INSTRUÇÕES DE USO Inmunofluor CHAGAS Kit reagente

Transcrição

INSTRUÇÕES DE USO
Inmunofluor CHAGAS
Kit reagente de imunofluorescência indireta para a determinação de anticorpos antiTrypanosoma cruzi em soro humano e líquidos biológicos.
30 – 60 – 90 determinações
USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
Fundamentos do método
A técnica de anticorpos fluorescentes fundamenta-se na capacidade dos anticorpos de
unir-se a determinados corantes fluorescentes sem alterar suas propriedades
imunológicas. Isto permitiu desenvolver métodos de testes com grande aplicação no
diagnóstico sorológico de diversas doenças. O teste de anticorpos fluorescentes
Inmunofluor CHAGAS utiliza o método indireto, descrito por Weller e Coons em 1954.
O procedimento é formado por duas reações. Na primeira etapa, o soro do paciente é
colocado em contato com o substrato antigênico. Se os anticorpos estiverem presentes
no soro, estes se ligam ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Se o
soro testado não contém anticorpos dirigidos contra este antígeno em particular, não se
formará o complexo antígeno-anticorpo e todos os componentes do soro serão
eliminados na etapa de lavagem. Na segunda etapa adiciona-se uma anti-gamaglobulina
humana marcada com isotiocianato de fluoresceína. Na segunda etapa, se o complexo
antígeno-anticorpo formou-se na primeira etapa, a anti-gamaglobulina marcada
fluoresceína adere-se ao mesmo. Poderá ser observada uma reação positiva, com
fluorescência verde maçã brilhante, através de um microscópio de fluorescência.
Resumo e explicação do teste
As infecções com Trypanosoma cruzi são comuns no Hemisfério Ocidental, com ampla
distribuição geográfica nas zonas rurais do México e das Américas Central e do Sul: em
algumas zonas apresenta uma endemicidade elevada.
Podem ser diferenciadas três formas da doença de Chagas: doenças agudas, crônicas e
doença de Chagas congênita. A doença aguda ocorre em porcentagem mínima de
infectados, cerca de 5%, considerando que 95% não apresentam manifestações clínicas
ao infectar-se. O quadro agudo aparente caracteriza-se por febre variável, mal-estar
geral, linfadenopatia e hepatoesplenomegalia. Pode ocorrer uma reação inflamatória no
local da infecção (chagoma), e a mesma persistir por até 8 semanas. O edema unilateral
das pálpebras (sinal de Romã) ocorre em uma porcentagem significativa de casos
agudos. As manifestações que podem ser uma ameaça à vida do indivíduo podendo
causar sua morte, são a miocardite aguda e a meningoencefalite.
Dez a vinte anos após a infecção, cerca de 30% dos infectados, tenham ou não tido um
quadro agudo, apresentam sequelas crônicas da doença, sendo as mais frequentes as
lesões do miocárdio com dilatação cardíaca e arritmia, e alterações digestivas com
megaesôfago e megacólon. A infecção congênita pode ser a causa de abortos, de
natimortos, de prematuros polisintomáticos com hepatoesplenomegalia, manifestações
neurológicas etc, com alta mortalidade ou recém-nascidos normais apresentando alguns
sintomas.
INTERLAB DISTRIBUIDORA DE PRODUTOS CIENTÍFICOS S/A.
Praça Isaac Oliver, 342 - São Paulo - SP - Brasil
Depto. Científico: Fone: (11) 5564-9527 - Fax: (11) 5564-9520
e-mail: [email protected]
O diagnóstico na fase aguda é estabelecido pela presença parasitas no sangue por
exame direto, por cultivo, por inoculação intracerebral de camundongos lactantes ou
através de xenodiagnóstico. A parasitemia é mais intensa durante os episódios febris no
princípio da infecção.
Em geral, na fase crônica, não se observa a presença de parasitas na circulação
sanguínea e o imunodiagnóstico pode ser uma ferramenta muito importante para a
confirmação da doença. O imunodiagnóstico fundamenta-se no mínimo em resultados de
reações in vitro, como mínimo, realizadas simultaneamente. Recomenda-se que uma de
destas reações seja por imunofluorescência indireta (IFI).
A prova por imunofluorescência indireta
extremamente sensível e específica.
para o diagnóstico da doença de Chagas é
A sensibilidade do teste na fase aguda é de aproximadamente 70-90% (72% na
primeira semana, 90% após um mês) e 100% na fase crônica, tanto na doença
sintomática como na assintomática. Foram observadas algumas reações cruzadas com
Leishmaniose e malária.
O kit reagente Inmunofluor CHAGAS contém todos os reagentes necessários para a
detecção precoce da infecção por Trypanosoma cruzi, pela técnica de imunofluorescência
indireta.
Procedimento
1. Reconstituir o tampão salino fosfato (PBS) por diluição em 1 litro de água destilada.
Conservar o tampão reconstituído entre 2-8° C.
2. Preparar as diluições dos soros no PBS - diluição de screening: 1/30; diluições
seriadas à metade para uma determinação semi-quantitativa.
3. Retirar o material necessário para trabalhar e deixar 15 minutos à temperatura
ambiente.
4. Cobrir generosamente as áreas reagentes com as amostras e os controles diluídos.
5. Incubar na câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente.
6. Lavar com PBS, em duas etapas de lavagem com
uma.
duração de cinco minutos cada
Colocar as lâminas na jarra de Coplin contendo PBS, agitando suavemente durante as
etapas de lavagem.
7. Diluir a anti-gamaglobulina total humana marcada com isotiocianato de fluoresceína
no PBS, de acordo o título indicado no frasco (Por exemplo, Título: 1/100 - Colocar
0,01 ml de anti-gamaglobulina em 1 ml de PBS).
Título:
8. Secar cuidadosamente as bordas laterais externas da lâmina com papel absorvente,
mantendo úmidas as áreas reagentes.
9. Cobrir cada área reagente com a diluição de anti-gamaglobulina e incubar no câmara
úmida 30 minutos à temperatura ambiente.
10. Repetir os passos 6 e 8.
11. Cobrir as áreas reagentes com Azul de Evans durante quatro minutos.
12. Lavar o excesso de corante com PBS, adicionar o meio de montagem sobre as
lâminas e cobrir cuidadosamente com a lamínula a área reagente sem exercer uma
pressão excessiva.
NOTA: Para obter bons resultados, recomenda-se ler imediatamente no microscópio de
fluorescência. Se as lâminas forem conservadas, selar suas bordas para prevenir a
secagem do meio de montagem e estocar entre 2-8º C ao abrigo da luz.
Instruções de armazenagem
Os kits reagentes são estáveis até data de validade marcada na embalagem, não
podendo ser utilizados após a mesma.
Conservar o kit reagente entre 2-8ºC.
Componentes do kit reagente
1. Lâminas com 6 áreas reagentes cada uma, sendo 2 áreas para controles e 4 áreas
para amostras. Cada área reagente contém suspensão do antígeno Trypanosoma cruzi.
•
15 lâminas - Para 90 determinações
•
•
2.Anti-gamaglobulina total huma na marcada com isotiocianato de fluoresceína. Diluir de
acordo com o título.
•
1 frasco x 0,20 ml - Para 90 determinações
•
•
3. Tampão salina fosfato(PBS), pH 7,2 ± 0,2. Frasco para reconstituir com
água destilada.
•
4 frascos para 90 determinações
•
•
1 litro de
4. Soro humano controle positivo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso.
5. Soro humano controle negativo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso.
6. Meio de montagem (glicerina tamponada com tampão fosfato pH 7.2) - 1 frasco x 5
ml. Pronto para uso.
7. Azul de Evans - 1 frasco x 5 ml. Pronto para uso.
8. Lamínulas
•
15 - Para 90 determinações
•
•
Estabilidade dos reagentes reconstituídos
O tampão fosfato salino reconstituído é estável até 15 dias, se conservado entre 2-8°C.
Para períodos mais prolongados de armazenamento, adicionar 0,1% de azida sódic a,
para evitar contaminações.
Material necessário, mas não fornecido
1. Água destilada ou deionizada para preparo do PBS.
2. Tubos para hemólise (ou semelhantes) e estantes para tubos.
3. Pipetas para preparar as diluições.
4. Câmara úmida.
5. Proveta de 1 litro.
6. Jarras de Coplin ou semelhantes.
7. Timer de 0 a 60 minutos.
8. Microscópio de Fluorescência equipado adequadamente.
9. Esmalte para unhas para selar as lâminas.
Coleta das amostras
1. O desempenho ótimo do teste IFI do kit reagente Inmunofluor CHAGAS depende
do uso de amostras de soro frescas. Deve ser evitado o uso de soros hemolisados,
lipêmicos ou contaminados.
2. Se o soro for testado em até 3 dias após a coleta, estocar entre 2-8º C.
3. Para períodos de armazenamento mais prolongados, congelar a -20°C. Evitar ciclos
de congelamento-descongelamento repetidos das amostras, considerando que isto pode
induzir a uma deterioração dos anticorpos.
4. Ocasionalmente, as amostras podem conter enzimas proteolíticas, as quais digerem o
substrato. Em geral, isto ocorre com amostras contaminadas com microrganismos. A
inativação por calor a 56°C durante 30 minutos, reduz a atividade enzimática.
Interpretação dos resultados
Critérios de leitura
Critério de positividade: No caso de soros positivos, os Trypanosomas cruzi são
observados com uma coloração típica fluorescente verde maçã. A fluorescência é
particularmente intensa na membrana e no flagelo do parasita.
Critério de negatividade:
a) Ausência total de fluorescência.
b) Parasitas corados difusamente sem fluorescência de membrana.
c) Parasitas apresentando fluorescência
citoplasmáticas em forma não homogênea.
no
citoplasma
e
nas
estruturas
intra-
d) Predomínio da coloração (fundo e antígeno róseos).
Gradientes de intensidade de fluorescência
A intensidade de fluorescência pode ser semi-quantificada de acordo a seguinte norma,
estabelecida pelo CDC - "Centro de Controle de Doenças” de Atlanta, Georgia.
4 (+)
Fluorescência máxima: verde maçã brilhante.
3 (+)
Fluorescência verde maçã brilhante luminosa.
2 (+)
Fluorescência verde maçã definida clara.
1 (+)
Fluorescência verde maçã opaca porém diferenciável.
0
Não fluorescente ou sem fluorescência visível.
Titulação
Se for realizada um teste semi-quantitativa, o resultado informado deverá ser o da
última diluição na qual se detecta uma fluorescência verde maçã com uma intensidade 1
(+).
Controle de qualidade
Devem ser incluídos controles positivos e negativo em cada teste. Para que o teste seja
validado, deve comprovar-se que os resultados para os controles estão corretos.
Características do sistema
Sensibilidade e Especificidade
A imunofluorescência
indireta é o método que permite o diagnóstico imunológico
precoce da doença de Chagas, com uma positividade inicial de 72%, que aumenta
progressivamente até 100% no quarto mês. A sensibilidade desta técnica na etapa
crônica da doença (sintomática ou assintomática) é de 100%.
Foi observada uma reatividade cruzada, em uma freqüência muito baixa com
leishmaniose.
a
Potência
A potência das preparações locais de anti-gamaglobulina total marcada com
isotiocianato de fluoresceína foi medida em relação ao Padrão Internacional "Fluorescein
lsothiocyanate
(FITC)
Labelled
Sheep
Anti-Human
Immunoglobulin
for
the
Demonstration of Antibodies in Human Serum” /CLB, Amsterdam /WHO INTERNATIONAL
STANDARD. Atividade das anti-gamaglobulinas totais FITC locais, em comparação com o
padrão internacional: 4000-8000 IU/ml.
Através da padronização com o padrão internacional, assegura-se a uniformidade do
teste, estabelecendo padrões de trabalho internos positivos e negativos, úteis em
controle de qualidade da metodologia.
Estabilidade
Se a temperatura de estocagem for constante, os reagentes contidos no kit reagente
são estáveis até a data de validade impressa nos rótulos internos e externos, não
podendo ser utilizados após esta data.
Precauções
1. Os componentes de soro humano utilizados na preparação dos controles deste kit
reagente apresentaram resultados não reagentes para a presença de antígeno de
superfície de Hepatite B (HBsAg), anticorpos anti-vírus da imunodeficiência humana
1 (HIV-1) e Hepatite C.
Considerando-se que nenhum teste diagnóstico pode oferecer uma segurança
absoluta a respeito da ausência dos vírus HIV e Hepatite B ou outros agentes
infecciosos, as amostras e os reagentes fabricados com materiais de origem humana
devem ser tratados como potencialmente infectantes.
2. Não usar os reagentes contidos no kit reagente após a data de validade impressa na
embalagem.
3. Todas as incubações devem ser realizadas em câmara úmida.
4. Devem ser mantidas úmidas as áreas reagentes durante toda a técnica (evitar
qualquer técnica de secagem artificial como: secagem ao ar
com estufa e/ou
secadores). Após as etapas de lavagem, recomenda-se remover o excesso de
umidade com papel absorvente; secar apenas nas bordas laterais externas das
lâminas, sem secar entre áreas. Cobrir imediatamente, generosamente com a
diluição conveniente de anti-gamaglobulina e/ou com o meio de montagem, de
acordo com a etapa correspondente
5. Alguns dos componentes deste kit reagente contém azida sódica como conservante.
Há relatos que a azida sódica pode reagir com o chumbo o cobre das tubulações de
água formando compostos explosivos. Ao se descartar os reagentes, deixar fluir
água em abundância para evitar a formação destas azidas metálicas explosivas.
6. Nunca pipetar com a boca ou permitir que amostras de pacientes entrem em contacto
com a pele.
7. Todos os materiais usados neste teste, incluindo-se os reagentes, amostras e
materiais para limpeza devem ser descartados de maneira que se inativem os
agentes infecciosos. Recomenda-se utilizar na descontaminação, hipoclorito de sódio
a 1%, durante um período de tempo igual ou acima de 30 minutos.
8. Somente para uso diagnóstico in vitro.
Limitações do procedimento
1. O usuário do kit reagente deve realizar uma cuidadosa leitura e compreensão destas
instruções de uso. O cumprimento exato do protocolo é indispensável para se obter
resultados confiáveis.
2. Os valores obtidos com este teste devem ser avaliados pelo médico, considerando o
histórico clínico do paciente, os sintomas físicos e clínicos e outros procedimentos
diagnósticos.
3. O excesso de lipídeos em soro a testar produz uma reação "filming" (película que
recobre a reação específica). Um técnico experiente e treinado tem a capacidade de
diferenciar uma reação "filming"" de uma reação específica.
4. A intensidade e reatividade do ponto final de uma reação em técnica de IFI podem ser
afetadas pelo microscópio por fluorescência utilizado.
Referências Bibliográficas
1) American Trypanosomiasis Research (Sc. Pub. Nº 318 Pan-American Health Organization
PAHO 206-211,1975).
2) Diagnóstico de laboratorio da enfermedad de Chagas/Anales F.L.I.P. 14:1974.
3) Coons A.H. Creech H.J. Jones R.N. et al: The demonstration of pneumococcal antigen in
tissues by the use of fluorescent antibody (Journal lmmunology 45:159-170, 1942).
4) Carvalho MR, Krieger MA, Almeida E, et al. Chagas' disease diagnosis: evaluation of several
tests in blood bank screening. Transfusion 1993; 33:830-4.
5) Pan AA, Rosenberg GB, Hurley MK, Schock GJH, Chu VP, Aiyappa A. Clinical evaluation of an
EIA for the sensitive and specific detection of serum antibody to Trypanosoma cruzi. (Chagas'
disease). J. lnfect Dis 1992; 165:585-8.
6) Schattschneider W, Lopes ER, De Alencar JE, Bienzle U, Feldmeier H. A comparative study
of four serological methods for diagnosis of acute and chronic Chagas'disease in Brazilian
patients. Trop Geogr Med 1992; 44:210-8.
7) Ross A, Novoa, Montero D. Comparability and reliability of ELISA, Immunofluorescence, and
indirect hemagglutination assays for Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. J lnfect Dis
1993; 168:1581-4.
8) Wison Marianna and Schantz Peter. "Manual of Clinical Microbiology” Chapter 67:
Nonmorphologic Diagnosis of Parasitic lnfections; pag. 719; 1991.
Fabricado por:
Biocientifica S.A.
Iturri 232/4
Caixa Postal C1427ADD
Buenos Aires - ARGENTINA
"SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO"
POTENCIALMENTE INFECTANTE
Conservar entre +2 e +8ºC.
Para maiores informações, vide Instruções de Uso.
Reg. ANVISA N°: 80189860053
Revisão Setembro/2004

INSTRUÇÕES DE USO Inmunofluor CHAGAS Kit reagente

Transcrição

Documentos relacionados

FTA-ABS _Sífilis

Equilíbrio químico e Princípio de Le Chatelier

GOT/AST UV - GT Laboratorio

para descargar - GT Laboratorio

hemogloWiener

BULA SOLUÇÃO HEMOLISANTE

Produto: FLRC3 - Solução em Microscopia de Fluorescência

ELITech Seppim S.A.S. AMYLASE SL ELITECH®

Instruções de Uso - Vida Biotecnologia

Proteínas Totais • • Biureto

InterLab - EGITRON

introdução às espectroscopias de absorção e fluorescência