ISSN 1984-0780 - Disciplina de Infectologia

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ISSN 1984-0780
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 1 1
12/2/08 12:06:36 PM
TENDÊNCIAS EM HIV/AIDS
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A revista Tendências em HIV/AIDS é uma publicação trimestral da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.
O intuito dessa publicação é apresentar artigos de revisão preparados
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apresentadas são inovadoras e modernas. Portanto, os conceitos apresentados podem estar à frente de consensos e da prática corriqueira
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Referências Bibliográficas
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devem seguir o estilo Vancouver, como exemplificado:
Revistas Científicas
Linnen J, Wages J, Jr., Zhang-Keck ZY, Fry KE, Krawczynski KZ, Alter H,
et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a
transfusion-transmissible agent. Science 1996;271(5248):505-8.
Livros
Ringsven MK, Bond D. Gerontology and leadership skills. 2 nd ed.
Albany(NY): Delmar Publisher; 1996.
Capítulos de Livro
Phillips SJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke. In: Laragh JH, Brenner
BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management.
2nd ed. New York: Raven Press; 1995. P. 465-78.
Anais de Congressos
Kimura J, Shibasaki H. Recent advances in clinical neurophysiology. Proceedings of the 10th International Congress of EMG and Clinical Neurophysiology; 1995 Oct 15-19; Kyoto, Japan. Amsterdam: Elsevier; 1996.
Dissertações e Teses
Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly’s access and utilization [dissertation]. St. Louis(MO): Washington Univ.; 1995.
Tabelas e Ilustrações
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Tendências
em
HIV•AIDS
Volume 3 - Número 4 - 2008
Editor chefe
Ricardo Sobhie Diaz – Universidade Federal de São Paulo
Corpo editorial
Adauto Castelo Filho – Universidade Federal de São Paulo
André Lomar – Hospital Israelita Albert Einstein
Artur Kalichman – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP
Artur Timerman – Hospital Heliópolis
Breno Riegel – Hospital Nossa Senhora da Conceição, Rio Grande do Sul
Celina Maria Pereira de Moraes Soares – Universidade Federal de São Paulo
Celso Ramos – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Celso Francisco Hernandes Granato – Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo
David Salomão Lewi – Universidade Federal de São Paulo – Hospital Israelita Albert Einstein
Eduardo Sprinz – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Érico A. Gomes de Arruda – Hospital São José de Doenças Infecciosas do Ceará
Esper Georges Kallas – Universidade de São Paulo - USP
Estevão Portella – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Giovana Lótici Baggio-Zappia – Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo
Guido Levi – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo
João da Silva Mendonça – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo
José Luiz de Andrade Neto – Universidade Federal do Paraná
Jeová Keny Baima Colares - Universidade de Fortaleza, Ceará.
Jorge Simão do Rosário Casseb – Universidade de São Paulo, USP.
Márcia Rachid – Assessoria de DST/Aids da Secretaria do Estado do Rio de Janeiro
Marcos Montani Caseiro – Fundação Lusíadas, Santos, SP
Marcos Vitória – Organização Mundial de Saúde
Marinella Della Negra – Instituto de Infectologia Emílio Ribas
Paulo Feijó Barroso – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Paulo Roberto Abrão – Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo
Reinaldo Salomão – Universidade Federal de São Paulo – Casa de Saúde Santa Marcelina
Ricardo Pio Marins – Organização Panamericana de Saúde
Rosana Del Bianco – Secretaria Municipal de Saúde de São Paulo
Shirley Cavalcante Vasconcelos Komninakis – Fundação Lusíadas, Santos – SP
Simone Barros Tenore – Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo
Unaí Tupinambás – Universidade Federal de Minas Gerais
Valdez Madruga – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP
Índice
HIV e Doença de Chagas.............................................................................................................................................................................. 5
Giovana L. Baggio-Zappia – Aline J. Barbosa – Celso Spada
A EXPRESSÃO GÊNICA DO HIV-1.................................................................................................................................................................... 11
Luiz Mario Janini
Ensaios fenotípicos para a determinação do tropismo viral: A chave para o entendimento
da transmissão e patogênese da infecção pelo HIV-1.................................................................................................................. 18
Wagner Alkmim – Mário Janini
Aspectos Imunológicos na co-infecção HIV-1/Leishmania........................................................................................................... 24
Victor Barreto-de-Souza – Elvira Maria Saraiva – Dumith C. Bou-Habib
DESTAQUES...................................................................................................................................................................................................... 28
Resumo de Teses.......................................................................................................................................................................................... 29
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12/2/08 12:06:37 PM
EDITORIAL
O tropismo do HIV-1 tem sido objetivo de pesquisa há quase 20 anos. Inicialmente estes estudos relacionavam
o perfil do vírus à progressão da doença, sendo que hoje sabemos que em realidade esse perfil se relaciona
ao tropismo destes vírus a co-receptores diferentes. Após isto, foi definido que a ausência do receptor CCR5
que ocorre em alguns poucos indivíduos relacionava-se a resistência à infecção pelo HIV-1. Além disto, a expressão diminuída de CCR5 na superfície das células naqueles indivíduos heterozigotos para o alelo defeituoso
que codifica o CCR5 progridem mais lentamente para a imunodeficiência e respondem melhor ao tratamento
anti-retroviral(1). A conseqüência lógica disto foi o desenvolvimento de moléculas chamadas de antagonistas
do CCR5 para fazerem parte do arsenal de anti-retrovirais existente. Outra conseqüência natural foi a incorporação de testes para definição do tropismo da maioria dos vírus presentes na quase-espécie (população viral)
de HIV-1 infectando o candidato a receber esta nova classe de medicamentos. Neste fascículo do Tendências,
Alkmin e Janine descrevem o racional do tropismo do HIV e suas conseqüências à patogênese. Descrevem
também testes fenotípicos existentes que são utilizados para a determinação do tropismo do HIV, ou seja, os
testes que definem se os vírus infectando um determinado indivíduo utilizam o receptor CCR5 (vírus R5) ou o
CxCR4 (vírus X4) ou ambos. Os testes fenotípicos mais modernos normalmente utilizam vírus recombinantes,
ou seja, um vírus produzido in vitro a partir do gene que codifica o envelope do HIV-1 que infecta o paciente,
sendo que o restante do conteúdo genético deste vírus é proveniente de um vírus de laboratório. Estes vírus
recombinantes são então submetidos a cultivo celular em linhagens de células que selecionam as cepas que
utilizariam o co-receptor CCR5 ou o co-receptor CxCR4. Estes tipos de teste também têm sido utilizados na
prática clínica na tentativa de se detectar a presença de vírus que utilizem o CxCR4, nos quais hipoteticamente
os novos medicamentos conhecidos como antagonistas de CCR5 não atuariam.
Os testes de tropismo que utilizam o cultivo viral (fenotipagem) têm de alguma forma se constituído em um
obstáculo à incorporação dos inibidores do CCR5 na prática clínica, principalmente por se tratarem de testes
complexos, caros e demorados. Por se tratar de testes que produzem um HIV recombinante (transgênico),
existe a necessidade do cultivo destes vírus em um laboratório de segurança, conhecido como laboratório NB3
ou P3, sendo também necessária uma automação complexa para a realização de número significativo de testes
de fenotipagem. Felizmente, algumas alternativas têm sido desenvolvidas em todo o mundo. Partindo-se do
princípio de que o que precede a mudança no tropismo do vírus é uma alteração genética que emergiu neste
vírus, ensaios de genotipagem para detecção destas alterações genéticas têm sido realizados. A correlação
entre a predição do tropismo do HIV-1 através de um teste de genotipagem é geralmente boa. O desafio tem
sido justamente conseguir interpretar os correlatos genotípicos que levam a predição do tropismo, ou seja,
quais as mutações genéticas ou combinações de mutações que poderiam estar relacionadas com o uso do
co-receptor CxCR4 pelo vírus. Em última análise, o objetivo do teste seria o de maximizar a relação custo efetividade no momento em que se prescrevesse um antagonista de CCR5 a algum paciente. De qualquer forma,
no mundo inteiro alguns especialistas argumentam que para pacientes com resistência ampla a 4, 5 ou seis
classes de drogas e que já tenham passado por todas as drogas novas disponíveis, o uso de antagonistas de
CCR5 poderia até valer a pena para aqueles pacientes em que houvesse uma população viral com misturas
de vírus X4 e R5. Nestes pacientes com misturas de R5 e X4, se esperaria que os antagonistas de CCR5 tivessem ação contra uma parcela dos vírus da quase-espécie que infecta este individuo (vírus R5) enquanto os
outros medicamentos do tratamento poderiam ter ação contra as variantes X4 que infetariam este paciente. De
qualquer forma, principalmente em grandes centros, deveremos estar preparados para nos depararmos com
um grupo de pacientes com resistência a todos os medicamentos das 6 classes de anti-retrovirais existentes,
incluindo as mais recentes, como os inibidores de fusão, inibidores da integrase e antagonistas do CCR5. Para
este grupo de pacientes, alternativas terapêuticas mais criativas e menos ortodoxas podem significar o prolongamento da sobrevida.
Ricardo Sobhie Diaz
1. Accetturi C.A., Pardini R., Pinto G.H.N., Turcato G., Lewi D.S., Diaz R.S.. (2000). Effects of CCR5 genetic polymorphism and HIV-1 subtype in antiretroviral response
in Brazilian HIV-1 infected patients. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 24, 04: 399-400.
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HIV e Doença de Chagas
HIV and Chagas Disease
Giovana L. Baggio-Zappia1, Aline J. Barbosa1, Celso Spada2
1 – Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP;
2 – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC
Endereço para correspondência: Disciplina de Infectologia – Laboratório de Virologia e Imunologia I – Endereço: Rua Pedro
de Toledo 781, 15º andar, Vila Clementino – São Paulo-SP – Telefone: 55 11 5081-5394 – e-mail: [email protected]
Resumo
A doença de Chagas, causada pelo parasito protozoário intracelular Trypanosoma cruzi, apresenta considerável ação oportunista em
pacientes HIV soropositivos. O estado de imunossupressão característico do paciente HIV pode permitir a reativação da doença de
Chagas crônica. Nesses casos, as complicações da infecção pelo T. cruzi são exacerbadas, sendo a meningoencefalite e a miocardite
as manifestações mais comuns. Este artigo revisa aspectos relevantes da doença de Chagas e das metodologias empregadas no
diagnóstico, com o objetivo de fundamentar o entendimento dos aspectos clínicos e imunológicos na co-infecção HIV/T. cruzi.
Descritores: Trypanosoma cruzi, doença de chagas, co-infecção, HIV.
Abstract
Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi, presents considerable opportunistic action in
HIV seropositive patients. The state of immunosuppression characteristic of the HIV infected patient could induce the reactivation
of the chronic Chagas disease. In such cases, the complications of the infection by the T. cruzi are extremely exacerbated, with
meningoencephalitis and myocarditis as the most common manifestations. This article reviews the most relevant aspects of the
Chagas disease and the methodologies commonly used in the diagnosis, with an attempt to facilitate the understanding of the
clinical manifestations and immunological aspects in the HIV/T. cruzi co-infection.
Keywords: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, co-infection, HIV.
Introdução
A doença de Chagas, ou tripanossomíase americana, causada
pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma antropozoonose
freqüente no continente americano, principalmente na América
Latina, e tem se tornado objeto de estudo em outros continentes
onde não é endêmica. De acordo com Kjos e colaboradores(1,2)
o T. cruzi é reconhecidamente endêmico nos Estados Unidos,
como confirmam as ocorrências de infecções em humanos e
cães. A presença do parasito causador da doença de chagas
em populações selvagens como gambás, ratos e guaxinins tem
sido relatada nos Estados Unidos há cerca de 70 anos(3,4).
O T. cruzi é transmitido por insetos triatomídeos hematófagos infectados, popularmente conhecidos como barbeiros,
pertencentes à família Reduviidae, sendo Triatoma infestans,
Rhodnius prolixus e Panstrongylus megistus as principais espécies transmissoras. Os hospedeiros vertebrados somam uma
grande variedade de espécies, incluindo o homem. O T. cruzi
também pode ser transmitido por meio de sangue ou órgãos
provenientes de doadores infectados, além de atravessar a
placenta de mães infectadas e infectar o feto.
Recentemente, o Ministério da Saúde, em nota técnica, confirmou a transmissão do T. cruzi associada ao consumo de caldo
de cana no Estado de Santa Catarina(5). Nessa ocasião, 45
casos de doença de Chagas aguda foram confirmados laboratorialmente e destes, 5 foram a óbito. Nestes casos, a provável
forma de contágio foi a ingestão do líquido contaminado com
as fezes do inseto vetor. Outro relato de surto de doença de
Chagas envolvendo transmissão oral foi recentemente publicado na Revista Brasileira de Medicina Tropical, por Pereira
Tendências em HIV • AIDS (Volume 3 - Número 4 - 05-10)
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Dias e equipe(6). Os autores identificaram 7 casos positivos de
indivíduos que viviam em uma cidade do sudoeste da Bahia,
e que provavelmente se infectaram por meio da ingestão de
água contaminada por fezes de triatomídeos.
No Brasil, dados apontam a existência de 2 a 3 milhões de
infectados pelo T. cruzi(7), enquanto dados da OMS estimam
16 a 18 milhões de infectados no mundo(4,8). De acordo com o
último boletim da OMS(8), aproximadamente 7,2% da população
argentina, 22% da população boliviana, 10% da população do
Chile e 4,3% da população brasileira eram cronicamente infectadas e desde a década de 90 esses países têm desenvolvido
estratégias no intuito de interromper a transmissão e reduzir a
incidência da doença. De acordo com o Ministério da Saúde, a
ocorrência de surtos, como o ocorrido em Santa Catarina, são
eventos raros e não refletem a atual situação de controle da
doença de Chagas no Brasil, uma vez que o país vem sendo
eficiente na interrupção da transmissão vetorial da doença(5).
De acordo com Salvatella(9) “a doença de Chagas não pode
ser erradicada: o reservatório selvagem do agente causador
sempre existirá independente da ocorrência de infecções em
humanos, mas é possível interromper a transmissão da doen
ça”. Para a Organização Mundial da Saúde (OMS), programas
de controle da doença de Chagas devem ser focados na detecção da infecção e no tratamento da doença, assim como no
controle dos vetores. O programa da OMS para erradicação
de doenças em países emergentes sugere que a testagem
sorológica periódica para a doença de Chagas de crianças em
idade escolar, moradoras de áreas endêmicas, é necessária
para que se consiga controlar os vetores(8). Esses pontos es-
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tão em consonância com as metas fixadas por um comitê de
pesquisadores, recentemente reunido em Brasília e liderado
pela pesquisadora Tânia Araújo Jorge, do Instituto Osvaldo
Cruz(10). O grupo, que debateu as prioridades de pesquisa para
a doença de Chagas, definiu como prioridades o diagnóstico,
o tratamento e a vigilância da doença de Chagas aguda, assim
como o acompanhamento da sua evolução clínica, o tratamento e a atenção ao paciente da doença de Chagas crônica. Ainda
de acordo com o grupo, na Região Amazônica ocorrem cerca
de 100 novos casos comprovados por ano. Os pesquisadores
alertam para a alta morbidade e alta mortalidade da doença de
Chagas, que chega a 5.000 mortes/ano, além da alta prevalência da doença de chagas crônica, que acomete cerca de 3
milhões de pessoas, das quais 30% evoluem para cardiopatia
grave, ocasionando elevado custo para o país.
A doença de chagas pode se apresentar nas formas aguda, indeterminada e crônica. A fase aguda, quando aparente,
pode durar de três a oito semanas, apresentando elevada
parasitemia e sintomas como febre, edema, hipertrofia dos
linfonodos, mal-estar, cefaléia, astenia, hepato-esplenomegalia,
insuficiência cardíaca e perturbações neurológicas. O estado
clínico do paciente pode se agravar para uma forma meningoencefálica na primeira infância, levando à morte devido à miocardite aguda difusa. Além dessas complicações pode haver
manifestações locais, quando o parasito penetra na conjuntiva,
ocasionando o sinal de Romaña, ou na pele, formando o chagoma de inoculação e, conseqüentemente, comprometendo
os linfonodos satélites e do complexo cutâneo(7,11,12).
Após a fase aguda, que pode ser aparente ou inaparente,
quando o paciente resiste às manifestações, pode ocorrer um
longo período assintomático, considerado a forma latente ou
fase indeterminada da doença, com positividade nos testes
sorológicos e parasitológicos(13).
A forma crônica pode se manifestar após um longo período, entre 10 a 30 anos depois da infecção inicial. Os pacientes podem
apresentar manifestações cardíacas, digestivas ou nervosas. A
forma cardíaca da fase crônica é considerada a mais grave, sendo a principal causa de morte. O paciente pode se apresentar
sem sintomatologia, mas com alterações do eletrocardiograma,
ou pode apresentar uma síndrome de insuficiência cardíaca
progressiva, insuficiência cardíaca fulminante, arritmias graves
e mesmo morte súbita. Estudos sugerem o envolvimento de
respostas de caráter auto-imune na cardiopatia chagásica(14,15).
A presença de intenso infiltrado inflamatório, acompanhado
pela presença de um número relativamente pequeno de parasitas e a presença de autoanticorpos fornecem evidências para
que se considere essa hipótese(16,17). Este tópico vem sendo
alvo de intensos e acalorados debates entre os especialistas da
aérea, enquanto alguns defendem a hipótese auto-imune, outros autores a refutam. Embora seja um tema muito instigante,
não será abordado em profundidade nessa revisão.
Na forma digestiva da doença de Chagas, podem ocorrer alterações ao longo do trato digestivo em decorrência das lesões
dos plexos nervosos, tendo como conseqüências alterações
da motilidade e morfologia. Neste caso, o megaesôfago e o
megacólon são as manifestações mais comuns. O paciente
pode ainda apresentar a forma mista da doença crônica, associando a forma cardíaca e digestiva(18,19).
A invasão do T. cruzi
O processo de adesão do parasito na célula hospedeira é
mediado por receptores e nem toda forma tripomastigota que
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adere à célula hospedeira invade ou é fagocitada. Além disso,
a forma infectante do T. cruzi pode penetrar de forma ativa nas
células musculares do hospedeiro.
Diferentes proteínas de superfície estão envolvidas na entrada
do parasito nos macrófagos e em outras células. A transialidase parasitária é uma proteína que remove resíduos de ácido
siálico de glicoproteínas, glicolipídeos e oligossacarídeos da
célula do hospedeiro e os transfere para as mucinas presentes na membrana plasmática das formas tripomastigotas. A
penetrina, outra proteína que auxilia no processo de invasão,
tem afinidade por proteínas da matriz extracelular e se liga à
heparina, ao sulfato de heparan e ao colágeno, modulando a
entrada nas células do hospedeiro(20).
Uma terceira proteína, a neuraminidase, também está presente
na membrana plasmática do parasito. Essa proteína remove
o ácido siálico das proteínas do hospedeiro que revestem os
lisossomos, desestabilizando-os. Devido à estimulação do pH
ácido no interior dos lisossomos, os parasitos passam a liberar
hemolisinas e a formar poros nas membranas lisossômicas até
que essas se rompam(21).
Independente do mecanismo de entrada, o parasito é encontrado em um vacúolo endocítico que se funde com os lisossomos
da célula hospedeira, formando um fagolisossomo. Para evitar
a destruição pelos macrófagos, os parasitos movem-se dos lisossomos para o citoplasma da célula hospedeira, onde se diferenciam na forma amastigota. Além dos macrófagos e células
dendríticas, o T. cruzi é capaz de infectar uma variedade de tipos
celulares, como as fibras musculares esqueléticas, as fibrocélulas cardíacas e as células da glia. A invasão do T. cruzi no sistema
cardíaco, respiratório e no tecido muscular esquelético é a chave
para a cronicidade e o desenvolvimento da doença. Dentro de 12
– 18, horas o parasito escapa da forma inicial, envolvido por uma
membrana que o delimita no vacúolo fagocitário e passa a se
replicar no citoplasma, desenvolvendo-se na forma amastigota.
A forma amastigota multiplica-se por divisão binária a cada 12
horas, transformando-se na forma tripomastigota sanguícola e,
posteriormente, cai na corrente sanguínea antes de infectar outros macrófagos e outras células do hospedeiro(22).
Reconhecimento do T. Cruzi pelo sistema imune
Tanto a resposta imune celular inata, quanto a adaptativa são
necessárias para o reconhecimento e controle da infecção pelo
T. cruzi. O entendimento de como o sistema imune reconhece
e responde aos patógenos evoluiu muito nos últimos dez anos,
especialmente com a identificação dos receptores de reconhecimento de padrões moleculares associados à patógenos
(PRRs – pattern recognition receptors)(23-25). Embora novos conhecimentos tenham sido agregados, muitas questões ainda
permanecem não resolvidas e infecções, como a causada pelo
T. cruzi, ainda não são completamente compreendidas. Parasitos complexos como o T. cruzi, embora sejam reconhecidos
pelas células do sistema imune inato, são capazes de estabelecer infecções crônicas e evadir das respostas do organismo
que tentam eliminar a infecção. Organismos como o T. cruzi
são geneticamente complexos e capazes de produzir muitas
proteínas diferentes, além de apresentar um perfil antigênico
em cada estágio de seu ciclo de vida.
A infecção causada pelo T. cruzi pode ser controlada pela
detecção e destruição dos parasitos pelas células dendríticas
e macrófagos, além da ação das células não-hematopoiéticas
que são os primeiros alvos da invasão. Estudos demonstraram
que os macrófagos e as células dendríticas reconhecem o T.
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cruzi via TLR2 e TLR9(26,27). Essas células também se infectam
e são capazes de suportar elevados níveis de replicação do
parasito. O reconhecimento do T. cruzi via TLR culmina com a
indução de óxido nítrico, IL-2 e TNF, in vitro(26). Existem evidências de que a resposta mediada pelos TLRs é responsável pelo
controle da infecção e direcionamento para a resposta imune
adaptativa contra o T. cruzi, uma vez que ratos com deficiências
seletivas desses PRRs apresentam diminuição da produção de
IL-12 e maior susceptibilidade à infecção(28). O reconhecimento
do T. cruzi também estimula a produção de interferons do tipo
I in vitro; no entanto, nem os antígenos e nem os receptores
envolvidos nesse reconhecimento e na sinalização intracelular
foram identificados até o momento(29).
As respostas de células T CD8 citotóxicas, T CD4, células B e
citocinas do perfil Th1 são importantes no controle da infecção, mas são ineficientes e falham em eliminar o parasito dos
tecidos(30). As respostas de células T CD8 parecem iniciar com
certo atraso na infecção pelo T. cruzi; as proteínas liberadas no
processo de replicação das formas amastigotas no citoplasma
da célula hospedeira são apresentadas em associação com
as moléculas do MHC de classe I e são reconhecidas pelas
células T CD8. Estudos conduzidos por Garg e colaboradores(31) identificaram a família das proteínas fosfatidilinositol de
superfície (GPI) e as transialidases (ts) como os principais
alvos do reconhecimento pelas células T CD8. No entanto, de
acordo com Tartetlon(32), esse reconhecimento é tardio, pois
ocorre após vários ciclos de replicação do parasito na célula
do hospedeiro e pode ser um dos o responsáveis pelas altas
taxas de cronicidade da doença de Chagas.
As infecções parasitárias desencadeiam um estado prolongado de ativação imune, associado ao declínio da contagem de
linfócitos T CD4 e T CD8, à diminuição da atividade das células
natural killer e ao aumento das células apoptóticas e anergia
celular(33). A maioria dos pacientes com reativação da doença de
Chagas apresenta níveis de células T CD4 abaixo de 200 células/
mm3, semelhante ao que ocorre em pacientes imunocomprometidos com outras infecções oportunistas(34-36). Algumas infecções
parasitárias direcionam a resposta imune tipo Th2, que provoca
diminuição da produção de citocinas do perfil Th1 e, conseqüentemente, redução da atividade dos macrófagos e da resposta de
células T citotóxicas(37). Camundongos BALB/c imunizados com
cruzipaína, uma cisteíno protease reconhecida como um fator de
virulência do T. cruzi, resulta na indução exacerbada de citocinas
do perfil Th2 como IL-4, IL-5 e IL-10 e TGF-β(38). Já a resposta do
camundongo C57BL/6, imunizado com o mesmo antígeno, além
de estimular a produção de IL-4, resulta na produção de IFN-γ,
uma citocina do tipo Th1(39). Além de promover o crescimento
do protozoário(40), o perfil Th2 favorece a apoptose de linfócitos
e é ineficaz na resposta imune ao HIV(41-43).
Diagnóstico Laboratorial da Doença de Chagas
Os métodos de diagnóstico da doença de Chagas podem
se basear na detecção direta do T. cruzi ou nas respostas do
hospedeiro à presença do parasito. A OMS recomenda a utilização de pelo menos dois testes convencionais de diferentes
princípios para que se faça a determinação do diagnóstico da
doença de Chagas(44).
Na fase aguda ou na reativação da doença de chagas ocorre
elevada parasitemia, desenvolvimento de anticorpos inespecíficos e pré-formação de anticorpos específicos. Os métodos
indicados nessa fase são a pesquisa direta do parasito pelo
exame de sangue à fresco, que revela os parasitos móveis
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 7 7
na amostra. Essa técnica é mais sensível que o esfregaço
sanguíneo corado com Giemsa. Análises repetidas podem
ser necessárias, sendo que uma única amostra negativa pelo
exame direto não exclui o diagnóstico de doença de Chagas.
Métodos indiretos como o xenodiagnóstico ou hemocultura
também podem ser utilizados, no entanto, são mais indicados
na fase crônica, uma vez que o resultado final demora cerca
de 90 dias ou mais(45). Embora sejam testes demorados, o
xenodiagnóstico e a hemocultura dificilmente produzem resultados falso-positivos.
Já na fase crônica, onde a parasitemia é baixa e há a presença
de anticorpos específicos dirigidos ao parasito, o método de escolha baseia-se na detecção de anticorpos, sendo recomendados os testes comerciais convencionais de imunofluorescência
indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e hemaglutinação indireta (HAI), além da utilização de métodos moleculares,
como a reação em cadeia de polimerase (PCR)(45). O diagnóstico da doença de Chagas humana não é completamente satisfatório, pois pode apresentar resultados discordantes.
Embora os testes parasitológicos indiretos (xenodiagnóstico e
hemocultura) sejam altamente específicos, possuem baixa sensibilidade. Em contraposição, os testes sorológicos apresentam
alta sensibilidade, mas a especificidade parece não ser muito
elevada devido às reações cruzadas com outros parasitos,
como Leishmania spp e Trypanosoma rangeli(46,47).
A pesquisa direta do parasito no sangue periférico ainda segue o mesmo princípio adotado por Carlos Chagas em 1909,
ocasião na qual descobriu o agente etiológico da doença de
Chagas, examinando uma criança febril de dois anos de idade,
chamada Berenice(48).
Em 1914, foi introduzido o xenodiagnóstico, que consiste em
colocar o inseto vetor em contato com o paciente e, posteriormente, após algumas semanas, analisar as fezes e urina do parasito em busca do protozoário. Nos últimos anos, o xenodiagnóstico sofreu algumas modificações favoráveis ao bem-estar
do paciente; passou-se a empregar o xenodiagnóstico artificial,
que consiste em ofertar o sangue de um paciente supostamente
infectado ao triatomíneo, utilizando aparatos apropriados, sem
que haja o contato direto do vetor com o paciente(49,50).
A hemocultura foi introduzida na década de 40 e surgiu como
alternativa para melhorar a efetividade do método diagnóstico
considerando as dificuldades inerentes ao diagnóstico em zonas rurais. Esse método não era muito utilizado por apresentar
resultados inferiores aos obtidos no xenodiagnóstico. Em 1966,
Chiari e Brener aperfeiçoaram o diagnóstico e analisaram 35
pacientes chagásicos crônicos, obtendo 31,4% de positividade
pelo método de xenodiagnóstico e 25,7% pela hemocultura(51).
Outros estudos foram realizados nesse período a fim de aperfeiçoar o método e em 1994, Luz e colaboradores avaliaram
as amostras de 52 pacientes chagásicos crônicos, obtendo
79% de positividade com sensibilidade de 94% empregando
o método modificado de Chiari e colaboradores (1989)(52), utilizando 30 mL de sangue e conservação a 4ºC(53,54).
A técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para detecção
do T. cruzi foi adaptada em 1966 por Camargo e colaboradores e utilizada no inquérito nacional sorológico que determinou a precisão da técnica e a prevalência da doença. Essa
metodologia apresenta elevada sensibilidade e facilidade de
execução(55,56). A grande desvantagem dessa técnica está na
necessidade de um microscópio de fluorescência. Além disso,
o uso dessa técnica pode ser limitado pela dependência de
um microscopista experiente, que garanta resultados fidedig-
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nos, já que a reatividade cruzada com soros de pacientes
com tripanossomíase americana e leishmaniose pode induzir
resultados falso-positivos.
O teste de ELISA para detecção do T. cruzi é utilizado na rotina
de serviços de hemoterapia e diagnóstico. Esta metodologia é
rápida, principalmente se comparada aos métodos indiretos,
e permite a análise de um grande número de amostras ao
mesmo tempo. Os testes comerciais disponíveis se baseiam
em diferentes princípios antigênicos, empregando lisado parasitário e peptídeos sintéticos. Atualmente, o emprego de novas
tecnologias e o desenvolvimento de novos testes utilizando
antígenos recombinantes podem aumentar a especificidade do
teste diagnóstico, eliminando a ocorrência de reações cruzadas com antígenos/anticorpos de outras doenças, evitando os
resultados falso-positivos. O teste rápido Chagas Stat-Pak® é
um teste de detecção de anticorpos anti-T. cruzi em amostras
de soro, plasma ou sangue total. Esse teste foi desenvolvido
com proteínas recombinantes e se trata de um teste de fácil
execução e leitura, além de ser uma ferramenta útil para estudo de campo e em laboratórios de pequeno porte localizados
nas áreas endêmicas. Em 2003, Luquetti e colaboradores(57)
avaliaram a eficiência desse teste utilizando um painel de 393
amostras provenientes de áreas endêmicas. A avaliação foi
realizada em três etapas: na primeira, um estudo duplo cego
em que foi possível identificar 197 infectados (98,5% de sensibilidade) e 183 não-infectados (94,8% de especificidade).
Na segunda etapa, o teste foi realizado com 352 amostras de
quatro países da América Latina e apresentou 100% de sensibilidade e 98,6% de especificidade. E na terceira e última etapa,
o teste foi avaliado comparando soros preservados em 50% de
glicerol e soros não-diluídos, sem alteração nos resultados.
A hemaglutinação indireta (HAI), descrita em 1962 por Cerisola
e colaboradores(58) também é um teste muito empregado no
diagnóstico da doença de Chagas. A HAI é de fácil execução,
proporciona resultados rápidos e não necessita de equipamentos sofisticados. Apresenta elevada especificidade (entre
96 a 98%); no entanto, oferece menor sensibilidade quando comparada aos testes de RIFI e ELISA, o que resulta em
falso-positivos, principalmente quando as amostras não são
estocadas ou transportadas adequadamente.
O avanço da biologia molecular e o emprego de novas técnicas como a reação em cadeia da polimerase (PCR) trazem
alternativas às técnicas anteriormente descritas, que além de
demoradas, podem produzir resultados falso-negativos. A PCR
permite a detecção direta do parasito e poderia ser considerada uma técnica padrão-ouro, principalmente em bancos
de sangue como teste confirmatório e para acompanhar a
evolução da doença à cura em pacientes que recebem tratamento(47). Ávila e colaboradores avaliaram 114 amostras de
pacientes chagásicos e não-chagásicos aplicando os métodos
de xenodiagnóstico, sorologia e PCR. Neste estudo, todos os
pacientes com sorologia positiva tiveram resultado positivo
para PCR, indicando 100% de sensibilidade(59). Miyamoto e
colaboradores(60) avaliaram o desempenho da PCR para detectar o DNA do T. cruzi em camundongos infectados utilizando
diferentes genótipos desse parasito, comparando-a com o
exame de sangue a fresco, a hemocultura e ELISA. Concluíram
que embora os testes tenham sido realizados em modelo experimental, os resultados foram satisfatórios e demonstraram
o potencial da PCR com relação aos outros testes.
Sabe-se que, ao incluir uma nova metodologia em uma rotina,
devem ser avaliados os parâmetros sensibilidade e especifi-
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cidade, além do custo, rapidez e complexidade de execução
do teste. Embora a PCR seja cara, principalmente porque os
testes comerciais não estão disponíveis, vários estudos demonstraram que essa metodologia pode ser empregada como
teste confirmatório em bancos de sangue, assim como no
acompanhamento clínico do paciente(59-64).
A co-infecção T. cruzi/HIV
A doença de Chagas representa uma preocupação em saúde
pública e alguns estudos demonstram o comportamento oportunista do T. cruzi em pacientes infectados pelo HIV. Há evidências
consideráveis da interação bidirecional entre as doenças parasitárias e o HIV, além do efeito deletério provocado pela ação
individual de cada patógeno(13). Considerando a característica
imunológica do HIV, sabe-se que essa interação pode alterar o
ciclo natural dos parasitos, tendo impacto negativo na replicação
do HIV e diminuindo a eficácia do tratamento antiparasitário.
Desde 1992, quando ocorreu a segunda revisão da definição
de casos de AIDS em adultos, os serviços de saúde passaram
a dispensar atenção especial a algumas doenças endêmicas no Brasil, incluindo a doença de Chagas. Desde 2004 a
reativação da doença de Chagas é considerada como uma
das condições definidoras de AIDS, para fins de vigilância
epidemiológica(65). Embora a pneumonia provocada por patógenos do gênero Pneumocystis (PCP) e Toxoplasma sejam
mais comuns e mais freqüentemente relatadas no contexto da
infecção pelo HIV, dados recentes demonstram a importância
da reativação da doença de Chagas nesses pacientes(34,66).
Devido às migrações das zonas rurais para as regiões urbanas,
verifica-se que a doença de Chagas tem se urbanizado nas
últimas décadas e, como a maioria dos casos de pacientes
HIV soropositivos ainda são encontrados em áreas urbanas, é
esperado que a co-infecção aconteça com freqüência(34).
Os primeiros relatos de co-infecção T. cruzi/HIV foram descritos
por Castillo e colaboradores(67) em um jovem que apresentava
febre, fotofobia, dores de cabeça, perda de peso e baixa contagem de células T CD4. Esse paciente apresentava positividade
para ambos os testes, seguindo um curso grave da doença
devido à miocardite aguda que o levou a óbito.
O achado anatomopatológico mais comumente relacionado à
associação entre a doença de Chagas em imunocomprometidos é a meningoencefalite aguda, que se caracteriza por edema
cerebral generalizado e hemorragia. Geralmente, estas lesões
estão localizadas na região periférica do cérebro, atingindo em
sua maior parte a massa branca em relação à cinzenta(33,36,68‑70).
Histologicamente há presença do exsudato perivascular e parenquimatoso, que consiste em macrófagos, linfócitos, células plasmásticas (plasmócitos) e muito raramente, neutrófilos(36,71,72). A análise do líquido cefalorraquidiano pode revelar
a presença de linfócitos, aumento dos níveis de proteínas e a
presença de formas tripomastigotas do T. cruzi(34).
O coração é o órgão comumente afetado em 25 a 44% dos
casos de reativação da tripanossomíase em pacientes HIV
soropositivos(33,34,67,71,73,74). A miocardite é um dos achados
clínicos na reativação e, muitas vezes, está associada ao envolvimento do SNC. Os achados anatomopatológicos mais
freqüentemente encontrados nos pacientes imunocomprometidos chagásicos são a cardiomegalia e o infiltrado focal e difuso
das células mononucleares no miocárdio, além de intenso
parasitismo nas fibras cardíacas(35,68,71,75). As manifestações
clínicas na cardiopatia chagásica crônica grave e na reativação
da doença em pacientes HIV soropositivos são similares(69). No
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entanto, enquanto na doença de Chagas crônica há diminuição da parasitemia, na reativação relacionada ao HIV os níveis
de parasitos no sangue se elevam(33,76).
Além do cérebro e do coração, outros órgãos podem ser afetados, embora mais raramente, como ilustrado por Concetti e
colaboradores(77). Os autores relatam o caso de uma paciente
de 27 anos de idade, HIV soropositiva e com reativação da doença de chagas. A biópsia do tecido uterino seguida pela análise imuno-histoquímica revelou células gigantes com presença
de formas amastigotas do protozoário T. cruzi nesse órgão. A
paciente foi a óbito 5 meses mais tarde, como resultado da
cardiopatia chagásica aguda.
A interação entre o T. cruzi e o HIV pode influenciar negativamente o curso de ambas as infecções. Sartori e colaboradores
demonstraram aumento da carga viral (CV) do HIV, concomitante à exacerbação da parasitemia, sendo que os níveis de
CV do HIV diminuíram após o tratamento anti-T. cruzi com
Benzinidazol(66), tratamento de escolha, empregado na fase
aguda da doença de Chagas. Em outro estudo, Sartori e colaboradores avaliaram a parasitemia pelo T. cruzi em pacientes
HIV soropositivos e soronegativos e relataram que a parasitemia foi significantemente maior nos pacientes co-infectados(78),
demonstrando o efeito deletério do HIV sobre a doença de
Chagas. Além do aumento da parasitemia, a instabilidade do
sistema imune em pacientes com imunodeficiência permite o
aumento do parasitismo tecidual e a exacerbação das manifestações clínicas(34,35,69,78,79). Curiosamente, em um estudo recente, Dolcini e colaboradores demonstraram que a presença
do patógeno intracelular T. cruzi foi capaz de inibir a replicação
do HIV em modelo de cultura de células de placenta(80), o que
contraria os dados dos estudos in vivo(66). Este estudo parece
ser o único até o momento, que sugere um “efeito inibitório” do
parasito sobre a replicação do HIV, embora esse efeito tenha
sido demonstrado in vitro.
A diminuição da contagem de células T CD4 é uma característica marcante da infecção pelo HIV. Além do comprometimento
da produção de células T CD4, existem evidências de que os
elevados níveis de apoptose, verificados nos pacientes infectados pelo HIV, são responsáveis pela depleção das células
T periféricas(81). Estudos em modelo animal relatam elevados
níveis de apoptose de linfócitos e o desenvolvimento de atrofia
progressiva do timo, com morte massiva dos timócitos, em
camundongos experimentalmente infectados pelo T. cruzi(82).
Guillermo e colaboradores(83) demonstraram que o uso de um
anticorpo monoclonal anti-Fas (anti-CD95), um receptor que sinaliza morte celular, foi capaz de reduzir os níveis de apoptose
de linfócitos T CD8 em modelo animal infectado pelo T. cruzi.
Os autores demonstraram que o bloqueio do sistema Fas/FasL
resultou em infiltrado de células T no peritônio, sendo essas
células, na sua grande maioria, T CD8 e conseqüentemente,
controle sistêmico da infecção e da parasitemia. A apoptose via
Fas/FasL também está aumentada em pacientes HIV soropositivos(84). Considerando o exposto, percebe-se que os efeitos
deletérios observados na infecção pelo T. cruzi e na infecção
pelo HIV, isoladamente, são extremamente graves e podem ser
amplificados na co-infecção, agravando significativamente o
quadro do paciente e acelerando o curso das duas infecções.
Considerações Finais
A co-infecção HIV/T. cruzi resulta na reativação da doença de
Chagas, com exacerbação da parasitemia e das manifestações
clínicas similares à fase crônica da doença. A partir da década
de 90, a doença de Chagas passou a ocupar espaço no cenário
da infecção pelo HIV e nos últimos anos passou a ser considerada doença definidora de AIDS pelo Ministério da Saúde. O
surgimento de novas técnicas de biologia molecular, como a
PCR, incrementaram o diagnóstico da doença de Chagas, adicionando alternativas mais modernas aos testes empregados
desde a sua descoberta, em 1909. No entanto, os testes moleculares comerciais ainda não estão disponíveis; uma alternativa
seria o desenvolvimento e a padronização dessa metodologia
in house, o que exigiria equipamentos e pessoal técnico capacitado, e, por isso, estão longe de ser uma realidade na maior
parte dos locais onde a doença é endêmica. A partir do primeiro
relato de caso de co-infecção HIV/T. cruzi, vários outros foram
publicados; no entanto a prevalência da co-infecção ainda não
está bem esclarecida. Embora estudos envolvendo a doença
de Chagas estejam em desenvolvimento em centros considerados de referência, especialmente no Brasil, as estratégias
terapêuticas ainda são limitadas, principalmente na reativação
da doença de Chagas em pacientes HIV soropositivos e pouco
se sabe sobre a eficácia do tratamento nesses pacientes. Dessa
forma, é impossível não adotar o lugar-comum “mais estudos
são necessários” para que se possa conhecer a prevalência da
co-infecção, assim como para desenvolver novas estratégias
terapêuticas para esses pacientes.
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A EXPRESSÃO GÊNICA DO HIV-1
HIV-1 GENE EXPRESSION
Luiz Mario Janini
Laboratório de Retrovirologia, Disciplina de Infectologia, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP – Endereço para correspondência: Laboratório de Retrovirologia. Rua Pedro de
Toledo, 781, 16° andar. CEP: 04041032. Telefone: 55 11 5571 2130
Resumo
O HIV-1 possui 3 genes estruturais e 6 genes regulatórios e acessórios em seu genoma. A expressão destes genes deve seguir
um programa estruturado onde genes regulatórios são expressos precocemente a partir do provírus. Para que isto ocorra o
HIV-1 apresenta uma intensa atividade de processamento dos seus transcritos primários. Uma célula produtivamente infectada
pode expressar até 30 tipos de RNAms virais os quais codificam proteínas acessórias, estruturais e enzimas atuantes no ciclo
viral. O controle da expressão gênica viral é essencial para a geração de uma progênie viral infecciosa e constitui um dos elementos fundamentais patogênese viral.
Descritores: HIV-1, LTR, expressão gênica, “splicing”
Abstract
HIV-1 genomes bear 3 main coding regions and 6 regulatory and accessory genes. Regulatory genes are expressed soon after
provirus activation what is followed by the expression of structural genes. There is an elaborate expression program in which
viral primary transcripts undergo several alternative splicing events. A productively infected cell may harbor up to 30 different
viral mRNAs coding for structural, enzymatic or accessory functions. HIV-1 gene expression control is fundamental for progeny
formation and constitutes one of the elements implicated in viral pathogenesis.
Keywords: HIV-1, LTR, gene expression, “splicing”
Introdução
A síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) tem como
agente causador o vírus HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus), um retrovírus pertencente à subfamília
Lentivirinae(1). Calcula-se que no final de 2007, após quase
30 anos de epidemia, 33,1 milhões de pessoas no planeta,
estavam vivendo com HIV-1/aids (www.uniaids.org ). A aids foi
reconhecida no início da década de 1980 nos EUA, a partir da
identificação de cinco homossexuais masculinos, moradores
de São Francisco e Nova York, que apresentavam infecções
oportunistas mal responsivas ao tratamento(2). A aids é caracterizada por uma profunda depressão da resposta imunológica mediada pelos linfócitos T CD4 fundamentais para
a coordenação das defesas do organismo, o que resulta em
infecções oportunistas, neoplasmas secundários, e manifestações neurológicas(2).
O Virus e sua Partícula
Os HIV-1 são lentivírus animais classificados de acordo com
critérios biológicos, morfológicos e de genômica comparativa
da partícula e do genoma viral(3). Assim como os genomas dos
retrovírus, o genoma do HIV-1 possui 3 regiões codificadoras
principais : a região gag, que codifica as proteínas estruturais
do capsídeo viral e núcleo proteínas p17 (MA), p24 (CA), p7
(NC) e p6, a região pol, que codifica as enzimas envolvidas
no ciclo de replicação viral que são, a protease (p11, PR), a
transcriptase reversa (p66/p51, RT) e a integrase (p31, IN) e,
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finalmente, a região env, responsável pela codificação das
proteínas do envelope viral , gp120 (SU) e gp41 (TM)(1,4,5). O
genoma do HIV-1 codifica ainda seis outras proteínas acessórias e regulatórias , sendo duas (Tat e Rev) relacionadas com
a regulação da expressão gênica, e outras 4, Vpr, Vpu, Vif e
Nef relacionadas à diversas funções indispensáveis para a
ciclo de replicação viral(1,4-9). A partícula do HIV-1 com diâmetro
em torno de 110 nm possui duas glicoproteínas de envelope, uma de superfície gp120 e outra transmembrana gp41.
O complexo glicoproteico do envelope viral está ancorado ao
envelope lipídico através da gp41. A proteína p17, ou matriz,
sustenta o envelope viral contribuindo para a arquitetura do
virion. O capsídeo é composto por um arranjo molecular de
monômeros da proteína gag p24. No interior do capsídeo há
duas cópias do RNA genômico de fita simples e polaridade
positiva associados à nucleoproteínas, havendo também a
presença de várias unidades de proteínas envolvidas no ciclo
de replicação viral; transcriptase reversa (RT), Integrase (IN),
e Protease (PR)(1,4-12).
Ciclo de Replicação do HIV-1
A infecção pelo HIV-1 se inicia pela ligação da partícula viral
a receptores específicos na superfície da célula alvo. A interação com o receptor celular é mediada pela glicoproteína
de superfície do envelope viral. A proteína responsável pelo
reconhecimento do HIV-1 por suas células alvo é a gp120.
O principal receptor para HIV-1 é a molécula de CD4, uma
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proteína sinalizadora expressa principalmente na superfície de
células T, monócitos e macrófagos. A proteína gp120 liga-se
ao receptor CD4 através de uma região altamente conservada próxima à sua porção carboxi-terminal. Porém, apenas a
interação gp120-CD4 não é suficiente para a entrada do HIV-1
na célula alvo(3,5,11,13-16). Moléculas receptoras de quimiocinas,
que mobilizam cálcio intracelular e induzem quimiotaxia em
leucócitos, atuam como co-receptores durante o reconhecimento e penetração viral na célula alvo. Isolados de HIV-1
podem apresentar um tropismo diferenciado. Alguns isolados
possuem predileção por moléculas receptoras do tipo CXCR4
mais abundantes na superfície de linfócitos T enquanto outros
isolados possuem tropismo por células expressando receptores CCR5 presentes principalmente em macrófagos, portanto
estes isolados diferem quanto aos receptores envolvidos na
fixação viral. Há diversos estudos que reputam uma maior
patogenicidade aos vírus CXCR4, devido à sua capacidade
de geração de sincício celular em cultura de células. Há um
momento crítico durante as infecções pelo HIV-1 onde a troca
do tropismo viral coincide com a piora dos parâmetros laboratoriais do paciente. A alça V3 da proteína gp120 é responsável
pelo reconhecimento dos receptores celulares e conseqüente
tropismo celular. A gp120 liga-se primeiramente às moléculas
de CD4 presentes na superfície de células permissíveis. Em
seguida, a gp120 interage com os receptores de quimiocinas, processo este dependente de mudança conformacional
em gp120 decorrente da interação inicial entre gp120 e CD4.
A alça V3 apresenta uma grande diversidade viral, inclusive
com a inserção de aminoácidos adicionais que dificultam ou
obstruem o reconhecimento imune de determinantes virais.
Ocorre também um intenso processo de glicolisação da gp120
que blindam ou protegem da ação imune, as estruturas virais
indispensáveis para o reconhecimento vírus-célula(3,11,13,15,16).
Após a ligação de gp120 ao CD4 e receptor de quimiocina,
ocorre uma mudança conformacional no envelope do vírus
que permite à gp41 promover a fusão do envelope viral com
a membrana celular, resultando na introdução capsídeo na
célula. A porção N terminal hidrofóbica, rica em glicina, presente na gp41 inicia a fusão enquanto que uma modificação
resultando em uma estrutura do tipo coiled-coil aproxima a
partícula da membrana alvo. Após a fusão, o capsídeo viral não
é totalmente desestruturado, as duas fitas de RNA genômico,
enzimas virais, são mantidas no interior do capsídeo viral. A
transcriptase reversa é a enzima responsável pela transcrição
do genoma viral resultando este processo na síntese de um
genoma viral de DNA de fita dupla. A transcriptase reversa é
capaz de polimerizar uma fita de DNA a partir de moldes RNA
e DNA. Quase que simultaneamente à síntese da nova fita de
DNA negativa, a atividade de RNAse H do complexo transcriptase reversa tem como função degradar o genoma RNA
presente no híbrido RNA-DNA que aparece como intermediário
durante o processo de transcrição reversa. Acredita-se que as
duas fitas virais genômicas sejam utilizadas como moldes no
processo da geração do uma única molécula de DNA de fita
dupla. A transcrição reversa ocorre no interior dos sub-capsídeos virais sem a exposição do genoma viral ao citoplasma
celular. Após a transcrição reversa, o complexo nucleoproteico,
incluindo IN, MA e o DNA viral genômico, constituindo-se o
ficou reconhecido como complexo pré-integrativo, é transportado para o núcleo da célula hospedeira em um processo
mediado pela Vpr, uma proteína de 96 amino ácidos, também
atuante na parada do ciclo celular em G2 e na promoção de
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um estado de apoptose em células infectadas ou próximas
de células infectadas pelo HIV-1. A ação da proteína viral R
permite o transporte do complexo nucleoproteico através dos
poros do envelope celular. A ação de uma outra enzima viral,
a integrase (IN), resulta na integração estável do DNA viral no
genoma da célula hospedeira através de várias etapas como
a digestão endonucleolítica dos terminais do genoma viral
linear ainda não integrado, a quebra de ligações fosfodiester
do DNA do hospedeiro pelos terminais OH livres do genoma
viral, transferência de fita, e ligação, estabelecendo o provírus
e completando assim a fase pré-integrativa(3,4,9,11‑13,15‑20).
Uma vez que o provírus é integrado ao DNA do hospedeiro,
ela atua como uma seqüência gênica regular do genoma celular. Após a integração, a replicação do provírus é feita pelas
DNA polimerases celulares, contudo, a expressão dos genes
provirais é dependente do estado de ativação celular. Nas
infecções por HIV-1, a expressão gênica dos provírus integrados é mediada por proteínas virais e celulares. Os transcritos
virais são expressos a partir do promotor viral localizado no
extremo 5’ do genoma viral que é representado por uma região denominada de LTR (“Long Terminal Repeat”). A proteína
regulatória Tat, que é o fator transativador da expressão gênica
viral, aumenta consideravelmente a velocidade da transcrição
dos genes virais. Na ausência de Tat, as RNA polimerases
são geralmente incapazes de transcrever seqüências maiores que algumas centenas de nucleotídeos. Ao contrário de
ativadores de transcrição usuais, a Tat não se liga em sítios
no DNA, mas sim à uma estrutura secundária na região 5’
terminal do RNAm viral recém sintetizado conhecida como
TAR (“Trans-activating Responsive Element”). O conjunto de
RNAms virais, genômicos ou sub-genômicos, é transportado
para o citoplasma, onde ocorrerá a tradução. O processamento dos RNAms virais é regulado pela proteina Rev. Este
processamento produz tanto RNAms curtos e que produzem
as proteínas Vif, Vpr, Nef, como RNAms pouco processados
referentes às poliproteínas Gag e Gag-Pol. Rev atua após a
transcrição e promove o transporte das moléculas de RNAm
das proteínas estruturais e acessórias do núcleo celular para
o citoplasma para que ocorra sua eficiente tradução no citoplasma. Rev controla a proporção entre RNAms processados
e não processados ao ligar-se ao elemento de resposta a Rev
(RRE), presente em todos os transcritos virais que ainda não
sofreram splicing(4,8,11,13,15,21‑34).
Após a tradução, os produtos gênicos serão processados em
proteínas da matriz, capsídeo, nucleocapsídeo, protease, integrase e transcriptase reversa, e proteina precursora do envelope gp160. A poliproteina Gag, ou p55, ao ser processada pela
protease viral, dá origem a quatro proteínas que irão constituir
o interior da partícula do HIV-1e que são; p17 ou proteína da
matriz, p24 ou principal componente do capsídeo viral, p6, que
interage com fatores celulares envolvidos no tráfego intracelular e auxilia na inclusão da proteína acessória Vpr na partícula
viral e p7 uma nucleoproteína. As proteínas gp41 e gp120, são
formadas a partir do precursor gp160, o qual é clivado pela
ação de proteases residentes do retículo endoplasmático. A
gp120 é a proteína de superfície do HIV-1, responsável pela
interação do vírus com o receptor CD4 e com os co-receptores
CCR5 e CXCR4, presentes na membrana das células alvo,
sendo portanto, alvo de anticorpos neutralizantes produzidos
pelo hospedeiro. Como conseqüência do constante ataque
imune, a gp120 desenvolveu diversos mecanismos de escape
baseados na diversificação das suas estruturas antigênicas.
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A gp120 é composta de cinco regiões ou domínios variáveis
intercalados por regiões mais conservadas que desde a região conservada 1 até a região variável 5(1,11,35,36). A proteína
Vpu degrada receptores CD4 recém sintetizados. A ação de
Vpu impede que as proteínas do envelope viral permaneçam
retidas no retículo endoplasmático complexadas à moléculas
de CD4. Isto permite que as proteínas do envelope viral sejam
transportadas até a membrana celular. Além de sua função na
degradação de CD4, a Vpu promove a “downregulation” de
proteínas de superfície celular como o MHC I, que estão envolvidas no reconhecimento das células infectadas por linfócitos T
citotóxicos(37). A Vpu estimula também a liberação de partículas
virais. As poliproteínas virais a Gag, Gag-Pol e Env, sofrem uma
série de modificações pós-traducionais incluindo a miristolilação de Gag e a glicosilação de Env. A adição de ácido mirístico
fornece um domínio hidrofóbico necessário à interação com a
membrana celular, facilitando a montagem do vírus e a glicolisação de Env contribui para o escape viral. As poliproteinas
Gag e Gag-Pol possuem atividade antes mesmo de sofrerem
processamento proteolítico. A porção p17 de Gag promove a
agregação de Gag e de Gag-Pol no citoplasma e a p7 liga-se
à fita do RNA, iniciando a montagem do vírus. O processamento, ou montagem dos vírions se dá inicialmente próximo
à membrana celular. As partículas imaturas são compostas de
envelope glicoprotéico, RNA genômico e poliproteínas virais
que passam por uma modificação morfológica ou maturação
durante ou após o brotamento viral. O evento da maturação
ocorre com a clivagem das poliproteínas Gag e Gag-Pol pela
protease viral produzindo as enzimas e proteínas estruturais
da capsídeo. O processamento proteolítico das poliproteínas
ocorre apenas em um estágio avançado do ciclo replicativo e
requer altas quantidades de substrato, provavelmente devido
à baixa atividade enzimática da protease não processada; este
estado é alcançado somente durante o brotamento. Após uma
hidrólise inicial, a protease liberada pode então exercer sua
atividade máxima, processando de forma rápida as poliproteínas, completando assim o ciclo replicativo do HIV-1. Uma vez
maduros e livres os novos vírions são potencialmente capazes
de infectar novas células alvo(3,15,16,35,38-41).
A Expressão dos Genes Virais
O controle da expressão gênica do HIV-1 resulta da interação entre o DNA do provírus o qual se apresenta associado à
cromatina, os fatores de transcrição do hospedeiro, e o fator
viral transativador referido como Tat. O controle da expressão
gênica do HIV-1 integrado é regulado pela ligação de fatores
celulares em uma variedade de sequências em cis localizadas
na região LTR do genoma viral. O LTR do HIV-1 possui 3 re
giões: U3, R e U5. Estas regiões possuem 4 trechos funcionais
relacionados ao controle da expressão gênica viral: o elemento
de resposta à transativação (TAR) localizado na região R (nt +1
até +60), a porção promotora central (nt –78 até –1), o “enhancer” ou região acentuadora da região promotora central (nt
–105 até –79) e a região modulatória (nt –454 até –104). Estes
3 últimos elementos estão localizados na região U3 do LTR.
Já foi demonstrado que os sítios de ligação de Sp1 presentes na região promotora central do LTR assim como os sítios
“enhancers” para NF- B são elementos chave na regulação
da expressão do HIV-1(21,23,34,42).
A transcrição dos genes virais pode ser dividida em duas fases.
A primeira ocorre precocemente durante a transcrição viral e
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corresponde à interação direta entre fatores de transcrição celulares e elementos em cis presentes na região promotora do
HIV-1. A segunda fase ocorre imediatamente após a primeira e
é decorrente do acúmulo em quantidades adequadas da proteína Tat produzida na fase inicial(8,15,24,25,32,34,43). Em decorrência
da integração do genoma viral, a região promotora do HIV-1 fica
sob controle do contexto local da cromatina celular, a qual determina a atividade transcrição basal do trecho genômico onde
ocorreu a integração viral. Independente do sítio de integração,
a região 5’ LTR é compactada em 3 nucleossomos distintos:
nuc-0, nuc-1, e nuc-2. Nuc-1 esta localizado “downstream” ao
sítio de início da transcrição e é rapidamente desestabilizado
quando ocorre a ativação da seqüência promotora do HIV1. A região entre nuc-0 e nuc-1 não possui nucleossomos
embora exista espaço suficiente para a acomodação de um
nucleossomo adicional(34,43,44). Nesta região ocorre a ligação
de vários fatores de transcrição celulares que podem induzir
uma curvatura no DNA e que interferem com a montagem de
nucleossomos, ou por competição direta com as histonas pelo
trecho do DNA, ou por deixar este trecho desfavorável à montagem de nucleossomos. Esta região livre de nucleossomos e´o
local onde as regiões promotora central e “enhancer” do LTR
do HIV-1 estão localizadas(43). A região central promotora viral
(nt -78 até -1) contém o motivo TATAA box e os sítios consenso
de ligação de SP1. A região enhancer (nt -105 até -79) possui
uma duplicação de sítios de ligação do fator NF-kB(43). Uma
região “upstream” dos sítios NF-kB pode também influenciar a
expressão gênica viral sendo esta região referida como região
modulatória da expressão viral (-454 até -104). Deleções nesta
região aumentam a intensidade da expressão gênica viral. Esta
região contém um elemento regulatório negativo (NRE) que
pode interagir com vários fatores celulares como NF-AT, USF,
Ap-1, c-Myb, COUP. Sequências próximas ao sítio de início
de transcrição do RNA viral possuem elementos regulatórios,
como a seqüência indutora de transcritos curtos (IST), o sítio
iniciador, e o elemento de resposta transativadora (TAR) localizado entre os nucleotídeos +1 e +60 e que interage com
Tat respondendo ao estímulo transativador(5,8,31,32,34,43,44). Na
ausência de Tat e de estimulação celular, o LTR compactado
em nucleossomos é praticamente silenciado. A baixa atividade
transcripcional pode resultar da ação de níveis residuais de
fatores de transcrição celulares. A ativação eficiente do LTR
é exercida por Tat e pelo rearranjo dependente de acetilação
das histonas do nucleossomo posicionado sobre o sítio de
início de transcrição do HIV-1. É possível que Tat seja capaz
de remodelar nucleossomos e retirar o bloqueio transcripcional
viral imposto pela cromatina celular. Já foi demonstrado que
Tat pode se associar com acetiltranferases (HATs) de histona
tanto in vitro como em células. HATs podem fazer parte de um
complexo protéico envolvido com o início da transcrição e Tat
pode interagir direta ou indiretamente com HATs influenciando
a região promotora do LTR viral. Tat também pode ser capaz
de interagir diretamente com fatores de transcrição celulares
como Sp1 e TBP promovendo a transcrição viral. É importante
ressaltar que Tat interage com RNA viral recém sintetizado e
não com o DNA viral. Esta interação ocorre em uma estrutura
secundária específica em formato de “hairpin” e que possui
59 nucleotídeos, o TAR, presente na seqüência líder do RNA
transcrito. Tat causa uma intensificação da expressão viral
ao interagir com TAR muito provavelmente pela estimulação
de uma quinase associada à Tat (TAK) a qual hiperfosforila o
domínio carboxi terminal (CTD) da RNA polimerase II celular
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fazendo-a libertar-se da região promotora e iniciar a elongação processiva do RNA viral(5,8,31,32,34,43,44). A transcrição bem
sucedida do HIV-1 leva à geração de aproximadamente 30
transcritos diferentes a partir do provirus. Todos estes transcritos são derivados de transcritos únicos “full-length”. O splicing
alternativo produz transcritos diferentes, mas que possuem
terminais 5’ e 3’ comuns. O RNAm viral “spliced” ou processado pode ser categorizado em 3 classes: 1) multiplamente
processado contendo de 1.7 a 2.0 kb e codificando proteínas
precoces de função regulatória como Tat, Nef, e Rev; 2) RNAm
viral resultando de apenas 1 evento de “splicing” contendo de
4.3 a 5.5 kb e codificando as proteínas Vpu, Vpr, Vif e Env; e
3) RNAm “full-length” sem “splicing”, codificando a poliproteina Gag-Pol. A expressão gênica viral também é controlada
pela exportação nuclear de transcritos contendo introns. Este
processo é mediado pela proteína viral Rev. Tanto os RNAm
virais sem “splicing” ou resultantes de apenas 1 evento de
“splicing”, possuem seqüência intrônica e apresentam uma
estrutura secundária denominada de elemento responsivo de
Rev (RRE) presente na porção 3’ da seqüência intrônica. Os
transcritos eucariotos não processados e que possuem introns
são retidos no núcleo pela presença de fatores de “splicing”
ligados a eles até que eles sofram “splicing” ou sejam degradados. Entretanto a interação entre REV e RRE faz com que os
transcritos virais mesmo não apresentando “splicing” completo
sejam capazes de deixar o núcleo das células infectadas. É
provável que REV se ligue diretamente ao RRE e sofra um
processo de multimerização. A multimerização de REV estabiliza um complexo formado por REV, a exportina-1(CRM-1) e
a GTPase Ran. Este complexo dirige o RNAm através do poro
da membrana nuclear levando então à sua exportação. Depois
da translocação para o citoplasma, Ran-GTP é convertida em
Ran-GDP, e dissociada do RNAm viral assim como a exportina1. REV também se dissocia do RNAm viral por um mecanismo
ainda desconhecido e retorna ao núcleo por intermédio da
importina-beta. Uma vez no núcleo celular, REV se dissocia da
importina-beta pela ação de Ran-GTP(3,5,8,15,22,24,26‑32,34,42‑46).
Todos os retrovirus precisam processar através de “splicing”
seus transcritos de RNAm para gerarem o RNAm que codifica
as proteinas do envelope viral, eliminando assim as seqüências
de gag e pol neste processamento. Neste processamento, as
seqüências gag e pol comportam-se como introns. Para retrovirus simples esta é a única reação de “splicing” que ocorre nos
transcritos primários virais. O “splicing” dos RNAms do HIV-1
é muito mais complexo pela presença de motivos doadores e
receptores de “splicing” tanto constitutivos como alternativos
que aparecem distribuídos ao longo do genoma viral. Como
descrito acima, as 3 classes de RNAms do HIV-1 que já foram
identificados em células com infecção produtiva. O RNAms
virais não completamente processados, mesmo assim são
eficientemente exportados do núcleo para o citoplasma pela
ação de Rev . Análises dos diferentes tipos de RNAms através
de RT-PCR revelaram a presença de mais do que 30 transcritos
únicos do HIV-1 em células produtivamente infectadas(47‑49).
Estes RNAms são gerados através da seleção alternativa entre
mais de 10 motivos doadores de “splicing” e mais de 10 receptores de “splicing” presentes no genoma viral. O uso variável
dos sinais de “splicing” dá origem a muitos RNAms distintos
mas altamente relacionados que servem como moldes alternativos para a tradução de uma mesma proteína viral. Por
exemplo, já foram identificados 12 RNAms diferentes a partir
de rev, 5 a partir de nef, 8 de tat, e16 de env(47‑51).
14
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 14 14
Duas Estratégias de Tradução Empregadas pelo HIV-1
A seleção do sítio que demarca o início da tradução é determinada pelo contexto de nucleotídeos ao redor do primeiro códon
AUG encontrado pela subunidade ribossomal trafegando o início do RNAm viral. Modificações a partir da sequência canônica
accAUGg fazem com que o ribossoma comece a traduzir a proteina a partir deste primeiro códon AUG com pouca freqüência.
Assim um outro sítio de início AUG localizado “downstream” ao
primeiro AUG passa a ser reconhecido como sítio de início de
tradução com uma eficiência maior. A seletividade na escolha
do primeiro AUG é referida como “leaky scanning”. O mecanismo de “leaky scanning” permite a tradução de ORFs múltiplas
a partir de um único RNAm. Esta versatilidade dada pela estratégia “leaky scanning” permite ao HIV-1 maximizar a capacidade codante do seu genoma e produzir proteinas funcionais
distintas a partir de um mesmo RNAm mesmo que elas não
estejam na mesma fase de leitura. O RNAm bicistrônico que
codifica para as proteínas virais Vpu e Env(52) é um exemplo da
estratégia de “leaky scanning” empregada pelo HIV-1. As ORFs
(“Open Reading Frames”) para Vpu e Env estão dispostas em
série com a região para Vpu precedendo a região para Env. A
síntese de Env é essencial para a replicação do HIV-1 e ocorre
pelo “leaky scanning” da ORF anterior que codifica Vpu(49,50,52).
O contexto fraco ao redor do códon AUG do sítio de inicio de
Vpu permite ao ribossoma ultrapassar a ORF de Vpu iniciando
a tradução apenas no códon AUG para Env a seguir ao longo
da seqüência do RNAm viral.
O genoma do HIV-1 possui genes sobrepostos. A tradução
de produtos gênicos sobrepostos ocorre por um mecanismo
conhecido como “frameshifting” no qual o ribossoma muda
sua fase de leitura em +1 ou 1 nt, resultando na síntese de
proteínas em fases de leitura diferentes(53). Este mecanismo também permite ao HIV-1 controlar a produção das poliproteinas
Gag e Gag-Pol em uma razão ótima para o vírus(54). Através de
“frameshifting” ocorre o empacotamento eficiente dos produtos
de pol porque eles são levados à partícula em formação como
parte de Gag-Pol poliproteínas direcionadas pelos sinais de
empacotamento presentes em Gag. Sítios de “frameshift” presentes nos RNAms virais correspondem à sequências de heptanucleotídeos que permitem ao RNAm escorregar 1 base em
relação aos RNAts presentes nos sítios A e P do ribossoma que
está realizando a tradução . “Frameshifting” ocorre pela presença de uma estrutura tipo “pseudoknot” no RNAm localizada de
2 a 4 nt “downstream” do sítio onde deverá ocorrer o deslocamento. O pseudoknot provoca uma parada do ribossoma e esta
pausa facilita que o deslocamento de uma base entre ribossoma, RNAts, e RNAm ocorra. O início da tradução de gag a partir
de um RNAm codificando para Gag-Pol inicia-se no extremo 5’
do gene gag. O ribossoma encontra um sítio de deslocamento
seguido por uma estrutura “pseudoknot” perto do extremo 3’ do
gene gag. A maioria dos ribossomas prosseguirá através desta
região, mas 10% hesitarão no sítio heptanucleotídico, ocorrendo
um derrapamento de 1 nt para trás. A leitura clássica de gag
leva a um códon de terminação impedindo a tradução dos produtos gênicos de pol. O “frameshift” ribossomal -1 que ocorre
a 200 nt “upstream” do códon de terminação de gag, permite a
síntese do peptídeo de fusão Gag-Pol de160-kDa(54). Desta forma o HIV-1 expressa quantidades ótimas das proteínas Gag as
quais funcionarão como substrato para a ação da enzima protease viral, mantendo uma relação ótima entre enzima e substrato.
Ainda, com a síntese da poliproteína Gag-Pol as enzimas virais
são seguramente empacotadas na partícula viral.
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Ensaios fenotípicos para a
determinação do tropismo viral:
A chave para o entendimento da
transmissão e patogênese da
infecção pelo HIV-1
Phenotypic assays for the determination of viral
tropism: the key to understanding the transmission and
pathogenesis of hiv-1 infection
Wagner Alkmin; Mário Janini
Laboratório de Retrovirologia, Disciplina de Infectologia, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP;
Endereço para correspondência: Rua Pedro de Toledo, 781, 16o andar. Laboratório de Retrovirologia. CEP: 04041032.
Telefone: 55 11 5571 2130 – e-mail:[email protected]
Resumo
O HIV-1 utiliza o CD4 e o CCR5 ou o CXCR4 para entrar nas células hospedeiras. Nos últimos anos, o interesse na utilização do
co-receptor (ou tropismo) ressurgiu principalmente devido às descobertas e progressos no desenvolvimento de promissoras
moléculas anti-HIV que têm como alvo os co-receptores. Ensaios fenotípicos têm sido amplamente usados para determinação
do tropismo viral. Além dos ensaios tradicionais, há ao menos quatro ensaios que utilizam vírus recombinantes disponíveis para
a predição do uso do co-receptor: Trofile (Monogram Biosciences), Phenoscript (VIRalliance), XtrackC/PhenX-R (inPheno) e uma
plataforma desenvolvida pela Virco. Os ensaios com vírus recombinantes são adequados para o manejo clínico de indivíduos
infectados tratados com antagonistas de co-receptores. Atualmente, não há uma definição sobre o método mais acurado para
a predição fenotípica do tropismo viral na rotina. Contudo, a adição de ensaios para a determinação do tropismo à outras ferramentas clínicas disponíveis para o manejo da infecção auxiliará os clínicos na seleção dos melhores regimes terapêuticos.
Possivelmente, o aumento do conhecimento sobre a expressão e o uso dos co-receptores permitirá um melhor entendimento
da infecção pelo HIV-1.
Descritores: HIV-1, co-receptores, tropismo viral, CCR5, CXCR4, ensaios fenotípicos
Abstract
HIV-1 utilizes CD4 and either CCR5 or CXCR4 to gain entry into host cells. Within the last few years, the interest in HIV coreceptor
utilization (or tropism) has resurged mainly due to the discovery and on-going clinical development of promising new anti-HIV
molecules that target CCR5 and CXCR4 coreceptors. Phenotypic assays have been widely used for determining HIV-1 tropism.
In this review we focus on the characteristics of phenotypic assays for the determination of HIV coreceptor tropism. Beside traditional phenotypic assays, there are at least four phenotypic recombinant virus assays available to predict coreceptor usage:
Trofile (Monogram Biosciences), Phenoscript (VIRalliance), XtrackC/PhenX-R (inPheno) and a platform developed by Virco. The
recombinant viral assays are suitable for the clinical management of HIV infected individuals treated with coreceptor antagonists.
Currently, it is still unclear which assay will show the most accurate result for phenotypic prediction of viral tropism in clinical
routine. Nevertheless, the addition of tropism assays to other clinical tools available for the management of HIV-1 infection will
assist clinicians in selecting and improving antiretroviral regimens. Perhaps the ever increasing knowledge of coreceptor expression and usage will enable HIV-1 infection to eventually be better understood than it is now.
Keywords: HIV-1, coreceptor, viral tropism, CCR5, CXCR4, phenotypic assay
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TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 18 18
12/2/08 12:06:57 PM
O tropismo viral do HIV-1: as bases dos co-receptores
O tropismo viral é um termo freqüentemente usado para definir
a especificidade de um vírus a um tecido particular ou célula
do hospedeiro. O tropismo é determinado, principalmente,
pela interação entre estruturas de superfície viral com receptores presentes na superfície da célula(1,2).
No caso do HIV-1, a transmissão da infecção em humanos
requer a disseminação do vírus, a partir de locais de infecção
nas superfícies das mucosas para zonas de células T nos
órgão linfóides secundários, onde ocorre extensa replicação
viral nas células T CD4+ auxiliares. Estas células expressam
universalmente a molécula de CD4(3).
Além do CD4, o HIV requer um co-receptor para a entrada nas
células alvo. Atualmente, o repertório de co-receptores inclui
vários membros, em sua maioria, receptores de quimiocina e
alguns receptores órfãos. O CXCR4 e o CCR5, membros da
superfamília de receptores acoplados à proteína G, são os
principais co-receptores utilizados pelos isolados de HIV-1 com
tropismo por células T e macrófagos, respectivamente(1,4,5).
Geralmente, os vírus que são transmitidos entre os indivíduos são capazes de infectar macrófagos e células TCD4+
primárias, mas são se replicam em linhagens de células T
transformadas(6,7). Como resultado, não induzem a formação
de sincício em cultura de células (MT-2 ou outras linhagens
celulares comumente utilizadas). Anteriormente, vírus com
estas propriedades eram referidos como M-tropic, devido à
habilidade de infectar macrófagos, NSI (Non-Syncytium Inducing), devido à inabilidade de formar sincício em linhagens
de células T, ou SL (Slow-low), em relação à sua cinética de
replicação em cultura(8). Dada a importância do fenótipo viral para a patogênese e progressão da doença, associada à
natureza imprecisa dos sistemas de classificação anteriores,
um sistema de classificação mais acurado foi proposto(9,10).
Atualmente, baseando-se no uso do co-receptor, as cepas
virais que infectam células que expressam o CCR5 em sua
superfície, são chamadas de R5(1,2).
Os vírus capazes de infectar linhagens de células T eram previamente referidos como T-tropic, SI (Syncytium Inducing) ou
RH (Rapid High), de acordo com propriedades já mencionadas. Hoje, esses vírus, que infectam células que expressam o
CXCR4 em sua superfície são chamados de X4. Com o tempo,
tipicamente 4-5 anos após a infecção, as cepas virais R5 evoluem em alguns indivíduos (cerca de 50%), adquirindo a capacidade de infectar linhagens de células T (em adição às células
TCD4+ primárias). Estas cepas virais, previamente conhecidas
como dual-tropic, são agora denominadas R5/X4(11-13).
O tropismo viral e a patogênese da infecção pelo HIV-1
A emergência destas variantes virais correlaciona-se diretamente com a progressão da doença. Somente os vírus R5
podem infectar células dendríticas, tais como, as células de
Langerhans na mucosa(14). As cepas de HIV-1 R5 são também selecionadas após a transmissão parental(15,16). Vírus com
tropismo para outras quimiocinas receptoras, especialmente
CXCR4, são raramente transmitidos e, geralmente, aparecem
somente tardiamente na infecção como uma tendência de
troca a partir do fenótipo R5 para o X4(14,15).
Os vírus R5 predominam nos estágios iniciais da infecção pelo
HIV-1 e são responsáveis pelo estabelecimento da infecção in
vivo(17,18), enquanto que os vírus X4 tendem a aparecer nos úlTendências em HIV • AIDS (Volume 3 - Número 4 - 18-23)
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 19 19
timos estágios e podem estar relacionados com um rápido declínio de células TCD4+, acelerada progressão para a doença
e reduzida sobrevivência dos indivíduos não tratados(7,19‑21).
O CCR5 é altamente expresso em células TCD4+ de memória
(CD4+RO+CCR5), as quais representam a principal fonte de
produção viral in vivo. O tecido linfóide associado ao intestino,
que é rico em células T CD4+ CCR5 positivas, tem uma função crucial no sítio de infecção inicial na replicação massiva
do HIV-1 e na depleção de células TCD4+(22) Por outro lado,
as moléculas de CXCR4 são expressas preferencialmente em
células T naive, como os timócitos imaturos. Esta diferença na
expressão de co-receptores pode explicar, em parte, a maior
depleção celular e a mais rápida progressão para a aids verificada em indivíduos infectados com variantes X4(21).
A importância da determinação do tropismo viral
No final de 1995, descobertas independentes por Lusso e Gallo
de que receptores CC de quimiocinas poderiam inibir a replicação viral e, por Berger no início de 1996, de que o receptor
de CXC de quimiocina CXCR4 era um dos coreceptores mais
usados por algumas cepas de HIV-1, abriram uma nova linha
de pesquisa em HIV/aids. Logo foi demonstrado que o CCR5
era o coreceptor mais comumente verificado em cepas de HIV-1
transmitidas. A ausência completa do CCR5 em alguns humanos (homozigotos defectivos para o alelo CCR5 D32) fortemente
protegia contra a infecção pelo HIV-1 in vitro e in vivo, enquanto
a diminuição da expressão causada pela heterozigosidade para
o alelo CCR5∆32 reduzia a taxa da progressão da doença.
Nos últimos anos, desde observações seminais precoces, a
função central da função desses coreceptores na patogênese
da infecção pelo HIV-1 tornou-se óbvia. A descoberta destes
co-receptores celulares forneceu uma nova abordagem para o
entendimento de importantes características da biologia viral,
incluindo o tropismo seletivo de variantes virais para diferentes
células CD4 alvo e também os mecanismos que regem o processo de fusão e entrada do HIV-1 na célula. Os co-receptores
também fornecem perspectivas moleculares em relação ao
enigma central da infecção pelo HIV-1, incluindo a transmissão
seletiva de variantes R5 e o surgimento de variantes X4 na
maioria dos indivíduos infectados durante a progressão para
a aids, bem como diferenças individuais na susceptibilidade
à infecção e progressão da doença. Estudos genéticos têm
produzido os principais insights in vivo sobre a função de coreceptores específicos e seus ligantes. Neste sentido, foi de
particular importância, a descoberta de uma mutação no gene
CCR5, no qual a forma homozigota confere forte resistência
à infecção pelo HIV-1. Além de fornecer novas perspectivas
sobre aspectos fundamentais da transmissão e patogênese do
HIV-1, os co-receptores representam agora novas abordagens
terapêuticas e estratégias de combate à aids(23,24).
Recentemente, muitos estudos têm avaliado a dinâmica do tropismo viral durante o curso da infecção pelo HIV-1 e sua associação com a terapia antiretroviral graças ao desenvolvimento
de drogas inibidoras da entrada do vírus na célula, como, por
exemplo, o Maraviroc®(25-28). Grande parte dos estudos envolvendo a diversidade genética do HIV-1 e o tropismo viral está voltada
para a determinação do uso do co-receptor, monitoramento genotípico da transição R5 para X4 e resistência à drogas(21,29-35).
Uma vez que variantes virais R5 ou X4 podem contribuir de
maneira distinta para a patogênese e que isto já é verificado desde os momentos precoces da infecção pelo HIV, uma
19
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abordagem importante seria a determinação da dinâmica
evolucionária dessas populações virais, particularmente, para
revelar o impacto relativo da seleção natural e do drift genético
imediatamente após a infecção(36,37).
Em estudo recente em nosso laboratório, analisamos a geração da diversidade genética do HIV-1 nos momentos iniciais
da infecção em cultivo celular e sua correlação com o tropismo
viral. Para tanto, partículas virais pseudotipadas com envelopes R5 e X4 do HIV-1 foram utilizadas para a um ciclo único
de infecção em Células Mononucleares do Sangue Periférico
(PBMCs) de indivíduos saudáveis, submetidas à diferentes
estímulos com fitohemaglutinina. Interessantemente, verificamos que a distribuição dos sítios onde as mutações ocorrem
no genoma viral é influenciada pelo status de ativação celular,
ocorrendo clustering de mutações em segmentos de seqüências em células ativadas. Os pseudotipos R5 acumularam mais
variação do que os vírus X4, sugerindo que a colonização do
hospedeiro por vírus R5 logo após a transmissão pode fazer
parte de uma estratégia viral para recuperar parte da diversidade genética perdida durante os eventos de transmissão, como
os population bottlenecks.
Ferramentas fenotípicas para a determinação do tropismo
viral
Devido a disponibilidade de novos anti-retrovirais que alvejam
os co-receptores CCR5 e CXCR4, a determinação do tropismo
tornou-se clinicamente relevante(38,39). Contudo, a determinação do uso do co-receptor ainda não é usada rotineiramente,
estando restrita a poucos laboratórios. Vários ensaios foram
desenvolvidos para a determinação do tropismo viral. Atualmente, ainda não está claro qual é o ensaio mais preditivo ou
o mais adequado. De uma forma geral, podem ser usados
ensaios genotípicos e fenotípicos para a predição do co-receptor(40). Nesta revisão discutimos os ensaios fenotípicos disponíveis para a determinação do uso do co-receptor.
Acompanhando o desenvolvimento clínico-farmacológico, o
desenho de novos testes para a determinação do tropismo e
a resistência a novas drogas está sendo rapidamente melhorado. Dessa forma, além de uma variedade de métodos biológicos clássicos, vários ensaios recombinantes estão sendo
produzidos para a determinação do tropismo viral.
Ensaios Fenotípicos Tradicionais
Desde os primeiros ensaios fenotípicos em cultura de células
no início década de 1980, diversos ensaios foram desenvolvidos para a determinação do uso do co-receptor. No final da
década de 1980, o ensaio utilizando a linhagem celular MT-2
serviu como ferramenta para estabelecer a categorização de
cepas virais indutoras ou não de sincício. Este ensaio baseiase na expressão de CXCR4 sobre a superfície das células. A
habilidade que o vírus apresenta de se replicar nestas células,
associada à formação de sincício, confirma a presença de vírus
X4(2,41,42). Uma das desvantagens do método é a necessidade
de um estoque viral de PBMCs ativadas(41). O procedimento
padrão de isolamento requer o co-cultivo de PBMCs do indivíduo infectado com PBMCs de um doador saudável, estimuladas com fitohemaglutinina. A coleta viral é muito laboriosa
e requer laboratórios e profissionais altamente qualificados, o
que limita a aplicabilidade clínica deste ensaio(40,43).
20
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 20 20
Ensaios com Vírus Recombinantes
Atualmente, vários ensaios utilizando vírus recombinantes estão
disponíveis comercial e não comercialmente para determinação
do tropismo viral. Exceto as metodologias inPheno (PhenoX-R)
e a plataforma Virco, todos os demais métodos baseiam-se
em ensaios de ciclo único de infecção com partículas virais
recombinantes para determinar o tropismo no manejo clínico
dos pacientes. Ao contrário dos métodos clássicos nos quais
os isolados virais são usados para a infecção de células indicadoras, nos ensaios com vírus recombinantes partículas virais
pseudotipos são construídas contendo segmentos ou mesmo
o gene do envelope inteiro dos pacientes infectados(44-48).
Resumidamente, o RNA viral é isolado a partir do plasma dos
pacientes e transcrito reversamente em cDNA. Em seguida,
este é amplificado por PCR usando primers específicos para o
gene env do HIV-1. Os produtos da PCR são, então, inseridos
em vetores de expressão. Estes vetores geram as proteínas
Env correspondentes às do indivíduo infectado. Além do vetor de expressão, também é necessário um vetor genômico,
defectivo para o gene do envelope, mas carregando todos os
demais genes do vírus. Este vetor genômico gera as partículas
virais defectivas, que não se replicam por mais de um ciclo.
Dessa forma, usando este sistema, as partículas pseudotipo
infectarão as células (PBMCs, por exemplo), sendo capazes
de apenas um ciclo replicativo por produzirem uma progênie
que não possui proteínas de envelope viral(44-48).
Assim sendo, para a montagem das partículas virais pseudotipos, ambos os vetores devem ser transfectados numa linhagem celular empacotadora para a produção dos vírus recombinantes. Logo, o vetor genômico do HIV-1 gera as partículas e
utiliza as proteínas do envelope viral dos pacientes infectados,
geradas pelo vetor de expressão do env para concluir o montagem dos pseudotipos(40).
Assim, para a determinação do uso do co-receptor os pseudotipos são usados em ensaios para infectar dois tipos de
células:linhagens celulares que expressam o CCR5 ou linhagens que expressam o CXCR4. O uso do tipo celular varia de
acordo com os diferentes ensaios.
Após o ciclo único (ou múltiplos) de infecção, as células infectadas devem expressar um indicador gênico, o qual pode ser
entregue pelo pseudotipo ou é um gene celular responsivo.
Normalmente, estes genes podem ser quantificados por bioluminescência ou ensaios colorimétricos. Obviamente, vírus X4
preferencialmente infectarão células expressando CXCR4/CD4
em sua superfície e os vírus R5 predominantemente infectarão
células CCR5/CD4. Assim, estes sinais (colorimétricos ou luminescentes) podem ser usados como uma quantificação direta
da entrada viral na célula bem como para a determinação do
uso do co-receptor. Ademais, a verificação do tropismo pode
ser confirmada adicionando-se drogas antagonistas dos coreceptores durante a infecção em cultivo de células(44-48).
Principais Ensaios utilizam vírus recombinantes
TrofileTM (Monogram Biosciences, San Francisco, California, USA)
O Trofile é um ensaio de vírus recombinante de ciclo único de
infecção desenvolvido pela(45,49-51) Monogram Biosciences. É o
teste mais amplamente comercializado e validado para a determinação do tropismo viral usando vírus recombinantes em estuTendências em HIV • AIDS (Volume 3 - Número 4 - 18-23)
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do clínicos. Basicamente, um fragmento de 2,5kb é do gene do
envelope é amplificado e inserido num vetor de expressão. Este
plasmídeo é co-transfectado em células HEK293 com o vetor
genômico do HIV-1, carregando o gene repórter luciferase. Após
a montagem, as partículas virais pseudotipos são usadas para
infectar células U87/CCR5+ ou U87/CXCR4+. A quantificação
da luminescência emitida pela luciferase é controlada por antagonistas dos co-receptors. [26]. Uma vez que a confiabilidade
do teste depende da acurácia e da sensibilidade das reações de
RT-PCR para analisar quasispécies do HIV in vivo, este ensaio
garante bons resultados para a determinação do uso do co-receptor em pacientes com carga viral acima de 1000 cópias/mL.
O Trofile tem sido usado em vários estudos e no desenvolvimento clínico de inibidores de entrada. Além de apresentar boa acurária e adequada reprodutibilidade este ensaio pode ser usado
para a determinação do tropismo viral em diversos subtipos do
HIV-1. Ademais, a maneira em que os vetores são engenheirados asseguram as partículas virais recombinantes mantenham
a replicação incompetente. Outra vantagem do método é a
utilização do gene do envelope inteiro para a montagem dos
pseudotipos. Embora a alça V3 da gp120 seja considerada o
principal determinante da especificidade pelo co-receptor, o
sítio de ligação dos co-receptores incluem outras regiões da
gp120. As regiões V1, V2, V4 V5 e C4 podem ter uma função
importante no tropismo viral. Dessa forma, a inclusão do env
inteiro permite uma complexa elucidação dos determinantes
moleculares, mecanismos de inibição e neutralização para muitos antagonistas de co-receptores(24,52‑64). A taxa média de erros
utilizando o Trofile é de 4-6% em 25.000 amostras clínicas.
HIV-1 Phenoscript EnvTM (VIRalliance, Paris, France)
Este ensaio de inibidor de entrada da VIRalliance pode ser usado para a determinação do tropismo viral ou avaliação de susceptibilidade à inibidores de entrada do HIV-1. Neste ensaio, um
fragmento de 2,2kb do env é utilizado para testes de resistência
ou tropismo ao passo que 900pb da região V1V3 é usado apenas para a determinação do tropismo. Estes fragmentos podem
ser inseridos no plasmídeo pNL4-3∆env. As partículas virais
recombinantes são empacotadas em HEK293-T e a infecção
ocorre em células indicadoras U373MG-CD4. Este tipo celular
expressa CCR5 ou CXCR4. O vetor genômico do HIV-1 utilizado neste ensaio possui um cassete gênico HIV-1 LTR-lacZ que
permite a quantificação da infectividade em um único ciclo de
replicação através de um ensaio colorimétrico baseado na expressão de of β-galactosidase induzida pelo gene tat(29,30,47,65).
O HIV-1 Phenoscript EnvTM apresentou 92% de sucesso na
determinação do tropismo em pacientes com carga viral entre
1000 e 10000 cópias/mL. A eficiência do teste está intimamente ligada à eficiência da reação de amplificação por PCR.
O ensaio também apresenta boa eficiência quando testado
para diferentes subtipos do HIV-1 (cerca de 71% para todos
os subtipos não-B)(40).
XtrackC and PhenX-R (InPheno AG, Basel, Switzerland)
Este ensaio replicativo utilizado para a determinação do tropismo combina dois testes específicos: um sistema de hibridização com sondas (XtrackC) e um ensaio de fenotipagem
(PhenX-R). Primeiramente, um teste rápido é realizado por
genotipagem para a indentificação de vírus R5 ou X4. Neste
caso, utiliza-se sondas fluorescentes específicas para variantes
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virais R5 ou X4. As diferenças entre estas sondas resultam em
migração capilar diferente e os picos podem ser avaliados de
acordo com cada co-receptor. Amostras ambíguas e aquelas
com suspeita de vírus R5/X4 (dual-tropic virus) são, então,
avaliadas por uma por fenotipagem(40,66-68).
Contrariamente aos demais ensaios, que utilizam ensaios de
ciclo único de infecção, no XtrackC and PhenX-R os vírus se
replicam em 3-4 ciclo, limitados à um total de 4 dias. A vantagem neste caso seria a avaliação de uma população viral maior
e, conseqüentemente, uma susceptibilidade aumentada para
a detecção de populações minoritárias. Ademais, a adição de
drogas específicas separa vírus R5/X4 de populações virais
mistas durante os vários ciclos replicativos. Contudo, replicações adicionais podem selecionar subpopulações melhores
adaptadas. Além disso, a replicação dos vírus recombinantes
neste caso permite avaliação do fitness e outras propriedades
virais mas não é adequada para a maioria dos laboratórios
devido à ausência de dispositivos de segurança para a manipulação de partículas virais ativas(68).
Virco tropism platform (Virco BVBA, Mechelen, Belgium)
A empresa belga Virco desenvolveu um teste de tropismo
baseado em 4 ensaios(48). Todos os ensaios baseiam-se na
amplificação por RT-PCR em uma única etapa (One-Step) de
um fragmento de 1,3kb, que se extende da alça V1 até a V4
(denominado NH2-V4).
Cada ensaio pode ser aplicado de maneira isolada, de acordo
com a necessidade: a) Sequenciamento e avaliação do tropismo
da alça V3; b) genotipagem da região NH2-V4; c) fenotipagem
a partir de clones da região NH2-V4; fenotipagem populacional
da região NH2-V4; Para a fenotipagem, os produtos da PCR da
região NH2-V4 são clonados no vetor genômico HXB2 contendo
o gene gfp, que codifica a proteína fluorescente verde e NH2-V4.
As partículas virais são produzidas em células 293T e usadas
para infectar células indicadoras U87. O teste de tropismo é
detectado pela expressão da proteína GFP. Atualmente esta
plataforma apenas está disponível para fins de pesquisas(40,48).
Esta nova plataforma oferece várias opções, dependendo da
necessidade e é capaz de detectar menos de 5% de populações minoritárias em indivíduos com alta carga viral (>4log
UI/mL) [6, 56]. Poucos dados estão disponíveis para a determinação do uso do co-receptor em diferentes subtipos virais.
Considerações Finais
Além do CD4, considerado o receptor universal, o HIV-1 requer um dos dois principais co-receptores de quimiocinas
para completar o processo de internalização nas células alvo.
Devido a disponibilidade de novos anti-retrovirais que alvejam
os receptores CCR5 e CXCR4, a determinação do tropismo
tornou-se clinicamente relevante(69-71).
Diferentes ensaios fenotípicos foram desenvolvidos e validados
para determinar o uso do co-receptor no manejo clínico dos pacientes infectados. As principais diferenças são verificadas entre os ensaios clássicos, tradicionais e os ensaios que utilizam
vetores virais recombinantes. Estes últimos apresentam uma
série de vantagens sobre os ensaios que somente recuperam
vírus em cultura de células a partir do co-cultivo com PBMCs
estimuladas. O cultivo de amostras de indivíduos infectados por
período prolongado poderá selecionar variantes virais melhores
adaptadas, tal como as condições de cultivo em questão.
21
12/2/08 12:06:58 PM
Ferramentas padrão de co-cultivo usando células indicadoras
(por exemplo, MT-2, que expressa CXCR4) podem apenas
determinar se o vírus é capaz de infectar células que expressam CXCR4. Logo, não conseguem determinar se o vírus é X4
(exclusivamente) ou R5/X4. Por outro lado, ensaios utilizando
vírus recombinantes podem distinguir entre variantes virais R5,
X4 ou R5/X4(71,72).
A detecção de populações minoritárias é um dos maiores desafios para o sucesso da determinação do tropismo viral. Isto
é uma limitação dos ensaios que baseiam-se em múltiplos
ciclos de infecção.
A análise clonal individual do gene env é muito laboriosa, de alto
custo, sendo utilizada principalmente em pequisas, podendo ser
justificada para a deteção de específicos de variantes virais.
Atualmente, os ensaios de ciclo único de infecção detectam
quasispecies minoritárias presentes numa quantidade inferior
à 5-10% da população. Um ensaio com replicação prévia de
3-4 ciclos dos pseudotipos pode detectar estas quasispecies
com freqüências de quase 1%(40).
Todos os ensaios fenotípicos que utilizam vírus recombinantes
apresentam alta sensibilidade para amostras do HIV-1 subtipos
B e não-B. No entanto, o desafio ainda está relacionado aos
dados amostrais insuficientes para a predição do tropismo
em diferentes subtipos. A maioria dos ensaios são validados
a partir de um conjunto limitado de amostras. Subtipos raros
do HIV são freqüentemente desconsiderados. O Phenoscript
é o ensaio que fornece dados mais compreensivos acerca do
tropismo viral em relação aos diferentes subtipos do HIV-1.
O Trofile é o ensaio que apresenta a maior validação clínica,
com cerca de 25000 amostras analisadas. Importantemente,
controles de qualidade externos são necessários para a comparação entre os principais ensaios fenotípicos.
A maior parte dos ensaios fenotípicos para a determinação do
tropismo viral apresenta alto custo (1000-1500 US$) e tempo
de execução, além de requerer profissionais altamente capacitados. Uma alternativa seria a predição do uso do co-receptor
baseada na análise de seqüências do envelope(47,67).
Ferramentas de bioinformática podem ser usadas para correlacionar o genótipo com o fenótipo. Tal abordagem representa
um atrativa em termos de custo-benefício e tempo. Nesse sentido, a Virco desenvolveu um sistema de fenotipagem virtual,
que representa uma associação de dados genotípicos e análises fenotípicas(33,73-75).
Por fim, fica claro que, dentre as ferramentas fenotípicas para
a determinação do tropismo viral do HIV-1, os ensaios com
vírus recombinantes são os mais adequados para o manejo
clínico de indivíduos infectados tratados com antagonistas
de co-receptores. Atualmente, ainda não há uma definição
sobre o método mais acurado para a predição fenotípica do
tropismo viral. A associação de ensaios de determinação do
tropismo com outras ferramentas clínicas auxiliarão na seleção
dos melhores regimes terapêuticos.
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23
12/2/08 12:06:59 PM
Aspectos Imunológicos na
co-infecção HIV-1/Leishmania
Immunological Aspects on HIV-1/Leishmania co-infection
Victor Barreto-de-Souza1; Elvira Maria Saraiva2; Dumith C. Bou-Habib1
1 – Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, 2 – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes – UFRJ
Endereço para correspondência: Laboratório de Pesquisas sobre o Timo, sala 506, Pavilhão Leonidas Deane – IOC
FIOCRUZ - Av Brasil 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro - RJ CEP: 21040-360e-mail: [email protected], esaraiva@
micro.ufrj.br, [email protected]
Resumo
Indivíduos infectados pelo HIV-1 podem ser acometidos por infecções causadas por outros patógenos, dentre os quais o protozoário Leishmania sp. Nos últimos anos, a frequência de pacientes HIV-1-positivos co-infectados por Leishmania aumentou notavelmente, atingindo diversos países Mediterrâneos e tropicais, incluindo o Brasil. Em episódios de co-infecção HIV-1/Leishmania
ocorre desequlíbrio na produção de citocinas, aumento na proliferação de ambos os patógenos, localizações atípicas das lesões
leishmanióticas e curso clínico acelerado da infecção pelo HIV-1. Como tanto o HIV-1 quanto a Leishmania podem infectar a
mesma célula (macrófagos), diversos estudos procuram compreender os mecanismos relacionados com a interferência mútua no
crescimento destes dois agentes infecciosos. Nesta revisão, alguns aspectos clínicos e imunológicos da co-infecção HIV-1/Leishmania serão discutidos e correlacionados com a imunopatogênese das infecções isoladas causadas por estes patógenos.
Descritores: HIV; AIDS; Leishmania; Leishmaniose; Co-infecção
Abstract
HIV-1-infected Individuals can be co-infected by other pathogens, including the protozoan Leishmania. Lately, the frequency of
HIV-1-positive patients co-infected by Leishmania substantially increased, and can be found in several Mediterranean and tropical
countries, Brazil as well. The HIV-1/Leishmania co-infection promotes unbalance of cytokine production, increased proliferation
of both pathogens, atypical localization of leishmaniotic lesions and faster clinical progression of HIV-1 infection. Considering
that both pathogens can infect the same cell (macrophages), several studies have focused on mechanisms related to the mutual
growth interference of these two infectious agents. In this review, some clinical and immunological aspects of this co-infection
will be discussed, correlating with the pathogenesis of infections caused either by HIV-1 or Leishmania.
Keywords: HIV; AIDS; Leishmania; Leishmaniasis; Co-infection
Introdução
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), agente etiológico
da AIDS, promove uma deterioração progressiva do sistema
imune, particularmente através da destruição de linfócitos T
CD4+, acarretando em uma profunda imunossupressão(1). Devido ao comprometimento do sistema imune e a um progresso
clínico crônico da infecção, indivíduos HIV-positivo podem ser
acometidos por infecções com microorganismos oportunistas
ou não, particularmente em regiões tropicais do planeta onde
a variedade de patógenos é maior(2). Dentre estes patógenos, a co-infecção com Leishmania vem atingindo relevância
devido à grande incidência de casos, sendo recentemente
classificada como a segunda co-infecção HIV/protozoários
com maior ocorrência no mundo(3). Em 2007, o relato de pessoas infectadas somente por HIV foi de 33,2 milhões em todo
mundo, sendo 2, 5 milhões de novos casos reportados apenas
no último ano(4). Na América do Sul, o Brasil é o epicentro da
epidemia de HIV, respondendo por aproximadamente um terço
de pessoas infectadas por este vírus em nosso continente, e
a incidência da infecção ainda permanece elevada com 19,5
casos por 100 mil habitantes(4,5). A sobreposição de áreas
endêmicas para Leishmania e HIV tem aumentado principalmente devido a migração de indivíduos HIV positivos para
24
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 24 24
regiões com elevada incidência de Leishmania e também pela
urbanização da leishmaniose(6). Em 1998, um estudo conduzido por Kubar e colaboradores indicou que aproximadamente
10% dos indivíduos portadores do HIV-1 contêm infecções
assintomáticas por Leishmania em uma área epidêmica no
sul da França(7). Infelizmente, a freqüência desta co-infecção
ainda é sub-estimada devido a escassez de notificações clínicas para os órgãos responsáveis pela vigilância(8). De acordo
com notificações oficiais, em 2006 estimou-se a existência de
465 casos no Brasil, centenas na África (em particular Etiópia,
Kenia, Uganda, Somália, Burquina Faso e Sudão) e na Ásia,
enquanto na Europa já foram descritos casos clínicos em países Mediterrâneos, como Portugal (257 casos), Espanha (1229
casos), França (347 casos), assim como relatos esporádicos
na Grécia, Reino Unido, Suíça e Alemanha(9).
A leishmaniose é um espectro de doenças causadas pela infecção de um hospedeiro vertebrado por protozoários do gênero Leishmania, pertencentes à família Trypanossomatidae(10).
No ciclo natural, este patógeno é transmitido para hospedeiros vertebrados através de picadas de insetos flebotomíneos
infectados por este protozoário, o qual se replica no interior
dos macrófagos sob a forma amastigota(10). A leishmaniose foi
reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (WHO) como
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sendo uma das mais importantes doenças negligenciadas em
países tropicais, com mais de 12 milhões de pessoas infectadas com este protozoário, 2 milhões de novos casos reportados a cada ano, e 350 milhões de pessoas vivendo em áreas
de transmissão ativa do protozoário(9,11). Embora não usual em
pacientes imunocompetentes, a ocorrência da forma amastigota no sangue periférico já foi relatada em diversos casos de coinfecção HIV/Leishmania na Europa, onde a maior incidência
desta co-infecção ocorre entre usuários de drogas injetáveis
que compartilham seringas(8). Além disso, amastigotas já foram encontrados no interior de agulhas oriundas de seringas
compartilhadas por usuários de drogas injetáveis, sugerindo
uma via de transmissão entre indivíduos, também chamada
de antroponótica(12). Mais de 25 espécies de Leishmania são
capazes de provocar doenças em humanos, e as principais
manifestações clínicas da leishmaniose (Cutânea, Muco-cutânea e Visceral) dependem basicamente da espécie do parasito
envolvida na infecção, uma vez que existem diferenças em
relação ao tropismo tissular entre as espécies do protozoário(10). Enquanto na Europa a forma viscerotrópica predomina
sobre as demais em casos de co-infecção HIV/Leishmania, no
Brasil já foram descritas todas as três manisfestações clinicas
da leishmaniose associadas ao HIV-1, provavelmente devido
à elevada ocorrência de diferentes espécies de Leishmania e
de seus respectivos flebotomíneos vetores em diversas áreas
do nosso território(8,9). Nos dias atuais, o uso da terapia antiretroviral combinada (HAART) alterou drasticamente o curso
clínico da infecção pelo HIV e, conseqüentemente, diminuiu a
susceptibilidade à patógenos oportunistas. Entretanto, vários
enigmas envolvendo este tipo de co-infecção permanecem
obscuros, e a interação entre estes dois patógenos no interior
do organismo, ou mesmo no interior da mesma célula (macrófago), merece investigações minuciosas.
Aspectos imunológicos da co-infecção HIV-1/Leishmania
in vivo
O primeiro caso de co-infecção HIV/Leishmania foi reportado
em 1985 por um grupo espanhol(13). Até o momento, análises
moleculares de isoenzimas revelaram 1037 cepas de Leishmania em pacientes co-infectados, sendo que destas, 695
isolados foram caracterizados como sendo da espécie visceralizante Leishmania infantum, principalmente oriundos de
pacientes da Espanha, França, Itália e Portugal(9). Na Europa,
o maior número de casos desta co-infecção foi detectado na
Espanha e pode estar relacionado à reativação da leishmaniose em um organismo previamente infectado por este tripanossomatídeo(9). Por exemplo, investigações moleculares em
pacientes espanhóis co-infectados com a forma visceralizante
da Leishmania apontam para uma grande ocorrência de recidivas da infecção (aproximadamte 90% dos casos), sugerindo
que a infecção pelo HIV promove a replicação acentuada da
Leishmania que já infectava o indivíduo(9). A recidiva deve-se
ao fato deste protozoário persistir em determinados sítios do
organismo hospedeiro, mesmo após o tratamento adequado
e diagnóstico clínico de cura(14). Além das reativações da infecção por Leishmania, pacientes co-infectados por espécies
viscerotrópicas apresentam manisfestações clínicas não usuais, como ulcerações disseminadas ou ulcerações cutâneas e
muco-cutâneas(9). Cabe ressaltar que o tratamento de indivídos
HIV-positivos com a terapia anti-retroviral combinada (HAART)
promoveu uma drástica redução da epidemia da Leishmania
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 25 25
entre os indivíduos portadores do HIV-1, pois a manutenção
do número de células T CD4+ contribui no combate ao protozoário(8,15). Porém, o diagnóstico de casos desta co-infecção
ainda permanece difícil porque algumas manifestações patognomônicas clássicas associadas à leishmaniose não estão
sempre presentes. Por exemplo, esplenomegalia, associada
à leishmaniose visceral, é menos freqüente em pacientes coinfectados, e 50% destes pacientes normalmente apresentam
outras infecções oportunistas, apresentando sintomatologia
semellhante a leishmaniose, o que acarreta em um diagnóstico
clínico mais complexo(16). Os exames utilizados para o diagnóstico parasitológico da co-infecção ainda são os rotineiros,
como análise microscópica do aspirado da medula óssea nos
casos de suspeita de co-infecção, análise sorológica, detecção
de antígenos de Leishmania na urina, além de técnicas moleculares, como as baseadas em Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)(9,17,18). As manifestações clínicas da co-infecção variam
de acordo com a espécie de Leishmania envolvida, mas, em
geral, caracterizam-se por febre, perda de peso, hepato-esplenomegalia e pancitopenia(18). A terapia contra a Leishmania é
baseada em antimoniais pentavalentes, fungicidas e antibióticos, mas tanto as formas cutâneas quanto as viscerais são
mais difíceis de serem tratadas nos pacientes co-infectados
por HIV/Leishmania(9,18). Além disso, Mira e colaboradores relataram uma elevada frequência de recidivas da leishmaniose em
indivíduos co-infectados recebendo HAART(19). Em conjunto,
os resultados sugerem que a presença do HIV e/ou a imunossupressão decorrente da infecção viral pode reativar a replicação de Leishmanias latentes em indivíduos co-infectados,
promovendo um crescimento não controlado do protozoário
com subsequente disseminação pelo organismo.
Análises da viremia em pacientes com HIV sugerem uma maior
quantidade de partículas virais em pacientes co-infectados por
HIV e Leishmania, quando comparados à pacientes infectados
somente pelo HIV(20,21). O aumento na viremia pode ser conseqüência da ativação imunológica crônica desencadeada pela
presença de ambos os patógenos. Por exemplo, na infecção
por HIV é possível verificar um aumento de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, T CD8+ e linfócitos B, assim como
a presença no plasma e no linfonodo das interleucinas (IL)-6 e
IL-1β, e das citocinas/quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e RANTES(22).
Esta ativação imunológica detectada em pacientes infectados
por HIV-1 é multifatorial e está relacionada ao vírus, tanto direta
quanto indiretamente: presença persistente de antígenos virais,
levando à estimulação antigênica de linfócitos T CD4+ e CD8+;
indução de citocinas por moléculas do próprio HIV-1; destruição
das barreiras da mucosa em tecidos linfóides gástricos com
consequente translocação sistêmica de produtos microbianos,
os quais ativam células da imunidade inata(22). A infecção por
Leishmania também é capaz de induzir uma ativação do sistema imunolólico e pacientes infectados somente com este
protozoário apresentam níveis séricos elevados de IL-1, IL-6,
IL-8, IL-12, IL-15 e TNF-α(23). Curiosamente, na co-infecção com
HIV/Leishmania infantum podemos constatar níveis séricos reduzidos da citocina IL-10, e níveis séricos aumentados da citocina
interferon (IFN)-γ, sugerindo um desequilíbrio na polarização
Th1/Th2. A influência do padrão Th1/Th2 no crescimento do
HIV-1 in vivo ainda é controversa, mas a predominância de um
destes subtipos de T CD4+ é fundamental para o desfecho da
leishmaniose: a polarização da resposta para linfócitos CD4+
Th1 confere resistência contra este tripanossomatídeo em indivíduos imunocompetentes, enquanto que a predominância de
25
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Th2 normalmente está associada à susceptibilidade e desenvolvimento da doença. Neste aspecto, células Th1 desempenham
papel leishmanicida principalmente pela síntese de IFN-γ/IL-2,
ao passo que a resposta Th2 favorece a Leishmania pela síntese
de IL-4/IL-10(24,25). Níveis elevados da citocina TNF-α, um potente
estimulador da produção de HIV-1, também já foram observados
em soros de pacientes co-infectados por HIV/Leishmania, correlacionando-se com o aumento da viremia no plasma destes
pacientes(21). Como o linfócito T CD4+ é um importante maestro
no orquestramento da resposta imune contra a Leishmania, é
possível que a morte elevada destas células, que ocorre durante
a infecção pelo HIV, também contribua para a replicação da
Leishmania, pois a detecção da co-infecção HIV-1/Leishmania
é mais freqüente na fase de imunossupressão, quando a contagem de línfócitos T CD4+ é baixa(9).
Lições a partir dos modelos de co-infecção in vitro
Como tanto o HIV quanto a Leishmania infectam as mesmas
células (os macrófagos), os estudos in vitro de interação entre
os patógenos são muito atraentes. Durante o progresso da
infecção pelo HIV-1, a percentagem de macrófagos não é alterada, contrariamente ao que ocorre com a percentagem de
linfócitos T CD4+, e diversos estudos sugerem que macrófagos
podem servir como reservatórios virais(26,27). Por exemplo, experimentos in vivo utilizando símios indicam que, após a depleção
de linfócitos T CD4+, a quimera SHIV continua sendo produzida
por macrófagos de diferentes tecidos(28). Quando culturas de
macrófagos são co-infectadas in vitro, podemos observar aumento na replicação tanto do HIV quanto da Leishmania, um
fenômeno semelhante ao que constatamos in vivo(29). Nos modelos in vitro, a replicação de ambos os patógenos parece ser
dependente da produção de fatores solúveis liberados pelos
macrófagos: nós demonstramos que a proteína Tat do HIV-1
é capaz de aumentar a replicação intracelular da Leishmania
através da síntese do Fator de Transformação do Crescimento
(TGF)-β1(29). Em culturas co-infectadas com HIV‑1 e Leishmania amazonensis, a neutralização do Tat do HIV‑1 reduz significativamente a exacerbação do crescimento da Leishmania
promovido pelo HIV-1, e a adição de Tat recombinante a culturas infectadas somente por Leishmania aumenta a replicação
intracelular deste tripanossomatídeo, através da indução de
Prostaglandina E2 (PGE2) e subseqüente indução de TGF-β1
pelos macrófagos(29). Cabe ressaltar que também já relatamos
que tanto o TGF-β1 quanto a PGE2 podem promover a replicação do HIV-1 em macrófagos primários in vitro, sugerindo que a
produção destes dois fatores pode ser benéfica para o crescimento de ambos os patógenos(30). Recentemente descrevemos
que o Tat do HIV-1, também via indução da citocina TGF-β1, é
capaz de permitir o estabelecimento e divisão intracelular de
um protozoário que normalmente é eliminado por macrófagos
primários não infectados pelo HIV‑1(31). A modulação do crescimento da Leishmania também pode ser explicada pela inibição
de citocinas com potencial leishmanicida (produzidas por Th1)
ou pela indução de citocinas promotoras da replicação do
protozoário (produzidas por Th2). Por exemplo, Wolday e colaboradores descreveram que a adição de HIV e Leishmania a
culturas de células mononucleares do sangue periférico resulta
em uma menor produção de IFN-γ (padrão Th1) quando comparada à produção pelas células estimuladas somente com
Leishmania ou somente com mitógeno(32). Além disse, análise
da produção de citocinas ex vivo por células mononucleares
do sangue periférico, oriundas de pacientes co-infectados, re-
26
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 26 26
velou maiores níveis de IL-4 e IL-10 (padrão Th2)(33). Uma vez
que a infecção pelo HIV induz uma maciça morte de linfócitos
T CD4+ por apoptose, é provável que o reconhecimento destas
células apoptóticas por macrófagos também atue no aumento
da replicação da Leishmania e do HIV-1. De fato, a exposição
de macrófagos a células apoptóticas contribui para o aumento
da replicação do protozoário e do vírus(34,35).
Assim como para Leishmania, o crescimento do HIV-1 também
pode ser alterado por citocinas presentes no ambiente onde o
vírus está sendo produzido. Dentre os clássicos mediadores
solúveis que favorecem a produção do vírus por células infectadas in vitro podemos destacar IL-1β, IL-7, TNF-α, IFN-γ, ao
passo que IFN-α, IFN-β, IL-23 e IL-27 estão associadas à redução viral(36). Na presença do HIV-1, macrófagos primários infectados por Leishmania infantum produzem maior quantidade de
TNF-α, IL-1α e IL-6 ,e o bloqueio das citocina IL-1α e IL-6 resulta
em menor produção de HIV-1 pelos macrófagos co-infectados,
sugerindo uma participação direta das citocinas na modulação
da replicação do HIV-1, provavelmente via indução da transcrição viral(37). Outro fator que pode contribuir para a replicação
viral, também através da indução de mediadores solúveis, é
a molécula Lipofosfoglicana (LPG) oriunda de promastigotas
de Leishmania. Bernier e colaboradores demonstraram que a
adição de LPG de L. donovani, ou do componente intramembrana do LPG (core-PI), é capaz de aumentar a replicação de
HIV-1 em linhagens de monócitos e em linfócitos T CD4+ via
um processo dependente da translocação de NF-kB para o
núcleo(38,39). Curiosamente, se macrófagos forem expostos à
molécula LPG ou à Leishmania infantum antes da infecção com
HIV‑1, a entrada do vírus na célula é reduzida e o aumento da
replicação do vírus só é observado a partir do sexto dia de coinfecção, embora os autores deste estudo não tenham testado
o efeito do LPG em células já infectadas, conforme o estudo
de Bernier e colaboradores(40). A fisiologia de células dendríticas (DC) também parece ser influenciada pela Leishmania e
HIV‑1: amastigotas de Leishmania podem ligar-se a moléculas
membranares de DC-SIGN, as quais também podem ser utilizadas na captura do HIV-1 por células dendríticas(41). Células
dendríticas transferem HIV-1 para linfócitos T CD4+ durante o
processo de apresentação antigênica e, a ligação das moléculas DC-SIGN pelos amastigotas pode interferir na captura de
partículas virais e, conseqüentemente, reduzir a trasferência do
HIV-1 para linfócitos T CD4+(42,43). Levando-se em consideração
que as DCs são fundamentais para a ativação de linfócitos T e
muito importantes na patogênese da infecção pelo HIV-1 e pela
Leishmania, a perturbação das atividades deste tipo celular
pode alterar a resposta efetora a ambos os patógenos.
Nestes últimos anos as pesquisas na co-infecção HIV-1/Leishmania vêm ganhando destaque e importância devido ao aumento de casos clínicos envolvendo ambos os patógenos. Sem
dúvida, a presença destes patógenos num organismo promove
uma alteração na resposta imunológica, favorecendo a replicação viral e do tripanossomatídeo. Neste contexto, acreditamos
que a interface entre pesquisas ex vivo, observações clínicas
e modelos in vitro é tênue, uma vez que podemos planejar
modelos terapêuticos para a co-infecção a partir de modelos in
vitro ou ex vivo. Por exemplo, um estudo in vitro recente sugere
que inibidores de protease já utilizados na terapêutica contra o
HIV podem reduzir o crescimento intracelular da Leishmania e
do HIV-1 em culturas de macrófagos infectados por ambos os
agentes infecciosos(44). Um longo caminho ainda precisa ser
descortinado para que possamos alcançar novas estratégias
farmacológicas contra a co-infecção HIV/Leishmania.
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27
12/2/08 12:07:02 PM
DESTAQUEs – 20th IFCC – WorldLab 2008
Por Celso Spada, Arício Treitinger – Departamento de Análises Clínicas – Centro de Ciências da Saúde/UFSC, Campus Universitário
– Bairro Trindade, Cx Postal 470, 88.010-970 – Florianópolis – SC. Fone (0xx48) 3721-9712 Ramal 222 [email protected]
Dentre os diversos temas tratados durante o XX Congresso Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial alguns mereceram
destaque, dentre eles o entendimento dos co-receptores e fusão do
HIV que fez parte da palestra proferida pelo Dr. Ricardo Sobhie Diaz.
A evolução da infecção pelo HIV depende da interação do vírus com
dois co-receptores distintos, o receptor de α-quimicionas CXCR-4(1) e o
receptor da família das β-quimiocinas, CCR-5(2) expressos na superfície
de células T e monócitos/macrófagos, respectivamente(3).
O papel específico dos co-receptores na patogênese da infecção pelo
HIV ainda permanece em discussão. Vários estudos foram realizados,
todavia, qual é o co-receptor usado pelo HIV, se é o CCR-5 ou o
CXCR-4, ainda é controverso. As diferenças dos níveis de expressão
de CCR-5 e CXCR-4 e a fusogenicidade do CXCR-4 são aspectos
a serem considerados na patogênese dessa virose(4), porém, para
KARLSSON(5), a expressão do co-receptor CXCR-4 pode não ser requerida para a progressão da infecção. Por outro lado em estudo
recente, OLIVIERI(6) demonstrou que o vírus com tropismo para o
CCR-5, isolado de pacientes que se encontravam nos estágios iniciais
da infecção, diferiam daqueles verificados em pacientes em estágio
mais avançado e desenvolvimento acelerado para AIDS. Mais especificamente, a atividade de fusão do Env pode estar relacionada com
a diminuição na contagem de células CD4, bem como da quantidade
de co-receptores CCR-5 expressos pelas células alvo, que parece ser
mediada pela gp41(7).
Em indivíduos caucasianos a deleção nucleotídica Δ32 pode estar
presente em um ou em ambos os alelos do gene CCR-5. Enquanto a
deleção homozigótica (Δ32/Δ32), em ambos os alelos, confere proteção à entrada do vírus nas células que expressam receptor CD4(3).
Por outro lado a deleção Δ32 em apenas um alelo do gene CCR-5
cursa com uma progressão mais lenta da doença(8), em decorrência
dos baixos níveis de expressão desse co-receptor(9). Todavia, para
BALOTTA(10) e HUSMANN(11), os polimorfismos Δ32/Δ32 e Δ32 heterozigoto em indivíduos HIV-1 infectados e em indivíduos não infectados
no gene CCR-5, são similares, e, portanto, necessitam mais estudos,
considerando-se o sistema imune do indivíduo, fatores genéticos e
do próprio vírus para uma análise mais precisa e estabelecimento de
uma estratégia terapêutica.
A linhagem CCR-5 não indutora de sincícios, e com tropismo por células monocíticas predomina na fase assintomática da infecção(12).
Variantes do vírus podem emergir e induzir a formação de sincícios,
o que está associado com uma rápida depleção dos linfócitos CD4 e
progressão para a AIDS(13). Esses eventos independem da forma da
infecção pelo vírus, bem como do fenótipo viral(14).
Ativação Imune e Patogênese do HIV
O HIV infecta aproximadamente 10% das células T-CD4. O mecanismo de seleção destas células parece constituir um conjunto de
manifestações imunológicas, complexas, que ainda necessitam serem
esclarecidas. Embora seja amplamente aceito que a infecção pelo HIV
resulte em ativação imunológica crônica, com desequilíbrio no perfil
de produção de citocinas, em que se verifica aumento dos níveis de
citocinas do tipo Th2, não está claro se esta é causa ou conseqüência
da diminuição do número de células CD4(15). Entretanto a ativação imune crônica permanece como um marcador da patogenia da infecção
pelo HIV(16). Além disso é, também, considerada melhor preditor de
apoptose de células CD4 que a viremia plasmática(17).
A ativação imune resulta, ainda, em um descontrole da expressão dos
co-receptores, CCR-5 e CXCR-4, o que não somente facilita a infecção
viral(18), mas também aumenta a apoptose mediada pelo Env, que por
sua vez gera antígenos estimuladores das caspases que induzem a
ativação imune e perpetuam o ciclo vicioso que envolve aumento da
infecção viral e replicação às custas da observação da morte celular.
É, amplamente, conhecida a participação da glicoproteína do Env na
mediação da fusão de células vizinhas e a importância desta na patogênese do HIV. Contudo, apesar de a estrutura e função da glicoproteína Env do HIV tenha sido amplamente estudada, o seu mecanismo
de ação ainda permanece desconhecido.
Estudos recentes sugeriram que in vivo a morte celular mediada pela
gp41 pode ocorrer através do fenômeno da hemifusão com muito mais
freqüência do que se imagina, tomando como referência evidências
recentes, que a patogênese mediada por subunidades que apresentavam mutação da Env gp41 encontravam-se reduzidas. No entanto,
estudos futuros, necessitam ser realizados para esclarecer o papel da
subunidade gp41 mutante na patogênese do HIV.
Algumas questões precisam ser respondidas: o polimorfismo CCR-5
afeta a apoptose mediada pelo CCR-5 Env, ou a ativação imune é
mediada pela geração de células apoptóticas por mediação do Env e
morte celular? Ainda outras análises de alterações celulares e bioquímicas ocorrem durante o fenômeno “Kiss of death” e necessitam ser
estudadas detalhadamente.
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TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 28 28
12/2/08 12:07:02 PM
Resumo de Teses
Aluno: Renata Karina Reis
Orientador: Elucir Gir
Tese de Doutorado
Instituição: Universidade de São Paulo – USP Ribeirão Preto
Título: Qualidade de vida de portadores do HIV/AIDS: influência dos fatores demográficos, clínicos e psicossociais
Resumo:
Em decorrência dos avanços científicos e tecnológicos da
última década, a aids passou a ser considerada como doença
crônica. O grande benefício gerado pelo uso da terapia antiretroviral é o prolongamento da sobrevida e a redução da
mortalidade; entretanto, o impacto psicossocial da doença
e dos efeitos adversos associados a esta terapia pode provocar alterações na qualidade de vida. Objetivos: avaliar a
qualidade de vida de portadores do HIV/aids e suas relações
com os fatores demográficos, clínicos e psicossociais, utilizando o WHOQOL HIV bref e o HATQoL. Metodologia: Tratase de um estudo analítico correlacional, de corte transversal,
realizado em dois serviços de atendimento especializado em
aids, no município de Ribeirão Preto-SP. Cinco instrumentos
foram utilizados para a coleta de dados: Instrumento para
caracterização sociodemográfica, Inventário de Sintomas de
Depressão de Beck, Escala de auto-estima de Rosemberg,
WHOQOL HIV bref e o HATQoL. Resultados: Dos 228 portadores do HIV/aids, 122 (53,5%) eram homens e 106 (46,5%),
mulheres, com idade média de 39 anos. Com relação aos domínios do WHOQOL HIV bref, não se observaram importantes
diferenças, nas médias deste instrumento, que variaram de
58,0 a 69,2. O domínio Espiritualidade apresentou os maiores escores de qualidade de vida, seguido pelos domínios
Físico, Psicológico, Relações Sociais, Nível de Independência
e Meio Ambiente. Quanto às dimensões da escala HATQoL,
os valores médios encontrados variaram de 31,6 a 95,7. Os
domínios que apresentaram maiores escores foram: Confiança no Médico, Questões Relativas à Medicação, Atividade Geral e Satisfação com a Vida. Dentre os domínios mais
comprometidos do HATQoL, destacam-se: Preocupação com
o Sigilo, seguido de Preocupação Financeira, Preocupação
com a Saúde. Diferentes variáveis influenciaram na qualidade de vida. Quanto às sociodemográficas, destaca-se que
as mulheres apresentaram pior qualidade de vida, quando
comparadas com os homens em vários domínios. Os indivíduos analfabetos e com menos de oito anos de escolaridade,
aqueles sem renda e sem vínculo empregatício apresentaram qualidade de vida considerada prejudicada em diversos
domínios. Sobre as variáveis clínicas, identificou-se que os
portadores de aids, com baixa contagem de CD4 e alta carga
viral, apresentaram pior qualidade de vida. Com referência
às variáveis psicossociais, identificaram-se menores escores
entre os portadores que não têm parceria afetivo-sexual e que
apresentam sintomas depressivos. A depressão e o gênero
constituíram-se nos preditores mais associados com pior qualidade de vida, e, ao contrário, a auto-estima associou-se com
melhor qualidade de vida em vários domínios. Conclusão: O
presente estudo constatou diversas variáveis que influenciam
na qualidade de vida de pessoas que vivem com o HIV/aids.
Este estudo oferece importante contribuição para a equipe
de saúde, pois fornece subsídios para compreender melhor
os fatores que podem influenciar a qualidade de vida destes
indivíduos. Aponta, ainda, os domínios mais prejudicados, o
que contribui para que sejam implementadas intervenções
específicas pelos profissionais de saúde, bem como pelos
gestores de políticas públicas.
Aluno: Juan José Cortez Escalante
Orientador: Cleudson Nery de Castro
Tese de Doutorado
Instituição: Universidade de Brasília
Título: Modelo prognóstico de desenvolvimento de TB ativa
nos pacientes com HIV/AIDS
Resumo:
Antecedentes: a tuberculose (TB) tem causado importante
morbidade e mortalidade durante séculos. Embora a incidência e letalidade diminuíram marcadamente no decurso
do século XX, o surgimento da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) no final desse século mudou significativamente estas tendências. Objetivo: identificar características associadas à TB ativa nos pacientes com HIV/Aids,
atendidos nos estabelecimentos de saúde especializados do
Distrito Federal e desenhar um escore clínico-epidemiológico
para fins de predição. Método: realizado um estudo de caso
- controle em pacientes com 18 anos ou mais com diagnóstico de HIV/Aids, comparando os que desenvolveram TB ativa com os que não desenvolveram a doença entre os anos
2000 a 2004. Os pacientes foram identificados nas bases de
dados da Secretaria de Saúde do Distrito Federal (DF), isto
é no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) de TB e Aids, de HIV e do Sistema de Informações
sobre Mortalidade (SIM), complementada com os dados dos
laboratórios de TB e HIV do LACEN - DF. A identificação dos
fatores de risco foi realizada utilizando regressão logística
para análises uni e multivariada. Com esses fatores se desenvolveu um modelo de predição de TB ativa nos pacientes
com HIV/Aids. O modelo foi avaliado no mesmo grupo de
pacientes que o gerou, mediante análise de sensibilidade,
especificidade, valores preditivos positivos e negativos, razões de verossimilhança, acurácia, curva ROC e a área sob
esta curva, assim como o cálculo de probabilidade pós-teste.
Resultados: foram identificados 222 pacientes co-infectados,
dos quais, 206 apresentaram critérios de seleção adequados. Desses, 64 foram identificados como óbitos e 51 não foram encontrados. Foram incluídos na investigação 91 casos
e 91 controles. A prevalência estimada de TB nos pacientes
com HIV/Aids em 2000 e 2004 foi 0,55 e 0,43%, respectivamente. Na população geral, a prevalência da co-infecção foi
2,62 casos por 100.000 habitantes. Dentre as características
associadas à TB, sete permaneceram significativas após a
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TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 29 29
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análise multivariada: ter menos de 8 anos de estudos completos (OR - ajustado = 4,6; IC 95% = 1,5 a 13,8), renda
mensal menor que R$ 600,00 (US$ 300,00) (OR - ajustado
= 4,8; IC 95% = 1,5 a 14,8), mais de uma família morando
no domicílio (OR - ajustado = 48,7; IC 95% = 3,5 a 672,3),
existência de doente com TB na família (OR - ajustado =
13,6; IC 95% = 2,4 a 78,3), ter apresentado toxoplasmose
cerebral nos últimos dois anos (OR - ajustado = 7,2; IC 95%
= 1,5 a 33,8), linfócitos T CD4+ inferior a 200 células/ µl no
mesmo período (OR - ajustado = 6,5; IC 95% = 2,1 a 20,1)
e o não uso de um mesmo esquema HAART nos últimos 6
meses (OR - ajustado = 27,2; IC 95% = 7,8 a 95,1). Estas
sete características constituíram o modelo de predição recebendo escores de 1, 1, 3, 2, 1, 1 e 2, respectivamente.
Na avaliação do modelo encontrou-se 100% de sensibilidade
quando o ponto de corte foi zero, 100% de especificidade
quando foi igual ou maior que seis pontos, a maior razão de
verossimilhança positiva (69) com seis pontos e a maior acurácia (90,1%) com quatro pontos. Com a prevalência de TB
nos pacientes com HIV/Aids de 0,43% a maior probabilidade
pós-teste (23%) foi obtida com o ponto de corte 6. Conclusão: foi possível identificar características associadas à TB
nos pacientes com HIV/Aids, que definem a co-infecção no
Distrito Federal e com estas características desenvolver um
modelo de predição clínica.
Aluno: Luisa de Moraes Madeira
Orientador: Elibio Leopoldo Rech Filho
Dissertação de Mestrado
Instituição: Universidade de Brasília
Título: Expressão de Cyanovirin-N, um Microbicida Anti-HIV,
em Plantas
Resumo:
O Vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um vírus envelopado e as proteínas do seu envelope, em especial a
gp120, controlam os eventos necessários para a sua entrada
em células suscetíveis. A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é a manifestação clínica da infecção por HIV.
Apesar dos esforços globais de combate à AIDS, o número
de portadores de HIV no mundo continua crescendo. O contato heterossexual é a principal forma de transmissão e tem
acarretado no aumento alarmante do número de mulheres
infectadas. Os microbicidas são medicações antimicrobianas
capazes de prevenir a transmissão do HIV quando aplicadas
na vagina ou reto antes da relação sexual, e surgiram como
uma ferramenta adicional de combate à AIDS direcionada
às mulheres. Cyanovirin-N (CV-N) é uma proteína candidata à microbicida capaz de inativar várias linhagens do HIV
se ligando irreversivelmente à gp120 viral. A produção de
CV-N, assim como de qualquer microbicida, para ser economicamente viável e suprir a demanda mundial deve ser
alcançada em níveis muito altos. Dessa forma, plantas geneticamente modificadas oferecem um sistema adequado
para a produção de CV-N. Neste trabalho, plantas de soja
transgênicas para a expressão de CV-N sob o controle do
promotor da β-conglicinina α` foram produzidas e a análise
das sementes R1 mostrou que CV-N está acumulando a 6%
do total de proteínas solúveis da semente, um nível significativamente alto quando comparado a outros trabalhos semelhantes. Adicionalmente, foi testado o sistema de expressão
transiente de CV-N e CV-N mutada (Asn30Gln/Pro51Gly) em
folhas de Nicotiana benthamiana, com três diferentes tipos
de endereçamento celular. Os resultados demonstraram que
todas as construções produziram CV-N capaz de se ligar à
gp120, com níveis de expressão de aproximadamente 0,1%,
sendo assim bastante inferiores aos observados em soja.
Este trabalho é um exemplo das vantagens de produção de
proteínas recombinantes em sementes quando comparada
a folhas.
Aluno: Kedma de Magalhães Lima
Orientador: Ana Carolina Brandão Salgado
Dissertação de Mestrado
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco
Título: Aspectos clínicos e laboratoriais das onicomicoses em
pacientes HIV - positivos e susceptibilidade da Candida spp
aos antifúngicos
Resumo:
Onicomicoses afetam 15-40% dos indivíduos com HIV. São
causadas por leveduras, dermatófitos e fungos filamentosos
não-dermatófitos (FFND), apresentando as formas clínicas
de onicomicose subungueal distal e lateral (OSDL), branca superficial (OBS), distrófica (OD) e subungueal proximal
(OSP). Objetivamos descrever os aspectos clínicos e laboratoriais das onicomicoses em HIV-positivos. MÉTODOS:
Estudo de série de casos realizado no Hospital Correia Picanco, Recife, Pernambuco. Foram coletadas escamas ungueais de lesões sugestivas de onicomicose em pacientes
encaminhados para exame micológico. Os fragmentos foram
retirados com cureta estéril e submetidos a pesquisa direta
e cultura. RESULTADOS: Dos 100 pacientes com micoses
superficiais, 35(35%) possuíam suspeita de onicomicose.
Destes, 5(14,5%) apresentavam lesões ungueais em pés e
nas mãos. Das 40 amostras, 22(55%) pertenciam ao sexo
feminino, 18(45%) ao masculino; 21(52,5%) eram em unhas
das mãos e 19(47,50%) em unhas dos pés. A idade media foi
de 40,7 anos. Dos 21 casos de OSDL, 71,42% eram nos pés
e dos 15 casos de OD, 93,33% eram nas mãos. Leveduras
foram isoladas em 21(52,5%), FFND em 7(17.5%), dermatófitos em 4(10%) e infecções mistas (leveduras + bactérias)
em 3(7,5%). O diagnostico micológico para as suspeitas de
onicomicose foi confirmado nas 40 amostras, entretanto não
houve crescimento fúngico em 5 cultivos. CO*CLUSÕES-A
OSDL foi a principal forma clinica nas unhas dos pés, enquanto a OD, nas unhas das mãos. Em todas as suspeitas
de onicomicose houve confirmação por exame direto e/ou
cultura micológica. Levedura foi patógeno predominante, seguido em freqüência por FFND, passando os dermatófitos a
um plano inferior.
30
TEND HIV VOL 3 N4 2008 02 12 08 30 30
12/2/08 12:07:03 PM

ISSN 1984-0780 - Disciplina de Infectologia

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