Teste de Antioxidantes: Teste de Antioxidantes:

Teste de Antioxidantes:
As últimas novidades sobre o ORAC
Avaliar a capacidade antioxidante é um desafio, mas o
ORAC e outros métodos similares podem ser a melhor
solução diante de toda confusão a respeito deste assunto.
Ginny Bank, MA
Diretora Técnica da
RFI Ingredients
Blauvelt, NY
&
Alex Schauss, PhD, FACN, CEDS
Diretor de Pesquisas de Produtos Naturais e Medicinais
da Life Sciences Division American Institute
for Biosocial and Medical Research, Inc.
Puyallup, WA
Durante um período de tempo que
abrange 138 anos de pesquisas, o U.S
Agricultural Research Service (a
Divisão interna de pesquisas do U.S.
Department of Agriculture) relaciona
uma lista com a automação dos
experimentos sobre a Capacidade de
Absorção de Radicais de Oxigênio
(comumente conhecido como teste
ORAC) método que é considerado uma
das mais importantes realizações para a
Pesquisa¹. (Uma descrição detalhada do
teste ORAC foi previamente discutida
no NUTRACEUTICAL WORLD em
setembro de 2002²). O método original
foi desenvolvido por Cutler e Cao³ no
National Institutes on Aging em
Baltimore, MD, mas este método
precisava ser automatizado e foi
considerado complicado para medir
lado a lado o valor ORAC de muitas
amostras. Eventualmente, o Dr. Cao ia
até o laboratório do Dr. Ronald Prior no
USDA Human Nutrition Research
Center on Aging na Tufts University em
Boston, MA, levando o método com
ele. O objetivo inicial era determinar se a
produção de óxido nítrico alteraria a
atividade antioxidante in vivo. Mas antes
que continuassem com a pesquisa, eles
queriam saber se o método poderia ser
utilizado para avaliar alimentos. De
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acordo com o Dr. Prior, que ainda
participa das pesquisas
antioxidantes/ORAC, os resultados
“realmente mudaram a direção da nossa
programação das pesquisas. Naquele
momento, não tínhamos idéia de que o
método teria uma utilização tão ampla”
Embora os princípios químicos
fundamentais e o modelo matemático
do método ORAC permaneciam iguais
desde 1994, eles acabaram tendo com o
passar do tempo, algumas melhorias e
mudanças significativas. Em 2001,
cientistas do Brunswick Laboratories,
Inc., Wareham, MA, trabalhando em
conjunto com o Dr. Prior, substituíram
a prova original b-phycoerythrins (PEs)
um pigmento fluorescente de alga
vermelha, por fluoresceína (FL)4. O FL
comparado ao PEs, não interage com os
antioxidantes, demonstrando excelente
foto-estabilidade e reduzindo o custo
dos experimentos. Logo depois, mais
progressos ocorreram quando um
outro método foi desenvolvido e
validado para medir o ORAC de
antioxidantes lipofílicos utilizando
aleatoriamente o álcool desnaturado
beta ciclodextrina para acentuar a
solubilidade 5.
Além do teste ORAC, que determina a
atividade de eliminação dos radicais
livres contra os radicais de peroxil tanto
para substâncias solúveis em água como
em lipídeos, o Brunswick Laboratories
também desenvolveu experimentos
para determinar a atividade de
eliminação de radicais livres contra
outros radicais livres, incluindo os
radicais de peroxinitrito e hidroxil
(conhecido como NORAC e HORAC).
A colaboração entre o Brunswick
Laboratories e o Dr. Prior continua. Em
2003, o Brunswick Laboratories
recebeu o Small Business Innovation
Research (SBIR), um subsídio do FDA
para desenvolver testes ORAC para
oxigênio singlet, hidroperóxido e
superóxido de ânion. Com o suporte
contínuo do USDA e a justificação
científica inerente ao método, o teste
ORAC possui todas as consagrações do
método de escolha para testes
antioxidantes in vitro e in vivo de
marcadores bioativos. Quando estiver
completo, este painel de testes ORAC
fornecerá um perfil antioxidante
compreensível, com importantes
aplicações de larga escala para os
mercados de nutrição e saúde humana.
Tópicos deste artigo:
• ORAC: Uma Revisão Essencial
• A influência do ORAC no mercado
Nutraceuticals World • Março 2004
Últimas novidades sobre o ORAC
ORAC: Uma Revisão Essencial
Estas notícias oportunas não poderiam
ter chegado antes por diversas razões.
Primeiro, alguns críticos dizem que o
ORAC não mede a habilidade de
prevenir a formação de antioxidantes.
Nas principais condições de moradia, os
seres humanos estão sujeitos ao stress
fisiológico e do meio ambiente que
destroem as defesas naturais do corpo.
A prevenção da formação de radicais
livres é a função primordial dos
antioxidantes endógenos produzidos
pelo organismo. É comumente
compreendido que para combater a
oxidação prejudicial é preciso aumentar
as defesas naturais do corpo com
antioxidantes provenientes de outras
fontes. Assim, medir a capacidade
antioxidante de várias fontes torna-se
importante.
A capacidade antioxidante é definida
como a habilidade de um componente
em reduzir os pró-oxidantes. Os
radicais livres são produzidos in situ (no
corpo) e são úteis para importantes
funções biológicas. Os nutrientes
ingeridos fornecem um diverso e
complexo estoque de antioxidantes para
combater a atividade excessiva de
radicais livres. Aparentemente existem
combinações ilimitadas de
antioxidantes internos e externos, e de
radicais que eles combatem. Isto
explicaria porque nenhum status de
medida de antioxidantes fornece uma
quantidade suficiente de dados para
avaliar em um único experimento a
atividade de eliminação dos radicais
livres de um alimento in vitro ou o
potencial de sua atividade antioxidante
in vitro. Então o que o ORAC mede?
O teste ORAC mais conhecido mede
a capacidade de eliminação de
antioxidantes em nutrientes ou in vivo
contra os radicais de peroxil, que é uma
das espécies de oxigênio reativo (ROS)
m a i s c o mu n s e n c o n t r a d a s n o
organismo. O teste hidro-ORAC reflete
a c a p a c i d a d e a n t i ox i d a n t e d e
solubilidade na água, enquanto o teste
lipo-ORAC mede a capacidade
antioxidante de solubilidade em
lipídeos. A importância destes dois
testes é aditiva. Trolox - um tipo de
vitamina E solúvel em água - é utilizada
como parâmetro de calibração e o
resultado do teste ORAC é expresso em
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micromole “Trolox equivalent” (TE)
por grama. Este teste ORAC bastante
conhecido não mede a capacidade de
eliminação do corpo maior dos radicais
livres. No entanto, é uma representação
válida e significativa da capacidade
antioxidante.
Este método está se tornando uma
ferramenta cada vez mais útil para os
consumidores. Estima-se que somente
10% da população dos Estados Unidos
consomem cinco porções de frutas e
vegetais por dia. Assim que os
c o n s u m i d o r e s e s t ive r e m m a i s
familiarizados com o ORAC como uma
medida de consumo de antioxidantes,
este método será uma ferramenta
padronizada que poderá auxiliar
empresas do mercado nutricional e
far macêutico, na instrução dos
consumidores sobre os benefícios
relativos aos níveis de antioxidantes dos
produtos.
É uma boa novidade para a indústria
Nutracêutica o fato do Brunswick
Laboratories recentemente ter
desenvolvido para o uso comercial,
testes adicionais para medir a atividade
de eliminação de radicais livres in vitro,
denominado HORAC e NORAC. Eles
mediram a capacidade de “quebra” dos
radicais de peroxinitrito e hidroxil,
respectivamente (Boxin, O. et al. J Agric
Food Chem, 2002; 50: 2772-2777).
Vários estudos constataram que para a
doença de Alzheimer, de Parkinson e
outras doenças neurológicas
degenerativas, os níveis de radicais de
p e r ox i n i t r i t o a u m e n t a m c o m o
evidência do acúmulo de nitrato de
tirosina. Além disso, relativamente
poucos produtos estão sendo medidos
pelo NORAC, apesar do temor de
milhões de pessoas a respeito do
aumento da epidemia de doenças
neuro-degenerativas.
Os radicais de hidroxil pertencem à
terceira geração das espécies de radicais
livres derivadas do peróxido de
hidrogênio, que por sua vez é derivado
do radical de superóxido embora tenha
a ação da enzima superóxido dismutase
(SOD). Esses radicais em excesso
podem ser extremamente prejudiciais
quando in vivo. A necessidade de fazer o
revezamento dos painéis de testes de
SOD ofereceria uma visão mais
completa da atividade antioxidante total
de um produto.
Sem esse conveniente conjunto de
testes (ORAC, HORAC e NORAC),
para avaliar os níveis de atividade dos
radicais de hidroxil, peroxil e
peroxinitrito, seria necessário utilizar
uma variedade de metodologias
oferecidas globalmente, incluindo os
métodos: trolox equivalent antioxidant
capacity (TEAC), 2,2-azinobis-3ethylbenzothiazoline-6-sulphonate
(ABTS), the total radical-trapping
antioxidant (TRAP), 2,2-diphenyyl-1picrylhydrazl (DPPH),
dichlorofluorescin-diacetate (DCFHDA) e N,N-dimethyl-pphenylenediamine (DMPD), citando
somente alguns dos métodos existentes.
O problema que surge devido à
existência de tantos métodos é que
alguns não possuem o grau ideal de
validade, resistência, especificação, e
confiabilidade desejadas pelos analistas
químicos, ou sofrem interferências
frustrantes como a dificuldade de
relacionar um método a outro. Por essa
razão, o teste ORAC mais conhecido
atualmente utilizado há mais de duas
décadas, permite que as empresas façam
comparações de seus produtos entre
mais de 8.000 testes utilizados em
centenas de produtos alimentícios e
suplementos. Isso não é somente um
banco de dados considerável, mas tem
um valor inestimável para as empresas
que desejam substanciar alegações
antioxidantes de parâmetros válidos e
consistentes.
Segunda razão é que os críticos
também afirmam que utilizar um
experimento in vitro para insinuar
benefícios in situ in vivo é inválido. Um
valor ORAC correspondente não pode
s e r a s s u m i d o, e n t r e t a n t o, o s
pesquisadores tiveram um progresso
significativo na medida em que
conseguiram comparar resultados in vivo
e in vitro. Estudos comparativos in vitro e
in vivo incluíam investigações de
metabolização de enzimas e ORAC no
fígado dos animais. Um bom exemplo é
um estudo realizado por Marnewick e
seus colegas, que examinaram a
modulação de enzimas metabolizantes
hepáticas e o status oxidante do chá de
“rooibos” (Aspalathus linearis), chás
preto e verde (Camellia sinensis) e chá
“honeybush” (Cyclopia intermedia) em
Nutraceuticals World • Março 2004
Últimas novidades sobre o ORAC
ratos (Marnewick JL, Joubert E, Swart P
et al. “Modulation of hepatic drug
metabolizing enzymes and oxidative
status by rooibos (Aspalathus linearis)
and honeybush (Cyclopia intermédia),
green and black (Camellia sinensis) teas
in rats” J Agricul Food Chem,
2003;51:8113-8119). Neste estudo, a
atividade antioxidante foi refletida no
estado reduzido da glutationa e no teste
ORAC no fígado de ratos expostos aos
vários tipos de chás. Os estudos das
enzimas incluíam as seguintes análises:
glutathione s-transferase, UDPg l u c u r o n o s y l - t r a n s f e r a s e, t o t a l
glutathione (GSH e GSSH) e ORAC.
À medida que estes tipos de estudos
começarem a incluir investigações em
humanos, dados de supor te
inestimáveis deverão surgir para
substanciar alegações de atividade
antioxidante in vivo para produtos
baseados em dados provenientes de
resultados in vitro. Devido à importância
do “Paradoxo Francês” durante mais de
10 anos, e evidências de que a atividade
antioxidante do soro é superior em
voluntários saudáveis que consumiam
vinho tinto do que em aqueles que não
consumiam (Lancet, 1994;344;193),
não há dúvidas que o ORAC aparecerá
com maior freqüência em referência à
atividade antioxidante in vivo ao invés
de somente como um valor in vitro.
Terceira razão, os críticos afirmam
que o ORAC recebeu muito mais
atenção que os outros métodos. Desde a
sua primeira alegação em 1993 que o
método ORAC corresponde às suas
expectativas originais, representando
um “método relativamente simples,
mas sensível e confiável que quantifica a
capacidade de absorção de radicais de
oxigênio dos antioxidantes” (Cao G,
Alessio HM, Cutler RG. “Oxygen
radical absorbance capacity assay for
antioxidants.” Free radicals Biol Med,
1993;14:303-311). Não há dúvidas que
o ORAC obteve um considerável
reconhecimento de marca sendo um
parâmetro para analisar a capacidade
antioxidante, especialmente para
fornecedores e fabricantes. Mas o
futuro do ORAC ou de qualquer outro
teste de antioxidantes dependerá de
uma utilização responsável de seus
resultados para efeitos comparativos.
Existe uma razão para que o valor
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ORAC da uva vermelha seja menor que
o do pó desidratado deste mesmo tipo
de uva. Especialistas sobre o assunto
sabem que isso ocorre por causa da
diferença do teor de umidade. A
indústria Nutracêutica deve agir com
muita cautela ao fazer comparações. O
extrato de uva vermelha tem valor
ORAC realmente muito elevado, mas
isso não significa que é possível afirmar
que um produto é melhor que outro
comparando somente preço, dosagem
e/ou tamanho da porção. Fabricantes e
fornecedores devem anotar: DHSEA
afir ma veementemente que em
publicidade e marketing a medida “falsa
e honesta” deve prevalecer quando
comparações de unidades de
antioxidantes forem feitas. Se
comparações forem feitas, que sejam
feitas com base em análises
consistentes, caso contrário a indústria
Nutracêutica corre o risco de destruir a
aceitação do ORAC na mente dos
consumidores conforme a importância
de comparação entre produtos
aumenta.
A influência do ORAC no Mercado
Quem está utilizando o ORAC na
comercialização de seus produtos e
serviços? Uma rápida busca no
“google” das palavras “ORAC e
antioxidantes” forneceu 3880 opções,
indo muito além dos websites de
empresas de suplementos alimentares.
A busca também selecionou artigos de
pesquisas, laboratórios, sites educativos
para o consumidor sobre saúde e
nutrição, empresas alimentícias (duas
maiores fabricantes de ameixa seca
possuem informações sobre ORAC em
seus websites) e associações, comissões
sobre alimentos, como por exemplo, a
Washington Red Raspberry Comission
e a Wild Blueberry Association of
North America. Parece que todos estão
entrando na onda dos antioxidantes, e
incorporar o ORAC em suas ações de
marketing parece ser a melhor maneira
para explicar o significado dos
antioxidantes aos seus consumidores.
Os produtos a base de suplementos
competem entre si pelo título de “Maior
va l o r O R AC ” . M a s, c o m a
competitividade da utilização de valores
ORAC surgem idéias equivocadas e uso
indevido do mesmo. Seriam todas essas
referências sobre o valor ORAC
comparáveis entre si? A tradução, para o
vocabulário do consumidor, pode ser
um pouco confusa. O valor ORAC de
alimentos é geralmente expresso em
100 gramas, enquanto que o valor
ORAC para suplementos é expresso
por grama e freqüentemente as
unidades são completamente ignoradas.
Muitas empresas estão comparando os
valores ORAC de seus produtos
equiparando a atividade antioxidante a
porções de frutas e vegetais, mas quais
são as frutas ou vegetais e qual o
tamanho desta porção? Por exemplo, o
website de uma empresa alegou que o
seu produto possuía atividade
antioxidante equivalente a 10 porções
de frutas e vegetais, depois definiu
melhor esta comparação listando alface
e outros vegetais com baixos valores
ORAC como parte das 10 porções
citadas.
Mesmo alguns artigos publicados
anteriormente pelo USDA podem
induzir ao erro. Um artigo publicado
pelo USDA em 1999 apresenta uma
tabela comparando os valores ORAC de
frutas, incluindo os valores para frutas
secas6. De acordo com este artigo,
ameixas secas têm valor ORAC seis
vezes maior que ameixas frescas, mas na
verdade o seu valor ORAC deveria ser
muito próximo, baseado no peso
líquido e nas calorias. Além disso, ainda
existe o antigo problema de diferenças
nas afirmações contidas no rótulo
versus o verdadeiro conteúdo. Somente
porque a informação no rótulo afirma
que o produto tem valor ORAC de 5000
unidades por porção, como podemos
ter certeza que essa afirmação é de fato
verdadeira?
Resolver estas questões não é uma
tarefa fácil. Seria necessário um esforço
conjunto por parte dos fabricantes em
promover os valores ORAC utilizando
uma linguagem padronizada; confundir
o consumidor não ajudará vender
antioxidantes. Assim como a validação
dos valores ORAC no produto final, o
fabricante também é responsável pela
aquisição de um certificado de controle
de qualidade (QC) que garante os
valores ORAC, da mesma forma que
eles garantem o conteúdo de outras
afirmações. À medida que mais dados
Nutraceuticals World • Março 2004
Últimas novidades sobre o ORAC
ORAC de frutas e vegetais se tornarem disponíveis baseados
no novo método fluorescente (a maioria dos dados sobre
frutas e vegetais utiliza informações do método antigo), os
problemas de recomendação de dosagens ORAC e valores
ORAC por porção estarão resolvidos.
O laboratório do Dr. Prior no USDA tem trabalhado
cuidadosamente a respeito deste assunto. Eles terminaram as
análises de mais de 100 amostras, a maioria de frutas frescas e
vegetais. Baseado neste trabalho, que será publicado no
decorrer deste ano, o Dr. Prior afirma que sete a dez porções
de frutas e vegetais podem conter aproximadamente de 8.900
a 17.500 unidades ORAC, dependendo da combinação dos
alimentos. Pode parecer uma variação muito ampla, mas são
consideradas as várias combinações de frutas e vegetais que
podem constituir sete porções e essas frutas frescas possuem
valor médio ORAC superior quase quatro vezes o valor
médio ORAC de vegetais. Novamente, depende de a
indústria utilizar esta informação sem causar confusão para o
consumidor. Talvez, fazer comparações entre ORAC e
determinadas frutas e vegetais pode acabar com a
ambigüidade.
O desafio, portanto, é como transformar o ORAC em uma
ferramenta de sucesso tornando os antioxidantes um assunto
mais simples para o consumidor? A equação para este
sucesso deve incluir três elementos principais. Primeiro,
devemos utilizar uma linguagem semelhante ao comparar
valor ORAC com alimentos de verdade. Segundo, apesar do
USDA estar planejando liberar futuramente as informações
do ORAC no banco de dados de alimentos de seu website,
não existe nenhum plano específico para instruir melhor o
consumidor sobre o ORAC, deixando este assunto da
equação ORAC para as indústrias de suplementos
alimentares, alimentos funcionais e de alimentos
convencionais. Finalmente, precisamos nos concentrar na
terceira parte desta equação: o rótulo do produto. Como o
ORAC pode ser utilizado no rótulo do produto leva à
discussão e esclarecimento das questões regulatórias, que é
um assunto que futuramente deverá fazer parte das
conversas.
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Sobre os Autores
Alexander Schauss, PhD, FACN, CEDS, é Diretor de Pesquisas de
Produtos Naturais e Medicinais da LifeSciences Division, American
Institute for Biosocial and Medical Research Inc., Puyallup, WA. Há
mais de 30 anos, o Dr. Schauss estuda Nutrição e Medicina Botânica e
é autor de mais de 100 ensaios em várias publicações conceituadas
abrangendo diversos tópicos. Para contatá-lo ligue 253-286-2888; Email: [email protected]. Ginny Bank é Diretora Técnica do RFI
Ingredients, Blauvelt, NY. Há 10 anos a Sra. Bank pesquisa e
desenvolve produtos antioxidantes e possui quatro patentes nos Estados
Unidos de antioxidantes e suas aplicações. Para contatá-la ligue 720304-7335; E-mail: [email protected]
Referências
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2. Bank, G.; Lenoble, R. “Oxygen Radical Absorbance Capacity,
S t a n d a r d i z i n g t h e Wa y We L o o k a t A n t i o x i d a n t s. ”
NUTRACEUTICALSWORLD September 2002;42-45.
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4. Ou B.; Hampsch-Woodill M.; Prior R.L. “Development and Validation
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5. Huang, D.; Ou, B.; Hampsch-Woodill, M.; Flanagan, J.A.; Deemer,
E.K. “Development and Validation of Oyxgen Radical Absorbance
Capacity Assay for Lipophilic Antioxidants using Randomly Methylated
Cyclodextrin as the Solubility Enhancer.” Journal of Agricultural and
Food Chemistry 2002;50(7):1815-1821.
6. “Can Foods Forestall Aging.” Agricultural Research Feb 1999.
Nutraceuticals World • Março 2004