epidemiologia da leptospirose em animais silvestres de vida
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epidemiologia da leptospirose em animais silvestres de vida
EPIDEMIOLOGIA DA LEPTOSPIROSE EM ANIMAIS SILVESTRES DE VIDA LIVRE DA REGIÃO DE BOTUCATU, SP Felipe Fornazari1*, Pâmela Merlo Marson2, Carlos Roberto Teixeira3, Valdinei Moraes Campanucci da Silva4, Helio Langoni1 1 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP, Botucatu 2 Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP, Botucatu 3 Centro de Medicina e Pesquisa de Animais Silvestres – CEMPAS, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP, Botucatu 4 Secretaria Municipal da Saúde de Botucatu, Vigilância Ambiental em Saúde de Botucatu *[email protected] Palavras-chave: leptospira, saúde pública, saúde animal Introdução: a leptospirose é uma zoonose de grande importância nos animais e no homem. São escassos os estudos em animais silvestres e, devido ao papel dos mesmos como reservatórios de diversas enfermidades, bem como à severidade das lesões causadas pela leptospirose, o presente estudo teve como objetivo principal pesquisar a infecção por Leptospira spp. em mamíferos silvestres de vida livre na região de Botucatu, SP. Material e métodos: os animais foram amostrados de duas formas: (1) captura, utilizando-se armadilhas em fragmentos florestais e (2) acompanhamento da casuística do Centro de Medicina e Pesquisa de Animais Silvestres, da FMVZ – UNESP - Botucatu. Foram colhidas amostras de sangue e urina de 309 animais, representando 16 espécies. Para o diagnóstico sorológico foi realizada a técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) para 18 sorogrupos de Leptospira spp.. As amostras de urina foram submetidas ao diagnóstico molecular pela PCR em tempo real (qPCR), utilizando-se o equipamento StepOneTM Plus Real Time PCR System, o sistema SYBR®Green, e os primers Lep1 e Lep2. A análise estatística foi realizada para comparar a positividade com o local de origem de indivíduos agrupados dentro de uma mesma espécie. Resultados: Na SAM foram positivos 50 animais (16,1%), reagentes para os sorogrupos Semaranga (n=18), Djasiman (n=9), Australis (n=7), Sejroe (n=5), Icterohaemohrragiae (n=5), Grippotyphosa (n=3), 1 Canicola (n=3), Autumnalis (n=3), Shermani (n=2) e Panama (n=1). Na qPCR foram positivos 17 animais (5,5%). No total, 64 animais foram positivos (20,7%) para pelo menos uma das técnicas de diagnóstico (SAM e/ou qPCR), obtendo-se as maiores prevalências para as espécies: furão (83,3%), cachorro do mato (75.0%), lobo guará (66,6%) e quati (30,3%). A análise estatística revelou que gambás provenientes da mata apresentaram maiores chances de se infectar em relação aos gambás residentes da área urbana (Odds Ratio = 3,87). Não foi observada diferença significativa nas prevalências de quatis positivos provenientes de duas regiões distintas, mas de características ambientais semelhantes. Conclusões: uma grande diversidade de sorogrupos foi responsável pela infecção nos animais estudados, com uma alta positividade para o sorogrupo Semaranga; a presença de DNA de leptospiras na urina indica o papel dos animais silvestres como reservatórios; existem diferenças significativas na prevalência de infecção entre diferentes espécies, havendo maior positividade em indivíduos das famílias Canidade e Mustelidae; fatores ambientais estão envolvidos na maior prevalência de infecção em gambás provenientes da mata em relação aos gambás localizados na área urbana. 2 ABSTRACT Leptospirosis is zoonosis of great importance in animals and humans. Studies in wild animals are scarce and, due to the role of them as reservoirs of other diseases, as well as the severity of injuries caused by leptospirosis, the present study aimed to investigate the infection by Leptospira spp. in free-ranging wild mammals in the region of Botucatu, SP. Animals were sampled by two methods: (1) capture, using traps in forest fragments and (2) following the routine of the Center of Medicine and Research in Wildlife, FMVZ – UNESP – Botucatu. Blood and urine samples were collected from 309 animals, representing 16 species. Serological diagnosis was performed by Microscopic Agglutination Test (MAT) for 18 Leptospira spp. serogroups, using 29 antigens. Urine samples were submitted to molecular diagnosis by Real Time PCR (RTPCR), using StepOneTM Plus Real Time PCR System equipment, SYBR®Green system, and primers Lep1 and Lep2. To investigate clinical symptoms compatible with leptospirosis, blood cell count, hepatic/renal enzymes dosage and physical exam were performed. Statistical analysis was used to compare positivity with place of origin of animals grouped in the same species. In MAT 50 animals were positive (16.1%), reagents to serogroups Semaranga (n=18), Djasiman (n=9), Australis (n=7), Sejroe (n=5), Icterohaemohrragiae (n=5), Grippotyphosa (n=3), Canicola (n=3), Autumnalis (n=3), Shermani (n=2) and Panama (n=1). In RT-PCR 17 animals were positive (5.5%). In total, 64 animals were positive (20.7%) for at least one of the diagnosis test (MAT and/or RT-PCR), yielding the highest prevalence for species: lesser grison (83.3%), crab-eating fox (75.0%), maned wolf (66.6%), and coati (30.3%). No significant clinical abnormalities that could be associated with leptospirosis were observed. Statistical analysis revealed that opossums from the forest had higher chances of infection than opossums from urban areas (Odds Ratio = 3.87). No significant difference was observed between prevalence of coatis from two distinct areas, but with similar environmental features. In conclusion: (1) a great diversity of serogroups was responsable for the infection in the studied animals, with a high positivity for Semaranga serogroup; (2) leptospiral DNA in urine samples indicates the role of wild animals as reservoirs; (3) leptospirosis presented low morbidity; (4) there is a 3 great diversity of species infected by Leptospira spp. in Botucatu, SP; (5) there are significant diferences in prevalence among species; (6) opossums presented a high prevalence of infection by saprophyte leptospires; (7) environmental features are associated in the higher prevalence of infection in opossums from the forest than those from urban areas. Key-words: leptospirosis, wildlife, microscopic agglutination test, real time PCR, zoonosis. 4 INTRODUÇÃO 5 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma enfermidade infecto-contagiosa, de caráter zoonótico, de ampla distribuição mundial. Possui grande importância em saúde pública e saúde animal devido à severidade das lesões, bem como aos prejuízos econômicos, decorrentes principalmente do tratamento dos doentes e das perdas na produção animal (Adler e de la Peña Moctezuma, 2010; Guerra, 2013; Picardeau, 2013). Diversas espécies de bactérias patogênicas do gênero Leptospira spp., agrupadas em mais de 250 sorovares, são responsáveis pela etiologia da leptospirose. A infecção ocorre principalmente pela penetração ativa da bactéria pelas mucosas ou soluções de continuidade, tanto de forma direta (contato com animais infectados) como indireta (contato com água ou solo úmido contaminado). Uma vez infectados, os animais e humanos eliminam as leptospiras pela urina, completando assim o ciclo epidemiológico da doença (Levett, 2001). Leptospiras são pouco resistentes no ambiente, necessitando de condições adequadas de temperatura, pH e umidade para sobreviver. Portanto, os reservatórios são essenciais na manutenção da enfermidade, atuando como portadores renais e eliminando as leptospiras de forma intermitente durante longos períodos. Os roedores sinantrópicos são considerados os reservatórios mais importantes da leptospirose (Levett, 2001; Picardeau, 2013), destacandose a espécie Rattus norvegicus (popularmente chamado de ratazana), a qual possui grande adaptação às leptospiras do sorogrupo Icterohaemorrhagiae. Diversas espécies domésticas também são consideradas importantes reservatórios, como suínos, ovinos, caprinos e bovinos (Miraglia et al., 2008; 6 Fornazari et al., 2012; Gamage et al., 2014; ). Devido à proximidade com humanos, importância econômica e facilidade de amostragem, as espécies domésticas são muito mais estudadas do que espécies silvestres, não somente no campo da leptospirose, mas de diversas enfermidades de caráter infeccioso. A pesquisa de leptospiras em animais silvestres pode fornecer informações a respeito da condição de portador renal e, consequentemente, indicar seu potencial como fontes de infecção. Este aspecto adquire especial importância em áreas rurais, onde existe uma maior proximidade entre as espécies silvestres, humanos e animais domésticos. Além disso, o mesmo impacto que a leptospirose apresenta nos animais domésticos e em humanos já foi documentado em algumas espécies selvagens em outros países, como macacos e leões marinhos (Norman et al., 2008; Szonyi et al., 2011; Delaney et al., 2014). Portanto, a pesquisa de leptospiras em animais silvestres possui importância tanto no contexto de saúde pública como de saúde animal. O Brasil é considerado um dos países com a maior biodiversidade do planeta (Begossi et al., 2003). A grande quantidade de espécies animais e vegetais, aliadas à extensão de nosso território, ao clima tropical e à diversidade de biomas, constitui uma rede complexa de relações na cadeia de transmissão de enfermidades infecciosas e parasitárias. Assim, há uma necessidade constante em nosso país de estudos que abordem o conceito de OneHealth – promoção da saúde animal, humana e ambiental de forma integrada (Atlas, 2013). Em nosso país, a leptospirose é considerada endêmica, ocorrendo com frequência surtos epidêmicos em períodos de alta pluviosidade e/ou em regiões com condições inadequadas de saneamento básico (Ko et al., 1999; Romero et 7 al., 2003). Os estudos direcionados para a leptospirose em animais silvestres são escassos, e geralmente consistem de inquéritos sorológicos realizados em um pequeno grupo de animais mantidos em cativeiro (Côrrea et al., 2004; Esteves et al., 2005; Pimentel et al., 2009; Silva et al., 2010; Jorge et al., 2011; Pinna et al., 2012; Ullmann et al., 2012a; Ullmann et al., 2012b; Proença et al., 2013). Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo pesquisar a infecção por Leptospira spp. em uma amostragem significativa de animais, utilizando técnicas sorológicas e moleculares, contribuindo assim para um maior conhecimento da epidemiologia da leptospirose. 8 OBJETIVOS 9 OBJETIVOS Determinar a prevalência de anticorpos anti-Leptospira spp. em amostras de sangue de mamíferos silvestres de vida livre, seus títulos e sorogrupos mais frequentes; Pesquisar a presença de DNA genômico específico para o gênero Leptospira spp. em amostras de urina de animais silvestres pela PCR em tempo real (PCR-TR); Avaliar o impacto da leptospirose nos animais silvestres, pela correlação entre os resultados da sorologia/PCR-TR e as alterações observadas na avaliação do estado de saúde dos animais; Comparar os resultados da sorologia e da PCR-TR entre as diferentes espécies, determinando-se quais são as mais acometidas e/ou mais frequentes fontes de infecção; Investigar a influência de fatores ambientais na infecção por Leptospira spp., por meio da associação entre a positividade dos animais com seus respectivos habitats de origem. 10 MATERIAL E MÉTODOS 11 MATERIAL E MÉTODOS Delineamento experimental O estudo foi realizado no município de Botucatu, SP (22° 53’ 09” S 48° 26’ 42” O). Para a amostragem dos animais foram utilizadas duas técnicas: (1) captura utilizando-se armadilhas em fragmentos florestais e (2) acompanhamento da casuística do Centro de Medicina e Pesquisa de Animais Silvestres (CEMPAS), da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) - UNESP - Botucatu. Ambos os métodos de amostragem selecionados permitiram o estudo de populações representativas da região de Botucatu, diminuindo assim a possibilidade de vieses na análise epidemiológica. Tanto a captura como a amostragem dos animais encaminhados ao CEMPAS foram distribuídas de forma homogênea, tanto de forma temporal como espacial ao longo de 22 meses. Embora não tenha sido possível capturar animais na maioria dos fragmentos florestais da região, foram selecionadas as áreas de maiores dimensões territoriais, conforme descrito posteriormente. Devido à falta de dados presentes na literatura, não foi possível calcular o número mínimo de animais a serem amostrados no presente estudo para que se obtivessem resultados expressivos. De forma empírica, foi estabelecido um número de 300 a 400 animais, considerando-se o tempo do estudo e a experiência prévia da equipe em trabalhos anteriores. A colheita das amostras biológicas foi realizada a campo, no mesmo local da captura dos animais, bem como no CEMPAS, durante os procedimentos ambulatoriais. Em seguida as amostras foram encaminhadas ao Núcleo de 12 Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO) da FMVZ - UNESP - Botucatu, para serem processadas, armazenadas e analisadas. O estudo foi realizado segundo a aprovação do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), mediante autorização emitida pelo Sistema de Autorização e Informação da Biodiversidade (SISBIO), no 33162-2. O estudo também foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da FMVZ - UNESP – Botucatu (protocolo no 10/2012). Captura dos animais Para a captura dos animais foram selecionados fragmentos florestais localizados na Fazenda Lageado, na Fazenda Edgardia e no Jardim Botânico do Instituto de Biociências, todos pertencentes à UNESP – Botucatu. O principal critério adotado para a seleção destes locais foi a extensão territorial – capaz de suportar grandes populações de animais silvestres –, além da facilidade de acesso e conhecimento prévio da fauna existente. As capturas foram realizadas mensalmente, entre abril de 2012 e janeiro de 2014, com duração variável de 4 a 10 dias/mês, dependendo das condições climáticas e disponibilidade da equipe. Foram empregadas armadilhas do tipo tomahawk (Gabrisa®), de metal galvanizado, dobráveis, medindo 40 x 40 x 70 cm. De 5 a 20 armadilhas eram utilizadas em cada local de captura, dependendo do tamanho do fragmento florestal e inclinação do terreno. As armadilhas eram instaladas pela manhã, sob a sombra, iscadas com banana e/ou carne crua (cabeça de frango) e verificadas na manhã do dia seguinte. 13 Animais encaminhados ao CEMPAS A casuística do CEMPAS foi acompanhada diariamente. Somente foram amostrados exemplares com o perfil do estudo: mamíferos, de vida livre, encaminhados de Botucatu ou de municípios próximos. As amostras biológicas foram colhidas durante os procedimentos ambulatoriais de rotina, no momento em que os animais se encontravam anestesiados. Nos casos em que não era possível a colheita no momento da admissão do animal, este procedimento foi realizado em um período de até quatro dias após sua chegada ao CEMPAS. Se a amostragem do animal só fosse possível em um período superior a quatro dias, o mesmo era descartado do estudo. Contenção e anestesia dos animais capturados Os animais capturados em seu ambiente natural foram anestesiados para a colheita de material biológico. A contenção física foi realizada utilizando-se luvas de raspa de couro e/ou puçás, seguida da aplicação do anestésico. Em alguns casos a anestesia foi aplicada por meio de dardos artesanais e zarabatana, para garantir uma maior segurança da equipe e do animal. A anestesia foi realizada pela associação dos anestésicos cloridrato de quetamina (Dopalen®) e midazolan (Dormire®), utilizando-se doses apropriadas para cada espécie, conforme a literatura consultada (Cubas et al., 2006) e a experiência dos profissionais envolvidos. Esta combinação foi escolhida devido à sua eficiência e segurança, considerando-se os procedimentos que foram realizados, além de rápido retorno anestésico. 14 Os animais foram devidamente identificados com brincos metálicos (Zootech®) modelo ZT 900 7 mm, para evitar a amostragem repetida de um mesmo indivíduo caso ele fosse recapturado. Após a colheita das amostras, os animais foram colocados novamente no interior das armadilhas, a qual foi coberta por um pano para diminuir o estresse do animal durante sua recuperação, bem como proteger de insetos parasitas. Os animais foram soltos somente após total ausência dos efeitos da medicação anestésica. Avaliação da saúde dos animais Foi realizada uma avaliação do estado de saúde dos animais com o objetivo de investigar a presença de sinais clínicos compatíveis com a infecção por Leptospira spp.. Para tanto, foram realizados exames laboratoriais específicos (os quais são descritos em detalhe nos tópicos seguintes); e exame físico, o qual foi realizado imediatamente após a anestesia. O exame físico foi direcionado aos principais sinais clínicos observados na leptospirose em animais domésticos, como icterícia, febre e hemorragias em mucosa (Greene et al., 2006). Colheita e preparo das amostras Amostras de sangue e urina foram colhidas de cada animal. Para a colheita de sangue, foi realizada a punção de vasos periféricos, enquanto que a urina foi colhida ou por cistocentese, ou por sondagem uretral ou por micção natural. As amostras de sangue de cada animal foram divididas em duas 15 alíquotas, uma para hemograma e outra para a obtenção de soro. As amostras de urina foram armazenadas na própria seringa utilizada para a colheita. Após o transporte do material para a FMVZ – UNESP – Botucatu, uma das amostras de sangue foi imediatamente encaminhada ao Serviço de Laboratório Clínico Veterinário, do Departamento de Clínica Veterinária, para a realização do hemograma. O restante do material foi encaminhado ao Núcleo de Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO), do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública. A segunda amostra de sangue foi centrifugada e o soro obtido armazenado em freezer -80°C para posterior análise. As amostras de urina foram lavadas em solução salina tamponada (SST) estéril, pH 7,6, previamente ao congelamento, com o objetivo de remover proteínas e íons que pudessem interferir na reação de PCR-TR. Para tanto, cada amostra de urina foi centrifugada a 11.000 rpm, o sobrenadante descartado, e o pellet lavado em SST utilizando-se um agitador automático do tipo vortex (IKA®) por aproximadamente 10 s. O procedimento foi repetido mais uma vez e o pellet ressuspendido em uma solução final de 1 mL de SST, obtendo-se assim uma alta concentração celular na urina, a qual foi armazenada a -80°C para posterior análise. Exames complementares Os exames complementares ao exame físico dos animais foram hemograma e dosagem de enzimas hepáticas/renais. O hemograma foi realizado utilizando o equipamento pocH-100ivTM Diff (Roche®), conforme as instruções do fabricante, no qual foram mensurados: hemácias, hemoglobina e leucócitos totais. O diferencial leucocitário foi feito por esfregaço sanguíneo 16 utilizando o corante Wright. A leitura de hematócrito foi realizada em capilar pelo método do microhematócrito, enquanto que a determinação das proteínas plasmáticas totais foi realizada por refratometria. A avaliação do perfil hepático e renal foi realizada pela dosagem sérica dos seguintes componentes do sangue: alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gama-glutamil-transferase (GGT), fosfatase alcalina (FA), bilirrubinas, proteínas totais séricas, albumina, uréia e creatinina. Foi realizada a dosagem de CK (creatino quinase) para a validação da AST. Todas as mensurações foram realizadas no espectofotômetro COBAS Mira Plus (Roche®), segundo o protocolo de análise nos kits comerciais, de acordo com as instruções do fabricante. Exame sorológico As amostras de soro foram testadas para anticorpos anti-Leptospira spp. pela técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM), segundo as normas do Ministério da Saúde (Brasil, 1995). Foi utilizada uma bateria de antígenos vivos, mantidos e repicados semanalmente em meio Ellinghausen-McCulloughJohnson-Harris (EMJH) (DIFCO Laboratories®), a 28°C, constituída de 24 sorovares, quatro variantes do sorovar Hardjo e uma cepa local isolada de um cão (sorovar Canicola), totalizando 18 sorogrupos (Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Celledoni, Djasiman, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe, Shermani, Andamana e Semaranga). Cada amostra foi inicialmente diluída em SST pH 7,6 na proporção 1:100, misturada separadamente com cada um dos 29 antígenos em placas de fundo chato (96 orifícios) e incubadas a 37°C por 17 uma hora. A leitura foi realizada em microscópio de campo escuro (Zeiss®) com aumento de 100x. Foram consideradas positivas amostras que apresentaram 50% ou mais de leptospiras aglutinadas. Em seguida, as amostras reagentes foram novamente testadas – conforme anteriormente descrito – somente para o antígeno reagente, em diluições seriadas na razão de dois (100, 200, 400, 800 e 1600) para obter-se o título final. Como controle negativo foi utilizada SST pH 7,6. No caso das amostras que apresentaram reação para mais de um sorovar, foi considerado como reagente somente aquele que apresentou maior título. Extração de DNA Para a extração de DNA das amostras de urina foi utilizado o kit IllustraTM Blood Genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare®), segundo as instruções do fabricante. As amostras foram transferidas, no volume de 200 µL, para um microtubo estéril de 1,5mL (AXYGEN®), livre de DNAse e RNAse. Em seguida, foi adicionado 20µL de proteinase K, homogeneizado em agitador automático do tipo vortex (IKA®) por 10 s, e acrescentados 400 µL de tampão de lise, incubando-se por 10 min em temperatura ambiente sob agitação constante em agitador automático (IKA®). As amostras foram submetidas a spin por 10 segundos, e o conteúdo transferido para um filtro e seu respectivo tubo coletor. Os tubos foram centrifugados a 11.000 rpm por 1 min, acrescentados 500 µL de solução de tampão de lise e novamente centrifugados a 11.000 rpm por 1 min. Em seguida foi adicionado 500 µL de tampão de lavagem e centrifugados a 11.000 rpm por 3 minutos. Os tubos coletores foram descartados e os filtros acoplados em novos microtubos de 1,5 mL, previamente descritos. Foram 18 acrescentados 200 µL da solução de eluição a 70°C, incubados por 1 minuto a temperatura ambiente, e os microtubos centrifugados a 11.000 rpm por 1 minuto. A amostra obtida foi armazenada em geladeira a 4°C por 24 horas, para a estabilização do DNA, e em seguida estocada em freezer a -20°C para posterior análise. Foi utilizado como controle negativo SST pH 7,6. Reação em Cadeia pela Polimerase em Tempo Real (PCR-TR) Foi realizada a PCR em tempo real para a detecção do DNA genômico específico para o gênero Leptospira. A análise foi desenvolvida utilizando-se o equipamento StepOne™ Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems®) e o sistema SYBR®Green para detecção de fluorescência. Os primers empregados foram o Lep1 e Lep2 (Merien et al., 1992), os quais correspondem a sequência de oligonucleotídeos 38-57 (5’GGCGGCGCGTCTTAAACATG3’) e 348-368 (5’TTCCCCCCATTGAGCAAGATT3’), da estrutura primária do gene 16 S rRNA da Leptospira interrogans sorovar Canicola, e que resultam em um produto de 331 pb. Como controle positivo foi utilizado o mesmo antígeno empregado na SAM, pertencente ao sorovar Hardjo, enquanto que para o controle negativo foi utilizado a amostra de SST pH 7,6 processada na etapa de extração de DNA. O ensaio foi realizado em placas descartáveis (Applied Biosystems®), nas quais foram adicionados em cada orifício 10 μL de Power SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems®), 7,6 μL de água MilliQ estéril, 0,2 μL de cada primer e 2 μL da amostra a ser testada, totalizando 20 μL por reação. Todas as amostras foram analisadas em triplicata. Em seguida a placa foi selada, inserida no equipamento e submetida às seguintes condições: 95°C por 19 10 min, seguido de 40 ciclos de 95°C por 15 sg e 60°C por 1min, e uma etapa final para a curva de dissociação (melting curve) de 55 min (60°C a 95°C). O sinal de fluorescência foi obtido ao longo dos ciclos de amplificação e analisados pelo software do equipamento. Foram consideradas positivas amostras cuja curva de dissociação apresentou variação de até um grau celsius em relação ao controle positivo. Análise estatística Frequências absolutas e relativas das diferentes variáveis foram calculadas. Os intervalos de confiança 95% foram calculados para medidas de prevalência como estimativas de precisão dos valores obtidos sempre que possível. No caso de número amostral reduzido ou valores das estimativas próximos dos extremos, o cálculo foi baseado na distribuição binomial para evitar intervalos menores do que 0 ou maiores do que 1 (Dohoo et al., 2009). Nos demais casos, os intervalos foram calculados considerando-se probabilidades aproximadas da distribuição normal. Aplicou-se o teste do qui-quadrado com o objetivo de estudar possíveis associações entre o local de origem dos animais (área urbana x mata; Fazenda Lageado/Edgardia x Jardim Botânico) e o resultado (positivo x negativo) para qualquer uma das técnicas (SAM ou PCR-TR). Esta análise foi realizada somente entre indivíduos da mesma espécie, evitando-se a análise entre exemplares de diferentes espécies. Assim, foi possível constituir grupos homogêneos e livres de interferências intrínsecas à variável “espécie” – considerada uma possível fonte de viés. Também foram excluídas da análise espécies com poucos indivíduos amostrados e/ou com tendência para somente 20 um tipo de local de origem, com o objetivo de aumentar a validade do teste. O resultado obtido na SAM e/ou PCR-TR foi utilizado como variável dependente, enquanto que o local de origem como variável independente. Em casos de significância estatística (P < 0.05), valores de odds ratio e seus limites de confiança para o intervalo de 95% foram calculados para designar o tamanho do efeito observado. As análises foram conduzidas no software R (Crawley, 2013). 21 RESULTADOS 22 RESULTADOS Animais No total foram amostrados 309 animais, incluídos em 16 espécies: gambá de orelha branca (Didelphis albiventris, n=195), quati (Nasua nasua, n=56), ouriço cacheiro (Sphiggurus villosus, n=13), tamanduá bandeira (Myrmecophaga tridactyla, n=6), furão (Galictis cuja, n=6), tamanduá mirim (Tamandua tetradactyla, n=5), veado catingueiro (Mazama gouazoubira, n=5), tatu galinha (Dasypus novencinctus, n=4), raposa (Lycalopex vetulus, n=4), cachorro do mato (Cerdocyon thous, n=4), lobo guará (Chrysocyon brachyurus, n=3), onça parda (Puma concolor, n=2), macaco prego (Sapajus nigritus, n=2), lebre europeia (Lepus europaeus, n=2), mão pelada (Procyon cancrivorus, n=1) e irara (Eira barbara, n=1). Exame sorológico Na SAM foram positivos 50 animais, correspondendo a uma prevalência de 16,1% (95% IC: 12,0 – 20,2). As espécies que apresentaram maior positividade foram: furão (83,3%; 95% IC: 35,8 – 99,5), cachorro do mato (75%; 95% IC: 19 – 99), lobo guará (66,6%; 95%: 9 – 99) e raposa (50%; 95% IC: 6 – 93). Também apresentaram alta positividade irara (100%) e mão pelada (100%), mas como somente um exemplar de cada espécie foi amostrado, estes resultados possuem baixa validade. Os sorogrupos reagentes foram: Semaranga (n=18), Djasiman (n=9), Australis (n=7), Sejroe (n=5), Icterohaemohrragiae (n=5), Grippotyphosa (n=3), Canicola (n=3), Autumnalis (n=3), Shermani (n=2) e Panama (n=1), conforme indica a tabela 1. Quatro 23 animais foram positivos para mais de um sorogrupo. Os títulos apresentados foram 100 (n=16), 200 (n=21), 400 (n=5), 800 (n=5) e 1600 (n=3). Os demais resultados obtidos na SAM estão sumarizados na tabela 2. Reação em Cadeia pela Polimerase em Tempo Real (PCR-TR) Foram positivos na PCR-TR 17 animais, correspondendo a uma prevalência de 5,5% (95% IC: 2,9 – 8,0). Cada uma das amostras positivas apresentou curva de amplificação e de dissociação nos três ensaios. As espécies que apresentaram positividade foram: gambá de orelha branca (3,5%; 95% IC: 0,9 – 6,2), macaco prego (100%; 95% IC: não calculado), ouriço cacheiro (15,3%; 95% IC: 1,9 – 45,4), quati (8,9%; 95% IC: 1,4 – 16,4) e tatu galinha (25%; 95% IC: 0,6 – 80,5). Os resultados estão sumarizados na tabela 1. Associação da SAM e PCR-TR Ao considerar as duas técnicas de diagnóstico como complementares, 64 animais foram positivos, correspondendo a uma prevalência total de 20,7% (95% IC: 16,1 – 25,2). Dessa forma, as prevalências de indivíduos positivos para cada espécie foram semelhantes às obtidas considerando-se somente a SAM, conforme indica a tabela 1. Entre os 64 animais positivos pela associação de técnicas, somente três foram positivos tanto pela SAM como pela PCR-TR. 24 Avaliação do estado de saúde dos animais e exames complementares No exame físico não foram encontrados sinais clínicos característicos da leptospirose, tanto nos animais positivos como negativos. Em alguns indivíduos foram observados sintomas inespecíficos compatíveis com enfermidades de natureza infecciosa ou parasitária. Como exemplo, em 11 animais foi observado aumento (de discreto a acentuado) de linfonodos inguinais e/ou poplíteos. Destes, três animais (dois gambás e um furão) foram positivos na SAM com baixos títulos (100 ou 200), enquanto que um indivíduo (gambá) foi positivo na PCR-TR. Os sete animais restantes com aumento de linfonodos não apresentaram positividade para nenhuma das técnicas de diagnóstico. Em alguns animais também foram observados variados graus de caquexia, mas estes estavam associados, em sua grande maioria, a traumas físicos principalmente decorrentes de atropelamentos. Não foram observados outros sinais clínicos inespecíficos que poderiam estar associados à leptospirose. Os exames complementares foram analisados em 25 animais, os quais apresentaram resultado positivo na PCR-TR (n=17) ou com títulos ≥ 800 na SAM (n=8), parâmetros estes considerados como indicativos de infecção recente (Levett, 2001). Não foram observadas alterações significativas compatíveis com leptospirose nos exames complementares. Somente um animal – lobo guará – apresentou alterações compatíveis com leptospirose: intensa leucocitose com neutrofilia (30.000 leucócitos/µL; 29.100 neutrófilos/µL) 25 Análise estatística As frequências absolutas e relativas das diferentes variáveis, valores da estatística de qui-quadrado (χ2), graus de liberdade (GL), significância exata em P (two-tailed), e valores de Odds Ratio (OR) com limites superior (LS95%) e inferior (LI95%) do intervalo de confiança 95% são expressas na tabela 1, 2, 3 e 4. As espécies gambá e quati, devido à maior representatividade de indivíduos amostrados, foram selecionadas para comparar o local de origem dos animais com a positividade em pelo menos uma das técnicas. No caso dos gambás, foi observada uma maior prevalência nos indivíduos provenientes da mata em relação aos da área urbana, com uma razão de chances de 3,87, conforme indica a tabela 3. Em relação aos quatis, embora todos os animais amostrados fossem provenientes da mata (e nenhum da área urbana), o mesmo tipo de análise foi realizada adotando-se como critério de classificação as localidades onde não havia sobreposição de território ocupado pelos animais, objetivando investigar se havia diferença na prevalência de infecção em quatis de regiões distintas, mas com características ambientais semelhantes. Assim, os locais de origem dos quatis foram classificados em (1) Jardim Botânico e (2) Fazenda Lageado/Edgardia, localizados a uma distância aproximada de 7 km e separados pela área urbana de Botucatu. Não foi observada diferença significativa na positividade entre os diferentes locais de origem dos quatis (P=0,88), conforme indica a tabela 4. 26 Tabela 1. Frequência absoluta, relativa (%) e prevalência de animais positivos - com limites superior (LS95%) e inferior (LI95%) do intervalo de confiança 95%* - para as técnicas de Soroaglutinação Microscópica (SAM), PCR em tempo real (PCR-TR) e a combinação de ambas (SAM + PCR-TR) realizadas em animais silvestres da região de Botucatu, SP. ESPÉCIE Cachorro do mato (Cerdocyon thous) Furão (Galictis cuja) Gambá de orelha branca (Didelphis albiventris) Irara (Eira barbara) Lebre (Lepus europaeus) Lobo guará (Chrysocyon brachyurus) Macaco prego (Sapajus nigritus) Mão pelada (Procyon cancrivorus) Onça parda (Puma concolor) Ouriço cacheiro (Sphiggurus villosus) Quati (Nasua nasua) Raposa (Lycalopex vetulus) Tamanduá bandeira (Myrmecophaga tridactyla) Tamanduá mirim (Tamandua tetradactyla) Tatu galinha (Dasypus novencinctus) Veado catingueiro (Mazama gouazoubira) TOTAL N SAM (%) LI95% LS95% PCR-TR (%) LI95% LS95% SAM + PCR-RT (%) LI95% LS95% 4 6 195 1 2 3 2 1 2 13 56 4 6 5 4 5 309 3 (75,0) 5 (83,3) 16 (8,2) 1 (100,0) 0 (0,0) 2 (66,6) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 17 (30,3) 2 (50,0) 0 (0,0) 1 (20,0) 1 (25,0) 1 (20,0) 50 (16,1) 0,1941 0,3588 0,0435 0,0943 0,1831 0,0676 0,0051 0,0063 0,0051 0,1207 0,9937 0,9958 0,1206 0,9916 0,4240 0,9324 0,7164 0,8059 0,7164 0,2029 0 (0,0) 0 (0,0) 7 (3,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (15,3) 5 (8,9) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 17 (5,5) 0,0098 0,0192 0,0146 0,0063 0,0296 0,0620 0,4545 0,1640 0,8059 0,0804 3 (75,0) 5 (83,3) 22 (11,2) 1 (100,0) 0 (0,0) 2 (66,6) 2 (100,0) 1 (100,0) 0 (0,0) 2 (15,3) 21 (37,5) 2 (50,0) 0 (0,0) 1 (20,0) 1 (25,0) 1 (20,0) 64 (20,7) 0,1941 0,3588 0,0684 0,0943 0,0192 0,2482 0,0676 0,0051 0,0063 0,0051 0,1619 0,9937 0,9958 0,1572 0,9916 0,4545 0,5018 0,9324 0,7164 0,8059 0,7164 0,2523 N: Número de animais amostrados de cada espécie; *Intervalos de confiança foram calculados considerando-se aproximações da distribuição normal para resultados de gambás de orelha branca, quatis e para o total de animais. O cálculo dos intervalos de confiança das medidas de prevalência das demais espécies foi baseado em probabilidades exatas derivadas da distribuição binomial. 27 Tabela 2. Frequência absoluta de animais reagentes para diferentes sorogrupos de Leptospira spp. pela técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) realizada em animais silvestres capturados na região de Botucatu, SP. ESPÉCIE Cachorro do mato Furão Gambá Irara Lebre Lobo guará Macaco prego Mão pelada Onça Ouriço cacheiro Quati Raposa Tamanduá bandeira Tamanduá mirim Tatu galinha Veado catingueiro TOTAL SOROGRUPO* Australis (n=2), Djasiman (n=1) Shermani (n=2), Semaranga (n=2), Djasiman (n=1), Australis (n=1), Canicola (n=1) Semaranga (n=14), Autumnalis (n=1), Grippotyphosa (n=1), Canicola/Ictero (n=1) Djasiman (n=1) Canicola (n=1), Djasiman (n=1) Icterohaemohrragiae (n=1) Australis (n=4), Sejroe (n=4), Icterohaemohrragiae (n=3), Djasiman (n=2), Grippotyphosa (n=2), Autumnalis (n=2), Panama (n=1), Semaranga (n=1) Djasiman (n=2) Sejroe (n=1) Djasiman (n=1) Semaranga (n=1) Semaranga (n=18), Djasiman (n=9), Australis (n=7), Sejroe (n=5), Icterohaemohrragiae (n=5), Grippotyphosa (n=3), Canicola (n=3), Autumnalis (n=3), Shermani (n=2), Panama (n=1) *Número de animais positivos Tabela 3. Frequência absoluta e frequência relativa (%) de gambás positivos para o diagnóstico de leptospirose (SAM e PCR-TR) capturados na região de Botucatu, SP, de acordo com o local de origem, bem como os valores de quiquadrado (χ2), grau de liberdade (GL), significância exata em P (two-tailed), e valores de Odds Ratio (OR) com limites superior (LS95%) e inferior (LI95%) do intervalo de confiança 95%. Resultado Urbano % Mata % Positivo 9 6.7 13 21.7 Negativo 126 93.3 47 78.3 χ2 GL P OR LS95% LI95% 9.338 1 0.002 3.87 1.553 9.654 28 Tabela 4. Frequência absoluta e frequência relativa (%) de quatis positivos para o diagnóstico de leptospirose (SAM e PCR-TR) capturados na região de Botucatu, SP, de acordo com o local de origem, bem como os valores de quiquadrado (χ2), grau de liberdade (GL), significância exata em P (two-tailed), e valores de Odds Ratio (OR) com limites superior (LS95%) e inferior (LI95%) do intervalo de confiança 95%. Resultado L/E* % JB** % Positivo 14 36.8 7 38.8 Negativo 24 63.2 11 61.2 χ2 GL P OR LS95% LI95% 0.022 1 0.883 - - - *Fazendas Lageado e Edgardia **Jardim Botânico 29 DISCUSSÃO 30 DISCUSSÃO Foi observada uma grande diversidade de animais silvestres infectados por Leptospira spp. na região de Botucatu, SP, corroborando com estudos previamente realizados no Brasil, tanto em espécies domésticas (Miraglia et al., 2008; Fornazari et al., 2012; Miraglia et al., 2012; Oliveira et al., 2014) como silvestres (Pimentel et al., 2009; Silva et al., 2010; Jorge et al., 2011; Pinna et al., 2012; Ullmann et al., 2012a; Ullmann et al., 2012b). O presente estudo destacou-se pela grande amostragem de animais e pela utilização de técnicas moleculares, visto que, até o momento, a literatura nacional limita-se à amostragem de um número reduzido de indivíduos analisados e somente por técnicas sorológicas. Assim, a detecção de DNA em amostras de urina indica não somente a infecção por leptospiras, mas também o papel dos animais como reservatórios, uma vez que eliminam o agente no ambiente. Vários sorogrupos foram detectados como responsáveis pela infecção, demonstrando a diversidade de leptospiras na região estudada, bem como múltiplos ciclos epidemiológicos da enfermidade. Foi observada uma maior positividade do sorogrupo Semaranga em gambás, revelando uma alta prevalência da infecção para este sorogrupo, o qual é considerado saprófita (Levett, 2001). Porém, no caso particular do sorogrupo Semaranga, reações cruzadas com outros sorogrupos patogênicos podem ocorrer com frequência (Mauermann et al., 1993), contestando a verdadeira identidade das leptospiras responsáveis pela evidência sorológica. Mais estudos devem ser realizados para elucidar a causa da alta positividade do sorogrupo Semaranga nos gambás, visto que outras espécies foram capturadas nos mesmos locais e apresentaram resultados distintos. Ademais, observou-se que gambás 31 localizados na mata apresentam maiores chances de se infectar em relação aos gambás provenientes da área urbana, havendo uma alta prevalência do sorogrupo Semaranga nos animais das duas procedências. É muito provável que os gambás, independente da origem, compartilham o mesmo ciclo epidemiológico, porém, apresentam diferentes prevalências de infecção de acordo com o ambiente que habitam. Diversos fatores podem estar envolvidos nesta hipótese, contudo, o contato com o solo parece ser um aspecto importante a ser questionado, considerando a natureza saprófita do sorogrupo em questão. Na mata há uma maior quantidade de matéria orgânica no solo do que nas áreas urbanas e, dessa forma, as chances dos gambás se infectarem neste ambiente são maiores. Em relação aos quatis, não foi observada diferença estatística significativa entre os dois grupos analisados, resultado este esperado, pois as condições ambientais entre os dois grupos são semelhantes. Foram amostradas três espécies da família Canidae (cachorro do mato, raposa e lobo guará), nas quais se observou uma alta prevalência pela SAM. Ao agrupar os indivíduos das três espécies supracitadas, obteve-se uma prevalência total de 63,3% (7/11). Apesar do baixo número de canídeos estudados, estes resultados não devem ser subestimados, pois nenhum viés foi identificado no processo de amostragem – todos os 11 animais eram provenientes de regiões distintas e foram capturados em intervalos regulares ao longo do período do estudo. Poucos trabalhos envolvendo estas espécies foram realizados, demonstrando basicamente a presença de anticorpos antiLeptospira spp. para diversos sorogrupos (Deem e Emmons, 2005; Jorge et al., 2011; Scialfa et al., 2013). Um importante estudo foi publicado por Jorge et al. 32 (2011), no qual foi analisada uma quantidade expressiva de canídeos silvestres na região do Pantanal, também se obtendo prevalências elevadas. Embora os canídeos tenham exibido alta prevalência de animais positivos na SAM, nenhum foi positivo pela PCR-TR. Esse fato poderia ser explicado pelo pequeno número de animais amostrados, pela eliminação intermitente das leptospiras pela urina ou ainda pela baixa eficiência destas espécies como reservatórios. Capturar canídeos silvestres de vida livre envolve muitas dificuldades de ordem prática, conforme observado no presente estudo. Ainda assim, novos trabalhos devem ser realizados com um número mais significativo de exemplares desta família a fim de complementar os resultados aqui apresentados, confirmando assim a alta positividade de canídeos silvestres em relação a outras espécies. Quanto aos furões e iraras, espécies incluídas na família Mustelidae, é possível extrapolar os mesmos aspectos discutidos sobre os canídeos, onde foi observada uma alta prevalência na SAM e ausência de positivos pela PCR-TR em um número reduzido de indivíduos amostrados. Na literatura os dados sobre leptospirose nestas espécies são praticamente inexistentes. Somente três animais apresentaram resultado positivo tanto pela SAM como pela PCR-TR, indicando uma baixa concordância entre os testes de diagnóstico. Outros estudos mostram resultados similares (Fornazari et al., 2012; Hamond et al., 2014), o que pode ser justificado pelos diferentes propósitos de cada técnica. Animais apresentando anticorpos anti-Leptospira spp. não necessariamente possuem o agente em seu organismo e, assim, o resultado da PCR-TR será negativo. Ainda, caso o animal seja soropositivo e portador renal, a eliminação de leptospiras pela urina é intermitente, 33 dificultando assim a probabilidade de detecção do DNA na amostra. Outro fator associado à baixa concordância dos testes de diagnóstico é o sorovar da leptospira responsável pela infecção. Caso este sorovar não tenha sido incluído na bateria de antígenos empregados SAM, o resultado será negativo. Apesar desta limitação, a SAM é considerada o diagnóstico sorológico de eleição para leptospirose (Levett, 2001; Adler e de la Peña Moctezuma, 2010; Picardeau, 2013) e, no presente trabalho, foi utilizada uma grande diversidade de sorovares – superior a muitos estudos publicados na literatura. Em relação à PCR-TR, esta técnica tem sido empregada com frequência para o diagnóstico de leptospirose, apresentando alta sensibilidade e especificidade (Ahmed et al., 2009; Wu et al., 2014). Embora a PCR-TR seja recomendada para a amplificação de produtos de até 150 pb, em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório foi constatada uma boa eficiência da PCR-TR para produtos de 331 pb, apresentando sensibilidade maior que a PCR convencional quando utilizados os mesmos primers e amostras (Fornazari et al., 2012). Doenças infecciosas já foram responsáveis por causar impacto em populações de animais selvagens em diversos países (Roelker-Parker et al., 1996; Prager et al., 2012; Denner e Young, 2013; Olson et al., 2013). No caso da leptospirose, ocorrem quadros clínicos muito variáveis em diversas espécies, inclusive no homem (Greene et al., 2006). A infecção assintomática é muito comum (Adler e de la Peña Moctezuma, 2010) e, conforme observado no presente estudo, é provável que o mesmo desfecho ocorra nas espécies analisadas. Outro importante fator responsável pela dificuldade em se observar sinais clínicos em animais de vida livre – independente do agente etiológico – é a seleção natural. Animais doentes tem dificuldade em obter alimento, escapar 34 de predadores e procurar abrigo. Como consequência, o quadro clínico rapidamente resulta em óbito, impossibilitando a amostragem do animal. Entre os animais estudados, um exemplar de lobo guará com título 800 na SAM apresentou intensa leucocitose. É possível, porém incerto, que esta alteração clínica tenha sido causada pela leptospirose, pois existem diversas causas de leucocitose que não foram investigadas. Pelos resultados obtidos, a leptospirose possui baixa morbidade nos animais silvestres da região de Botucatu. 35 CONCLUSÕES 36 CONCLUSÕES Os animais estudados apresentaram uma soroprevalência de 16,1% para diversos sorogrupos, havendo uma maior positividade para o sorogrupo Semaranga; A presença do DNA de leptospiras na urina indica a eliminação do agente no ambiente e, consequentemente, o papel dos animais silvestres como reservatórios; A infecção por Leptospira spp. apresentou baixa morbidade nos animais silvestres; Há uma grande diversidade de espécies infectadas por Leptospira spp. na região de Botucatu, SP; Existem diferenças significativas na prevalência de infecção entre espécies, havendo maior positividade em indivíduos das famílias Canidae e Mustelidae; Os gambás apresentaram alta prevalência de infecção por leptospiras saprófitas; Fatores ambientais estão envolvidos na maior prevalência da infecção em gambás provenientes da mata em relação aos localizados em áreas urbanas; 37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADLER, B.; De La PEÑA MOCTEZUMA, A. 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Serologic survey of infectious diseases in populations of maned wolf (Chrysocyon brachyurus) and crab-eating fox (Cerdocyon thous) from Águas Emendadas Ecological Station Park. J. Zoo Wild. Med., v.44, n.1, p.152-155, 2013. 43 ROELKE-PARKER, M.E.; MUNSON, L.; PACKER, C.; KOCK, R.; CLEAVELAND, S.; CARPENTER, M.; O'BRIEN, S.J.; POSPISCHIL, A.; HOFMANN-LEHMANN, R.; LUTZ, H.; MWAMENGELE, G.L.; MGASA, M.N.; MACHANGE, G.A.; SUMMERS, B.A.; APPEL, M.J. A canine distemper virus epidemic in Serengeti lions (Panthera leo). Nature, v.379, n.6564, p.441-445, 1996. SCIALFA, E.; BRIHUEGA, B.; VENZANO, A.; MORRIS, W.E.; BOLPE, J.; SCHETTINO, M. First isolation of Leptospira interrogans from Lycalopex griseus (South American gray fox) in Argentina shows new MLVA genotype. J Wildl Dis., v.49, n.1, p.168-172, 2013. SILVA, C.S.; GÍRIO, R.J.S.; GUERRA NETO, G.; BRICH, M.; SANTANA, L.A.S.; AMÂNCIO, F.H.; MARIANI, J.R.; WESSORT, P.M.F. Anticorpos antiLeptospira spp. em animais selvagens do zoológico municipal de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, Brasil. Braz. Journal of Vet. Res. Anim. Sci., v.47, n.3, p.237-242, 2010. SZONYI, B.; AGUDELO-FLÓREZ, P.; RAMÍREZ, M.; MORENO, N.; KO, A. An outbreak of severe leptospirosis in Capuchin (Cebus) monkeys. Vet. J., v.188, n.2, p.237-239, 2011. ULLMANN, L.S.; HOFFMANN, J.L.; De MORAES, W.; CUBAS, Z.S.; Dos SANTOS, L.C.; Da SILVA, R.C.; MOREIRA, N.; GUIMARÃES, A.M.; CAMOSSI, L.G.; LANGONI, H.; BIONDO, A.W. Serologic survey for Leptospira spp. in captive neotropical felids in Foz do Iguaçu, Paraná, Brazil. J. Zoo. Wildl. Med., v.43, n.2, p.223-228, 2012a. ULLMANN, L.S.; NETO, R.N.D.; TEIXEIRA, R.H.F.; NUNES, A.L.V.; SILVA, R.C.; RICHINI-PEREIRA, V.B.; LANGONI, H. Epidemiology of leptospirosis at Sorocaba Zoo, São Paulo state, Southeastern Brazil. Pesq. Vet. Bras., v.32, n.11, p.1174-1178, 2012b. 44 WU, Q.; PRAGER, K.C.; GOLDSTEIN, T.; ALT, D.P.; GALLOWAY, R.L.; ZUERNER, R.L.; LLOYD-SMITH, J.O.; SCHWACKE, L. Development of a realtime PCR for the detection of pathogenic Leptospira spp. in California sea lions. Dis. Aquat. Organ., v.11,0, n.3, p.165-172, 2014. 45 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O CURSO DE DOUTORADO (Fevereiro de 2012 a Novembro de 2014) DISCIPLINAS CURSADAS Clínica e cirurgia de animais silvestres (2 créditos). Período: 1º semestre de 2012. Conceito: A Modelos experimentais e animais de experimentação (4 créditos). Período: 1º semestre de 2012. Conceito: A Tópicos especiais – Atualização em raiva (2 créditos). Período: 2º semestre de 2012. Conceito: A Defesa sanitária animal no contexto de saúde pública (3 créditos). Período: 1º semestre de 2013. Conceito: A Manejo pré-abate e abate de bovinos (2 créditos). Período: 1º semestre de 2013. Conceito: A Zoonoses e saúde pública (6 créditos). Período: 2º semestre de 2013. Conceito: A Técnicas laboratoriais de estudo dos vírus (6 créditos). Período: 2º semestre de 2014. Conceito: A 46 PALESTRAS MINISTRADAS Título: O papel dos animais selvagens como reservatórios de zoonoses (VI Semana Acadêmica da Medicina Veterinária da UNIP – Bauru). Local: Universidade Paulista – UNIP, Bauru, SP. Data: 12 de setembro de 2013. Título: Captura de mamíferos silvestres em vida livre (Grupo de Estudos de Animais Selvagens – GEAS). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 2 de dezembro de 2013. Título: Estudos realizados com animais silvestres encaminhados ao CEMPAS – UNESP – Botucatu. Local: Vigilância Ambiental em Saúde, Secretaria da Saúde, Prefeitura de Botucatu. Data: 7 de novembro de 2013. Título: Raiva em animais silvestres (Grupo de Estudos de Zoonoses e Saúde Pública – GEZOSP). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 26 de novembro de 2013. Título: Animais silvestres como sentinelas para as zoonoses (curso de extensão universitária comemorativo aos 20 anos do programa de aprimoramento em zoonoses e saúde pública “Desafio no Enfrentamento das Zoonoses”). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 11 de outubro de 2014. 47 Título: Campos de atuação do médico veterinário (Grupo de estudos de Animais Selvagens – GEAS). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 19 de março de 2012. Título: Principais zoonoses em animais silvestres (III Curso de Identificação e Resgate de Animais Silvestres em Situação de Risco). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 2 de março de 2012. Título: Principais zoonoses em animais selvagens e seus impactos na saúde pública (Grupo de Estudos de Zoonoses e Saúde Pública – GEZOSP). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 28 de agosto de 2012. Título: Participação dos cães e animais silvestres na transmissão da leishmaniose visceral canina (mesa redonda “Leishmaniose Visceral CaninaTratar ou Não?”). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 27 de março de 2013. Título: Principais zoonoses em animais selvagens e seus impactos na saúde pública (Grupo de Estudos de Zoonoses e Saúde Pública – GEZOSP). Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 28 de agosto de 2012. 48 ARTIGOS PUBLICADOS Felipe Fornazari, Rodrigo Costa da Silva, Virgínia Bodelão Richini- Pereira, Hugo Enrique Orsini Beserra, Maria Cecília Rui Luvizotto, Helio Langoni. 2012. Comparison of conventional PCR, quantitative PCR, bacteriological culture and the Warthin Starry technique to detect Leptospira spp. in kidney and liver samples from naturally infected sheep from Brazil. Journal of Microbiological Methods 90, 321-26. Felipe Fornazari, Felipe de Freitas Guimarães, Carlos Roberto Teixeira, Helio Langoni. 2012. Isolation of Staphylococcus epidermidis from inflamed upper respiratory tract of an orange-spined hairy dwarf porcupine (Sphiggurus villosus). The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases 18, 455-458. Helio Langoni, Felipe Fornazari, Rodrigo Costa da Silva, Elis Talita Monti, Fausto Baptista Villa. 2013. Prevalence of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum in dogs. Brazilian Journal of Microbiology, 44, 1327-30. Jane Megid, Carlos Roberto Teixeira, Adriana Cortez, Marcos Bryan Heinemann, João Marcelo Azevedo de Paula Antunes, Felipe Fornazari, Fabricio Braga Rassy, Leonardo José Richtzenhain. 2013. Canine distemper virus infection in a lesser grison (Galictis cuja): first report and virus phylogeny. Pesquisa Veterinária Brasileira 33, 247-50. Felipe Fornazari, Helio Langoni. Principais zoonoses em mamíferos selvagens. 2014. Veterinária e Zootecnia 21, 10-24. 49 Lucilene Granuzzio Camossi, Felipe Fornazari, Virgínia Bodelão Richini- Pereira, Rodrigo Costa da Silva, Daniel Fontana Ferreira Cardia, Helio Langoni. 2014. Immunization of Wistar female rats with 255-Gy- irradiated Toxoplasma gondii: Preventing parasite load and maternofoetal transmission. Veterinary Parasitology 145, 157-63. Daniel Fontana Ferreira Cardia, Estevam Guilherme Lux Hoppe, José Hairton Tebaldi, Felipe Fornazari, Benedito Donizete Menozzi, Helio Langoni, Adjair Antônio Redescription do Nascimento, and Katia Denise taxonomical Saraiva Bresciani. considerations 2014. about Aonchotheca (Aonchotheca) pulchra n. comb. (Enoplida: Trichuridae), a nematode of Nyctinomops spp. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 23, 499-402. CONGRESSOS E CURSOS Evento: XV Congresso e XXI Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Local: hotel Praiatur, Florianópolis. Data: 30 de setembro a 5 de outubro. Evento: XVII Congresso e XXIII Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Local: Fundação Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo. Data: 4 a 10 de outubro de 2014. Evento: Workshop teórico-prático de “Sub-tipagem Molecular e Análise de Sequências Genômicas Aplicadas a Estudos de Microorganismos Patogênicos”. Local: Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Campinas. Data: 12 a 16 de maio de 2014. 50 Evento: Conferencia “XXIII RITA – Rabies in the Americas”. Local: hotel Maksoud Plaza, São Paulo. Data: 14 1 18 de outubro de 2012. TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS Felipe Fornazari, Pâmela Merlo Marson, Carlos Roberto Teixeira, Helio Langoni. Pesquisa de anticorpos contra Leptospira spp. em canídeos silvestres da região central do estado de São Paulo. Evento: XV Congresso e XXI Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Data: 30 de setembro a 5 de outubro de 2012. Laís Moraes Paiz, Felipe Fornazari, Benedito Donizete Menozzi, Carla Janeiro Coiro, Carlos Roberto Teixeira, Valdinei Moraes Campanucci, Gabriela Capriogli Oliveira, Helio Langoni. Anticorpos anti-Leishmania chagasi em mamíferos silvestres de vida livre da região de Botucatu, São Paulo. Evento: XVII Congresso e XXIII Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Data: 4 a 10 de outubro de 2014. Felipe Fornazari, Pâmela Merlo Marson, carlos Roberto Teixeira, Valdinei Moraes Campanucci da Silva, Diego Borin Nóbrega, Helio langoni. 2014. Pesquisa de novos reservatórios de Leptospira spp. na fauna silvestre da região de Botucatu, SP. Evento: XVII Congresso e XXIII Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Data: 4 a 10 de outubro de 2014. 51 TRABALHOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS Felipe Fornazari, Pâmela Merlo Marson, Carlos Roberto Teixeira, Helio Langoni. 2012. Pesquisa de anticorpos contra Leptospira spp. em canídeos silvestres da região central do estado de São Paulo. Anais do XV Congresso e XXI Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Marcella Zampoli Troncarelli, Lucilene Granuzzio Camossi, Felipe Fornazari, Virgínia Bodelão Richini-Pereira, Rodrigo Costa da Silva, Helio Langoni. 2013. Toxoplasma gondii: efficacy of an irradiated vaccine against experimental infection challenge in wistar female rats. Anais do XVI International Congress on Animal Hygiene. Janilda Barros Santiago, Lilian Silva Catenacci, Kristel Myriam de Vleeschouwer, Karina Rodrigues dos Santos, Leonardo de carvalho Oliveira, Felipe Fornazari, Adriana Castaldo Colosio, Paula dos Reis, Helio Langoni. 2012. Estudos clínico-sanitários de populações selvagens de mico-leãoda-cara-dourada (Leontopihtecus chrysomelas). Anais do XV Congresso e XXI Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Laís Moraes Paiz, Felipe Fornazari, Benedito Donizete Menozzi, Carla Janeiro Coiro, Carlos Roberto Teixeira, Valdinei Moraes Campanucci, Gabriela Capriogli Oliveira, Helio Langoni. 2014. Anticorpos anti-Leishmania chagasi em mamíferos silvestres de vida livre da região de Botucatu, São Paulo. Anais do XVII Congresso e XXIII Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. 52 Lucilene Granuzzio Camossi, Felipe Fornazari, Virgínia Bodelão Richini Pereira, Rodrigo Costa da Silva, Daniel Fontana Ferreira Cardia, Helio Langoni. 2014. Immunization Toxoplasma of gondii: transmission. Anais wistar female preventing do XVIII rats parasite Congresso with load 255-gy-irradiated and Brasileiro de maternofoetal Parasitologia Veterinária. Maria Regina Lucas Da Silva, Felipe Fornazari, Lucia Helena O'Dwyer. 2014. Piroplasma em Didelphis albiventris. Anais do XVIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária. Daniel Fontana Ferreira Cardia, José Hairton Tebaldi, Felipe Fornazari, Benedito Donizete Menozzi, Helio Langoni, Adjair Antônio Do Nascimento, Katia Denise Saraiva Bresciani, Estevam Guilherme Lux Hoppe. 2014. Pterygodermatites (Paucipectines) andyra n. sp., a new Intestinal nematode of Neotropical molossidae bats from Brazil. Anais do XVIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária. ESTÁGIOS DOCÊNCIA Disciplina: Zoonoses. Período: 2º semestre de 2013. Responsável: Prof. Dr. Helio Langoni. Créditos: 2 Disciplina: Epidemiologia e Saneamento. Período: 2º semestre de 2014. Responsável: Prof. Dr. José Carlos de Figueiredo Pantoja. Créditos: 2 53 PRÊMIOS Trabalho vencedor do 2º lugar do prêmio “Alcides Pissinatti”. Título: Anticorpos anti-Leishmania chagasi em mamíferos silvestres de vida livre da região de Botucatu, São Paulo. Evento: XVII Congresso e XXIII Encontro da Associação Brasileira de Veterinários de Animais Selvagens. Data: 4 a 10 de outubro de 2014. Local: Fundação Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo. CO-ORIENTAÇÃO Bolsista de iniciação científica Suellen Felix Lages da Silva. Trabalho: Papel dos animais selvagens na infecção leptospírica. Orientador: Prof. Dr. Helio Langoni. Processo FAPESP 2012/25126-4. ORGANIZAÇÃO DE CURSOS Curso de extensão universitária comemorativo aos 20 anos do programa de aprimoramento em zoonoses e saúde pública “Desafio no Enfrentamento das Zoonoses”. Local: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP. Data: 11 de outubro de 2014. 54