow. After the periods of study, the animals
were euthanized and the results evaluated through microscopic, histomorphometric,
radiographic and computerized tomography analysis. The photomicrografies of
samples treated with bone marrow and membrane, 60 days post surgery,
demonstrated a more advanced stage of bone regeneration in comparison to the
other treatments of this study, presenting a bone bridge covering the extension of the
defect. The quantitative analyses of newly formed bone through histomorphometry
and computerized tomography reinforce this result, with results statistically significant
(P<0.05) using ANOVA Tukey test for means comparisons.
Keywords: Bone Marrow, Guided Tissue Regeneration, Occlusive Membranes, Latex
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Estrutura molecular da borracha (a), formas das cadeias (b).
Figura 2 – Medicação utilizada para atingir e manter o plano anestésico adequado.
Figura 3 – Procedimento de tricotomia da calvária (A) e da face medial da tíbia
esquerda (B).
Figura 4 – Antissepsia da região a ser operada (A) e infiltração de anestésico local
(B).
Figura 5 – Incisão da pele (A). Exposição do periósteo (B).
Figura 6 – Incisão do periósteo (A). Exposição da calota craniana (B).
Figura 7 – Osteotomia realizada com broca trefina de 10,0mm de diâmetro (A).
Defeito bilateral confeccionado (B).
Figura 8 – Face medial da tíbia esquerda (A) Incisão cirúrgica para acesso a cortical
do osso tibial (B). Osteotomia com broca trefina de 5,0mm (C). Acesso ao canal
medular e exposição da medula óssea (D).
Figura 9 – Coleta da medula óssea (A). 5,0ml de medula óssea coletada (B).
Figura 10 - Tratamento realizado nos animais do grupo 1, lado esquerdo preenchido
por coágulo sanguíneo e uma membrana de látex cobrindo o defeito e lado direito
preenchido com medula óssea e uma membrana de látex cobrindo o defeito.
Figura 11 – Tratamento realizado nos animais do grupo 2, lado esquerdo preenchido
por coágulo sanguíneo e lado direito preenchido com medula óssea.
Figura 12 – Sutura do periósteo com fio-de-sutura reabsorvível (A). Sutura da pele
com fio-de-sutura de nylon (B).
Figura 13 – Analgésico e antimicrobiano utilizado como medicação pós-operatória.
Figura 14 – Forma padronizada para a coleta da peça do crânio do coelho (A).
Peça coletada (B). Aspecto do tecido cerebral após coleta de espécime (C).
Figura 15: Imagens axiais da calvária dos coelhos.
Figura 16 – Imagem de uma das metades da peça retirada do crânio. Período 7 dias.
Figura 17 – Imagem de uma das metades da peça retirada do crânio. Período 20
dias.
Figura 18 - Imagem de uma das metades da peça retirada do crânio. Período 60
dias.
Figura 19: Radiografias do defeito ósseo dos espécimes de 20 dias. a) Coágulo, b)
Coágulo + membrana de látex, c) Medula e d) Medula + membrana de látex.
Figura 20: Radiografias do defeito ósseo dos espécimes de 60 dias. a) Coágulo, b)
Coágulo + membrana de látex, c) Medula e d) Medula + membrana de látex.
FIGURA 21 – Fotomicrografia dos espécimes do período 7 dias – a) coágulo; b)
coágulo + membrana de látex; c) medula; d) medula + membrana de látex.
(Tricrômico de Masson; aumento original ~2x).
Figura 22 - 7 dias - Grupo coágulo sem membrana - Em a, presença predominante
de tecido conjuntivo fibroso (tc), sobrejacente a tecido nervoso (tn). Em b, destaque
para área de degeneração do tecido nervoso (setas) (H.E.; barras = a) 600µm, b)
200µm).
Figura 23 - 7 dias - Grupo coágulo com membrana - a) Subjacente ao espaço
previamente ocupado pela membrana (*) nota-se tecido de granulação (tg). Em b,
maior aumento do tecido de granulação, onde se observam numerosos leucócitos
mononucleares (H.E.; barras = a) 600µm, b) 200µm).
Figura 24 - 7 dias - Grupo medula sem membrana - Em a nota-se defeito
predominantemente preenchido por tecido adiposo amarelo (ad). Destaque de área
de osteogênese (seta) em b próxima aos adipócitos uniloculares (*) (a - H.E.; barras
= 600µm; b - Tricrômico de Masson; barras = 200µm).
Figura 25 - 7 dias - Grupo medula com membrana - Observa-se defeito preenchido
por abundante tecido adiposo amarelo (ad) em a, permeado por tecido de
granulação (tg) destacado em b (H.E.; barras = a) 500µm; b) 200µm).
Figura 26: Valor Médio e Desvio Padrão de resultados de área considerados na
Histomorfometria. Período de 7 dias, tratamento controle (coágulo).
Histomorfometria. Período de 7 dias, tratamento com coágulo + membrana.
Histomorfometria. Período de 7 dias, tratamento com medula.
Histomorfometria. Período de 7 dias, tratamento com medula + membrana látex.
Figura 30: Valor Médio e Desvio Padrão de resultados da Histomorfometria de Osso
Primário relativo ao período de 7 dias. Não há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados na comparação entre os grupos pelo teste ANOVA.
Figura 31: Valor Médio e Desvio Padrão de resultados da Histomorfometria de
Tecido Conjuntivo relativo ao período de 7 dias. Não há diferença estatisticamente
significativa entre os resultados na comparação entre os grupos pelo teste ANOVA.
Figura 32 – Fotomicrografia dos espécimes do período 20 dias – a) coágulo; b)
Figura 33 - 20 dias - Grupo coágulo sem membrana - Presença predominante de
tecido conjuntivo fibroso (tc), com áreas de osteogênese (setas longas), identificadas
pela intensa atividade osteoblástica (setas curtas) e formação de tecido ósseo
primário (op) (Tricrômico de Masson; barras = a) 600µm, b) 100µm).
Figura 34 - 20 dias - Grupo coágulo com membrana - Nota-se tecido conjuntivo
organizado no interior do defeito (tc) com áreas de formação de tecido ósseo
primário (op) (Tricrômico de Masson; barras = a) 600µm, b) 100µm).
Figura 35 - 20 dias - Grupo medula sem membrana - Nota-se tecido adiposo amarelo
preenchendo a área de defeito (ad). Eventuais trabéculas de tecido ósseo primário
são observadas (op). Em b, destacam-se os adipócitos uniloculares (*) e células em
degeneração (setas) em meio a leucócitos mononucleares (a - Tricrômico de
Masson; barra = 600µm; b - HE; barra = 200µm).
Figura 36 - 20 dias - Grupo medula com membrana - a) Preenchimento do defeito
tecido adiposo amarelo (ad) e trabéculas de tecido ósseo primário na base do
defeito (op). Em b, destacam-se os adipócitos uniloculares (*). (a - Tricrômico de
Masson; barra = 600µm; b - HE; barra = 150µm).
Histomorfometria. Período de 20 dias, tratamento com coágulo + membrana de
látex.
Histomorfometria. Período de 20 dias, tratamento com medula + membrana de látex.
Primário relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente
significativa entre os resultados na comparação entre os grupos indicados pelo teste
ANOVA. Há diferença estatisticamente significativa e entre os grupos indicados por *
pelo teste t pareado.
Secundário relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente
ANOVA.
Neoformado relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente
ANOVA. Há diferença estatisticamente significativa e entre os grupos indicados por *
pelo teste t pareado.
Neoformado relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente
ANOVA.
Figura 45 – Fotomicrografia dos espécimes do período 60 dias – a) coágulo; b)
Figura 46 - 60 dias - Grupo coágulo sem membrana - Defeito preenchido por curtas
trabéculas ósseas primárias em maturação (op), evidenciadas pelas linhas
basofílicas de reversão (setas). De permeio, tem-se tecido conjuntivo fibroso (tc) e
tecido adiposo amarelo também é observado (ad) (HE; barras = a) 600µm, b)
100µm).
Figura 47 - 60 dias - Grupo coágulo com membrana - O espaço vazio (*) representa
o espaço previamente ocupado pela membrana. Nota-se ponte de tecido ósseo
maduro (o) na base do defeito (a), apresentando células de revestimento em sua
superfície (setas) (b). (HE; barras = a) 600µm, b) 100µm).
Figura 48 - 60 dias - Grupo medula sem membrana - Em a visualiza-me área do
defeito em menor aumento, preenchida por tecido adiposo (ad) e curtas trabéculas
ósseas (o). Em b, destacam-se os adipócitos uniloculares (*). De permeio, notam-se
adipócitos multiloculares (setas), em c. (a, b - HE; barra = a) 300µm, b) 100µm; c Tricrômico de Masson; barra = 100µm).
Figura 49 - 60 dias - Grupo medula com membrana – a) Defeito preenchido por
tecido adiposo (ad) e tecido ósseo maduro na base do defeito (o). Em b, observa-se
tecido adiposo unilocular (*) permeado por adipócitos multiloculares (setas). Em c,
destacam-se os adipócitos multiloculares (setas). (a - HE; barra = 600µm; b, c Tricrômico de Masson; barra = 100µm).
Histomorfometria. Período de 60 dias, grupo controle (coágulo).
Histomorfometria. Período de 60 dias, tratamento com coágulo + membrana látex.
Primário relativo ao período de 60 dias. Não há diferença estatisticamente
significativa entre os resultados.
Secundário relativo ao período de 60 dias. Há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados com P<0.05 na comparação entre os grupos indicados pelo teste
ANOVA e entre os grupos indicados por * pelo teste t pareado.
Neoformado relativo ao período de 60 dias. Há diferença estatisticamente
significativa entre os resultados com P<0.05 na comparação entre os grupos
indicados pelo teste ANOVA e entre os grupos indicados por * e por ** pelo teste t
pareado.
Figura 57: Valor Médio e Desvio Padrão de resultados da Histomorfometria de
Tecido Conjuntivo relativo ao período de 60 dias. Não há diferença estatisticamente
significativa entre os resultados.
Figura 58: Histomorfometria do Osso Primário em função dos tratamentos e do
tempo. Há diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA seguido de
Tukey entre os grupos indicados por * e **.
Figura 59: Histomorfometria do Osso Secundário em função dos tratamentos e do
Tukey entre os grupos indicados por * , ** e #.
Figura 60: Histomorfometria do Osso Neoformado em função dos tratamentos e do
Tukey entre os grupos indicados pelos traços horizontais e por *.
Figura 61: Histomorfometria do Tecido Conjuntivo em função dos tratamentos e do
tempo. Não há diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA.
Figura 62: Histomorfometria do tecido adiposo de acordo com o tratamento e o
período de observação. Não há diferença estatisticamente significativa entre os
resultados, pelo teste ANOVA.
Figura 63: Média e Desvio Padrão da Volumetria por TC. Há diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos indicados pelo teste ANOVA e Tukey
(P<0.05) e pelo teste t pareado entre os grupos indicados por *.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de espécimes por tratamento incluídos na análise dos resultados
e seus respectivos períodos de estudo.
Tabela 2: Valores médios e desvio padrão da área de osso primário, osso
secundário, osso neoformado e tecido conjuntivo, obtidos por histomorfometria,
referente ao período de 7 dias e os diferentes tratamentos realizados.
Tabela 5: Valores médios e desvio padrão da área relativa ao tecido adiposo de
acordo com o tratamento e o período de estudo.
Tabela 6: Valor médio de desvio padrão dos resultados do volume ósseo relativo à
região do centro do defeito ósseo obtido por TC, considerando um valor de 100UH
(unidade Hounsfield).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
e-PTFE
Politetrafluoretileno expandido
HA
Hidroxiapatita
rpm
Rotações por minuto
mm
Milímetro
µm
Micrômetro
CEP
Comitê de Ética e Pesquisa
USC
Universidade do Sagrado Coração
kg
Kilograma
USP
Universidade de São Paulo
UNESP
Universidade Estadual Paulista
IM
Intramuscular
mg
Miligrama
PVPI
Polivinilpiloridona-iodo
ml
Mililitro
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
IPEN
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares
RSE
Ressonância do Spin Eletrônico
Gy
Gray
HE
Hematoxilina e Eosina
KGy
Kilo Gray
KVp
Kilo Volt
mA
Miliampere
mAs
Miliampere por segundo
UV
Ultra-Violeta
Radiação γ
Radiação Gama
DICOM
Digital Imaging Communications in Medicine
CCIFM
Centro de Ciências de Imagem e Física Médica
HCRP
Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto
FMRP
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
mm2
Milímetro quadrado
mW
Miliwatts
UH
Unidades Hounsfield
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………………. 22
2. REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………………
25
2.1. Biologia do Tecido Ósseo……………………………………………………
25
2.2. Regeneração Tecidual guiada………………………………………………
26
2.3. Terapia Celular no Processo de Regeneração Óssea...............................
30
3. OBJETIVOS......................................................................................................
36
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 37
4.1. Local e Grupos de Estudo..........................................................................
37
4.2. Delineamento Experimental.......................................................................
37
4.3. Procedimentos Cirúrgicos..........................................................................
38
4.3.1. Anestesia e Assepsia........................................................................
38
4.3.2. Técnica Cirúrgica………………………………………………………
40
4.4. Preparo das Peças e Forma de Análises dos Resultados.........................
46
4.4.1. Análise Macroscópica.......................................................................
47
4.4.2. Análise das Peças por Imagem Radiográficas.................................. 48
4.4.3. Volumetria Por Tomografia Computadorizada..................................
48
4.4.4. Análise Microscópica......................................................................... 50
4.4.5. Histomorfometria...............................................................................
51
5. RESULTADOS.................................................................................................. 52
5.1. Aspecto clínico...........................................................................................
52
5.2. Análise Macroscópica................................................................................. 52
5.3. Análise Radiográfica................................................................................... 53
5.4. Análise Microscópica.................................................................................. 54
5.4.1. Período de 7 dias..............................................................................
55
5.4.2. Período de 20 dias............................................................................
62
5.4.3. Período de 60 dias............................................................................
70
5.5. Análise da volumetria por tomografia computadorizada............................
83
6. DISCUSSÃO.....................................................................................................
85
7. CONCLUSÃO...................................................................................................
93
94
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................
102
ANEXO Parecer do Comitê de Ética......................................................................
22
1. INTRODUÇÃO
Os ossos crescem, são remodelados, se mantém ativos durante toda vida do
organismo e exibem uma forte capacidade de regenerar-se completamente.
Entretanto, devido a sua estrutura calcificada rígida, o osso tem requisitos
específicos que devem ser respeitados para a sua regeneração, em decorrência à
baixa perfusão sanguínea. Quando lesados, uma nova formação óssea é
criticamente dependente da estabilidade de um coágulo sanguíneo adequado, para
uma nova vascularização, bons níveis de oxigenação local e estabilização mecânica
para a formação óssea (Carranza et al, 2004).
Os tratamentos dos defeitos ósseos podem variar, dependendo de sua
localização, extensão e à que se destina a área reparada. Para tanto, pode-se
utilizar desde o próprio coágulo, formado a partir do sangramento local, até os
enxertos ósseos autógenos, alógenos, xenógenos e os biomateriais sintéticos, entre
tantas outras opções.
Os enxertos autógenos são considerados “padrão ouro” para tratamento de
defeitos ósseos devido ao risco diminuído de resposta imune adversa, da sua
capacidade osteoindutora que irá fornecer células funcionais de caráter osteogênico
que irá propiciar a neoformação óssea e também uma propriedade osteocondutora
que proporcionará uma estrutura em forma de um arcabouço que favorece o
processo de osteogênese (Burchardt, 1983; Goldberg, 1987; Helm, 2001; Vaccaro,
2002; Hsiong e Mooney, 2006; Jones et al, 2007). Todavia, o uso de enxertos
ósseos autógenos requer um leito doador cirúrgico maior, anestesia geral
prolongada em alguns casos e promove um aumento da morbidade, ausência de
tecido ósseo viável disponível para transplantes autógenos, fator muito comum em
23
criancás (Lerouxel, 2006; Hsiong, 2006). Os aloenxertos envolvem a coleta e
processamento do osso de cadáveres, transplantados mais tarde nos pacientes. Os
xenoenxertos, de origem bovina ou suína também são usados para defeitos ósseos,
porém com um potencial para transmissão de doenças (Hsiong, 2006). Os
biomateriais sintéticos, ao longo dos anos tem sido largamente utilizados como
substitutos ósseos. Apesar do sucesso obtido em alguns procedimentos de enxertia,
a falta da capacidade osteogênica e a baixa velocidade de degradação são fatores
freqüentemente relacionados à falha na cicatrização de grandes defeitos (Lerouxel
et al, 2006; Kitchel, 2006; Wang et al, 2007; Gan et al, 2008; Fellah et al, 2008).
Alguns autores têm considerado o transplante de células da medula óssea
uma alternativa ao enxerto ósseo autógeno, já que essas células possuem um
potencial osteogênico diminuindo a morbidade da área doadora. As células
estromais da medula óssea possuem a capacidade de se diferenciar em diversos
tecidos mesodérmicos in vitro e também tem o potencial de formar tipos de tecidos
mesodérmicos maduros in vivo após transplante com uma matriz apropriada
(Kuznetsov, 2008). Recentemente vários pesquisadores tem utilizado culturas de
células tronco, e células estromais derivadas da medula óssea associadas a algum
arcabouço no processo de reparo de defeitos ósseos. (Knoch et al.,2005; Wang et
al., 2007; Yuan et al., 2007; Kuznetsov et al., 2008;).
Embora as células-tronco da medula óssea sejam abundantes por todo o
tecido esquelético, algum dano ósseo pode acarretar uma falha do processo de
reparo espontâneo. Por essa razão um eficiente sistema de transplante que inclui
um carreador com propriedades osteocundutivas e um microambiente indutivo pode
ser uma ferramenta ideal do processo natural de reparo tecidual (Ciapetti et al.,
2006).
24
Um grande inconveniente no processo de regeneração de defeitos ósseos,
onde se visa à formação de uma ponte óssea que viria a recobrir esse defeito, é a
invaginação de tecido de caráter não osteogênico. Para contornar tais situações, o
uso de membranas que funcionam como barreira oclusiva, tem fornecido ótimos
resultados. Alguns estudos já apontaram a eficácia e os benefícios atingidos quando
utilizaram métodos de regeneração óssea guiada no tratamento de defeitos ósseos
com membrana não-absorvível de politetrafluoretileno expandida (e-PTFE) (Dahlin et
al, 1994), e comprovaram sua eficiência quando a compararam com duas outras
membranas absorvíveis (Dupoirieux et al (2001).
Conhecendo-se a capacidade osteogênica da medula óssea autógena e as
vantagens da regeneração óssea guiada, o presente estudo objetivou analisar o
processo de reparo de defeitos ósseos, preenchidos exclusivamente com medula
óssea e recobertos por membrana de látex, a fim de se observar o efeito deste
tratamento no processo de cicatrização óssea.
25
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Biologia do Tecido Ósseo
Os ossos, tendo seu principal constituinte o tecido ósseo, apresenta algumas
particularidades intrínsecas ao seu metabolismo que permite com que o mesmo
cresça, se mantenha ativo durante toda a vida e se remodele com o objetivo de
manter o seu volume e a homeostasia do cálcio através do tempo (Menuci Neto,
2009). É constituído por uma parte inorgânica dotada principalmente de cristais de
hidroxiapatita (HÁ), e uma parte orgânica composta de vários tipos de proteínas
extracelulares e colágeno do tipo I e também por células responsáveis pela sua
manutenção, síntese e reabsorção.
O tecido ósseo apresenta um excelente comportamento mecânico, revelando
um potencial único para o reparo. O osso está apto a cicatrizar fraturas ou defeitos
locais com tecido regenerado, ou regenerar-se com igual organização estrutural, e
em muitos casos sem deixar cicatrizes. Apesar de o tecido ósseo apresentar um
espantoso potencial de regeneração, restabelecendo perfeitamente sua estrutura
original e propriedades mecânicas, alguns fatores podem impedir seu reparo como a
deficiência de vascularização, instabilidade mecânica, grandes defeitos e a
competição tecidual de grande atividade proliferativa, principalmente pelo tecido
conjuntivo e tecido epitelial (Schenk, 1994).
A remodelação óssea é a fase final da regeneração do osso, que “esculpe” o
calo ósseo formado reparando a forma e função, produzindo uma estrutura biológica
e mecanicamente indistinguível do tecido antes de ser lesado, sendo que o processo
26
de remodelação envolve uma infinidade de elementos celulares e moleculares
(Hollinger et al, 2008).
De acordo com os trabalhos de Murray e Roschalau (1957), uma cavidade
óssea, com fonte de osteoblastos e um suprimento sanguíneo adequado, quando
isoladas dos tecidos moles adjacentes, a mesma pode ser preenchida por osso,
contudo se o espaço não for protegido, pode ocorrer o preenchimento por tecido
conjuntivo fibroso.
Um importante obstáculo ao sucesso da regeneração óssea e a criação de
um novo osso é a rápida formação de tecido sem caráter osteogênico, que pode ser
de origem conjuntiva ou epitelial. A invaginação de tecido mole dentro de uma
cavidade óssea pode atrapalhar ou impedir totalmente a osteogênese em um defeito
ou uma área lesionada. Numerosos métodos são utilizados na tentativa de resolver
esse problema. Um dos métodos mais comuns inclui a coleta e a implantação de um
enxerto ósseo autógeno, contudo o mesmo é um tratamento dispendioso, que
requer hospitalização e um potencial risco de morbidade a zona doadora (Dahlin,
1994). Algumas importantes complicações foram citadas em diversos trabalhos
como neuropraxia do nervo cutâneo femoral lateral, sensibilidade óssea e de
cicatrização (Baqain et al, 2009), dor persistente, infecção superficial, dormência,
cicatriz hipertrófica (Swan e Goodacre, 2006) e conforme descrito por De Riu (2008),
um incomum caso de abscesso ilíaco.
2.2. Regeneração Tecidual Guiada
Para contornar tais situações, estratégias de engenharia tecidual guiada tem
sido empregadas. O uso de membranas oclusivas e semi-oclusivas irá proporcionar
27
uma proteção, pelo preenchimento do espaço subjacente por um coágulo sanguíneo
e subsequentemente neoformação óssea (Hardwick, 1994).
As membranas são materiais que servem para proteger o coágulo sanguíneo
e prevenir as células do tecido mole (epitélio e conjuntivo) de migrarem para o
interior do defeito ósseo. Em um modelo experimental realizado em ratos, onde
defeitos ósseos realizados no ângulo da mandíbula dos animais que envolveram as
duas faces no osso mandibular foi utilizado a membrana de e-PTFE para o
recobrimento desses defeitos, sendo que ocorreu a completa regeneração óssea
dos osso mandibular em 12 dos 13 animais envolvidos no estudo (Dahlin et al,
1994).
Dupoirieux et al (2001), em um estudo comparativo utilizou a membrana de
e-PTFE e duas outras membranas reabsorvíveis (poliglactina 910 e uma membrana
hidrolisada de casca de ovo de ave) em termos de .biocompatibilidade, degradação
e a capacidade de aumentar a regeneração óssea. Para tanto foram utilizados 30
ratos divididos em três grupos de 10 animais, onde cada grupo recebeu um tipo de
membrana diferente na superfície interna e externa envolvendo um defeito de 6 mm
de diâmetro por 60 dias. O autor observou que apenas a membrana não absorvível
de e-PTFE exibiu resultados favoráveis no estudo.
Catanzaro (2002) demonstrou que a técnica de regeneração óssea guiada,
obteve sucesso em vários modelos experimentais e clínicos, e que o uso de uma
membrana como barreira oclusiva poderia prevenir a invasão de células indesejáveis
no defeito ósseo durante a reparação, permitindo a repopulação desta área por
células específicas.
28
As propriedades ideais para as membranas são 1) biocompatibilidade, 2)
manutenção do espaço, 3) oclusidade celular, 4) boas propriedades de manuseio e
5) capacidade de absorção (Carranza et al, 2004).
A membrana de látex tem sua matéria prima proveniente da seringueira
Hevea brasiliensis e forma um sistema coloidal polifásico e polidisperso. Depois de
centrifugado, o látex pode ser representado como sendo formado por três
componentes fundamentais (BERNARDES et al, 2000).
1. Fase borracha - hidrocarboneto isoprênico (37%). Apresenta coloração
branca e é formada quase exclusivamente de borracha.
2. Soro (48%). Fração intermediária em forma de líquido é o meio dispersivo
do sistema coloidal látex e contém proteínas e sais dissolvidos em água.
3. Fração de fundo (depósito) (15%)
.Apresenta coloração amarela e é
constituída de componentes não borracha: os lutóides (proteínas ,
fosfolipídios e sais minerais) e as partículas Frey-Wyssling (constituídas
de carotenóides e lipídios conferindo, por isso, à borracha, a coloração
amarelada).
(a)
29
(b)
Figura 1 – Estrutura molecular da borracha (a), formas das cadeias (b).
O processo de separação destas partes se dá através da ação de uma força
centrífuga elevada (40.000 rpm).
O látex pode ser considerado um composto perecível devido à composição do
soro que contém carboidratos, proteínas, sais minerais e microorganismos, sendo
que ele se coagula espontaneamente de 8 a 10 horas após a colheita, separando a
borracha em forma de coágulo.
O látex natural no primeiro instante que se escoa da seringueira é levemente
alcalino. Por efeito de reações químicas e, sobretudo bioquímicas, vai se
acidificando rapidamente, em contato com o ar.
O conteúdo da borracha seca é variável, notando-se que as primeiras
sangrias, em árvores virgens ou em árvores após um repouso prolongado,
produzem menor quantidade, porém em maior concentração de borracha. Na
medida em que as sangrias se sucedem, a quantidade aumenta e o conteúdo de
borracha decresce, até certo limite. O conteúdo de borracha seca também decresce
após períodos chuvosos ou em seguida aplicação de estimulantes. Ereno (2007),
em um estudo com coelhos New Zealand utilizou a membrana de látex natural como
membrana oclusiva na regeneração óssea guiada em defeitos críticos realizados na
30
calvária dos animais, percebeu que a mesma atuou efetivamente como barreira
oclusiva em processo de regeneração tecidual guiada.
Em outro experimento utilizando a membrana natural de látex como cobertura
e auxílio da fusão intervertebral lombar, oito coelhos New Zealand foram submetidos
a procedimento cirúrgico de artrodese póstero-lateral em ambos os lados do
processo transverso. Um dos lados recebeu enxerto de crista ilíaca e sobre este
uma cobertura da membrana de látex, já o outro lado recebeu apenas o enxerto e foi
considerado o controle por oito semanas. O autor evidenciou que a membrana de
látex natural associada ao enxerto de osso autógeno, mostrou resultados superiores
de tecido ósseo neoformado quando comparado com o lado controle (Oliveira,
2008).
2.3. Terapia Celular no Processo de Regeneração Óssea
O processo de reparo e regeneração do tecido ósseo é um fenômeno que se
encontra muito bem estabelecido na literatura (Buser, Dahlin e Schenk, 1994).
Procedimentos realizados para propiciar essa regeneração tem sido adotados
devido aos altos índices de sucesso, como os enxertos ósseos e os biomateriais
substitutos ósseos. Contudo, uma nova modalidade de terapia celular tem sido
sugerida como uma alternativa ao enxerto tecidual, devido a sua relativa facilidade
de coleta e cultura in vitro, demonstrada por estudos experimentais utilizando células
derivadas da medula óssea, comprovando sua eficácia (Vuola et al. 1995; Lecoeur e
Ouhayoun, 1997; Von Knoch et al. 2005; Ciapetti et al. 2006; Wang et al. 2006;
Bolland et al. 2008; Dégano et al. 2008).
31
As células estromais da medula óssea tem sua relevância clinica por
apresentarem apropriada quantidade de células pluripotentes, mesenquimais e
progenitoras, com capacidade de se diferenciarem em osteoblastos, adipócitos,
fibroblastos e miócitos (Aubin, 1998).
As células-tronco derivadas da medula óssea tem sido extensivamente
utilizadas em transplantes de medula óssea para o tratamento de inúmeras doenças
hematológicas e possivelmente fatais, como por exemplo alguns tipos de leucemias,
linfomas, anemia aplásica severa entre outras (Thomas, 1999).
Algumas características particulares tornaram a medula óssea um tecido ideal
para o estudo das células-tronco, como a sua fácil acessibilidade, quantidade
suficiente de tecido, resposta proliferativa, além da experiência dos transplantes de
medula óssea no tratamento de cânceres hematológicos (Tögel e Westenfelder,
2007).
Alguns autores demonstraram que as células-tronco derivadas da medula
óssea podem contribuir para o reparo e regeneração de muitos tecidos, inclusive de
ossos lesados (De Kork et al., 2003; Jafarian et al., 2008; Khojasteh et al., 2008). A
diferenciação das células-tronco derivadas da medula óssea em osso se deve em
muito ao fato de a medula óssea, particularmente em humanos, conter uma
complexa rede de espículas ósseas derivadas do osso trabecular muito similar ao
osso em processo contínuo de remodelação, e também por conter precursores de
osteoblastos derivados do osso trabecular ou dentro do osso propriamente dito
(Prockop, 1997).
Basicamente as células-tronco da medula óssea se dividem em células-tronco
hematopoéticas, que promovem a diferenciação de todas as linhagens de células
sanguíneas, e as células-tronco mesenquimais, representam uma população celular
32
muito menor, porém são expansíveis em culturas celulares e multipontentes, ou
seja, capazes de se diferenciarem em diversos tipos celulares, inclusive
osteoblastos (Wu et al. 2007).
Em relação ao processo de regeneração do tecido ósseo, alguns trabalhos
demonstraram resultados interessantes utilizando células derivadas da medula
óssea.
Niedźwiedzki et al (1993), em um estudo experimental, visavam observar a
aceleração do processo de cicatrização do tecido ósseo por meio de transplantes de
células estromais da medula óssea em defeitos realizados no osso rádio de coelhos,
e constataram a redução do tempo de reparo ósseo quando comparado com
defeitos controle que receberam apenas solução salina.
Em um estudo clínico Velardi et al (2006) testaram a capacidade de células
mononucleares derivadas da medula óssea autógena em aumentar a taxa de
mineralização da osteogênese em quatro crianças. Essas crianças apresentavam
defeitos nos ossos do crânio de origem traumática ou pós-cirúrgicas, que foram
preenchidos com um arcabouço de colágeno mineralizado. Foi inseminado nesse
arcabouço a medula óssea coletada previamente da crista ilíaca resultando em uma
atividade osteogênica mais rápida que o processo de reabsorção do arcabouço.
Kitchel (2006) embebeu uma matriz de colágeno mineralizada em medula
óssea e solução salina e utilizou em procedimento cirúrgico para a fusão
intervertebral. O autor observou que ocorreu a fusão espinhal semelhante ao
procedimento realizado com enxerto ósseo autógeno.
Quanto ao potencial de aplicações clínicas, os procedimentos reconstrutivos
de defeitos ósseos, sejam por materiais de enxertia ou compostos de medula
autógena, é frequentemente utilizado em procedimentos ortopédicos e cirurgias
33
orais. Contudo o material de exertia ideal deve preencher três funções fisiológicas:
primeiro, fornecer uma fonte de células formadoras de osso; segundo, induzir as
células a formarem osso e finalmente fornecer um arcabouço para a deposição do
novo osso (Krebsbach, 1999).
Os biomateriais sintéticos, ao longo dos anos tem sido largamente utilizados
como substitutos ósseos. O reparo e a regeneração óssea tem atingido sucesso por
meio de vários procedimentos de enxertia óssea utilizando biomateriais e substitutos
ósseos (Friedlaender e Mankin, 1984; Springfield, 1987; Roux, 1988; Gatti, 1990;
Thaller, 1993; Lerouxel et al, 2006; Kitchel, 2006; Wang et al, 2007; Gan et al, 2008;
Fellah et al, 2008). Materiais sintéticos para preenchimento ósseo, como a cerâmica
de cálcio fosfato tem se mostrado eficiente em diversas indicações clínicas (Daculsi,
2003; Fellah, 2006). Apesar de esses substitutos ósseos serem osteocondutores,
frequentemente falta a capacidade osteogênica para contribuir com a cicatrização
óssea em grandes defeitos e são lentamente degradados pelo organismo
(Habibovic, 2004).
Os substitutos ósseos se tornaram materiais dinâmicos quando passaram a
ser associados com células. A literatura pertinente aponta diversos estudos
associando arcabouços sintéticos e células derivadas da medula óssea. Yuan et al.
(2007) em um modelo experimental realizado em cães, utilizou um arcabouço de βtricálcio fosfato onde células-tronco derivadas da medula óssea, previamente
coletadas da crista ilíaca dos animais e cultivadas, foram injetadas no mesmo para o
preenchimento de defeitos críticos segmentares realizados no corpo da mandíbula
dos animais, mostrando-se eficiente em reparar amplos defeitos em mamíferos.
Não somente os biomateriais do tipo arcabouço, mas também os particulados
se mostram efetivos quando misturados às células derivadas da medula óssea,
34
como demonstrado por Kuznetsov et al. (2008) ao realizarem defeitos bilaterais em
mandíbulas de cães, comparando o uso de hidroxiapatita/tricálcio fosfato
particulados com uma mistura de hidroxiapatita/tricálcio fosfato e células derivadas
da medula óssea para o aumento de tecido ósseo em modelo experimental de
grandes animais.
Min et al (2007), utilizou-se de uma modalidade diferente de regeneração
óssea guiada, lançando mão de uma espécie de casquete de titânio, onde o mesmo
realizou um defeito cirúrgico no crânio de coelhos New Zealand com o auxílio de
uma broca trefina de 8 mm de diâmetro, confeccionando apenas uma canaleta no
osso parietal do animal bilateralmente, onde pode ser acoplado firmemente o
casquete de titânio que apresentava uma altura de 4mm, um diâmetro de 8 mm e
uma espessura de 0,2 mm. Dentro do espaço demarcado com a broca trefina,
destinado a ficar dentro do casquete de titânio foram realizadas nove perfurações na
cortical óssea com uma broca número 2, induzindo o sangramento proveniente da
medula óssea sendo esse o lado experimental e apenas a confecção da canaleta
tornado-se o lado controle. O autor pode observar que em ambos os lados ocorreu
neoformação óssea praticamente preenchendo o espaço interno do casquete de
titânio, sendo que o lado que ocorreu o preenchimento pelo sangue proveniente da
medula óssea apresentou um aumento ósseo mais significativo que o lado em que
não houve a penetração da medula óssea.
Em uma metodologia semelhante, Tamura et al (2005), avaliou o aumento
ósseo usando regeneração óssea guiada tridimensionalmente utilizando uma análise
tomográfica computadorizada de microfoco tridimensional que permite avaliar
detalhadamente estruturas sob uma resolução de 4µm.
35
A fim de avaliar a angiogênese em osso recém formado, Yamada et al (2008),
também utilizando casquetes de titânio em canaletas de 8 mm de diâmetro
comparou a preenchimento do espaço interno do casquete com sangue proveniente
da medula óssea, e a associação do sangue medular com β-tricálcio fosfato
granulado por um período experimental de 1 mês. Após o sacrifício dos animais,
todo o sangue foi removido, e foi realizado a injeção de um composto vermelho que
após a sua polimerização, formou um molde vascular tridimensional, sendo possível
avaliar a formação de novos vasos sanguíneos.
36
3. OBJETIVOS
• Estudar o efeito da medula óssea como fonte de estímulo à regeneração
óssea, quando associada à membrana oclusiva de látex;
• Avaliar o volume ósseo formado na área do defeito ósseo com auxílio de
imagens por tomografia computadorizada e o uso do software desenvolvido
pelo CCIFM do HCRP – USP;
• Realizar a histomorfometria dos cortes histológicos e determinar a proporção
entre as áreas correspondentes a tecido ósseo imaturo, tecido ósseo maduro
e tecido conjuntivo osteogênico.
37
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Local e Grupos de Estudo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade
Sagrado Coração, segundo protocolo número CEP/USC 164/2008, na data de 21 de
Novembro de 2008 (Anexo 1).
Foram utilizados 30 coelhos brancos adultos da raça New Zealand, com peso
médio de 3 kg, idade média entre cinco e seis meses mantidos durante todo o
período experimental em boas condições ambientais de alimentação, temperatura,
higiene e iluminação e em cativeiros individuais. Os coelhos foram doados pelo
Biotério Geral da USP de Ribeirão Preto e Unesp de Botucatu.
Os animais foram divididos em 2 grupos de 15 animais cada, onde foram
realizados defeitos ósseos bilaterais na calota craniana de cada animal com 10 mm
de diâmetro, e cada grupo recebeu um tratamento diferente.
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados no Biotério da Universidade
Sagrado Coração, na cidade de Bauru, São Paulo.
4.2. Delineamento Experimental
Os 30 animais foram submetidos a procedimento cirúrgico de craniotomia sob
anestesia geral para a confecção de defeitos cirúrgicos a serem tratados da seguinte
forma:
Tratamento A – o defeito foi preenchido por medula óssea;
38
Tratamento B – o defeito recebeu uma membrana de látex recobrindo o defeito com
coágulo sanguíneo internamente.
Tratamento C – o defeito recebeu uma membrana de látex, semelhante ao defeito B,
porém recebeu enxerto de medula óssea preenchendo o defeito ósseo;
Tratamento D – o defeito foi apenas preenchido por coágulo sanguíneo (controle).
A divisão dos grupos foi da seguinte maneira:
Grupo 1: Tratamento B e C;
Grupo 2: Tratamento A e D;
Os tratamentos B e D foram realizados nos defeitos cirúrgicos do lado direito
de cada animal, e os tratamentos A e C foram realizados nos defeitos cirúrgicos do
lado esquerdo de cada animal.
Os animais foram observados pelos períodos de 7, 20 e 60 dias. Para o
período de 7 dias foram utilizados 3 animais por grupo e para os períodos de 20 e 60
dias foram utilizados 6 animais por grupo.Decorrido este período, os animais foram
eutanasiados através de dose letal de anestésico, e os espécimes foram coletados
para análise macroscópica (exame radiográfico e tomográfico) e microscópica
(histomorfometria).
4.3. Procedimentos Cirúrgicos
4.3.1 Anestesia e Assepsia
Para a realização do procedimento cirúrgico, os animais foram submetidos à
anestesia geral com administração pré-anestésica de relaxante muscular por via
intramuscular (IM) de cloridrato de xilazina (Anasedan – Vetbrands, Jacareí - SP)
39
10,0mg/kg de peso corpóreo, seguido pela administração intramuscular de
anestésico geral de cloridrato de Ketamina (Dopalen – Vetbrands, Jacareí - SP)
50,0mg/kg de peso corpóreo (FIGURA 2).
Figura 2 – Medicação utilizada para atingir e manter o plano anestésico adequado.
Após o início de ação da anestesia foram realizados os procedimentos de
tricotomia da calota craniana e da porção proximal da face medial da tíbia esquerda
(FIGURA 3) do grupo de animais em que foi utilizado enxerto de medula óssea
autógena, e assepsia com gaze embebida em solução tópica de polivinilpiloridonaiodo (PVPI)a 1% (Povidine tópico, Johnson & Johnson, São Paulo, SP), montagem
de campos cirúrgicos estéreis e infiltração com anestésico local cloridrato de
mepivacaína a 2% associado a vasoconstrictor a base de epinefrina 1:100.000
(Mepiadre, DFL, Rio de Janeiro, RJ) na região a ser operada (FIGURA 4).
40
A
B
Figura 3 – Procedimento de tricotomia da calvária (A) e da face medial da tíbia esquerda (B).
A
B
Figura 4 – Antissepsia da região a ser operada (A) e infiltração de anestésico local (B).
4.3.2. Técnica Cirúrgica
O animal foi posicionado em decúbito ventral sob uma mesa cirúrgica, isolada
com campos cirúrgicos estéreis, a área a ser operada foi isolada pelo uso de
campos cirúrgicos estéreis, realizou-se uma incisão na pele no plano sagital desde a
região occipital até a região frontonasal de aproximadamente 4,0 cm e o tecido
divulsionado com tesoura romba (FIGURA 5), logo após o periósteo foi incisado e
descolado com o uso de um destaca-periósteo e exposto a calota craniana (FIGURA
6).
41
A
B
Figura 5 – Incisão da pele (A). Exposição do periósteo (B).
A
B
Figura 6 – Incisão do periósteo (A). Exposição da calota craniana (B).
Com o uso de uma broca trefina (Neodent, Brasil), montada em peça reta em
motor elétrico (Beltec LB-100, Araraquara – SP) a 30.000 rpm, foi realizado um
defeito ósseo circular de 10,0mm de diâmetro em ambos os lados da região frontoparietal sob abundante irrigação com soro fisiológico estéril a 0,9%, tomando o
cuidado para não lesar a membrana dura-máter. O defeito bilateral permaneceu
separado através da sutura sagital (FIGURA 7). Após a confecção dos defeitos
cirúrgicos, procedeu-se ao tratamento planejado para aquele determinado animal.
42
A
B
Figura 7 – Osteotomia realizada com broca trefina de 10,0mm de diâmetro (A). Defeito
bilateral confeccionado (B).
Para a coleta da medula óssea, foi realizada uma incisão na pele na face
lateral da porção distal da tíbia esquerda do animal e exposição da musculatura e
tendão, e divulsionados com a utilização de um destaca-periósteo para exposição da
superfície óssea. Logo após realizou-se a osteotomia para a remoção da porção
cortical do osso tibial, dando acesso à região medular para a coleta da medula
óssea (FIGURA 8). Com o auxílio de uma seringa descartável de 10,0ml e uma
agulha descartável de calibre 30 X 8, foram coletados 0,5ml de medula óssea,
suficiente para o total preenchimento do defeito ósseo. O volume foi padronizado
para todos os animais (FIGURA 9). Paralelamente, o procedimento referente a
estimativa celular foi realizado a partir do protocolo descrito no Association of
Genetic Technologists (AGT), com modificações (Barck et al, 1997). O material foi
centrifugado por 8 minutos a 1000 rpm, a fase superior mais a interface (soro e
células nucleadas, “buff coat”) foram aspiradas com pipeta estéril, anotado o volume
obtido sendo o mesmo transferido para um tubo estéril. A partir de diluição com
líquido de turk, foi realizada a contagem das células em câmara de neubauer e o
cálculo da estimativa celular de acordo com a fórmula: X x 20 x 103 x Y, onde X
equivale ao número de células nucleadas contadas em 10 quadrantes; Y, volume de
43
células nucleadas, 20 é o fator de diluição e 103 fator de correção de mm3 por mL. A
estimativa quanto a celularidade foi de aproximadamente 3,0 x 107.
A
B
C
D
Figura 8 – Face medial da tíbia esquerda (A) Incisão cirúrgica para acesso a cortical do osso
tibial (B). Osteotomia com broca trefina de 5,0mm (C). Acesso ao canal medular e exposição
da medula óssea (D).
A
B
Figura 9 – Coleta da medula óssea (A). 5,0ml de medula óssea coletada (B).
Nos animais do grupo 1, depois de realizada a craniotomia, o defeito ósseo
cirúrgico que recebeu o tratamento B foi preenchido por coágulo sanguíneo, e logo
44
em seguida fixado uma membrana oclusiva de látex sobre o mesmo. Já os defeitos
cirúrgicos que receberam o tratamento C, foi depositada medula óssea interposta
entre a membrana dura-máter, e a membrana oclusiva de látex (FIGURA 10).
Figura 10 - Tratamento realizado nos animais do grupo 1, lado esquerdo preenchido por
coágulo sanguíneo e uma membrana de látex cobrindo o defeito e lado direito preenchido
com medula óssea e uma membrana de látex cobrindo o defeito.
Já os animais do grupo 2, após a craniotomia o defeito ósseo cirúrgico que
recebeu o tratamento D foi preenchido somente pelo coágulo sanguíneo, ao passo
que os defeitos cirúrgicos que receberam o tratamento A, foram preenchidos pela
medula óssea (FIGURA 11).
45
Figura 11 – Tratamento realizado nos animais do grupo 2, lado esquerdo preenchido por
coágulo sanguíneo e lado direito preenchido com medula óssea.
Efetivado os tratamentos, realizou-se a sutura por planos, primeiramente do
periósteo sobre o defeito com fio de sutura reabsorvível poliglactina 910 4-0 (Vicryl,
Johnson & Johnson, São José dos Campos, SP), seguido pela sutura da pele com
fio de nylon 4-0 (Shalon, São Luiz de Montes Belos – GO), tanto da calota craniana
quanto da tíbia (FIGURA 12).
A
B
Figura 12 – Sutura do periósteo com fio-de-sutura reabsorvível (A). Sutura da pele com fiode-sutura de nylon (B).
46
Após os procedimentos cirúrgicos, como tratamento antimicrobiano, foi
administrado Enrofloxacino (Flotril 2,5% - Schering-Plough, Rio de Janeiro - RJ)
numa dose de 10,0mg/kg de peso corpóreo por via intramuscular e Dipirona sódica
500 mg (D-500 – Fort Dodge, Campinas – SP), 160mg/kg de peso corpóreo por via
intramuscular (FIGURA 13).
Figura 13 – Analgésico e antimicrobiano utilizado como medicação pós-operatória.
Decorrido os períodos de observação de 7, 20 e 60 dias os animais foram
mortos por sobredosagem de anestésico geral (Ketamina) 120mg/kg endovenoso.
4.4. Preparo das Peças e Forma de Análise dos Resultados
A coleta das peças se deu com o uso de um disco diamantado montado em
um motor de baixa-rotação, tomando o cuidado para preservar o periósteo. Durante
a coleta da peça foi adotado uma margem de 5,0 mm dos defeitos cirúrgicos e
realizado um pequeno entalhe na região anterior da peça, podendo assim definir os
defeitos esquerdo e direito (FIGURA 14). As peças coletadas foram fixadas em
47
solução de formalina tamponada a 10% (Merck, Darmstadt, Germany), por 48 horas
período no qual foram feitas as tomadas tomográficas. Logo após a tomada
tomográfica as peças referentes ao período de 60 dias foram separadas (lado direito
e esquerdo) e cortadas ao meio em micrótomo para tecidos duros para que as
metades das mesmas fossem submetidas à análise microscópica.
B
A
C
Figura 14 – Forma padronizada para a coleta da peça do crânio do coelho (A).
Peça coletada (B). Aspecto do tecido cerebral após coleta de espécime (C).
4.4.1. Análise Macroscópica
Os espécimes foram analisados macroscopicamente na suas dimensões,
coloração e fotografados em lente de aproximação.
48
4.4.2. Análise das Peças por Imagens Radiográficas
Inicialmente as peças foram envolvidas por um lenço de papel, para a retirada
da umidade.
Foi utilizado um aparelho de raios X médico com os seguintes
parâmetros: distância foco-filme 1,30m; tensão 38kV; exposição 2,5mAs
Após a revelação os filmes foram digitalizados para posterior análise
comparativa da radiopacidade obtida na região do defeito. O equipamento scanner
utilizado é da marca Vidar, modelo DiagnosticPro, com resolução espacial de 300dpi
e tamanho aproximado de pixel de 84,67µm.
4.4.3. Volumetria Por Tomografia Computadorizada
As peças fixadas em formol foram submetidas ao processo de imagem por
Tomografia Computadorizada.
Estas imagens foram realizadas no Tomógrafo
Siemens, pertencente ao Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto – FMRP-USP. Foram adquiridas imagens axiais com 0,3mm de espessura,
diâmetro de reconstrução 133 mm, distância fonte – detector 940 mm,
distância fonte – paciente 535 mm, altura 115 mm, direção de rotação CW,
tempo de exposição 800s, corrente do tubo 75mA, exposição 60mAs, tensão
110kV.
Os dados digitais da imagem produzida pelo Tomógrafo são gerados no
padrão DICOM (Digital Imaging Communications in Medicine) os quais foram
utilizados para o cálculo do volume. Para tanto, um software foi desenvolvido no
CCIFM (Centro de Ciências de Imagem e Física Médica) do HCRP (Hospital das
Clínicas de Ribeirão Preto), possibilitando a visualização de cada fatia e a
49
delimitação da área de interesse, referente ao osso neoformado dentro do defeito. O
cálculo do volume ósseo neoformado se dá pelo produto da área pela espessura
(0,3mm). O volume final é dado pela soma dos volumes das fatias.
Inicialmente, o software apresenta a imagem da fatia em uma janela,
como mostra a figura 15. A imagem nos permite visualizar uma ferramenta em que é
possível determinar um valor limiar de um determinado nível de cinza em escala UH
(unidade Housnfield) para apresentação da imagem.
Figura 15: Imagens axiais da calvária dos coelhos.
A seguir, o software permite que se delimite a área de interresse, que no caso
do presente trabalho foi a região central do defeito, sendo que essa marcação será a
mesma para todas as fatias, e foi padronizada para todos os espécimes. Feito isso o
software agora tem as ferramentas necessárias para poder calcular o volume de
50
tecido ósseo para aquela região. Tendo em vista que os espécimes também
apresentavam uma certa quantidade de tecido ósseo nativo, padronizou-se a
quantidade de 30 fatias para cada espécime, iniciando a volumetria com base na
imagem tomográfica onde ficava evidente o inicio do defeito ósseo. A contagem do
número de pixels relativos à área de interesse é armazenada para cada fatia, o que
possibilita o cálculo do volume. A conversão de número de pixels em área é feita
através do tamanho do pixel. No procedimento de aquisição da imagem adotada
neste trabalho, cada pixel tem a dimensão de 0.5mm de altura, valor fornecido pelo
software que opera o tomógrafo. Com isso, a área em pixels é convertida em mm²,
que multiplicado pela espessura da fatia (0,3mm) fornece o valor do volume de osso
neoformado. Devido ao grau de radiopacidade das imagens obtidas por tomografia
computadorizada, somente os espécimes do período de 60 dias foram incluídos
nessa análise.
4.4.4. Análise Microscópica
Os espécimes foram identificados e acondicionados em frascos contendo
formaldeído a 10% por período de 48 horas. Posteriormente, os mesmos foram
submetidos a processo de desmineralização em solução de ácido etilenodiamino
tetra-acético (EDTA) a 10% tamponado com pH 7,0, com trocas realizadas duas
vezes por semana por 30 dias, aproximadamente, até que não apresentassem
resistência ao corte com navalha. Neste momento os espécimes foram
encaminhados para procedimento histotécnico de rotina. Estas foram então lavadas
em água corrente, desidratadas em álcool, diafanizadas em xilol e incluídos em
parafina.
51
Realizaram-se cortes semi-seriados de 5µm de espessura de cada bloco, no
sentido longitudinal utilizando-se micrótomo rotatório elétrico Leica RM. Empregouse para as análises os cortes centrais dos espécimes correspondendo ao diâmetro
máximo dos defeitos.
Os métodos de coloração empregados foram o da hematoxilina-eosina de
Harris (HE) e Tricrômico de Masson, seguindo-se os protocolos técnicos do
Laboratório de Histologia da Universidade Sagrado Coração.
Os cortes foram analisados pela microscopia ótica, e descritos em todas as
suas peculiaridades. Foram selecionados e fotografados, os dados mais relevantes,
no próprio microscópio.
4.4.5. Histomorfometria
Os cortes microscópicos corados pelo método Tricrômico de Masson
referentes a cada grupo e período de estudo foram submetidas à Histomorfometria.
Foi utilizado o fotomicroscópio Nikon H550L, e o Software Image Pro-Plus, para a
determinação da fração do volume de tecido ósseo primário, secundário e tecido
conjuntivo.
52
5. RESULTADOS
5.1. Aspecto Clínico
Todos os animais mantiveram suas funções vitais, permanecendo em gaiolas
individuais, sem imobilização. Não houve infecções pós-operatórias e evidências
de corpo estranho. Durante o pós-operatório imediato, os animais se recuperaram
do procedimento cirúrgico.
5.2. Análise Macroscópica
No período de 7 dias observava-se apenas a região do defeito cirúrgico
confeccionado na calota craniana dos coelhos para todos os tratamentos (FIGURA
16), já com 20 dias de pós-operatório, em ambos os grupos não se observava
claramente a presença de osso formado (FIGURA 17). Com 60 dias, era possível
encontrar a presença de tecido maleável e tecido osso duro (FIGURA 18).
53
Figura 18 - Imagem de uma das metades da peça retirada do crânio. Período 60 dias.
5.3. Análise Radiográfica
Os filmes foram digitalizados através de um scanner de transmissão com
alguns dos resultados obtidos no período de 20 dias(FIGURA 19 a, b, c, d, e), e no
período de 60 dia (FIGURA 20 a, b, c, d, e).
Evidencia-se que há maior radiopacidade nos espécimes de 60 dias quando
comparado aos espécimes de 20 dias.
54
a
b
d
c
Figura 19: Radiografias do defeito ósseo dos espécimes de 20 dias. a) Coágulo, b) Coágulo
+ membrana de látex, c) Medula e d) Medula + membrana de látex.
d
c
b
a
Figura 20: Radiografias do defeito ósseo dos espécimes de 60 dias. a) Coágulo, b) Coágulo
+ membrana de látex, c) Medula e d) Medula + membrana de látex.
5.4. Análise Microscópica
Devido à morte precoce de alguns animais durante o decorrer dos períodos
de estudo, uma nova amostragem de espécimes por tratamento realizado foi
adotada (TABELA 1).
Tabela 1: Número de espécimes por tratamento incluídos na análise dos resultados e seus
respectivos períodos de estudo.
Tratamentos
Períodos de
estudo
Coágulo
Coágulo +
membrana látex
Medula
Medula +
membrana látex
7
3
3
3
3
20
5
3
5
3
60
4
3
4
3
55
5. RE5.4.1. Período de 7 dias
Os espécimes do período de 7 dias foram dispostos em sequência para que
fosse possível observar as diferenças entre os diferentes tratamentos realizados
(FIGURA 21 a, b, c, d).
a
b
c
d
FIGURA 21 – Fotomicrografia dos espécimes do período 7 dias – a) coágulo; b) coágulo +
membrana de látex; c) medula; d) medula + membrana de látex. (Tricrômico de Masson;
aumento original ~2x).
56
Descrição Microscópica
O grupo coágulo, cujos defeitos ósseos foram preenchidos apenas por
coágulo apresentaram tecido conjuntivo fibroso frouxo em organização com discreto
infiltrado inflamatório mononuclear difuso, em contato com o tecido nervoso, o qual
apresentava discretos focos de degeneração (FIGURA 22 a, b). Quando da
cobertura dos defeitos preenchidos por coágulo com membrana, os mesmos
mostravam presença de tecido de granulação intensamente infiltrado por leucócitos
mononucleares. Observou-se, ainda, discreta atividade osteogênica a partir das
paredes do defeito (FIGURA 23 a, b). Nos defeitos preenchidos apenas com medula
óssea observou-se presença predominante de tecido adiposo amarelo, permeado
por tecido de granulação. Discreto foco de osteogênese foi visualizado em meio ao
tecido de granulação em um dos espécimes. Nas paredes dos defeitos também se
observou neoformação óssea (FIGURA 24 a, b). Os defeitos preenchidos com
medula e recobertos por membrana apresentaram o mesmo quadro microscópico
dos defeitos com o mesmo tratamento, sem o recobrimento por membrana, com
predominância de tecido adiposo unilocular, permeado por tecido de granulação
(FIGURA 25 a, b).
57
tc
tn
a
b
Figura 22 - 7 dias - Grupo coágulo sem membrana - Em a, presença predominante de tecido
conjuntivo fibroso (tc), sobrejacente a tecido nervoso (tn). Em b, destaque para área de
degeneração do tecido nervoso (setas) (H.E.; barras = a) 600µm, b) 200µm).
*
a
tg
b
Figura 23 - 7 dias - Grupo coágulo com membrana - a) Subjacente ao espaço previamente
ocupado pela membrana (*) nota-se tecido de granulação (tg). Em b, maior aumento do
tecido de granulação, onde se observam numerosos leucócitos mononucleares (H.E.; barras
= a) 600µm, b) 200µm).
58
*
*
ad
a
b
Figura 24 - 7 dias - Grupo medula sem membrana - Em a nota-se defeito
predominantemente preenchido por tecido adiposo amarelo (ad). Destaque de área de
osteogênese (seta) em b próxima aos adipócitos uniloculares (*) (a - H.E.; barras = 600µm;
b - Tricrômico de Masson; barras = 200µm).
tg
ad
tg
a
b
Figura 25 - 7 dias - Grupo medula com membrana - Observa-se defeito preenchido por
abundante tecido adiposo amarelo (ad) em a, permeado por tecido de granulação (tg)
destacado em b (H.E.; barras = a) 500µm; b) 200µm).
Análise Histomorfométrica
Foi analisada a fração do volume de tecido ósseo neoformado e tecido
conjuntivo para as peças do período de 7 dias e os diferentes tratamentos realizados
(TABELA 2).
59
Tabela 2: Valores médios e desvio padrão da área de osso primário, osso secundário, osso
neoformado e tecido conjuntivo, obtidos por histomorfometria, referente ao período de 7 dias
e os diferentes tratamentos realizados.
Tratamento
Coágulo
Coágulo +
membrana de látex
Medula
Medula +
membrana de látex
Osso primário
µm²
Osso secundário
µm²
Osso
Neoformado
µm²
Tecido
Conjuntivo µm²
(5,13±0,75).105
0
(5,13±0,75).105
(1,36 ±0,75).106
(2,74±1,82).105
0
(2,74±1,82).105
(1,45 ±0,86).106
(4,71±4,12).105
0
(4,71±4,12).105
(7,33±2,42).105
(3,71±1,60).105
0
(3,71±1,60).105
(1,32 ±0,26).106
As figuras 26, 27, 28 e 29 mostram os resultados da Histomorfometria dos
seguintes tecidos: Osso Primário, Osso Secundário, Osso Neoformado e Tecido
conjuntivo para os tratamentos com Coágulo, Medula, Membrana e Medula e
Membrana, respectivamente.
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
6
2
Área (µm )
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primario
Secundário
Conjuntivo
60
6
2.6x10
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Conjuntivo
Histomorfometria. Período de 7 dias, tratamento com coágulo + membrana.
6
1x10
5
9x10
5
8x10
5
7x10
2
Área (µm )
5
6x10
5
5x10
5
4x10
5
3x10
5
2x10
5
1x10
0
Primário
Secundário
Conjuntivo
61
6
1.8x10
6
1.6x10
6
1.4x10
6
2
Área (µm )
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Conjuntivo
As figuras 30 e 31 mostram o estudo comparativo entre os tratamentos nos
resultados de Osso Primário, e Tecido Conjuntivo. Os resultados foram analisados
estatisticamente pelo teste ANOVA.
5
9x10
5
8x10
5
7x10
5
2
Área (µm )
6x10
5
5x10
5
4x10
5
3x10
5
2x10
5
1x10
0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Primário relativo ao período de 7 dias. Não há diferença estatisticamente significativa entre
os resultados na comparação entre os grupos pelo teste ANOVA.
62
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Figura 31: Valor Médio e Desvio Padrão de resultados da Histomorfometria de Tecido
Conjuntivo relativo ao período de 7 dias. Não há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados na comparação entre os grupos pelo teste ANOVA.
5.4.2. Período de 20 dias
seja possível observar as diferenças entre os diferentes tratamentos realizados
63
a
b
c
d
Figura 32 – Fotomicrografia dos espécimes do período 20 dias – a) coágulo; b) coágulo +
Os defeitos do grupo coágulo apresentaram-se preenchidos por tecido
conjuntivo fibroso, apresentando discretas áreas de osteogênese com formação de
tecido ósseo primário (FIGURA 33 a, b). Os defeitos preenchidos por coágulo e
recobertos por membrana apresentaram padrão semelhante no mesmo período. Um
dos espécimes exibia delicadas trabéculas de tecido ósseo primário, entremeadas
64
por conjuntivo fibroso (FIGURA 34 a, b). Os defeitos tratados com medula óssea
mostraram presença de tecido adiposo unilocular, ricamente vascularizado, com
infiltrado inflamatório mononuclear e polimorfonuclear neutrofílico difuso variando de
moderado a intenso. Em alguns espécimes notaram-se células em degeneração.
Observou-se, ainda, formação de trabéculas ósseas primárias nas porções superior
e inferior do defeito (FIGURA 35 a, b).
Os defeitos preenchidos por medula e
recobertos com membrana apresentaram padrão microscópico similar, com
presença de tecido adiposo unilocular moderadamente infiltrado por leucócitos
mononucleares e polimorfonucleares, permeado por delgadas trabéculas ósseas
primárias na base do defeito (FIGURA 36 a, b).
op
tc
a
b
Figura 33 ‐ 20 dias ‐ Grupo coágulo sem membrana ‐ Presença predominante de tecido conjuntivo
fibroso (tc), com áreas de osteogênese (setas longas), identificadas pela intensa atividade
osteoblástica (setas curtas) e formação de tecido ósseo primário (op) (Tricrômico de Masson; barras
= a) 600μm, b) 100μm).
65
op
tc
a
b
Figura 34 - 20 dias - Grupo coágulo com membrana - Nota-se tecido conjuntivo organizado
no interior do defeito (tc) com áreas de formação de tecido ósseo primário (op) (Tricrômico
de Masson; barras = a) 600µm, b) 100µm).
*
op
*
ad
*
a
b
Figura 35 - 20 dias - Grupo medula sem membrana - Nota-se tecido adiposo amarelo
preenchendo a área de defeito (ad). Eventuais trabéculas de tecido ósseo primário são
observadas (op). Em b, destacam-se os adipócitos uniloculares (*) e células em
degeneração (setas) em meio a leucócitos mononucleares (a - Tricrômico de Masson; barra
= 600µm; b - HE; barra = 200µm).
ad
*
*
op
a
b
Figura 36 - 20 dias - Grupo medula com membrana - a) Preenchimento do defeito tecido
adiposo amarelo (ad) e trabéculas de tecido ósseo primário na base do defeito (op). Em b,
destacam-se os adipócitos uniloculares (*). (a - Tricrômico de Masson; barra = 600µm; b HE; barra = 150µm).
66
conjuntivo para as peças do período de 20 dias e os diferentes tratamentos
realizados (TABELA 3).
neoformado e tecido conjuntivo, obtidos por histomorfometria, referente ao período de 20
dias e os diferentes tratamentos realizados.
Osso primário
µm²
Osso secundário
µm²
Osso
Neoformado
µm²
Tecido
Conjuntivo µm²
(9,90±0,54).105
(1,68 ±2,06).105
(1,16 ±0,67).106
(1,29 ±0,62).106
(1,54±0,75).106
(2,20±3,8).105
(1,76 ±0,74).106
(1,00 ±1,00).106
Medula
(1,70±0,54).106
(1,13±1,09).105
(1,81 ±0,51).106
(9,88 ±4,36).105
Medula +
(1,39±0,75).106
(2,48±0,34).105
(1,64 ±0,73).106
(2,68 ±1,32).105
Tratamento
Coágulo
Coágulo +
membrana de látex
membrana de látex
Membrana, respectivamente, relativos ao período de 20 dias.
67
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
6
1.4x10
6
2
Área (µm )
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
Histomorfometria. Período de 20 dias, tratamento com coágulo + membrana de látex.
68
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
2
Área (µm )
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
6
2
Área (µm )
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
.
Histomorfometria. Período de 20 dias, tratamento com medula + membrana de látex.
As figuras 41, 42, 43 e 44 mostram o estudo comparativo entre os tratamentos nos
resultados de Osso Primário, Osso Secundário, Osso Neoformado e Tecido Conjuntivo. Os
resultados foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA, seguido do teste Tukey,
para a comparação entre as médias e pelo teste t pareado para os tratamentos realizados
no mesmo animal.
69
6
2.4x10
*
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
*
6
1.6x10
2
Área (µm )
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
Tratamento
os resultados na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA. Há diferença
estatisticamente significativa e entre os grupos indicados por * pelo teste t pareado.
5
6.5x10
5
6.0x10
5
5.5x10
5
5.0x10
5
4.5x10
5
2
Área (µm )
4.0x10
5
3.5x10
5
3.0x10
5
2.5x10
5
2.0x10
5
1.5x10
5
1.0x10
4
5.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
Secundário relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA.
70
6
2.6x10
*
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
*
6
1.8x10
2
Área (µm )
6
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
Neoformado relativo ao período de 20 dias. Não há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA. Há
diferença estatisticamente significativa e entre os grupos indicados por * pelo teste t
pareado.
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
entre os resultados na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA.
5.4.3. Período de 60 dias
71
seja possível observar as diferenças entre os diferentes tratamentos realizados
a
b
c
d
Figura 45 – Fotomicrografia dos espécimes do período 60 dias – a) coágulo; b) coágulo +
72
Os defeitos preenchidos somente por coágulo mostraram tecido conjuntivo
fibroso permeado por trabéculas de tecido ósseo em maturação, marcadas por
linhas basofílicas de reversão localizadas predominantemente na base do defeito, e
tecido adiposo amarelo em toda a extensão do defeito, além de feixes de fibras
musculares esqueléticas (FIGURA 46 a, b). Os defeitos recobertos por membrana
sobre o coágulo apresentaram-se preenchidos por finas trabéculas de tecido ósseo
maduro recoberto por células de revestimento (FIGURA 47 a, b). O grupo tratado
com medula apresentou defeito preenchido por tecido adiposo ora unilocular, ora
multilocular, entremeado por septos de tecido conjuntivo fibroso denso, focos de
intenso infiltrado inflamatório mononuclear e polimorfonuclear neutrofílico. Esparsas
e curtas trabéculas foram observadas localizadas predominantemente na base do
defeito (FIGURA 48 a, b). Padrão similar foi visualizado nas áreas recobertas por
membrana e tratadas com medula, estando preenchidas por tecido adiposo ora
unilocular,
ora
multilocular
apresentando
moderado
infiltrado
inflamatório
mononuclear difuso. Nota-se presença de trabéculas de tecido ósseo maduro na
base do defeito (FIGURA 49).
ad
op
tc
a
b
Figura 46 - 60 dias - Grupo coágulo sem membrana - Defeito preenchido por curtas
trabéculas ósseas primárias em maturação (op), evidenciadas pelas linhas basofílicas de
reversão (setas). De permeio, tem-se tecido conjuntivo fibroso (tc) e tecido adiposo amarelo
também é observado (ad) (HE; barras = a) 600µm, b) 100µm).
73
*
o
o
b
a
Figura 47 - 60 dias - Grupo coágulo com membrana - O espaço vazio (*) representa o
espaço previamente ocupado pela membrana. Nota-se ponte de tecido ósseo maduro (o) na
base do defeito (a), apresentando células de revestimento em sua superfície (setas) (b).
(HE; barras = a) 600µm, b) 100µm).
ad
*
*
o
a
b
c
Figura 48 - 60 dias - Grupo medula sem membrana - Em a visualiza-me área do defeito em
menor aumento, preenchida por tecido adiposo (ad) e curtas trabéculas ósseas (o). Em b,
destacam-se os adipócitos uniloculares (*). De permeio, notam-se adipócitos multiloculares
(setas), em c. (a, b - HE; barra = a) 300µm, b) 100µm; c - Tricrômico de Masson; barra =
100µm).
74
*
ad
o
a
b
*
*
*
c
Figura 49 - 60 dias - Grupo medula com membrana – a) Defeito preenchido por tecido
adiposo (ad) e tecido ósseo maduro na base do defeito (o). Em b, observa-se tecido adiposo
unilocular (*) permeado por adipócitos multiloculares (setas). Em c, destacam-se os
adipócitos multiloculares (setas). (a - HE; barra = 600µm; b, c - Tricrômico de Masson; barra
= 100µm).
conjuntivo para as peças do período de 20 dias e os diferentes tratamentos
realizados (TABELA 4).
75
neoformado e tecido conjuntivo, obtidos por histomorfometria, referente ao período de 60
dias e os diferentes tratamentos realizados.
Tratamento
Osso primário
(µm²)
Osso secundário
(µm²)
Osso
Neoformado
(µm²)
Tecido
Conjuntivo
(µm²)
Coágulo
(1,21±0,57).106
(3,29 ±0,41).105
(1,54 ±0,59).106
(1,16 ±0,43).106
Coágulo +
(1,29±0,27).106
(1,48 ±0,23).106
(2,77 ±0,24).106
(1,08 ± 0,43).106
Medula
(1,36±0,30).106
(4,25 ±0,91).105
(1,79 ±0,33).106
(1,02 ±0,35).106
Medula +
(1,27±0,13).106
(2,12 ±0,27).106
(3,39 ±0,38).106
(1,22 ±1.19).106
membrana de látex
membrana de látex
Membrana, respectivamente, relativos ao período de 60 dias.
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
6
2
Área(µ )
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primario
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
Histomorfometria. Período de 60 dias, grupo controle (coágulo).
76
6
3.0x10
6
2.5x10
6
2
Área (µm )
2.0x10
6
1.5x10
6
1.0x10
5
5.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
Histomorfometria. Período de 60 dias, tratamento com coágulo + membrana látex.
6
2.0x10
6
1.8x10
6
1.6x10
6
1.4x10
6
2
Área (µm )
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Primario
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
77
6
3.5x10
6
3.0x10
6
2
Área (µm )
2.5x10
6
2.0x10
6
1.5x10
6
1.0x10
5
5.0x10
0.0
Primário
Secundário
Neoformado
Conjuntivo
As figuras 54, 55, 56 e 57 mostram o estudo comparativo entre os tratamentos nos
resultados de Osso Primário, Osso Secundário, Osso Neoformado e Tecido Conjuntivo. Os
resultados foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA, seguido do teste Tukey,
para a comparação entre as médias e pelo teste t pareado para os tratamentos realizados
no mesmo animal.
78
6
1.8x10
6
1.6x10
6
1.4x10
6
2
Área (µm )
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
os resultados.
6
2.5x10
6
2
Área (µm )
2.0x10
6
1.5x10
6
1.0x10
5
5.0x10
*
*
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
Secundário relativo ao período de 60 dias. Há diferença estatisticamente significativa entre
os resultados com P<0.05 na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA e
entre os grupos indicados por * pelo teste t pareado.
79
*
6
3.5x10
*
6
3.0x10
6
2
Área (µm )
2.5x10
6
2.0x10
6
1.5x10
6
1.0x10
5
5.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
Neoformado relativo ao período de 60 dias. Há diferença estatisticamente significativa entre
os resultados com P<0.05 na comparação entre os grupos indicados pelo teste ANOVA e
entre os grupos indicados por * e por ** pelo teste t pareado.
6
2.6x10
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Medula e Membrana
entre os resultados.
80
As figuras 58, 59, 60 e 61 mostram o estudo comparativo entre os períodos de
acordo com o tratamento nos resultados de Osso Primário, Osso Secundário, Osso
Neoformado e Tecido Conjuntivo. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo
teste ANOVA, seguido do teste Tukey, para a comparação entre as médias e pelo teste t
pareado para os tratamentos realizados no mesmo animal.
6
2.5x10
**
*
7 dias
20 dias
60 dias
6
2.0x10
2
Área (µm )
6
1.5x10
*
6
1.0x10
**
5
5.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Figura 58: Histomorfometria do Osso Primário em função dos tratamentos e do tempo. Há
diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA seguido de Tukey entre os grupos
indicados por * e **.
81
20 dias
60 dias
6
#
2.5x10
6
2.0x10
2
Área (m )
**
6
1.5x10
6
1.0x10
*
5
5.0x10
**
#
*
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Figura 59: Histomorfometria do Osso Secundário em função dos tratamentos e do tempo.
Há diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA seguido de Tukey entre os
grupos indicados por * , ** e #.
7 dias
20 dias
60 dias
6
4.0x10
*
6
3.5x10
6
3.0x10
*
6
2
Área (m )
2.5x10
6
2.0x10
6
1.5x10
6
1.0x10
5
5.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Figura 60: Histomorfometria do Osso Neoformado em função dos tratamentos e do tempo.
Há diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA seguido de Tukey entre os
grupos indicados pelos traços horizontais e por *.
82
7 dias
20 dias
60 dias
6
2.4x10
6
2.2x10
6
2.0x10
6
1.8x10
6
2
Área (µm )
1.6x10
6
1.4x10
6
1.2x10
6
1.0x10
5
8.0x10
5
6.0x10
5
4.0x10
5
2.0x10
0.0
Coágulo
Medula
Membrana
Membrana e Medula
Figura 61: Histomorfometria do Tecido Conjuntivo em função dos tratamentos e do tempo.
Não há diferença estatisticamente significativa pelo teste ANOVA.
Devido à presença de grande quantidade de tecido adiposo preenchendo
alguns defeitos em que foi empregado o uso da medula óssea, o mesmo foi
expresso na tabela 5, que resume os resultados de média e desvio padrão da área
relativa a este tecido, em µm2, de acordo com os tratamentos e com o período e a
Figura 62 demonstra esses resultados graficamente.
.
Tabela 5: Valores médios e desvio padrão da área relativa ao tecido adiposo de acordo com
o tratamento e o período de estudo.
Medula e Membrana (µm2)
Medula (µm2)
7 dias
8,3 ± 6,8 .106
3,2± 2,0 .106
20 dias
3,3± 2,0 .106
2,7± 1,7 .106
60 dias
2,3± 2,3 .106
2,2± 1,6 .106
83
Medula 60
Membrana e Medula 60
Medula 20
Membrana e Medula 20
Medula 7
Membrana e Medula 7
0.0
6
5.0x10
7
1.0x10
7
1.5x10
2
Área (µm )
Figura 62: Histomorfometria do tecido adiposo de acordo com o tratamento e o período de
observação. Não há diferença estatisticamente significativa entre os resultados, pelo teste
ANOVA.
5.5. Análise da Volumetria por Tomografia Computadorizada
A tabela 6 e a figura 63 mostram os valores dos volumes obtidos por
tomografia computadorizada (TC) comparando todos os tratamentos realizados
entre si.
84
Tabela 6: Valor médio de desvio padrão dos resultados do volume ósseo relativo à região do
centro do defeito ósseo obtido por TC, considerando um valor de 100UH (unidade
Hounsfield).
Tratamento
Volume (cm³)
Coágulo
0,13 ±0,03
Coágulo + membrana látex
0,16 ±0,03
Medula
0,18 ±0,03
Medula + membrana de látex
0,20 ±0,03
*
0.20
*
3
Volume (cm )
0.15
0.10
0.05
0.00
Coágulo
Membrana
Medula
Membrana e Medula
Figura 63: Média e Desvio Padrão da Volumetria por TC. Há diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos indicados pelo teste ANOVA e Tukey (P<0.05) e pelo teste t
pareado entre os grupos indicados por *.
85
6. DISCUSSÃO
O presente trabalho procurou demonstrar a eficácia das células-tronco
mesenquimais presentes na medula óssea fresca, e a influência do uso de
membrana oclusiva de látex no processo de reparo ósseo em defeitos realizados em
calvária de coelhos.
Defeitos ósseos pode ser resultado de várias causas, deficiências congênitas,
perda de elementos dentários, traumas, ressecção de tumores, entre outros. A
capacidade de regeneração desse defeito é variável, dependendo do seu local e
extensão, bem como das condições em que o mesmo se encontra.
A utilização de enxertos ósseos autógenos, ainda hoje mostra uma excelente
alternativa e considerado “padrão ouro” devido ao fato de associar a capacidade
osteocondutora e osteogênica (Matsushita et al., 2004). Porém como descrito por
alguns autores tais técnicas podem representar um grande transtorno ao paciente
(Dahlin, 1994; Swan e Goodacre, 2006; De Riu 2008; Baqainet al, 2009).
É de conhecimento da comunidade científica, tendo como base a literatura
pertinente, diversas técnicas e materiais utilizados para o ganho de tecido ósseo.
Mais recentemente, a terapia celular veio contribuir para esse mesmo fim. Contudo,
o tratamento com células muitas vezes requer uma técnica apurada e pessoal
especializado, além de equipamentos e ambiente próprio para ser realizada. As
técnicas de enxertia óssea predispõem o paciente a condições debilitantes, pois o
mesmo se submete a procedimentos cirúrgicos mais invasivos, aumentando o risco
da morbidade local, de infecções, de tempo cirúrgico aumentado, e nos casos de
86
grandes reconstruções, necessita de internação hospitalar, anestesia geral e um
tempo maior de recuperação. Já o uso de biomateriais muitas vezes falha em
decorrência da falta da capacidade indutora osteogênica. É devido a esse fato que o
uso da medula óssea autógena fresca, que é um tecido detentor de uma excelente
quantidade de células indiferenciadas capazes de se diferenciar em diversos tipos
celulares, inclusive células produtoras de tecido ósseo, chama a atenção. Algumas
vantagens que podemos citar são a facilidade da coleta, causando pouca ou
nenhuma morbidade ao paciente, e a não necessidade de tratamentos laboratoriais
complexos para seu emprego.
A utilização de coelhos como modelo experimental para a avaliação do reparo
ósseo, tem sido realizada com sucesso por diversos autores (Lu et al,. 1998;
Kanazawa et al., 2006; Walsh et al., 2008). Além disso, o modelo experimental
utilizado foi escolhido devido à facilidade de manipulação do animal, e aos
procedimentos de anestesia e cirurgia, que são facilitados devido ao seu pequeno
porte. A anatomia da calvária que, em virtude de seu tamanho e extensão, permite a
realização de dois defeitos de diâmetro de 10mm sem que os mesmos invadam a
linha média envolvendo a sutura sagital (Alberius et al., 1989; Dodde et al., 2000;
Gordjestani et al., 2006). A região óssea escolhida apresenta um pobre suprimento
sanguíneo, bem como uma relativa deficiência de osso medular. Por ser de origem
embrionária intramembranosa, semelhante aos ossos da região bucomaxilofacial,
caracteriza um potente modelo experimental para futuras aplicações em odontologia.
Além disso, o fácil acesso à região cirúrgica garante alta reprodutibilidade,
contribuindo para as análises quantitativas dos tratamentos realizados.
A medula óssea é encontrada por todo sistema esquelético dos mamíferos,
variando em quantidade, dependo do local em que a mesma é encontrada. A tíbia,
87
por ser um osso longo e apresentar um canal medular onde o mesmo aloja a
mesma, é um sítio doador bastante interessante devido a sua facilidade de
manipulação. Por ser um tecido que não tem a capacidade de manutenção de
espaço quando compete com outros tipos de tecidos, como por exemplo, tecido
conjuntivo e mucosa epitelial, o uso de uma barreira mecânica pode otimizar sua
ação. Devido a esse fato, o uso das membranas oclusivas é utilizado por diversos
autores (Dahlin et al, 1990; Karring et al., 1993; Dahlin et al, 1994; Hardwick, 1994;
Nyman et al., 1995; Dupoirieux et al. 2001; Catanzaro 2002).
A terapia celular como uma técnica alternativa tem sido bastante explorada,
principalmente quando a mesma está associada a um biomaterial. Nesta técnica as
células são previamente coletadas, cultivadas e expandidas para posteriormente
serem utilizadas.
Em seu estudo experimental, Lerouxel et al. (2006) utilizou um arcabouço de
fosfato de cálcio associado a medula óssea em defeitos realizados na tíbia e fêmur
de ratos irradiados e não irradiados, comparado com o preenchimento desses
defeitos somente com medula óssea, e o arcabouço apenas. O autor concluiu que o
uso do arcabouço somente apresentou boas propriedades osteocondutivas somente
em ratos não irradiados, mostrando claramente a importância da medula óssea no
reparo ósseo de animais irradiados.
Em um estudo experimental em coelhos, Niedźwiedzki et al. (1992) após ter
coletado previamente uma quantidade de medula óssea do fêmur do animal cultivou
e expandiu essas células, administrando posteriormente essa suspensão de célula
em defeitos ósseos realizados no rádio dos animais. O defeito que recebeu a
88
suspensão de células teve seu processo de regeneração óssea acelerada quando
comparado com o defeito controle que recebeu apenas solução salina.
Semelhante a metodologia empregada no presente trabalho, Vuola et al.
(1995), coletou medula óssea do fêmur de ratos wistar e misturou com solução
salina onde implantes de hidroxiapatita e carbonato de cálcio foram imersos por 5
minuto. Logo após esses implantes foram inseridos dentro do músculo latíssimo do
dorso e mantidos por 3, 6 e 12 semanas. Após esse período foi possível observar a
formação de tecido ósseo com intensa atividade osteoblástica em todos os
implantes que receberam a medula óssea.
Yuan et al. (2007) utilizou cachorros sem raça definida em um estudo que
visava reparar um defeito segmentar crítico de 30mm na mandíbula dos animais,
utilizando um arcabouço de β-tricálcio fosfato associado a células-tronco derivadas
da medula óssea, previamente coletada e cultivada na presença de dexametasona e
β-fosfoglicerol por 2 passagens. Após esse procedimento as células-tronco
apresentaram um fenótipo típico osteogênico. Foi comparado o processo de reparo
utilizando o biomaterial e as células derivadas da medula óssea com enxerto ósseo
autógeno, e também somente o uso do arcabouço de β-tricálcio fosfato. O estudo
demonstrou que o substituto ósseo construído com o arcabouço de β-tricálcio
fosfato, carregado com as células-tronco derivadas da medula óssea pode reparar
defeitos críticos mandibulares em grandes mamíferos, sendo uma abordagem
plausível em reconstruções clínicas de defeitos mandibulares.
Kuznetsov et al. (2008) também em um estudo com cachorros utilizou
partículas de hidroxiapatita/tricálcio fosfato misturados à células-tronco derivadas da
medula óssea, para o preenchimento de defeitos de 15mm realizados na mandíbula
89
dos animais. Seus resultados corroboraram com os demais autores apontando as
células derivadas da medula óssea como uma potencial fonte osteoindutora em
defeitos ósseos.
Neste trabalho, a medula óssea foi coletada e imediatamente utilizada sem
passar por nenhum tratamento laboratorial, assim como foi realizado no trabalho de
Kitchel (2006). O autor utilizou uma matriz de colágeno mineralizada embebida em
medula óssea coletada por punção da crista ilíaca, em procedimento cirúrgico de
fusão intervertebral, comparando com enxerto ósseo autógeno realizado em
humanos. Pode-se concluir que o uso da associação da medula óssea com o
biomaterial apresentou uma taxa de consolidação das vértebras semelhante a do
lado em que foi utilizado enxerto ósseo, além de diminuir o tempo operatório e a
morbidade gerada quando da coleta do osso da crista ilíaca.
Em
um
trabalho
semelhante,
Gan
et
al.
(2008)
também
realizou
procedimentos cirúrgicos para a fusão espinhal lombar posterior em humanos,
utilizando um arcabouço de β-tricálcio fosfato poroso associado à medula óssea, que
foi previamente coletada e centrifugada separando as células do plasma. O
biomaterial enriquecido com as células derivadas da medula óssea se mostrou
efetivo no processo de fusão espinhal posterior.
Velardi et al. (2006) em um estudo clínico para a reconstrução de defeitos
cranianos em quatro pacientes pediátricos, também utilizou uma matriz de colágeno
mineralizado associada uma cerâmica de hidroxiapatita embebida em medula óssea,
que fora coletada previamente ao procedimento cirúrgico. A Medula óssea coletada
foi centrifugada para a separação das células nucleadas do plasma para serem
90
inseminadas na matriz de colágeno. Foi observado em todos os pacientes um rápido
processo de osteogênese.
O padrão histológico encontrado neste trabalho relativo ao período de 60 dias
evidencia que, quando o enxerto com a medula óssea é associado à membrana de
látex, há uma aceleração no processo de formação e de amadurecimento do tecido
ósseo neoformado. De acordo com as fotomicrografias do período de 60 dias (figura
45), na região do defeito tratado com coágulo observa-se tecido conjuntivo
permeando ilhas de tecido ósseo curtas, enquanto que o tratamento com coágulo +
membrana de látex houve a formação de um tecido ósseo maduro com presença de
células de revestimento (Figura 47 b). O tratamento realizado somente com a
medula resultou a presença de tecido adiposo e pequenas ilhas de tecido ósseo em
processo de amadurecimento preenchendo o defeito é notado. Já o tratamento em
que foi empregada medula + membrana de látex, propiciou o amadurecimento do
tecido ósseo, com formação de uma ponte óssea ligando as bordas do defeito.
Essas características tornam-se evidentes através da histomorfometria, quando se
avalia a área relativa ao osso maduro (Figura 55), onde se observa que a
quantidade de osso formado é maior no grupo tratado com medula e membrana,
seguido do tratamento com membrana e coágulo, medula e coágulo. Nesta mesma
análise, pode-se verificar que os tratamentos com membrana
resultaram numa
maior formação de osso secundário quando comparado com o grupo tratado apenas
com o coágulo sanguíneo (P<0.05).
Em relação ao tecido ósseo neoformado, os dados da histomorfometria
mostram que o tratamento com medula + membrana de látex resultou numa maior
quantidade de tecido ósseo neoformado com valores estatisticamente significativos
quando comparado aos demais tratamentos (Figura 56). Este resultado corroborou
91
com a volumetria por tomografia computadorizada, que mostra que o volume de
osso neoformado foi superior quando utilizado o tratamento com medula +
membrana de látex (P<0,05). Nesta mesma análise (figura gráfico cinza 60d) podese observar que os tratamentos com membrana oclusiva de látex resultaram em
maior volume de osso neoformado quando comparado aos mesmos tratamentos
sem o uso desta barreira mecânica.
Com relação à presença do tecido adiposo, pode-se perceber que o
mesmo apareceu em grande quantidade nos tratamentos em que foi utilizada a
medula óssea. Isso se deve ao fato de que considerando a idade do animal de seis
meses o mesmo já é considerado adulto. Segundo Gimble et al. (1996), o ossos
longos apresentam uma abundante quantidade de adipócitos. Esse tecido adiposo
encontrado nos ossos longos pode ser tanto o tecido adiposo amarelo ou unilocular
quanto o tecido adiposo marrom ou multilocular. Contudo observou-se que com o
decorrer dos períodos de estudo essa quantidade de tecido adiposo diminuiu. Uma
hipótese é a diferenciação dos adipócitos em osteoblastos uma vez que os mesmos
apresentam potencial para tal transformação.
A análise da volumetria por tomografia computadorizada pode nos fornecer
dados relevantes a respeito do processo de regeneração óssea. Os defeitos ósseos
que receberam a medula óssea apresentaram diferenças estatisticamente
significativas (P<0.05) quando comparada com o defeito preenchido apenas por
coágulo sanguíneo, indicando a capacidade osteogênica acentuada desse
tratamento. Além disso, o uso de medula em associação com membrana oclusiva de
látex resultou em um maior volume ósseo em comparação ao uso somente da
membrana oclusiva. Esta diferença é estatisticamente significativa quando analisada
pelo teste t pareado, já que os tratamentos ocorreram no mesmo animal, indicando
92
que o uso da medula contribui para o aumento do volume ósseo 60 dias após o
tratamento.
93
7. CONCLUSÃO
• O tratamento com a associação da medula óssea à membrana de látex se
mostrou efetivo como estímulo à osteogênese, resultando em maior volume
ósseo secundário 60 dias após a cirurgia em relação aos outros tratamentos
estudados
• A membrana de látex contribui para o processo de regeneração óssea,
resultando em maior volume de osso neoformado em relação aos mesmos
tratamentos sem o uso desta barreira mecânica com base nos resultados da
histomorfometria.
• A análise da volumetria óssea por tomografia computadorizada se mostrou
uma ferramenta interessante quando da análise dos resultados possibilitando
avaliar o ganho de tecido em volume.
.
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102

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