CENTRO DE ENSINO FACULDADE SÃO LUCAS Yuri Vasconcelos

Transcrição

CENTRO DE ENSINO FACULDADE
SÃO LUCAS
Yuri Vasconcelos Andrade
APLICAÇÕES DE NANOCORPOS DE CAMELÍDEOS NA TERAPÊUTICA E
DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA
Porto Velho - RO
2015
YURI VASCONCELOS ANDRADE
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação em Biomedicina da
Faculdade São Lucas, para obtenção
do grau de Bacharelado da Faculdade
São Lucas.
Orientador: Dr.a Soraya dos Santos
Pereira.
Porto Velho - RO
2015
YURI VASCONCELOS ANDRADE
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação em Biomedicina da
Faculdade São Lucas, para obtenção
do grau de Bacharelado da Faculdade
São Lucas.
Orientador: Dr.a Soraya dos Santos
Pereira.
Aprovado (a):
_________________________________
Dr.a Soraya dos Santos Pereira
Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Rondônia
(Presidente)
___________________________
Nome – Local de origem
(Membro)
_______________________________
Nome – local de origem
(Membro)
___________________________
Nome – Local de origem
(Membro)
Porto Velho – RO
2015
AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus pela ajuda concebida e por me proporcionar mais
uma oportunidade de crescer.

A meus pais, pelos ensinamentos e exemplo de vida, pelo incentivo ao estudo e
direcionamento a caminhos excelentes.

Agradeço também a minha orientadora Dr.a Soraya dos Santos pela paciência, ajuda,
ensinamentos, oportunidades e por ter acreditado em mim.

A Dr.a Carla Freire Celedônio Fernandes pela oportunidade dada.

A FIOCRUZ – RO e aos integrantes do Laboratório de Engenharia de Anticorpos,
Marcos Barros, Luciana, Antonieta Lelo, Michelle Suelen, Nauanny Lima, Erika e em
especial ao M.e Naan Rodrigues pela enorme ajuda, sempre se dispondo quando
precisei, pelos conselhos, paciência e principalmente pela AMIZADE.

A meus Amigos ADILA TAI, JULIANA MAGALHÃES, GUILHERME ÁVILA, por
estarem sempre do meu lado em momentos alegres e difíceis, paciência, conselhos...

A todos os meus professores pelo aprendizado.
Ó Israel, confia no SENHOR;
Ele é Tua ajuda e Teu escudo.
Casa de Arão, confiai no SENHOR;
Ele é Sua ajuda e Seu escudo.
Os que temeis ao SENHOR, confiai no SENHOR;
Ele é Sua ajuda e Seu escudo.
Salmos: 115: 9-11.
RESUMO
Introdução: Os anticorpos são moléculas produzidas pelo sistema imunológico em resposta a organismos
estranhos com a finalidade de eliminá-los do organismo. Produzidos pela tecnologia do hibridoma, os anticorpos
monoclonais, são utilizados como importantes ferramentas aplicáveis no tratamento e diagnóstico de doenças,
constituindo uma das maiores classes de biofármacos desenvolvidos. No entanto, devido as características
funcionais e estruturais desses anticorpos, suas aplicações apresentam certas limitações. Através de técnicas
moleculares foram desenvolvidas variadas formatações de anticorpos monoclonais, como moléculas quimeras,
recombinantes, além dos fragmentos de anticorpos Fab e scFv. Alternativamente, outros fragmentos vêm se
destacando por apresentarem características bioquímicas e biofísicas favoráveis para fins de aplicações
biomédicas, os referidos nanocorpos ou VHHs, que compreendem os domínios únicos de reconhecimento
antigênico, derivados de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos. Nesta perspectiva, este trabalho foi
desenvolvido para demonstrar a diversidade da utilização dos nanocorpos em variados campos da saúde.
Objetivo: Levantar as principais aplicações dos nanocorpos de camelídeos na terapêutica e diagnóstico de
doenças que acomentem o homem. Metodologia: Foi realizado um levantamento bibliográfico, através de
consultas em livros, banco de teses e dissertações da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (Capes) e artigos indexados nos bancos de dados disponíveis on line. Resultados: Os anticorpos
monoclonais constituem insumos potenciais, entretanto, as dificuldades farmacocinéticas, relacionadas a
penetração tecidual e alto custo de produção, além do desenvovimento de respostas imunológicas anti-murino e
intoxicações, acabam por limitar a utilização clínica desses anticorpos. Apesar das vantagens advindas pelo uso
dos fragmentos de anticorpos, a saber, redução da imunogenicidade, maior capacidade de penetração tecidual e
melhor farmacodinâmica, esses não superaram as dificuldades de baixa estabilidade e afinidade, além de não
desencadearem respostas efetoras. Com isso, a proposta da utilização dos nanocorpos têm se mostrado eficiente
para fins de produção dos imunobiológicos. Pois estes demonstram ter afinidade e especificidade iguais ou
superiores às apresentadas pelos anticorpos monoclonais, tais como, elevada solubilidade, alta estabilidade
quando submetidos a variações de temperatura e pH, além da boa capacidade de penetração tecidual e baixo
custo de produção em larga escala, apresentando-se como ferramentas promissoras para aplicações na terapia e
diagnóstico de doenças neurodegenerativas, virais, inflamatórias, câncer, dentre outras. Conclusão: Devido as
características físicoquímicas, atreladas ao baixo custo de produção, os nanocorpos são ferramentas
farmacológicas potenciais para aplicações clínicas e no desenvolvimento de dispositivos diagnósticos voltados a
diversos tipos de doenças, podendo compor novas classes de imunobiológicos aplicáveis nos diversos campos da
ciência.
Palavras-chaves: Anticorpos. Anticorpos monoclonais. Terapêutica. Diagnóstico. Nanocorpos ou VHH.
ABSTRACT
Introduction: Antibodies are molecules produced by the immune system in response to foreign organisms for
the purpose of eliminating them from the organism. Produced by hybridoma technology, monoclonal antibodies
are used as important tools in the treatment and diagnosis of diseases, constituting one of the largest classes of
biopharmaceuticals developed. However, because of the functional characteristics and structure of these
antibodies, their application has certain limitations. Using molecular techniques various formats of monoclonal
antibodies have been developed, such as chimeras molecules, recombinant, in addition to Fab and scFv antibody
fragments. Alternatively, other fragments have been highlighted for being favorable biochemical and biophysical
characteristics for purposes of biomedical applications, such nanobodies or VHHs, comprising the single
domains of antigen recognition, derived from the heavy chain antibodies of camels. In this perspective, this study
was designed to demonstrate the diversity of the use of nanobodies in several fields of health. Objective: This
study aimed to identify the main applications of camelid nanobodies in the treatment and diagnosis of diseases
that acomentem man. Methods: A bibliographical survey was conducted through consults on books, theses and
dissertations database of Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) and papers
available on line. Results: Monoclonal antibodies are potential inputs, however, the pharmacokinetic difficulties
related to tissue penetration, the high cost of production and the development of anti-murine immune response
and poisoning, limit the clinical use of these antibodies. Despite the advantages from the use of antibody
fragments, namely, reduced immunogenicity, increased tissue penetration and better pharmacodynamics, these
have not overcome the problems of poor stability and affinity, and does not triggering effector responses. Thus,
the proposed use of nanobodies have proven effective for the biopharmaceuticals production purposes. Once
these demonstrate an affinity and specifity equal or greater than those presented by the monoclonal antibodies,
such as high solubility, high stability when subjected to variations in temperature and pH, in addition to good
capacity for tissue penetration and low-cost in large-scale production, they are presented as promising tools for
application in therapy and diagnosis of neurodegenerative, viral and inflammatory diseases, cancer, among
others. Conclusion: Due the physicochemical characteristics, linked to low production cost, the nanobodies are
potential pharmacological tools to clinical application and development of diagnostic devices of diseases, being
part of a new class of biopharmaceuticals applicable in the several fields of science.
Key words: Nanobodies. Monoclonal antibodies. Therapy. Diagnosis. Nanobody or VHH.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
68
Ga - Radionucleotídeo gálio-68
99
TC - Radioisótopo Tecnécio-99m
ADCC - Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo
Ags - Antígenos
AM - Androctonus mauretanicus
Arg - Arginina
AVC - Acidente vascular cerebral
BoNT - Neurotoxina botulínica
CDR - Regiões Determinantes de Complementaridade
CEA - Antígeno Carcinoembrionário
CH - Constante Pesada
CL - Constante Leve
c-Met - Receptor do fator de crescimento de hepatócitos
CXCR7 - Receptor de quimiocinas
DF-Bz-NCS - p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine
E.coli -Escherichia coli
EGFR - Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico Humano
ELISA - Ensaio Imunoenzimático
EUA - Estados Unidos da América
Fab - Fragmento de ligação ao antígeno
Fc - Fragmento cristalizável
FDA - Food And Drug Administration
FRs - Frameworks
Glu - Glutamato
Gly - Glicina
HAMA - Anticorpos Humanos Anti-murinos
HCAbs - Anticorpos de cadeia pesadas
HCV - Vírus da hepatite C
HER2 - Fator de Crescimento Epidérmico Humano
HGF - Fator de crescimento de hepatócitos
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
HPV - Papilomavírus Humano
IgA - Imunoglobulina A
IgD - Imunoglobulina D
IgE - Imunoglobulina E
IgG - Imunoglobulina G
IgM - Imunoglobulina M
Igs - Imunoglobulinas
kDa - Quilodalton
Leu - Leucina
LNH - Linfomas não-Hodgkin
mAbs - Anticorpos Monoclonais
MMR - Receptor de Manose dos Macrófagos
MUC-1 - Glicoproteína mucina 1
OPMD - Distrofia muscular oculofaríngea
PABPN1 - Proteína de ligação nuclear
pb - Pares de bases
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PEG - Polietileno Glicol
PEN - Peptídeo penetrante celular
PET - Cromatografia por emissão de pósitrons
Phe - Fenilalanina
RA - Artrite Reumatóide
rDNA - Tecnologia do DNA Recombinante
RNA - Ácido ribonucléico
ROS - Espécies Reativas de Oxigênio
RSV - Vírus Sincicial Respiratório
scFv - Fragmento variável de cadeia única
SPECT - Tomografia computadorizada por emissão de fóton único
STEC - Escherichia coli Produtora da Toxina Shiga
STX 1 e 2 - Toxinas Shiga
TNF - Fator de Necrose Tecidual
TRAIL - TNF-related apoptosis-inducing ligand
Trp - Triptofano
TSST-1 - Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico
Val - Valina
VCAM1 - Molécula de adesão da célula vascular 1
VGFR2 - Fator de Crescimento do Endotélio Vascular
VH – Domínio Variável Pesada
VHH – Domínio Variável da Cadeia Pesada
VL - Domínio Variável Leve
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Estrutura da imunoglobulina G (IgG)
19
Figura 2 - Demonstração esquemática da estrutura da IgG1 com seus fragmentos
22
Figura 3 - Fragmentos de anticorpos obtidos a partir da
Tecnologia do DNA Recombinante
23
Figura 4 - Anticorpos presentes no soro de camelídeos
26
Figura 5 - Diferenças na organização estrutural do VH
de anticorpos convencionais e de VHHs
27
Figura 6 - Formatações com Nanocorpos
28
Quadro 1 - Os principais alvos utilizados contra doenças neoplásicas
30
Quadro 2 - Aplicações dos nanocorpos na neutralização de toxinas animais
32
Quadro 3 - Aplicações dos nanocorpos em doenças neurodegenerativas
34
Quadro 4 - Demonstração da aplicação de nanocorpos em doença inflamatória
35
Quadro 5 - Aplicações dos nanocorpos em doenças virais
37
Quadro 6 - Aplicações dos nanocorpos em diagnósticos
39
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 15
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 15
3 METODOLOGIA .............................................................................................................. 16
4 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 17
4.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS ANTICORPOS .................................................... 17
4.2 ENGENHARIA DE ANTICORPOS ................................................................................ 19
4.2.1 Anticorpos Monoclonais .............................................................................................. 19
4.2.1.1 Aplicações dos Anticorpos Monoclonais..................................................................... 20
4.2.2 Fragmentos de Anticorpos .......................................................................................... 21
5 ANTICORPOS DE CAMELÍDEOS ................................................................................ 25
5.1 NANOCORPOS DE CAMELÍDEOS .............................................................................. 26
5.1.1 Aplicações potenciais dos nanocorpos ........................................................................ 28
5.1.1.1 Câncer ......................................................................................................................... 29
5.1.1.2 Toxinas ........................................................................................................................ 30
5.1.1.3 Doenças Neurodegenerativas ...................................................................................... 32
5.1.1.4 Inflamatórias ............................................................................................................... 34
5.1.1.5 Virais ........................................................................................................................... 35
5.1.1.6 Diagnóstico ................................................................................................................. 37
CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 40
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 41
13
1 INTRODUÇÃO
Os anticorpos são proteínas plasmáticas que, além de promoverem proteção contra
antígenos, são utilizados como ferramentas para aplicações terapêuticas e diagnósticas
(ABBAS et al, 2008). Constituem o maior grupo de moléculas utilizadas como biofármacos,
com um potencial de aplicação em doenças neoplásicas, inflamatórias e infecciosas
(MCCARRON et al., 2005; CORDEIRO et al., 2014).
Essas moléculas representam ferramentas com ampla aplicabilidade em laboratórios
voltados à diagnóstico e pesquisa em múltiplas áreas do conhecimento. A produção dos
anticorpos monoclonais descritos por George Köhler e Milstein Cesar em 1975, através da
tecnologia de hibridoma, representou o avanço biotecnológico (ABBAS et al, 2008; ROQUE
et al., 2004). Apesar do sucesso da técnica, as aplicações dos anticorpos monoclonais, obtidos
de murinos, apresentam limitações para aplicações clínicas relacionadas com o
desenvolvimento de resposta imune pelo organismo humano contra esses anticorpos,
apresentam baixa capacidade de penetração tecidual e alto custo de produção (AHMAD et al.,
2012; DOS SANTOS et al., 2006; KIJANKA et al., 2015).
Os principais desafios relacionados à produção de imunobiológicos terapêuticos
compreendem, não somente na qualidade e eficácia do anticorpo, mas também no
desenvolvimento de técnicas que gerem menos custos de produção (ROQUE et al., 2004).
Desta forma, novos formatos de anticorpos vêm sendo desenvolvidos. A partir de ferramentas
biotecnológicas e biologia molecular, é possível a manipulação e construção de fragmentos de
anticorpos com menor imunogenicidade (CARNEIRO et al., 2012).
Os fragmentos de anticorpos nos formatos Fab, Fv e scFv apresentam, além de baixa
imunogenicidade, maior capacidade de penetração tecidual e melhor farmacodinâmica
(NELSON, 2010; AHMAD et al., 2012). No entanto, as utilizações de fragmentação dos
anticorpos apresentam limitações, como por exemplo, uma menor estabilidade molecular,
levando a agregação dos fragmentos, um menor tempo de circulação no paciente e baixa
afinidade, além das dificuldades encontradas para produção em larga escala (SIONTOUROU
et al., 2013).
Em busca de novas ferramentas que superem os problemas apresentados pelos
fragmentos de anticorpos, os nanocorpos ou VHHs, derivados de anticorpos de cadeia pesada
de camelídeos têm apresentado grande potencial para aplicações medicamentosas devido as
suas características biofísicas (KOLKMAN; LAW, 2010), podendo ser produzidos a custos
14
relativamente baixos por técnicas de expressão em microrganismos (HARMSEN; HAARD,
2007).
Os nanocorpos apresentam pequeno tamanho molecular de aproximadamente 15
kDa, elevada especificidade e afinidade, e resistência a condições desnaturantes (DE GENST
et al., 2006; DUMOULIN et al., 2002). Outra característica que eles apresentam é a
possibilidade de serem multimerizados para construção de moléculas bivalentes e
biespecíficas (MUYLDERMANS et al., 2009), resultando em maior ligação e inibição de
alvos específicos. Por todas essas características os nanocorpos têm sido atrativos para
diversos estudos com fins terapêuticos e diagnósticos em diferentes doenças, como as
neoplásicas, neurodegenerativas, virais, inflamatórias, autoimunes e infecciosas (MORAIS et
al., 2014).
A potencialidade dos nanocorpos vem sendo explorada em pesquisas acadêmicas e
para fins de produção comercial, como exemplo a empresa Ablynx®, que desenvolve em
colaboração com indústrias farmacêuticas, nanocorpos endereçados a um número variado de
alvos, voltados para doenças agudas e crônicas com finalidade terapêutica. Atualmente, a
empresa possui seis nanocorpos em desenvolvimento em diferentes fases de estudo, voltados
para doenças inflamatórias, hematológicas, neutralização de infecção viral por vírus sincicial
respiratório (RSV), doenças autoimunes e oncológicas.
Visando a importância do conhecimento sobre novos insumos biotecnológicos
empregados nas ciências da saúde, este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento
bibliográfico, sobre a aplicabilidade terapêutica e diagnóstica dos nanocorpos às doenças de
importância médica que acometem o homem, demonstrando sua capacidade de interagir
contra diversos alvos antigênicos.
15
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Demonstrar a diversidade de aplicações dos nanocorpos de camelídeos como
ferramentas alternativas empregadas na terapêutica e diagnóstico de doenças de importância
médica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Descrever as características gerais e funções atribuídas aos anticorpos convencionais;
 Demonstrar as diferentes formatações de anticorpos empregados no campo da ciência;
 Levantar as principais utilizações dos anticorpos monoclonais, fragmentos de
anticorpos e nanocorpos de camelídeos;
 Demonstrar a aplicabilidade dos nanocorpos na terapêutica e diagnóstico de doenças
de importância médica que acometem o homem.
16
3 METODOLOGIA
Este estudo trata-se de uma revisão de literatura especializada, onde a busca foi
realizada no período de junho a novembro de 2015, caracterizando-se uma pesquisa
qualitativa para procedimento monográfico. Foram realizadas consultas bibliográficas em
livros de nível superior, banco de dissertações, teses e periódicos, da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), assim como artigos indexados
disponíveis em endereços eletrônicos. Para isso, foram realizadas pesquisas na Biblioteca
Dom João Batista Costa e consultados os seguintes banco de dados: PubMed, NCBI –
National Center for Biotechnology Information, BVS (Biblioteca Virtual em saúde). Como
estratégias de busca foram utilizadas as palavras- chave: anticorpo, diagnósticos e tratamento,
nanocorpo (VHH) e anticorpo monoclonal.
Como critérios para inclusão foram utilizados artigos bibliográficos e livros voltados
para os eixos temáticos, incluindo tanto os escritos na língua portuguesa quanto inglesa,
publicados entre o período de 1993 a 2015. Foram adotados como critérios de exclusão, o
período de publicação, e os trabalhos que não se enquadraram na abrangência da temática.
17
4 REVISÃO DA LITERATURA
4.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS ANTICORPOS
Um dos mecanismos de defesa do sistema imunológico dos mamíferos frente a
substâncias estranhas denominadas de antígenos (Ags) é através da produção de anticorpos.
Essas moléculas são proteínas plasmáticas efetoras constituídas por polipeptídios e
carboidratos, também denominados de imunoglobulinas (HYDE, 2002).
Os anticorpos são produzidos por linfócitos B, podendo ser encontrados em sua
superfície conferindo especificidade antigênica e desencadeando a expansão clonal (KUBY,
2007) ou podem ser secretados no sangue, tecidos e mucosas, com capacidade de distinguir
diferentes moléculas se ligando fortemente aos patógenos e neutralizando diversas toxinas.
Desencadeiam diferentes mecanismos da resposta imune através da ativação do sistema
complemento, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e processos de
hipersensibilidade imediata, dentre outros (ABBAS et al., 2008).
Com características estruturais semelhantes, os anticorpos são formados basicamente
por duas cadeias polipeptídicas leves (L, Light chains) e duas cadeias pesadas (H, Heavy
chains) (Figura 1A). A cadeia leve com aproximadamente 24 kDa, é composta por uma região
variável (VL, Variable light) e uma região constante (CL, Constant light) unidas por pontes
dissulfeto. A cadeia pesada com peso molecular de 50 a 70 kDa, é constituída por quatro
domínios, sendo um variável (VH) e três constantes (CH1, CH2, CH3) ligadas entre si, além
de uma dobradiça presente entre os domínios CH1 e CH2 que confere ao anticorpo
flexibilidade (ABBAS et al., 2008; CALICH, 2001).
As cadeias L e H possuem uma região aminoterminal variável (VL, Variable Light e
VH, Variable Heavy), estruturalmente reconhecida como Fab (antigen binding fragment),
responsável por reconhecer os antígenos. Cada região variável das cadeias leves e pesadas
possui três regiões hipervariáveis, também denominadas de regiões determinantes de
complementaridade (CDRs, Complementarity determining regions), determinadas a partir da
porção aminoterminal, de CDR1, CDR2 e CDR3, responsável pela especificidade,
diversidade e afinidade do anticorpo, sendo o local específico de ligação dos antígenos
(ABBAS et al., 2008; SIONTOROU, 2013).
Na região constante esta localizado o fragmento Fc (cristalizable fragment) com
funções atribuídas às respostas efetoras, como a eliminação de antígenos através da ativação
de células de defesa do sistema imunológico e ativação do sistema complemento (ABBAS et
al., 2008; MARQUES, 2005).
18
Nos vertebrados existem cinco classes ou isotipos de imunoglobulinas denominadas
de IgD, IgA, IgE, IgM e IgG que se diferem pelas sequências de aminoácidos na porção Cterminal de cada cadeia pesada, peso molecular e cargas elétricas (ABBAS et al., 2008;
NELSON; COX, 2006; MORAIS et al., 2014).
O isotipo IgM apresenta cerca de 180 kDa, e representa a primeira molécula a ser
produzida quando o corpo entra em contato com o antígeno (JANEWAY et al., 2002). Esta
molécula representa cerca de 5 a 10% das Igs séricas, podendo ser expressas na membrana
das células B e secretadas no soro como um pentâmero, apresentando 10 sítios de ligações ao
antígeno, o que possibilita uma ligação com alta avidez de até cinco moléculas
simultaneamente (KUBY, 2007).
A classe IgD, pode ser encontrada na superfície das células B atuando como um
receptor de antígenos. Apresenta peso molecular de 150 kDa e compreende cerca de 0,1%
(0,03 mg/ml) da concentração total das Igs no plasma. Não existem muitos dados sobre a
funcionalidade desta imunoglobulina, porém alguns estudos relatam sua relação com a
diferenciação de células B (TURNER, 2003; PARSLOW et al., 2004).
O isotipo IgA possui de 150 a 600 kDa, está presente principalmente nas secreções
externas como leite materno, salivas, lágrimas, no muco produzido pelo trato geniturinário,
digestivo e brônquico, porém está presente em baixa concentração no soro, correspondendo
cerca de 10 a 15% das Igs séricas (KUBY, 2007).
A IgE é uma imunoglobulina monomérica que apresenta um peso molecular de cerca
de 180 kDa e sua vida plasmática é curta, porém é prolongada quando está associada a
mastócitos no tecido conjuntivo desenvolvendo reações de hipersensibilidade imediata
(JANEWAY, 2002).
O isotipo IgG com peso molecular de 150 kDa, é o mais abundante no soro,
correspondendo a cerca de 80% das Igs séricas (KUBY, 2007). É capaz de atravessar a
barreira placentária e mucosas, ativar o sistema complemento, neutralizar toxinas, além de
realizar os processos de opsonização, aglutinação e bloqueio de antígenos (FORTE, 2004).
Nos seres humanos, além de isotipos, são encontrados subtipos ou subclasses de IgA
(IgA1 e IgA2) diferenciadas pelas sequências de aminoácidos da região constante da cadeia
pesada, e subtipos de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) (ABBAS et al., 2008) diferenciadas
segundo a quantidade presente no soro humano (MURPHY et al., 2010), número de pontes
dissulfeto e comprimento da região de dobradiça (GONÇALVES, 2015).
19
Figura 1. Estrutura da imunoglobulina G (IgG): Na porção aminoterminal, demonstradas a região Fab
(antigen binding fragment) as cadeias Variáveis leves (VL) e pesadas (VH) e regiões Constantes leves (CL) e
pesadas (CH) e os seus respectivos sítios de ligação ao antígeno e regiões de dobradiça, com formação de pontes
dissulfeto estão sendo demonstradas. Na porção carboxiterminal é ilustrada a porção Fc (cristalizable fragment)
contendo as regiões conservadas da cadeia pesada.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, 2013.
4.2 ENGENHARIA DE ANTICORPOS
4.2.1 Anticorpos Monoclonais
Os pesquisadores George Köhler e Milstein Cesar, desenvolverem em 1975 a
tecnologia do hibridoma, que consiste em uma técnica muito eficaz para a produção de
anticorpos monoclonais murinos (mAbs). A tecnologia compreende na fusão de um linfócito
B retirado do baço de camundongos previamente imunizados, com células mielômicas,
originando os hibridomas, que são células secretoras de anticorpos com poder de replicação
indefinido (CORDEIRO et al., 2014; ABBAS et al., 2008).
Apesar do sucesso da técnica, os mAbs murinos apresentam dificuldades em sua
utilização clínica pelo fato que o sistema imunológico dos seres humanos reconhecerem os
anticorpos de camundogos como antígenos, produzindo anticorpos humanos anti-murinos
(human anti-murine antibodies – HAMA) ocasionando a diminuição da meia vida plasmática
20
dos mAbs, desestimulando seu uso repetitivo na terapêutica de doenças (DOS SANTOS et al.,
2006; CARNEIRO et al., 2012).
As dificuldades na utilização clínica, terapêutica e diagnóstica dos mAbs puderam
ser superadas pelo avanço da engenharia genética, que tornou possível a produção de
anticorpos menos imunogênicos (DOS SANTOS et al., 2006; CARNEIRO et al., 2012).
A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o desenvolvimento de novos
formatos de anticorpos, tais como os anticorpos monoclonais quiméricos, obtidos através da
fusão de genes humanos e murinos (MARQUES, 2005). Tais anticorpos possuem a região
variável de camundongos, que é específica para um determinado antígeno, e as regiões
constantes de anticorpos humanos, reduzindo da produção de HAMA, todavia, não o
suficiente para a completa eliminação (QI ZHANG et al., 2007; MARQUES, 2005).
Alternativamente, anticorpos humanizados podem ser produzidos por meio da
recombinação das CDRs murinas com os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas da
imunoglobulina humana, mantendo o anticorpo com sua atividade biológica e quase
irreconhecível ao sistema imunológico do paciente (MARQUES, 2005; MARANHÃO;
BRÍGIDO, 2001). Assim como é possível produzir anticorpos monoclonais completamente
humanos a partir da Tecnologia do DNA Recombinante (rDNA) (CARNEIRO et al., 2012).
4.2.1.1 Aplicações dos Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos mAbs, são reconhecidos pelo FDA (Food and Drug Administration)
dos EUA e disponibilizados à venda com ampla abrangência de aplicações, podendo ser
administrados no tratamento de neoplasias, doenças virais, inflamatórias, auto-imunes e
cardiovasculares (KIJANKA et al., 2015). Atuam inibindo antígenos e moléculas envolvidas
com o desenvolvimento da doença, produzem citotoxicidade mediada por células ou
conjugados a fármacos, podem agir como um sistema de entrega direcionado de drogas (Drug
delivery) (DOS SANTOS et al., 2006; SIONTOROU, 2013).
O primeiro anticorpo mAb aprovado pelo FDA foi o Muromonab-CD3 (Orthoclone
OKT3) com função de reverter rejeições após transplantes de órgãos. Outros mAbs já foram
aprovados pela FDA e estão disponíveis para aplicações na inibição à rejeição de transplantes,
como por exemplo o Daclizumab (Zenapax®) e o Basiliximab (Simulect®) (MARQUES,
2005; REICHERT, 2008; CORDEIRO et al., 2014).
Voltados para emprego como anti-neoplásicos, o anticorpo mAb quimérico
Rituximab (Rituxan®) tornou-se em 2002 umas das principais drogas anti-tumorais em muitos
países. Atua especificamente sobre o antígeno transmembrana CD20, presente em células B
21
de linfomas não-Hodgkin (LNH) ocasionando a lise destas células através da ADCC e
ativação do complemento. O anticorpo mAb Alemtuzumab é dirigido contra uma
glicoproteína de membrana CD52 presentes em pacientes com leucemia linfocítica crônica de
células B. Tratando de anticorpos mAb humanizados, o Gemtuzimab, específico para o
antígeno CD33 atua conjugado a citotoxinas, que são endereçadas a células cancerosas, em
pacientes com leucemia mielóide aguda. O anticorpo mAb Trastuzumabe (Herceptin®) é
aplicado contra um fator de crescimento epidérmico humano (HER2), com capacidade de
parar o desenvolvimento das células tumorais em pacientes com câncer de mama (DOS
SANTOS et al., 2006; CORDEIRO et al., 2014).
Relacionadas às variadas aplicações dos mAbs, estão o Synagis Palivizumab
elaborados contra doenças infecciosas, direcionados ao Vírus Sincicial Respiratório (RSV),
doenças auto-imunes como o Remicade Infliximab, e o Humira Adalimumab para artrite
reumatóide (MARQUES, 2005).
Apesar das múltiplas aplicações, de modo geral os mAbs apresentam características
que limitam seu uso, como por exemplo, o alto custo de produção, elevada imunogenicidade,
o tempo para produção e a baixa afinidade, pois os anticorpos dos camundongos nem sempre
respondem com afinidade elevada a determinados antígenos (AHMAD et al, 2012). Quando
relacionados aos sistemas de entrega de drogas demonstram uma lenta distribuição e uma
baixa penetração no tecido tumoral por apresentarem um tamanho molecular de ~ 150 kDa
(SIONTOROU, 2013). Apresentam citotoxidade quando utilizados por tempos prolongados
podendo gerar lesões renais, e produção de resposta HAMA. Visando superar essas
dificuldades, uma ferramenta para vencer essas limitações está na produção de fragmentos de
anticorpos, resultando em uma maior penetração tecidual e uma rápida distribuição
(MARANHÃO; BRIGÍDO, 2001).
4.2.2 Fragmentos de Anticorpos
A produção de fragmentos de anticorpos se tornou possível quando Rodney Porter
observou em seus experimentos que misturando a enzima papaína com IgGs de coelho
purificadas era possível separar o anticorpo em três fragmentos, sendo dois fragmentos Fab e
um fragmento Fc (Figura 2B) (ABBAS et al., 2008).
Nisonoff e colaboradores em 1960, demonstraram que utilizando a enzima pepsina,
obtinha-se a digestão da porção Fc, gerando um fragmento bivalente com peso molecular de
100 kDa que mantinha sua capacidade de precipitação com o antígeno chamado de F(ab’)2
22
(Figura 2B). Ao misturar o F(ab’)2 com mercaptoetanol se obtinham mais dois fragmentos
monovalentes chamados de Fab’(CALICH, 2001).
Figura 2. Demonstração esquemática da estrutura da IgG1 com seus fragmentos: A. IgG1 convencional; B.
Os fragmentos Fab e Fc são gerados pela clivagem da enzima papaína; C. O fragmento F(ab’)2 desenvolvidos, a
partir de digestão enzimática da pepsina; D. O fragmento Fab’ oriundo da redução por mercaptoetanol.
Fonte: Adaptado de NELSON e COX, 2013; SIONTOROU 2013.
Através da tecnologia de DNA recombinante, os fragmentos de anticorpos podem ser
produzidos em bactérias, leveduras, células de mamíferos, insetos e plantas, obtendo-se altos
rendimentos de fragmentos purificados (MARANHÃO; BRÍGIDO, 2001). Os fragmentos
geralmente produzidos são o Fab (Fragmento de ligação ao antígeno), Fv (Fragmento
23
variável) e scFv (Fragmento variável de cadeia única) (Figura 3) (AHMAD et al., 2012;
MARANHÃO; BRÍGIDO, 2001).
Buscando aumentar a capacidade de reconhecimento a determinados alvos, são
formatados fragmentos bivalentes (Minibody) a partir da união de dois fragmentos anticorpos
específicos para o mesmo antígeno e anticorpos biespecíficos (Diabody) formados pela união
de dois fragmentos de anticorpos com especificidades diferentes (AHMAD et al., 2012;
MARANHÃO; BRÍGIDO, 2001).
Figura 3. Fragmentos de anticorpos obtidos a partir da Tecnologia do DNA Recombinante: A. Fragmento
variável de cadeia única (scFv); B. Fragmento Fab; C. Fragmento biespecífico (Diabody); D. Fragmento
bivalente (Minibody).
Fonte: Adaptado de McCarron et al., 2005.
As utilizações clínicas dos fragmentos de anticorpos apresentam vantagens quando
comparados com anticorpos inteiros, visto que apresentam maior capacidade de penetração
tumoral, diminuição da imunogenicidade, eliminação mais rápida pelo organismo
(KIJANKA, 2015; SIONTOROU, 2013; NELSON, 2010).
Entretanto, apesar do pequeno tamanho e da capacidade de conseguirem penetrar em
tecidos tumorais, os fragmentos possuem como desvantagens a tendência a agregação devido
24
à baixa estabilidade, apresentam menor afinidade com o antígeno e não conseguem promover
as funções efetoras devido à falta do domínio Fc (KINJANKA, 2015; SIONTOROU, 2013;
NELSON, 2010).
Na busca de novas ferramentas para aplicações multiméricas mais eficazes e que
possam superar as limitações apresentadas pelos fragmentos de anticorpos convencionais, têm
sido descrito na literatura os referidos domínios nanocorpos ou VHHs, provenientes de
anticorpos de cadeias pesadas de camelídeos. Devido os mesmos apresentarem características
biofísicas e bioquímicas particulares que os tornam candidatos atrativos para aplicações
terapêuticas e no diagnóstico de doenças (KOLKMAN; LAW, 2010).
25
5 ANTICORPOS DE CAMELÍDEOS
A descoberta de anticorpos desprovidos de cadeias leves tem revolucionado a
engenharia de anticorpos. Descobertos por Hamers-Carsterman e colaboradores na década de
1990, os anticorpos de cadeias pesadas (HCAbs) apresentando cerca de 90 kDa podem ser
encontrados no soro dos membros da família dos Camelídeos (camelos, dromedários, alpacas
e lhamas) e em peixes cartilaginosos (tubarões, raias e skates) (HAMERS-CARSTERMAN et
al, 1993; KIJANKA et al., 2015).
A presença de anticorpos funcionais desprovidos de cadeia leve, presentes nesses
animais com características evolutivas tão distintas (camelídeos e peixes cartilaginosos) não
são facilmente explicáveis. Acredita-se que o surgimento dos HCAbs tanto em camelídeos
quanto em tubarões foram adaptações do sistema imunológico desses animais frente a
situações de estresses semelhantes, levando ao aumento da imunidade nessas espécies
(FLAJNIK et al., 2011).
Os camelídeos apresentam tanto anticorpos convencionais classificados como IgG1
quanto anticorpos compostos exclusivamente por cadeias pesadas, IgG2 e IgG3. A quantidade
desses anticorpos dentre os membros desta espécie é variável. Os níveis séricos dos HCAbs
em camelos variam entre 50-80%, já em lhamas e vicunhas podem chegar de 10-25%. Tais
valores demonstram que esses anticorpos são de grande relevância na proteção imune destes
animais (MUYLDERMANS, 2013; LUIZ, 2014).
Estruturalmente os HCAbs de camelídeos são constituídos unicamente pelos
domínios da cadeia pesada formados por VHH, CH2, CH3, e dobradiça. Uma diferença
estrutural que distingue os HCAbs IgG2 e IgG3, está na região de dobradiça, onde as IgG2
apresentam uma dobradiça prolongada e a IgG3 uma dobradiça curta (Figura 4)
(MUYLDERMANS, 2013).
Os membros da família dos camelídeos apresentam supressão do domínio CH1 que é
dada por uma mutação genética (ROCHA, 2012). Mesmo na a ausência dessas regiões, os
HCAbs são totalmente funcionais, apresentando uma região de dobradiça alongada, que
permite ao anticorpo um maior ângulo de ligação com os antígenos (HAMERSCARSTERMAN et al., 1993). O domínio hipervariável da cadeia pesada, denominado como
VHH, também chamado de nanocorpo é o responsável pelo reconhecimento e ligação ao
antígeno (MUYLDERMANS, 2013).
26
Figura 4. Anticorpos presentes no soro de camelídeos: A. IgG1 (Anticorpo convencional) constituído de
cadeias leves e pesadas; B. IgG2 e IgG3 (HCAbs) formados por um homodímero de cadeias pesadas constituídas
pelos domínios CH3, CH2 e VHH ou nanocorpo, e região de dobradiça. Os HCAbs são desprovidos de cadeia
leve e não apresentam o domínio CH1, a região de dobradiça do anticorpo IgG2 é mais prolongada diferenciando
da IgG3; C. O nanocorpo (Nb) é o menor fragmento de ligação ao antígeno expresso naturalmente e tem um
tamanho de ~15 kDa.
Fonte: Adaptado de Muyldermans 2013.
5.1 NANOCORPOS DE CAMELÍDEOS
Os domínios VHHs ou nanocorpos, possuem características que os tornam
ferramentas potenciais aplicáveis à pesquisa, tais como seu pequeno tamanho, estabilidade a
variações de pH e temperatura, elevada solubilidade, rápida distribuição e eliminação do
organismo, além do baixo custo de produção. São essas vantagens que favorecem a utilização
dos nanocorpos, quando comparados aos fragmentos de anticorpos convencionais aplicados
em áreas biotecnológicas, no diagnóstico e tratamento de doenças (DE GENST et al., 2006;
DUMOULIN et al., 2002; MORAIS et al., 2014; ROCHA, 2012).
Com um tamanho de aproximadamente 15 kDa, o nanocorpo é o menor fragmento de
ligação ao antígeno, derivado de um anticorpo produzido naturalmente (MUYLDERMANS et
al., 1994). Os fragmentos VHHs apresentam características semelhantes à região VH dos
anticorpos convencionais. Eles são formados por 3 CDRs separadas por 4 regiões
Frameworks (FRs) (Figura 5). A similaridade apresentada pelas FRs dos VHHs com VHs dos
27
anticorpos convencionais é de aproximadamente 80%, tornando os nanocorpos menos
imunogênicos quando comparados com fragmento de anticorpos de murinos (CONRATH et
al., 2003; MUYLDERMANS, 2013; LUIZ, 2014; ROCHA, 2012).
Apesar da similaridade apresentada entre os fragmentos VHHs e o VHs de
anticorpos convencionais, a FRs 2 dos VHHs apresentam modificações pontuais com a
ocorrência de substituições de aminoácidos hidrofóbicos encontrados no VH convencional
(importantes na ligação com a VL) por aminoácidos hidrofílicos (Val37Phe, Gly44Glu,
Leu45Arg, Trp47Gly) (Figura 5) resultando em maior solubilidade dos nanocorpos. Para
suprir a ausência da VL presente nos anticorpos convencionais, as alças das CDRs 1 e 3 dos
VHHs se apresentam de forma mais alongada, aumentando o sítio de interação com o
antígeno o que possibilita a interação com regiões inacessíveis a anticorpos convencionais
(MUYLDERMANS, 2013; KOLKMAN et al., 2010; LUIS, 2014; ROCHA, 2012).
Figura 5. Diferenças na organização estrutural do VH de anticorpos convencionais e de VHHs: A.
Substituição de aminoácidos hidrofóbicos por hidrofílicos nos VHHs (indicado de roxo), prolongamento das
CDR3 (vermelho), e a formação de pontes dissulfeto adicionais entre a CDRs(representada em amarelo). B.
estrutura de VH e VHH dobradas.
Fonte: Adaptado de Muyldermans et al., 2009.
Os nanocorpos apresentam resistência química, enzimática e térmica, visto que após
serem submetidos a desnaturação por produtos químicos, e expostos a altas temperaturas
(superiores a 80 ºC), mantém a capacidade de interação ao antígeno. Tais características se
devem a estabilidade da molécula, devido capacidade de renovelamento, atribuídas a presença
constante de resíduos de cisteína nas CDR1 e 3, formando uma ponte dissulfeto adicional
entre as FR2 e CDR3 aumentando a estabilidade estrutural do nanocorpo (DUMOULIN et al.,
2002; MUYLDERMANS et al., 1994; ROCHA et al., 2014; LUIS, 2014; PEREIRA, 2013).
Estruturalmente os nanocorpos possibilitam a construção de formatações
multiméricas, bivalentes ou biespecíficos, a partir da fusão gênica, devido o fato de se
apresentarem como monômeros, com gene de aproximadamente 350pb e por suas
características físico-químicas (MUYLDERMANS et al., 2009; KOLKMAN et al., 2010).
28
Devido a possibilidade de elaborações em diferentes formatações, os nanocorpos
apresentam grande interesse na área médica, possibilitando o desenvolvimento de estratégias
para aumentar o tempo de meia vida em soros, inibir atividade viral e mediar citotóxicidade,
por meio de células em tecidos tumorais, aumentando a avidez ao antígeno em até 4000 vezes
quando formulados nas formulas multiméricas (KOLKMAN et al., 2010).
Figura 6. Formatações com Nanocorpos: A. Monomérico. B. Bivalente. C. Biespecífico. D. Conjugado a
enzima. E. Conjugado a toxina. F. Conjugado a micelas carregando fármacos.
Fonte: Adaptado de Smolarek et al., 2012; Kijanka et al., 2015.
5.1.1 Aplicações potenciais dos nanocorpos
Por apresentarem características únicas como um tamanho reduzido, alta
estabilidade, elevada afinidade e especificidade, os nanocorpos podem ser aplicados
amplamente no diagnóstico e terapêutica (GONÇALVES, 2015) de doenças autoimunes,
infecciosas (ROCHA, 2012), inflamatórias, neoplásicas, neurodegenerativas, virais,
neutralização de toxinas animais, entre outras (MORAIS et al. 2014).
29
5.1.1.1 Câncer
Os nanocorpos são vistos como uma ferramenta potencial para aplicações
terapêuticas e diagnósticas em neoplasias (PRUSZYNSKI et al., 2014). Estão disponíveis três
plataformas definidas para utilização dos nanocorpos no tratamento do câncer. A primeira
compreende na utilização de nanocorpos livres, a segunda esta relaciona a utilização de
nanocorpos fusionados com domínios efetores, tais como domínio Fc, TRAIL solúvel,
exotoxina A de Pseudomonas, radionuclídeos terapêuticos, enzimas, dentre outros, e a terceira
plataforma é baseada no uso de nanocorpos associados a nanopartículas como os lipossomos,
micelas, poliplexos e albuminas que carregam em seu interior drogas citotóxicas (Figura 6)
(KIJANKA et al., 2015).
Esses domínios podem ser produzidos contra alvos extracelulares que induzem a
proliferação celular cancerígena. Dentre esses alvos estão quimiocinas e receptores de
membranas que são expressos ou superexpressos quando há presença de neoplasias. Os
receptores de membrana (fatores de crescimento) que foram observados são: EGFR1 (HER1),
EGF2 (HER2), VGFR2, c-Met, CXCR7, MUC-1 e CEA (antígeno carcinoembrionário).
Em trabalho realizado in vivo por Roovers e colaboradores (2014) utilizando
nanocorpos biparatópicos anti-EGFR, produzidos contra a proteína EGFR, um fator de
crescimento epidérmico encontrado em neoplasias do colón, mama, cabeça, pescoço e
cérebro, foi demonstrado à inibição da proliferação celular tumoral em camundongos
(ROOVERS et al., 2014).
Cortez-Rotamozo e colaboradores (2004) utilizaram nanocorpos acoplados a enzima
lactamase, responsável por ativar um pró-fármaco contra o antígeno carcinoembrionário
(CEA), que é produzido em grande quantidade em tumores epiteliais do pulmão, colo, reto,
mama e ovários. Os nanocorpos mantiveram se estáveis a altas temperaturas, obtiveram boa
penetração, homogeneização e eliminação, resultando na cura do tumor sem efeitos
citotóxicos no organismo de camundongos (CORTEZ-ROTAMOZO et al., 2004).
Os pesquisadores Heukers e coloboradores realizaram estudos com o receptor c-Met
(Receptor do fator de crescimento de hepatócitos) que esta envolvido no desenvolvimento,
progressão e metástase de neoplasias hematológicas, cólon, mama e ovário. Observaram que
os nanocorpos anti c-Met, ligados a albumina foram internalizados, resultando na degradação
na célula tumoral, demonstrando a eficácia dos VHHs para atuação em sistema de entrega de
drogas (KINJANKA et al., 2015; HEUKERS et al., 2014).
30
Em outro estudo envolvendo o receptor c-Met, nanocorpos foram produzidos com o
intuito de competir com uma proteína ativadora do receptor, denominada de HGF (fator de
crescimento de hepatócitos). No estudo, os nanocorpos promoveram a inativação do receptor,
diminuindo a proliferação celular e a metástase em teste in vitro (SLORDAHL et al., 2013;
KINJANKA et al., 2015).
Behdani e colaboradores (2011) conseguiram desenvolver um nanocorpo (3VGR19)
que tinha como alvo o Receptor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR2),
importante no crescimento de tubos capilares em processos de metástase. Como resultado, o
nanocorpo bloqueou o receptor VEGFR2 e conseguiu inibir em testes in vitro o crescimento
de tubos endoteliais. Anos depois o mesmo nanocorpo foi conjugado com exotoxinas A de
Pseudomonas, conseguindo inibir em testes in vitro a proliferação de células tumorais que
expressão o receptor VEGFR2 (BEHDANI et al., 2011; 2013).
Em outro teste, nanocorpos foram conjugados com PEI (Polietileneimina) ligados
por PEG (POLIETILENO GLICOL) tendo como alvo o antígeno MUC1, super-expresso em
câncer de mama e cólon. Como resultado os poliplexos conseguiram induzir a morte celular
das células que super-expressavam o antígeno MUC1 (SADEQZADEH et al., 2011).
Quadro 1. Os principais alvos utilizados contra doenças neoplásicas: São indicados as Regiões e órgãos
acometidos, as respectivas plataformas de produção de nanocorpos e as referências.
Nanocorpos aplicados ao câncer
Alvos
Regiões Acometidas
Plataformas
Referências
EGFR
Colón, mama, cabeça, pescoço e
cérebro
A
ROOVERS et al., 2014.
CEA
Pulmão, cólon, reto, ovário e mama
B
CORTEZ-ROTAMOZO et al., 2004.
c-Met
Hematológicas, cólon, mama e ovário
AeC
HEUKERS et al., 2014; SLORDAHL et
al., 2013.
VEGFR2
Pulmão e cólon
AeB
MUC-1
Mama e cólon
C
BEHDANI et al., 2011; 2013.
SADEQZADEH et al., 2011.
5.1.1.2 Toxinas
O veneno de cobras, escorpiões e aranhas são constituídos por substâncias
neurotóxicas que têm como função a imobilização de suas presas. Cobras e aranhas ainda
contêm em seu veneno um conjunto de proteínas (fosfolipases e proteinases) que causam
degradação muscular e hemólise nos pacientes (RONCOLATO et al., 2015).
31
O tratamento utilizado em pacientes envenenados por toxinas animais é feito por
meio da administração de imunoterápicos derivados de cavalos (RONCOLATO et al., 2015) e
ovelhas hiperimunizados. Entretanto, o elevado custo de produção, baixa estabilidade,
pequena capacidade de neutralizar toxinas em tecidos profundos associados à possibilidade de
gerar reações adversas dificultam a utilização destes soroterápicos (LUIZ, 2014; HMILA et
al., 2008).
Visando buscar alternativas para otimizar a imunoterapia, estudos vêm sendo
desenvolvidos com base em nanocorpos. A baixa imunogenicidade aliados com a
possibilidade de formação de fragmentos multivalentes ou multiespecíficos, fazem dos
nanocorpos insumos potenciais para aplicações na imunoterapia para envenenamento com
toxinas (HMILA et al., 2008).
Em estudo realizado por Hmila e colaboradores (2008), construções bivalentes de
nanocorpos foram testadas em camundongos contra a toxina AahI presente no veneno do
escorpião Androctonus australis Hector. Os nanocorpos de camelídeos demonstraram uma
maior capacidade de neutralização da toxina quando comparados com fragmentos scFv
testados (HMILA et al., 2008; RONCOLATO et al., 2015).
Chgoury e colaboradores (2015) analisaram a capacidade de neutralização do
nanocorpo F12-10, específicos contra a proteína AahI e AahII, de uma fração da toxina F3
presente no veneno de escorpião Androctonus mauretanicus (AM). Nos testes realizados in
vitro foi possível observar a capacidade de redução dos danos teciduais e nos ensaios
realizados em in vivo, os nanocorpos apresentaram capacidade de neutralização do efeito letal
evitando a morte de 50% dos camundongos envenenados (CHGOURY et al., 2015).
No trabalho realizado por Luiz (2014) foi possível a seleção e caracterização de
nanocorpos ativos contra crotoxina, uma neurotoxina presente no veneno de serpente Crotalus
durissus terrificus. O autor sugere o uso dos nanocorpos como uma ferramenta potencial para
aplicações na terapêutica dos acidentes envolvendo envenenamento crotálico, em associação
com os soroterápicos disponíveis (LUIZ, 2014).
Perspectivamente os nanocorpos podem ser em um futuro próximo utilizado para
tratar o envenenamento de serpentes e escorpiões (LUIZ, 2015; HMILA et al., 2008), pois
apresentam um baixo custo de produção e não causam respostas no organismo
(HASSANZADEH-GHASSABEH et al., 2013), além de poderem ser utilizados como
insumos para o desenvolvimento de kits para diagnósticos (GONÇALVES, 2015).
Na vertente de aplicações de nanocorpos para toxinas animais, em um estudo
realizado por Brummelhuis e colaboradores (2010), nanocorpos tinham como alvo uma toxina
32
produzida por estafilococos, a TSST-1 (Toxina 1 da síndrome do choque tóxico) causadora da
síndrome do choque tóxico. Neste estudo, o VHH anti-TSST-1 demonstrou ser muito
eficiente na remoção da toxina in vitro, porém não apresentou bons resultados quando
aplicados em testes in vivo (BRUMMELHUIS et al., 2010).
Outro estudo atesta a capacidade de neutralização e eliminação das toxinas Shiga
(Stx1 e Stx2) produzidas pela Escherichia coli (STEC – Escherichia coli produtora da toxina
Shiga). Os nanocorpos produzidos apresentaram uma enorme capacidade de neutralização da
toxina quando associados com o anticorpo monoclonal antitag, obtendo capacidade de
eliminação e neutralização da toxina, promovendo uma maior proteção aos camundongos
(TREMBLAY et al., 2013).
Dong e colaboradores (2010) conseguiram, a partir de bibliotecas de anticorpos
lhamas não imunizadas, isolar nanocorpos inibidores da neurotoxina botulínica BoNT
produzida pela bactéria, Clostridium botulinun, utilizando para expressão dos nanocorpos a
levedura Shaccharomyces cerevisiae. Como resultado, além de apresentarem os nanocorpos
como potencias inibidores da toxina botulínica, este estudo validou a capacidade de
bibliotecas de VHH não-imunes serem utilizadas e definiram o α-exosítio como alvo para o
desenvolvimento de fármacos para o tratamento da toxina butolínica (DONG et al., 2010).
Quadro 2. Aplicações dos nanocorpos na neutralização de toxinas animais: Demonstração dos alvos de
estudo, origem animal , os danos gerados e referências.
Nanocorpos contra toxinas animais
Alvos (toxinas)
Origem
Doença ou dano
Referências
AahI e AahII
Escorpião
Neuromuscular
HMILA et al., 2008;
CHGOURY et al., 2015.
Crotoxina
Serpentes
Neuromuscular
LUIZ, 2014.
TSST-1
Bactérias
Síndrome do choque tóxico
BRUMMELHUIS et al.,
2010.
Shiga (Stx1 e Stx2)
Bactérias
Diarréia sanguinolenta, cólica abdominal e
HUS (Síndrome Urémica Hemolitica)
TREMBLAY et al., 2013.
BoNT –
Neurotoxina
Botulínica
Bactérias
Paralisia muscular flácida. (anticorpo –
VHH Aa1)
DONG et al., 2010.
5.1.1.3 Doenças Neurodegenerativas
A distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) é uma doença que causa o
enfraquecimento do músculo palpebral, gerada pelo acumulo da proteína nuclear de ligação
(PABPN1) podendo levar a apoptose. A OPMD é classificada como uma doença de
33
agregação de proteína, assim como as doenças neurodegenerativas (Parkinson, doença de
Huntington, Alzheimer e demência) (CHARTIER et al., 2009).
Os nanocorpos gerados intracelularmente (intrabody, intracorpos) contra a proteína
PABPN1, apresentaram em testes in vivo a restauração genética muscular após a inibição da
agregação do PABPN1. Dessa forma, intracorpos podem ser produzidos com o intuito de
serem utilizados na terapêutica das doenças como Alzheimer, Parkinson e doença de
Huntington (CHARTIER et al., 2009).
Estudos indicam que a doença de Parkinson, Alzheimer e acidente vascular cerebral
têm como mecanismo patológico a morte celular induzida por estresse oxidativo. Quando as
mitocôndrias produzem uma quantidade exagerada de espécies reativas de oxigênio (ROS),
este excesso resulta na ativação de uma proteína denominada de Bax levando uma alteração
da permeabilidade da membrana mitocondrial, permitindo a saída de agentes pró-apopitóticos
como o citocromo C e caspase-9 (GUEORGUIEVA et al., 2006).
Com o intuito de promover uma proteção contra estresse oxidativo, nanocorpos de
lhama anti-Bax apresentaram capacidade de inibição da apoptose em células de mamíferos.
Estes resultados demonstram que os nanocorpos podem ser propostos a ampliação de estudos
envolvendo a proteína Bax em processos apoptóticos induzidos por estresse oxidativo e como
uma nova terapia para doenças como o Alzheimer, Parkinson e acidente vascular cerebral
(AVC) (GUEORGUIEVA et al., 2006).
Em trabalho realizado por Lafaye e colaboradores (2009) foram produzidos
nanocorpos capazes de reconhecer seletivamente as formas oligoméricas do peptídeo βamilóide (Aβ) intraneuronal, que constituem marcadores biológicos utilizados para o
diagnóstico clínico da doença de Alzheimer, devido seu acúmulo nas placas senis, que
constituem indicadores patológicos da doença. Neste estudo, o nanocorpo V31-1 conseguiu
inibir a toxicidade causada pelos oligômeros e, além disso, interrompeu a formação de
emaranhados neurofibrilares dentro dos neurônios, ocasionados pela fosforilação da proteína
tau. Esses resultados demonstram que os nanocorpos podem ser utilizados para fins de
imunodiagnóstico, alem de prevenir a neurotoxidade induzida por Aβ e inibir formações
fibrilares (LAFAYE et al., 2009).
Na vertente, de nanocorpos intracelulares foram produzidos contra a enzima Caspase
3, uma enzima envolvida em quase todos os processos de apoptose celular. Neste estudo dois
nanocorpos foram produzidos contra a Caspase 3 (VhhCasp31 e VhhCasp32). O VhhCasp31
(antagonista) foi capaz de promover a proteção contra a apoptose gerada por estresse
oxidativo, enquanto que o VhhCasp32 (agonista) aumentou a capacidade apoptótica da
34
Caspase 3. Ambos os anticorpos demonstram ter grande potencial para serem utilizados na
terapêutica de doenças, podendo o VhhCasp31 ser aplicado em doenças neurodegenerativas e
o VhhCasp32 aplicado em neoplasias induzindo apoptose (MCGONIGAL et al., 2009).
Quadro 3. Aplicações dos nanocorpos em doenças neurodegenerativas: demonstração dos alvos envolvidos
na doença, assim como a patologia envolvida e os nomes dos nanocorpos.
Nanocorpos contra doenças neurodegenerativas:
Alvo
Doença
Nanocorpo
Referências
PABPN1
Distrofia Muscular oculofaríngea
Intrabody 3F5
CHARTIER et al., 2009.
Bax
Alzheimer, Parkinson e AVC
Anti-Bax
GUEORGUIEVA et al.,
2006.
Caspase 3
Alzheimer, Parkinson, AVC e
câncer
VhhCasp31 e
VhhCasp32
MCGONIGAL et al., 2009.
β-amilóide
(Aβ)
Alzheimer
V31-1
LAFAYE et al., 2009.
5.1.1.4 Inflamatórias
O TNF (Fator de Necrose Tecidual) é uma citocina que tem como uma de suas várias
funções a proteção do organismo contra microrganismos através da indução de processos
inflamatórios. As células secretam TNF após estímulos, desencadeados por microrganismos,
mediadores lipídicos, células tumorais, citocinas e quando há formação de imuno-complexos
para tentar gerar a eliminação do patógeno (HÉLIO, 2008).
Entretanto, quando produzido sem controle, o TNF esta associado com uma série de
doenças graves, como a artrite reumatóide, esclerose múltipla, doenças inflamatórias
intestinais, alergias, rejeição de enxertos e choque séptico (HÉLIO, 2008). O tratamento da
artrite reumatóide (RA), assim como em outras doenças inflamatórias, pode ser feito por meio
do bloqueio de TNF por via de drogas, apresentando ótimos resultados (COPPIETERS et al,
2006).
Nesta perspectiva, nanocorpos monovalentes e bivalentes foram projetados para
atuarem de forma antagônica contra o TNF em testes in vivo. Como resultado, obtiveram
melhor potência do que os anticorpos monoclonais (infliximab e adalimumab) utilizados no
tratamento da AR. Esse estudo demonstrou que os nanocorpos têm grande possibilidade de
serem utilizados no tratamento de doenças inflamatórias e apresentam um baixo custo na
produção (COPPIETERS et al., 2006).
35
Quadro 4. Demonstração da aplicação de nanocorpos em doença inflamatória
Nanocorpo contra alvos ligados à inflamação
Alvo
Doença
Nanocorpo
Referências
TNF
Artrite Reumatóide
VHH anti-TNF - antagonista
COPPIETERS et al., 2006.
5.1.1.5 Virais
Anticorpos neutralizantes quando aplicados para o tratamento viral, interferem na
disseminação do vírus no organismo hospedeiro, impedindo a entrada dele na célula por meio
da anulação da fixação nas células, também pode afetar a penetração na membrana, o
desencapsulamento e a transcrição do RNA viral (MINAEIAN et al., 2012).
Em estudo realizado por ZHU e colaboradores (2014), quatro nanocorpos de
camelídeos foram produzidos e selecionados tendo como alvo o vírus H3N2. Estes
nanocorpos expressos em E. coli apresentaram elevada especificidade e afinidade,
possibilitando a formação de Kits diagnósticos rápido e com um custo mais acessível,
utilizando para isso a conjugação de VHHs anti-H3N2 com esférulas magnéticas. Os autores
deste método, afirmam que o estudo pode viabilizar o diagnóstico de outros subtipos de vírus
da gripe (ZHU et al., 2014).
Em busca de promover a proteção e o diagnóstico contra o grupo A de rotavírus em
crianças menores de 5 anos e de recém nascidos de algumas espécies animais, Garaicoechea e
colaboradores (2008) produziram VHHs específicos contra uma proteína VP6 presente em
todos os subtipos de vírus do grupo A. Os resultados obtidos nesse estudo demonstrou que 4
nanocorpos se ligaram especificamente a proteína do vírus e dentre esses nanocorpos, 3
conseguiram neutralizar o vírus in vitro, e cerca de 60% de proteção contra a diarréia
causada pelo vírus em teste in vivo. Com isso os autores afirmam que os nanocorpos são bons
candidatos para o tratamento do rotavírus (grupo A) e reconhecimento em testes de ELISA,
podendo
ser
utilizados
também
no
desenvolvimento
de
kits
para
diagnóstico
(GARAICOECHEA et al., 2008).
Hultberg e colaboradores demonstraram em construções de nanocorpos multivalentes
e biespecíficos contra o vírus Sincicial Respiratório (RSV), Raiva e Influenza H5N1 uma
maior capacidade de neutralização quando comparado com anticorpos monoclonais
(HULTBERG et al., 2011).
Na busca de um melhor tratamento para o HIV, Koh e colaboradores (2010)
construíram nanocorpos específicos contra a glicoproteína (gp120) do envelope do vírus HIV-
36
1, uma proteína importante no processo de entrada na célula hospedeira. Foram selecionados
por meio de bibliotecas específicas de VHH 49 nanocorpos e 31 foram sequenciados para
análise dos aminoácidos que interagem reconhecendo e neutralizando o vírus HIV-1,
possibilitando no futuro uma nova geração de vacinas (KOH et al., 2010; ROCHA, 2012).
Já no estudo realizado por Jähnichen e colaboradores (2010), nanocorpos
antagonistas foram criados para se ligarem a um receptor de quimiocinas (CXCR4), que é um
importante receptor de entrada do vírus HIV, além disso, atua na migração de células
estaminais, organogênese, reparação de tecidos, inflamação e processos de metástases. A
construção de nanocorpos CXCR4 foram capazes de impedir a quimiotaxia e a ligação do
HIV nas células (JÄHNICHEN et al., 2010).
O mais recente estudo de aplicação dos nanocorpos, publicada por Jittavisutthikul e
colaboradoes (2015), têm em vista o vírus da hepatite C (HCV). Por serem capazes de se
ligarem a sítios inalcançáveis por anticorpos convencionais e inibirem atividade enzimática,
VHHs humanizados foram direcionados a protease NS3/4A (importante no processo de
replicação viral e proteção contra as células do hospedeiro). Os VHHs foram fusionados a um
peptídeo penetrante celular (PEN) e apresentaram um grande potencial na inibição da
replicação viral, e aumentaram a atividade inata do sistema imunológico do hospedeiro, que
tinha sido reduzida anteriormente pelo vírus (JITTAVISUTTHIKUL et al.,2015).
37
Quadro 5. Aplicações dos nanocorpos em doenças virais: quais os alvos envolvidos, vírus e o nome do
nanocorpo.
Nanocorpos contra doenças virais:
Alvo
Vírus
Nanocorpo
Referências
Influenza A H3N2
Influenza A H3N2
NB3
MIN ZHU et al., 2014.
VP6
Rotavírus (Grupo A)
GARAICOECHEA et al.,
2008.
Proteína de fusão – F,
Proteína G e
Hemaglutinina 5
Sincicial Respiratório RSV, Raiva e Influenza H5N1
2KD1, 3A6, 3B2 e
2KA4
RSV-D3, RSVD3/E4(9GS);
Rab-E8, Rab-H7;
Infl-C8, Infl-B12
Glicoproteína gp120
HIV-1
A12 e D7
KOH et al., 2010.
Receptor de quimiocinas
CXCR4
HIV
238D2 e 238D4
JÄHNICHEN et al., 2010.
Protease NS3/4A
Hepatite C – HCV
PEN-VHH 24 e
VHH 24
JITTAVISUTTHIKUL et
al.,2015.
HULTBERG et al., 2011.
5.1.1.6 Diagnóstico
Os nanocorpos vêm sendo empregado em algumas técnicas de imagem, como por
exemplo, a imagem óptica, ultrassom, cromatografia por emissão de pósitrons (PET) e
tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT). As técnicas de imagem
por PET e SPECT utilizam radionucleotídeos e apresentam uma sensibilidade elevada
permitindo a visualização dos alvos (CHAKRAVARTY et al., 2014).
Os estudos baseados em nanocorpos como insumos para o desenvolvimento de
diagnóstico têm sido direcionado para as neoplasias, doenças cardiovasculares (aterosclerose)
(MORAIS et al., 2014), artrite reumatóide, entre outras (Quadro 6) (CHAKRAVARTY et al.,
2014).
Em estudos com o fator de crescimento epidérmico (EGFR), nanocorpos foram
conjugados com o quelante DF-Bz-NCS e marcados com um emissor de positrões de curta
duração
68
Ga (radionucleotídeo). Os testes feitos com o nanocorpo
68
Ga-DF-Bz-NCS-7D12
demonstraram que eles obtiveram uma acumulação rápida em xenoinxertos A431 em
camundongos, pois cerca de 1 hora após a aplicação do anticorpo, já se tinham imagens de
alto contraste. Estes resultados demonstrando uma rápida biodistribuição e acumulação indica
que o uso de nanocorpos para a detecção de EGRF é muito promissor (VOSJAN et al., 2011).
Comparando dois nanocorpos Anti-EGFR 7C12 e 7D12 (produzidos pela empresa
Ablynx NV) radiomarcados com
99
mTc, Gainkam e colaboradores (2008) avaliaram a
capacidade de penetração tecidual, afinidade e depuração renal de ambos os nanocorpos com
38
fins de diagnóstico. Como resultado, os nanocorpos demonstraram ter boa eficácia na ligação
com o receptor, boa depuração renal e baixo acúmulo hepático gerando imagens com alto
contraste após 1 hora da aplicação em camundongos (GAINKAM et al., 2008).
Em outro estudo Cortez-Retamozo e colaboradores (2008) testaram a capacidade de
ligação do nanocorpo
99
mTc-His6-CEA1 à proteína CEA em camundongos. Os resultados
demonstraram uma depuração hepática e renal, com absorção média, apresentando ter um
bom contraste no tecido tumoral (CORTEZ-RETAMOZO et al., 2008).
Para um diagnóstico não invasivo de placas de ateroma, nanocorpos radiomarcados
foram criados para se ligarem a uma molécula de adesão celular e vascular (VCAM-1)
presente na superfície dos leucócitos, importantes no desenvolvimento do processo
inflamatório relacionado a lesões de placas de ateroma. Os VHHs foram capazes de detectar a
expressão de VCAM1 e obtiveram atividade cruzada em humanos e camundongos in vitro
(BROISAT et al., 2012).
Para a artrite reumatoide (RA), nanocorpos foram conjugados a um emissor de fóton
único (99TC) para serem detectados por meio de SPECT. O alvo visado foi um receptor de
manose dos macrófagos (MMR) presentes no fluído sinovial das articulações inflamadas. Os
osteoclastos (linhagem de macrófagos) destroem o tecido ósseo na presença de RA, quando
esta é provocada por meio do colágeno em camundongos. Nesse estudo, a tecnologia de
nanocorpos para geração de imagens foi utilizada para um melhor controle e quantificação da
inflamação (PUT et al., 2013).
No estudo realizado por Kijanka e colaboradores (2013), nanocorpos anti-HER2
foram conjugados com NIR fluorophore IRDye 800CW (IR) para o monitoramento de
cirurgias por meio de imagens. Como resultado, o nanocorpo 11A4-IR apresentou acumulo no
tecido tumoral cerca de 20 vezes mais rápido e com melhor contraste, quando comparado com
o anticorpo monoclonal Trastuzumab-IR, permitindo o monitoramento através de imagens na
cirurgia do xenoenxerto, validando o uso deles como sondas para a geração de imagens
Em trabalho realizado por Pereira e colaboradores (2014) são propostos nanocorpos
oriundos de Lama glama como insumos alternativos para o desenvolvimento de dispositivos
diagnóstico para detecção do Hantavírus. Os achados demonstram que os nanocorpos
selecionados contra a proteína recombinante do Nucleocapsídeo viral, são capazes de
reconhecer o vírus em soro de roedores, os reservatórios naturais dos hantavírus, apontando
seu uso para o desenvolvimento de dispositivos para o diagnóstico viral.
39
Dirigidos contra uma proteína importante do capsídeo do Papilomavírus Humano
(HPV) denominada de L1, nanocorpos foram obtidos por meio de bibliotecas de fagos. Os
resultados obtidos por ELISA demonstraram a especificidade dos nanocorpos contra a
proteína L1. Com isso, novas propostas surgirão propondo um melhor diagnóstico e uma
maior proteção contra a infecção do vírus HPV (16), como por exemplo, a utilização de géis e
soluções de lavagem vaginal (MINAEIAN et al., 2012).
Quadro 6. Aplicações dos nanocorpos em diagnósticos: demonstrando quais os alvos e as doenças envolvidas,
e o nome do nanocorpo.
Diagnóstico:
Alvo
Doença
Nanocorpo
Referências
EGFR
Câncer do colón, mama, cabeça,
pescoço, cérebro e próstata
7D12
VOSJAN et al., 2011.
EGFR
Câncer do colón, mama, cabeça,
pescoço, cérebro e próstata
CEA
Adenocarcinoma de cólon
humano
CEA1
VCAM-1
Aterosclerose
cabVCAM1-5
Receptor de manose dos
macrófagos – MMR
Artrite reumatoide
Α-MMR
PUT et al., 2013.
HER2
Câncer de mama, cólon e ovário
11A4-IR
KIJANKA et al.,
2013
rNΔ85
Hantavírus
KC329708
PEREIRA et al.,
2014.
Proteína L1
Papiloma Vírus Humano – HPV
SM5 e SM8
MINAEIAN et al.,
2012.
99m
Tc-7C12 e
Tc-7D12
99m
GAINKAM et al.,
2008.
CORTEZRETAMOZO et al.,
2008.
BROISAT et al.,
2012.
40
CONCLUSÃO
Os anticorpos monoclonais e os fragmentos de anticorpos são importantes
ferramentas utilizadas no tratamento e diagnóstico de doenças humanas, apesar de
apresentarem limitações clínicas, farmacológicas e de produção. Dentre os fatores limitantes
para utilização de anticorpos como imunobiológicos, estão relacionados a sua eficácia,
qualidade e custo benefício. Estes, são importantes critérios exigidos para a utilização de uma
nova geração de anticorpos como insumos para aplicações terapêuticas.
Como proposta de novos imunoterápicos que superem os obstáculos apresentados
pelos mAbs e pelos fragmentos de anticorpos, os nanocorpos ou VHHs contêm características
que se adéquam as exigências propostas para as utilizações clínicas e diagnósticas de
anticorpos. Dentre essas estão incluídas, a baixa imunogenicidade, devido a semelhanças
estruturais com os anticorpos humanos. Capacidade de penetração tecidual e rápida
eliminação do organismo por possuírem um tamanho de aproximadamente 15 kDa. Maior
solubilidade que os anticorpos convencionais, devido às substituições de aminoácidos
hidrofóbicos por hidrofílicos na FR2. São estáveis a variações de temperatura e pH, devido a
presença de pontes dissulfeto adicionais, o que também favorece uma boa capacidade de
remodelamento. Maior capacidade de interação e alcance de sítios inacessíveis a outros
anticorpos, por possuirem a região CDR3 mais prolongada. Capacidade de conjugação a
nanopartículas, podendo atuar como sistemas de entrega de drogas ou como moduladores de
imagem, auxiliando na imaginologia. São facilmente clonados e produzidos em larga escala
por meio de expressão em microorganismos e podem ser formatados em construções
multivalentes ou multiespecificas.
Diversos estudos vêm demonstrando o potencial de aplicação dos nanocorpos para o
tratamento e diagnóstico de diversas doenças, dentre elas estão, as neoplásicas, autoimunes,
neurodegenerativas, virais, envenenamento por escorpiões, serpentes e toxinas animais, e da
possibilidade da aplicação em diagnóstico por imagem.
Alem da existência de inúmeras pesquisas acadêmicas em desenvolvimento, tratando
sobre a utilização dos nanocorpos nos diversos campos da ciência, estão sendo produzidos,
pela empresa belga ABLYNX (http://www.ablynx.com), em estudos e testes de fase-clínica
nanocorpos para fins de liberação no mercado farmacêutico. Enfim, de acordo com que foi
levantado,
os
trabalhos
evidenciam
os
nanocorpos,
como
potencias
insumos
imunobiotecnológicos, podendo ser utilizados em um futuro próximo para diversos fins
diagnósticos e terapêuticos.
41
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CENTRO DE ENSINO FACULDADE SÃO LUCAS Yuri Vasconcelos

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