MADALENA, F. E. Verificação do parentesco em programas de

Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, 1999.
VERIFICAÇÃO DO PARENTESCO EM PROGRAMAS
DE MELHORAMENTO ANIMAL
F. E. Madalena
Departamento de Zootecnia
Escola de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567 – 30161-970 Belo Horizonte, MG
[email protected]
SUMÁRIO
1.
Introdução, 59
2.
Testes de parentesco, 60
3.
Tipagem de microssatélites, 62
4.
Lotes com vários reprodutores, 62
5.
Custos, 64
6.
Ganho genético, 64
7.
Benefícios econômicos, 65
8.
Testes por amostragem, 66
9.
Conclusões, 67
10. Referências bibliográficas, 67
1. INTRODUÇÃO
Segundo Ron et al. (1996), os erros na
paternidade de bovinos em diferentes
países tem variado de 4 a 23%
(Alemanha), 5 a 16% (Dinamarca), 8 a
16% (URSS), 1,3% (reino Unido), 8 a
20% (Irlanda) e 12% (Holanda). Taylor
(1997) situou os erros de paternidade nos
EUA em 5 a 10%. No Brasil, A. Rosa e F.
Meirelles
(comunicação
pessoal)
encontraram 15% de erro em amostra
aleatória de Nelore. As causas dos erros
de parentesco estão em erros de anotação,
inseminação com mais de um reprodutor,
touros ou vacas pulando cercas, troca de
bezerros etc., além de possíveis causas
intencionais.
Os métodos modernos de avaliação
genética, baseados no modelo animal
(p.ex. Henderson, 1984), fazem uso das
relações de parentesco entre os indivíduos
registrados na raça ou na população em
questão,
visando
aproveitar
as
informações do maior número possível de
parentes do indivíduo avaliado, lograndose dessa forma, estimar o valor genético
com muito maior acurácia que com os
métodos anteriores. As vantagens do
modelo
animal,
entretanto,
ficam
obviamente
comprometidas
se as
57
Madalena, Verificação de parentesco...
informações sobre os parentescos são
incorretas, levando a vieses na avaliação,
em caso de erros sistemáticos ou
deliberados, ou a perda de exatidão, em
caso de erros aleatórios.
Como a avaliação genética é a base de
qualquer programa de seleção, os erros
nas genealogias podem comprometer a
eficiência do programa e afetar a sua
credibilidade e valor comercial. Para
evitar ou diminuir esse problema, em
vários países vem se realizando ou
estudando a realização de testes rotineiros
de parentesco utilizando marcadores
moleculares do DNA.
Visando obter subsídios a respeito,
colocamos recentemente, no Animal
Genetics Discussion Group, na Internet,
pergunta sobre os testes em andamento
em diferentes países e sua viabilidade
econômica, com cujas respostas e outras
informações elaboramos este artigo, cujo
objetivo é apenas o de levantar o assunto
para
discussão,
face
aos
desenvolvimentos recentes, e salientar os
pontos de pesquisa necessários no Brasil,
mais do que pretender uma revisão
exaustiva do tema ou entrar em detalhes
das técnicas de laboratório utilizadas.
2. TESTES DE PARENTESCO
Os testes de parentesco não provam a
paternidade ou maternidade, senão que
apenas a excluem, no caso em que o
indivíduo não possua nenhum dos alelos
presentes no progenitor indagado, como
pode ser visto no exemplo da Tab. 1.
Tabela 1. Exemplo mostrando os genótipos de dois possíveis pais e de possível mãe de dois
indivíduos, para um loco com 4 alelos (x indica presença do alelo correspondente)
Alelo Reprodutor 1 Reprodutor 2 Reprodutriz Indivíduo 1 Indivíduo 2
A1
x
x
A2
x
x
x
x
x
x
A3
x
A4
Fonte: (Vankan & Burns, 1997).
Neste exemplo, independentemente do
genótipo materno, o indivíduo 2 não
poderia ser filho do reprodutor 2, já que
não possui nenhum dos marcadores desse
reprodutor, o qual, portanto, seria
excluído como seu pai. Já o indivíduo 1,
poderia ser filho de qualquer um dos dois
reprodutores, caso não se conhecesse o
genótipo da mãe. Entretanto, se o
58
genótipo da mãe fosse conhecido, o
reprodutor 2 seria claramente excluído
como pai. Ao se fazer os testes para
vários locos diferentes, aumenta-se o
número de combinações genéticas
diferentes e, portanto, a probabilidade de
exclusão dos parentescos errados.
Assim, a confiabilidade do teste de
Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, 1999.
parentesco
mede-se
pela
sua
probabilidade de exclusão (PE) do
parentesco errado. Num teste de
paternidade para reprodutor acasalado ao
acaso, a PE de um único sistema
polimórfico é
PE = 1 – ( 1–pi–pj )2,
onde pi e pj são as freqüências dos alelos i
e j na população. Para um teste
combinando n locos, a probabilidade de
exclusão combinada (PEC) aumenta para
PEC = 1 – Πn (1-PEk)
onde PEk se refere ao késimo loco testado
(Ron et al., 1996).
Os
testes
de
parentesco
foram
originalmente desenvolvidos com base
nos grupos sangüíneos e polimorfismos
bioquímicos. O PEC desses sistemas é
similar ao PEC com os polimorfismos do
DNA utilizados atualmente, como se
discute abaixo, mas, como existe em todo
o mundo um intenso esforço de pesquisa
de DNA, é de se esperar um aumento do
número de marcadores moleculares
disponíveis para os testes. Por outra parte,
a
caracterização
dos
marcadores
moleculares não implica em relações de
dominância, sendo possível detectar os
heterozigotos e, também, pode-se esperar
redução no custo futuro dos testes com
DNA que, por estes motivos tendem a
prevalecer,
principalmente
naquelas
espécies em que não existiam testes de
grupos sangüíneos em grande escala.
A técnica geralmente aceita para testes de
parentesco baseados no DNA utiliza a
amplificação de microssatélites através da
reação em cadeia da polimerase (PCR)
(Ron et al, 1996). Os microssatélites são
elementos
repetitivos
de
poucos
tetranucleotídios que apresentam alto grau
de polimorfismo. Eles podem ser
multiplexados, isto é, amplificados
simultaneamente, com procedimentos
cada vez mais automatizados, e com
tendência à redução dos custos.
Bernoco et al. (1997) discutiram as
vantagens e inconvenientes dos testes
baseados em grupos sangüíneos e em
polimorfismos do DNA. Trabalhando
com uma grande amostra de 4800 Quarter
Horse, Bowling et al. (1997) verificaram
que a probabilidade de exclusão,
testando-se para 15 locos de grupos
sangüíneos, foi de 97,3%, similar à PE
obtida testando-se 11 locos de
microssatélites
(98,2%).
Validaram,
assim, a tipagem de DNA que, segundo
estes autores, tem a vantagem de poder
facilmente atingir ainda maior eficiência,
acrescentando-se novos locos nos casos
duvidosos. Eles mostraram também que
as falsas exclusões, devidas a raros casos
de mutação ou erros de duplicação
durante a tipagem do DNA, podiam ser
evitadas baseando a exclusão em pelo
menos dois locos. A freqüência de
mutação dos microssatélites tem sido
estimada em 10-3 por loco por gameta por
geração, e a freqüência de erros de
duplicação em 10-4 (Ron et al., 1996), de
forma que a exclusão do parentesco com
base em dois microssatélites é
extremamente confiável.
Vankam & Burns (1997) comunicaram
que com uma bateria de 11 locos de
microssatélites, tipando pais, mães e
filhos, em 12 raças de bovinos,
59
Madalena, Verificação de parentesco...
detectaram-se entre 98,5% (Polled
Hereford) e 99,9% (Brahman) dos
parentescos errados. Quando apenas pai e
filho eram tipados, a eficiência caía para
88 a 99%, dependendo da raça.
irmãos, acasalados ao acaso com 92
ovelhas,
Parsons
et
al.
(1997)
identificaram os pais de 85% das
progênies e as mães de 40%, através da
tipagem de todos os animais para 12 locos
de microssatélites.
Num rebanho de seis carneiros meio3. TIPAGEM DE MICROSSATÉLITES
Para escolher quais microssatélites incluir
no teste, são necessários estudos para
caracterizar a variação existente na
população de interesse. Por exemplo, Ron
et al. (1996) descreveram os resultados da
tipagem de 10 locos de microssatélites na
raça Holstein Israelense (Tab. 2).
Tabela 2. Freqüências dos alelos em cada um de 10 locos de microssatélites no gado
Holstein Israelense.
Microssat Cromoss
Alelo1
N
élite
omo
1
2
3
4
5
6
D2S9
2
76
0,30 0,20 0,19 0,12 0,06 0,04
D2S18
2
75
0,38 0,20 0,18 0,09 0,09 0,03
D5S1
5
53
0,30 0,28 0,19 0,13 0,06 0,02
D7S13
7
41
0,45 0,24 0,15 0,10 0,02 0,02
D9S1
9
81
0,36 0,20 0,15 0,15 0,08 0,05
BRN
10
50
0,44 0,22 0,08 0,08 0,06 0,04
HBB
15
58
0,27 0,17 0,16 0,12 0,11 0,09
D18S7
18
30
0,47 0,20 0,17 0,13 0,03
D21S4
21
67
0,41 0,15 0,12 0,09 0,08 0,05
D21S10
21
50
0,58 0,16 0,14 0,12
CYP21
23
43
0,41 0,14 0,09 0,07 0,07 0,07
D25S13
25
45
0,38 0,36 0,18 0,04 0,02 0,02
N = Número de cromossomos.
1
Alelos em cada loco numerados da maior para a menor freqüência.
Fonte: Ron et al. (1996).
No estudo de Parsons et al. (1997), com
Merino Australiano, 12 locos de
microssatélites tiveram um conteúdo de
informação polimórfica (PIC) variando de
0,49 a 0,87, considerado adequado para
os testes de parentesco. Estes autores
comunicaram a existência de um 13o
microssatélite (BM415) com uma
significativa redução na freqüência dos
60
7
0,04
0,03
0,02
0,02
0,01
0,04
0,08
8
0,01
9
10
0,02
0,02
0,05
0,03
0,01
0,01
0,05
0,04
0,02
0,02
11
0,02
heterozigotos que atribuíram à não
amplificação de um alelo, de forma que o
microssatélite não pôde ser utilizado para
os testes de parentesco, salientando os
autores, em conseqüência, a importância
de se checar possíveis desvios das
freqüências observadas com respeito às
esperadas no equilíbrio de HardyWeimberg.
Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, 1999.
4. LOTES COM VÁRIOS REPRODUTORES
Os
testes
de
parentesco
são
particularmente úteis no caso de monta
natural não controlada e lotes com vários
reprodutores, uma prática comum em
gado de corte e outros ruminantes, usada
para facilitar o manejo reprodutivo em
lugar da inseminação artificial ou da
monta controlada.
A probabilidade de exclusão diminui com
o número de reprodutores no lote, como
pode ser visto na Tab. 3, que mostra a
PEC esperada com 11 microssatélites, em
Bos indicus, na Austrália.
Vankan & Burns (1997) sugeriram que os
grupos de reprodutores em cada lote
fossem constituídos considerando os seus
genótipos, de forma a incluir, na medida
do possível, reprodutores que pudessem
ser discriminados. Eles apresentaram
resultados práticos confirmando as
probabilidades teóricas em 16 rebanhos
Santa Gertrudes e Brahman, com lotes
variando de 5 a 34 touros (Tab. 4). Como
mostrado na tabela, a PEC, se necessário,
podia ser aumentada acrescentando-se
marcadores tipados.
Tabela 3. Probabilidades teóricas de
exclusão de paternidade errada em lotes
de vacas acasaladas com vários touros
não aparentados (sendo tipados somente
pais e filhos, mas não as mães).
No de touros no lote
Probabilidade de exclusão
(%)
1
99
5
95
10
90
15
86
20
82
Fonte: De Vankan & Burns (1997)
Tabela 4. Resultados de testes de paternidade em grupos com múltiplos reprodutores na
Austrália, testando-se somente os pais e os bezerros.
Rebanho
Raça
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
SG
SG
SG
SG
SG
SG
SG
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Bezerro
N
156
71
144
408
67
62
100
235
103
213
163
175
91
255
244
288
Touro no lote
N
10
12
28
26
6
5
7
22
10
11
19
14
6
12
34
28
Paternidade resolvida
Com 11 marcadores
Com 1 ou 2 marcadores extras
%
%
91,0
100,0
85,4
89,2
83,6
98,5
96,8
100,0
96,0
88,1
98,3
91,3
100,0
92,5
92,0
99,4
93,1
97,1
100,0
85,5
99,2
77,5
97,1
74,7
95,5
61
Madalena, Verificação de parentesco...
SG = Santa Gertrudes, B = Brahman
Fonte: De Vankan & Burns (1997)
Entretanto, Vankan & Burns (1997)
encontraram na maioria dos rebanhos
casos de bezerros cujos genótipos não
correspondiam a nenhum dos touros do
lote de acasalamento, o que atribuíram a
algumas vacas já estarem prenhes de
outros touros ou a touros ou vacas
pulando cercas. Por exemplo, no rebanho
15, de 244 vacas acasaladas com um
grupo de 16 touros, houve 5,4% de
bezerros que não podiam ser filhos de
nenhum dos 16. Porém, quando os outros
18 touros existentes na propriedade foram
tipados, todos os bezerros puderam ser
alocados a um pai.
5. CUSTOS
Segundo Taylor (1997), o método de
melhor custo/benefício para tipagem de
DNA é o de sistemas multiplexados de
microssatélites. Ron et al. (1996)
indicaram o custo de US$5 de cada
tipagem por microssatélite, em Israel.
Barnett et al. (1997) indicaram o custo de
US$16 por ovino na Austrália. Long
(1997) comunicou que a organização Bell
Ranch realiza anualmente genotipagem
dos touros e novilhas de reposição em seu
programa de compostos, objetivando
identificar parentesco no rebanho em
sistema de múltiplos touros, com custo de
US$25 por animal (que aumenta nos
casos duvidosos em que deve ser usado
maior número de marcadores). Trus
(1997) indicou que, no Canadá, os testes
em cavalos custam US$39 por animal e
em outras espécies, US$21 ou mais.
Um dos componentes importantes do
custo dos testes é a tomada de amostras
de material para extrair o DNA. O
CSIRO, da Austrália, que desenvolve
estudos para baratear esses testes,
verificou que as amostras de sangue de
ovinos colhidas em papel de filtro eram
tão eficientes para a extração e
amplificação do DNA quanto as amostras
colhidas em vacutainers ou de tecidos,
sendo que as primeiras podiam ser
facilmente enviadas ao laboratório (até
pelo correio) e estocadas sem refrigeração
por alguns meses (Demeny et al., 1997).
Além do sangue, podem ser usados outros
materiais biológicos, como sêmen e
folículos pilosos.
6. GANHO GENÉTICO
Van Vleck (1970a) indicou que a
covariância mãe-filha é reduzida numa
proporção p, no caso de freqüência de
erros de parentesco = p, enquanto que a
herdabilidade (h2) é reduzida em
[n(1–p)2 +p–1]/(n–1),
onde n é o número de filhas por
62
reprodutor. A acurácia do teste de
progênie (Van Vleck, 1970b).também é
reduzida para
r2 = [(1-p)2 n h2]/{4+(1-p)[(1-p)n-1]h2}
Gelderman et al. (1986) mostraram que
além da redução na acurácia do valor
genético estimado dos touros, perda de
ganho genético decorre também da
Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, 1999.
diminuição do diferencial de seleção,
resultante da seleção de reprodutores
errados. Eles apresentaram expressões
para o cálculo da perda de ganho genético
na seleção de touros por teste de progênie,
a qual aumentava com maior taxa de erro
de paternidade (p) e menor herdabilidade
da característica selecionada (Tab. 5).
Tabela 5. Redução percentual no diferencial de seleção genético dos touros, devido a erros
de paternidade, em programa de teste de progênie de 300 touros avaliados com 80 filhas
cada um.
Freqüência dos erros de paternidade
Herdabilidade
5%
15%
25%
%
0,50
0,30
0,20
2
4
5
9
13
18
17
24
30
Fonte: Gelderman et al. (1986)
Num teste de progênie, os erros de
parentesco tem o efeito de nivelar os
reprodutores, já que o valor genético dos
melhores diminui e o valor genético dos
piores aumenta. Numa verificação do
parentesco das progênies de 15 touros na
Alemanha, Gelderman et al. (1986)
encontraram que a média de produção de
leite de 1062 filhas com paternidade não
excluída foi 5099kg, enquanto que 159
filhas excluídas tinham média de 4933kg
(P<0,05).
7. BENEFÍCIOS ECONÔMICOS
Os benefícios da melhor identificação dos
progenitores decorrem principalmente do
maior ganho genético logrado. Assim,
uma forma de se quantificar esses
benefícios é estimar o valor econômico
das perdas no ganho genético devido aos
erros de parentesco, que pode então ser
comparado com o custo adicional.
Ron et al. (1996) estimaram o valor
presente líquido do investimento em teste
de paternidade das filhas usadas para
testar os touros jovens, para a situação de
Israel, com 100 mil vacas na população e
50 touros testados anualmente, com 100
filhas cada. Com base nos resultados de
Gelderman et al. (1986), eles estimaram o
ganho genético adicional, decorrente da
verificação da paternidade, em 5 kg/ano,
com lucro de US$ 0,10/kg. Mesmo tendo
aquele país uma taxa de erro de
paternidade bastante baixa (5%), o lucro
cumulativo descontado num horizonte de
20 anos seria de US$ 2,4 milhões de
dólares. O custo da tipagem foi estimado
em US$ 75 mil por ano, num programa de
teste de três microssatélites por filha, com
custo de US$ 15. A probabilidade de
exclusão combinada (PEC) foi de 0,85,
indicando que 15% dos erros ficariam não
63
Madalena, Verificação de parentesco...
detectados (ou 0,75% do total de filhas).
Entretanto, as vantagens da tipagem
seriam ainda maiores no caso da seleção
com modelo animal e não apenas com o
teste de progênie. Por outra parte, os
autores indicam que a PEC poderia
aumentar para mais de 90%, escolhendose os locos especificamente para cada
reprodutor. Assim, os autores concluem
que a tipagem está economicamente
justificada, estando Israel em vias de
implementá-la no seu programa nacional
de melhoramento de gado de leite (I.R.
Weller, comunicação pessoal).
Na Austrália, onde o CSIRO está
estudando maneiras de reduzir o custo
para a implementação da tipagem
rotineira de DNA (O. Mayo, comunicação
pessoal), Barnett et al.(1997) estudaram o
benefício econômico da tipagem com uma
abordagem diferente da de Ron et al.
(1996), descrita acima. Eles consideraram
o preço maior que os criadores de Merino
receberiam pelos carneiros que tivessem
genealogia com DNA, 5% a mais para os
carneiros vendidos por até A$ 1000, e
10% a mais para os carneiros com preço
acima desse valor. O programa proposto
incluía tipagem inicial de todos os
carneiros e ovelhas do rebanho e tipagem
a cada ano de todos os carneiros (mas não
das fêmeas) incorporados posteriormente.
Consideraram ainda diferentes eficiências
de seleção, levando em conta a ênfase que
o criador dava à seleção visual vs. um
índice de peso do velo e menor diâmetro
da fibra, variando essa eficiência de 40 a
100%. Estimaram então, sob certas
suposições, o ponto de equilíbrio
econômico para a verificação de
parentesco, a partir do seu valor presente
líquido, num horizonte de 10 anos. Esse
ponto de equilíbrio era maior com preços
de venda mais altos e com maior ênfase
na seleção objetiva. Assim, por exemplo,
os criadores que vendessem seus
carneiros por A$1000 poderiam pagar até
A$15,36 pela tipagem de cada animal,
enquanto os que vendesse por A$750 não
poderiam pagar mais de A$ 10,45. Com
custos de tipagem de A$20 por animal,
somente os que vendessem por preços
acima de A$1250 teriam lucro, e com
custo de A$25 (o custo atual), somente
com preços acima de A$1500. Assim, os
autores concluem que à medida que os
custos da tipagem venham a ser menores
no futuro próximo, aquele país assistirá a
enormes
mudanças
nos
registros
genealógicos no rebanho Merino.
8. TESTES POR AMOSTRAGEM
Do ponto de vista de uma raça como um
todo, a tipagem rotineira de amostras dos
animais registrados, ao causar diminuição
na freqüência de erros de genealogia,
acarreta benefício econômico decorrente
da maior confiabilidade geral na
genealogia na raça,. Por exemplo,
Bernoco et al. (1997) comunicaram que a
freqüência de exclusão de paternidade de
64
garanhões nos EUA, que era de 9 a 10%,
caiu para 1 a 2 % após a implantação de
testes rotineiros de parentesco naquele
país. Gelderman et al. (1986) também
comunicaram que, na Alemanha, os
criadores de gado não sujeitos a
verificação de parentesco incorriam em
maior freqüência de exclusão de
paternidade que os sujeitos a esses testes.
Cad. Téc. Esc. Vet. UFMG, n.27, p.57-66, 1999.
No Canadá, muitas associações de
criadores
aplicam
verificação
do
parentesco junto com o registro. Ha
bastante variação no tamanho da amostra
dessa verificação, indo de 1 a cada 25 a 1
a cada 1000 animais. Geralmente, a
associação requer tipagem ao acaso dos
animais quando chega a solicitação do
registro, e só nesse momento o criador
sabe que seu animal será verificado. Claro
que existe também o direito da associação
de requerer verificação específica em caso
de animais contestados ou duvidosos
(Trus, 1997).
9. CONCLUSÕES
A tipagem de DNA apresenta-se como
uma técnica de grande potencial para
verificação de parentesco nos animais
domésticos,
podendo
justificar-se
economicamente a implantação de testes
rotineiros
de
verificação,
independentemente
dos
necessários
esforços de conscientização para reduzir
os erros de parentesco.
A verificação do parentesco por
amostragem rotineira reduz os erros nos
animais registrados.
Nos programas de melhoramento é
aconselhável a verificação do parentesco
de todos os animais cujos dados são
utilizados nas avaliações genéticas.
No Brasil são necessários estudos sobre a
freqüência e as causas dos erros de
parentesco, assim como sobre a
freqüência dos alelos de microssatélites
nas raças locais.
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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V.A.M. et al. At what price is DNA pedigreeing
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