pastorextm meningitis - Bio-Rad

PASTOREXTM MENINGITIS
25 testes
61607
61608
61610
61611
61613
61614
61616
61618
61717
DETECÇÃO DOS ANTIGÉNIOS SOLÚVEIS EIDENTIFICAÇÃO
DE NEISSERIA MENINGITIDIS A, C, Y/W135, B/E. COLI K1,
HAEMOPHILUS INFLUENZAE b, STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B
1- VALOR CLÍNICO
A meningite bacteriana é uma infecção das meninges cujos principais germes
responsáveis são: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae de tipo b e Streptococcus grupo B.
Dada a sua evolução tantas vezes fulgurante e gravíssima, torna-se
importante diagnosticar rapidamente esta infecção a fim de permitir instaurar
um tratamento apropriado. As técnicas clássicas de identificação por cultura,
se bem que essenciais para o antibiograma e a confirmação do diagnóstico,
são lentas e podem fornecer resultados falsamente negativos, caso a colheita
tenha sido sujeita a transporte e armazenamento em condições deficientes ou
se tiver sido instituída uma antibioterapia antes de proceder à colheita.
A investigação por técnicas imunológicas dos antigénios solúveis libertados
pelo germe durante a infecção nos líquidos biológicos (líquido
cefalorraquidiano (LCR), urina, soro) permite um diagnóstico mais rápido.
Os antigénios solúveis detectados por meio deste dispositivo são
polissacarídeos específicos de serogrupos ou de serotipos: Streptococcus
pneumoniae (83 tipos), Haemophilus influenzae de tipo b, Neisseria
meningitidis grupo A, grupo B/E. coli K1, grupo C, grupo Y/W135 e
Streptococcus grupo B. O antigénio polissacarídeo específico do grupo B do
meningococo é muito pouco antigénico e sempre se revelou difícil obter, de
forma reprodutível, anticorpos de coelho específicos deste antigénio. A
tecnologia dos anticorpos monoclonais, aplicada à preparação de anticorpos
específicos de antigénios polissacarídicos bacterianos, permitiu obter anticorpos monoclonais de ratinho, capazes de reconhecer de forma específica e
reprodutível o antigénio polissacarídico do serogrupo B do meningococo.Este
antigénio é idêntico a um antigénio polissacarídico observado na E. coli K1.
Esta homologia antigénica entre o meningococo B e a E. coli K1 permite
diagnosticar grande parte das meningites por E. coli nos recém nascidos, das
quais aproximadamente 80% são estirpes K1. De referir que a E. coli e o
estreptococo do grupo B são os principais germes responsáveis das
meningites no recém-nascido e no prematuro e que, por outro lado, a infecção
pelo meningococo é extremamente rara nesta faixa etária.
2- PRINCÍPIO
O antigénio presente na amostra testada é identificado por meio de partículas
de látex cobertas com anticorpos específicos. Estas partículas aglutinam-se
fortemente em presença do antigénio homólogo, enquanto que se mantêm em
suspensão homogénea, na sua ausência.
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3- APRESENTAÇÃO
1. 25 kits de teste PASTOREX TM MENINGITIS, código 61607,
consistindo em:
• Reagente 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1
1 frasco com 0,40 ml de látex vermelho sensibilizado com anticorpo
monoclonal de rato específico para N. meningitidis grupo B/E.coli K1.
• Reagente 2 (R2): Controlo negativo N. meningitidis B/E.coli K1
1 frasco com 0,40 ml de látex vermelho sensibilizado com anticorpo
monoclonal de rato específico para toxóide tetânico.
• Reagente 3 (R3): H. influenzae b
1 frasco com 0,40 ml de látex vermelho sensibilizado com anticorpos de
coelho específicos para H. influenzae type b.
• Reagente 4 (R4): S. pneumoniae
1 frasco com 0,40 ml de látex verde sensibilizado com anticorpos de coelho
específicos para S. pneumoniae.
• Reagente 5 (R5): Streptococcus B
1 frasco com 0,40 ml de látex amarelo sensibilizado com anticorpos de
coelho específicos para Streptococcus B.
• Reagente 6 (R6): N. meningitidis A
1 frasco com 0,40 ml látex azul sensibilizado com anticorpos de coelho
específicos para N. meningitidis grupo A.
• Reagente 7 (R7): N. meningitidis C
1 frasco com 0,40 ml de látex vermelho sensibilizado com anticorpos de
coelho específicos para N. meningitidis grupo C.
• Reagente 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135
1 frasco com 0,40 ml de látex cor-de-rosa sensibilizado com anticorpos de
coelho específicos para N. meningitidis Y/W 135
• Reagente 9 (R9): Controlo polivalente negativo
1 frasco com 0,40 ml de látex cor de ameixa sensibilizado com
imunoglobulinas IgG de coelho não imunizado.
• Reagente 10 (R10): Controlo polivalente positivo
Controlo positivo: extracto antigénico seco congelado a ser reconstituído
com 1 ml de água estéril. Contém antigénios polissacarídeos de
N.meningitidis A, C, B, Y/W135, H.influenzae b, Streptococcus B, e
S.pneumoniae. Volume suficiente para 20 reacções.
Todos os reagentes contêm 0,02 % de timerosal.
65
Os reagentes R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 contêm menos de 0,1% de
azida de sódio.
• Placas de aglutinação descartáveis.
• Varetas de mistura descartáveis.
2. TESTES DE LÁTEX INDIVIDUAIS PASTOREX TM MENINGITIS (25
testes cada):
• Teste de látex individual (sem controlo)
- N. meningitidis A (R6)
- N. meningitidis C (R7)
- N. meningitidis B / E. coli K1 (R1)
- Streptococcus B (R5)
- Streptococcus pneumoniae ( R4)
- Haemophilus influenzae b (R3)
código 61608
código 61610
código 61611
código 61613
código 61614
código 61616
• Controlo PASTOREXTM Meningitis
Kit de reagentes de controlo para teste de látex individual
(para 2 x 25 testes)
código 61618
- 2 frascos conta-gotas com 0,40 ml de controlo negativo polivalente (R9)
- 2 frascos de controlo positivo polivalente seco congelado (R10) para
serem reconstituídos com 1 ml de água estéril.
- 2 frascos conta-gotas com 0,40 ml de controlo negativo para N.m.B /
E.coli K1 (R2)
- placas descartáveis.
- varetas de mistura descartáveis.
3. Diluente PastorexTM Meningitis
1 frasco com 40 ml de diluente para tratamento de soros
código 61717
4- ARMAZENAMENTO
Os reagentes conservados a +2-8°C e na ausência de contaminação mantêmse estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na etiqueta.
Após reconstituição, na ausência de contaminação, o controlo positivo
(R10) mantém-se estável 1 mês a +2-8°C. Este período de conservação
pode ser prolongado se o controlo positivo for alíquotado e congelado a
–20°C, imediatamente após a reconstituição.
Conservar os reagentes de látex em posição vertical.
NUNCA CONGELAR OS FRASCOS DE LÁTEX.
66
5- MATERIAL NECESSÁRIO NÃO FORNECIDO
•
•
•
•
•
•
Pipeta com capacidade de distribuição de 40 a 50 µl da amostra.
Tubo de hemólise ou Eppendorf
Incubadora a seco ou banho-maria a 100°C.
Centrifugadora para tubo de hemólise ou Eppendorf.
Recipiente desinfectante.
Água destilada estéril, solução salina estéril ou diluente (código 61717)
6- PRECAUÇÕES
A qualidade dos resultados depende do estrito cumprimento das Boas
Práticas Laboratoriais.
• Todos os reagentes e amostras devem ser utilizados à temperatura
ambiente entre os 18 e os 25°C.
• Não passar os dedos sobre as superfícies reactivas das placas de
aglutinação.
• Utilizar uma pipeta ou uma ponta de recolha nova para cada amostra
testada.
• Agitar os frascos de látex antes da utilização.
• Limpar a ponta conta-gotas do reagente por forma a obter gotas bem
calibradas.
• Manter o frasco de látex em posição vertical ao depositar a gota.
• Usar uma vareta misturadora nova para cada reacção.
• Após a utilização, eliminar as pipetas de recolha de produtos
patológicos,bem como as placas de aglutinação e as varetas, para um
recipienteesterilizável ou desinfectante.
• Reconstituir o controlo positivo com água destilada esterilizada e
evitarqualquer contaminação.
INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA
Observar permanentemente as técnicas e precauções em vigor em matéria de
protecção contra riscos microbiológicos.
• Todos os materiais recolhidos devem ser considerados como
potencialmente contagiosos.
7- PROCEDIMENTO: LCR, soro, urina
Amostras
As amostras devem ser tratadas assim que possível após a recolha. Caso tal
não seja possível, podem ser armazenadas durante algumas horas entre os
+2 e os +8°C, ou mais a -20°C (neste caso, mantenha apenas o sobrenadante
a –20°C após centrifugação). Evite congelar / descongelar repetidamente.
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Os exames bacteriológicos (cultura) devem ser realizados com toda a
prioridade no intuito de se evitar a contaminação da amostra. O volume
mínimo de amostra para teste com o kit de látex é de 0,5 ml.
A) PREPARACAO DE AMOSTRAS CLINICAS.
ATENÇÃO : quando recorrer a banho de água, utilize tubos impermeáveis
para impedir que a água entre para os tubos. Se possível, utilize um incubador
seco.
a) FCS (fluido cerebrospinal)
Se o FCS for muito turvo ou contiver glóbulos vermelhos, centrifugue durante
5 minutos a 350 g e recolha o sobrenadante.
• Aqueça a amostra durante 3 minutos a 100°C (incubador seco ou banho de
água).
• Deixe a amostra arrefecer até à temperatura ambiente, depois proceda a
centrifugação durante 5 minutos a 3 000 g ou filtração utilizando um filtro
com 0,45 µm.
b) SORO
• Adicione 3 volumes (1,5 ml) de diluente (código 61717) por um volume (0,5
ml) de soro.
• Aqueça durante 3 minutos a 100°C em banho de água ou incubador seco.
• Centrifugue durante 5 minutos a 3 000 g.
ATENÇÃO : Não utilize amostras de plasma. Não foi testada a interferência
devido a sobrecarga de albumina, lípidos, hemoglobina e bilirrubina. Os
melhores resultados são obtidos com soro fresco.
c) URINA
Para aumentar a concentração de antigénio, antes de testar, a amostra pode
ser concentrada até 25 vezes numa membrana do tipo Amicon B15 (Amicon
France).
• Aqueça a urina durante 3 minutos a 100°C (incubador seco ou banho de
água).
• Centrifugue durante 5 minutos a 3 000 g ou filtre utilizando um filtro de
0,45 µm.
B) PROCEDIMENTO DE TESTE
• Coloque uma gota (40 a 50 µl) do sobrenadante da amostra previamente
tratada em cada um dos círculos da placa de aglutinação
• Agite suavemente os frascos de reagente de látex.
• Segurando o frasco na vertical, coloque uma gota de cada reagente de
látex na placa descartável, seguindo o padrão de distribuição indicado: R9,
R6, R7, R1 e R2 nos círculos brancos e R8, R3, R4 e R5 nos círculos pretos.
68
• Misture os reagentes de látex e a amostra utilizando uma vareta; troque de
vareta para cada látex.
• Rode a placa (~120 RPM) suavemente durante 10 minutos e observe a
ocorrência de qualquer aglutinação visível a olho nu no período de
10 minutos (o agitador de tipo orbital pode ser utilizado a uma velocidade
de ~120 RPM).
8- PROCEDIMENTO: CULTURA DE SANGUE
Para uma orientação provável, verifique a morfologia e a coloração de Gram
• Retire 1 a 2 ml de uma cultura de sangue positivo.
• Centrifugue durante 5 minutos a 2000 g
• Coloque uma gota (40 a 50 µl) de sobrenadante em cada círculo da placa
descartável, correspondente aos reagentes de látex a testar, de acordo com
a coloração de Gram.
• Agite suavemente os frascos de reagente de látex seleccionados para o
teste.
• Segurando o frasco na vertical, coloque uma gota de cada reagente de
látex seleccionado na periferia das gotas de sobrenadante.
• Misture os reagentes de látex e a amostra utilizando uma vareta e trocando
de vareta para cada látex.
• Rode a placa a ~120 rpm durante 5 minutos. Durante este período de
5 minutos, verifique a ocorrência de aglutinação.
Alguns meios de cultura de sangue envolvem reacções não específicas ou
problemas de leitura. Como controlo negativo, utilize uma cultura de sangue
inoculada com sangue esterilizado ou com um organismo diferente dos
detectados pelo teste PASTOREX™ Meningitis.
9- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
REACÇÃO POSITIVA
Uma reacção positiva é indicada por uma aglutinação ligeira, visível a olho nu,
em comparação com os controlos negativos.
A intensidade da aglutinação e a altura da ocorrência depende da
concentração de antigénio na amostra testada.
Uma discordância entre um teste de antigénio positivo e uma cultura negativa
pode ser explicada pela ausência de bactérias viáveis na amostra cultivada (o
tratamento antibiótico teve início antes da colheita da amostra ou as
condições de transporte não eram adequadas à sobrevivência de bactérias
frágeis).
Na maioria dos casos, uma reacção positiva com látex anti-N. meningitidis B /
E. coli K1 num recém-nascido ou num bebé prematuro indica infecção por
E. coli K1. Numa pessoa de mais idade, o diagnóstico de Meningococos B é
mais provável. A cultura da amostra deve confirmar o diagnóstico.
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REACÇÃO NEGATIVA
Suspensão homogénea, sem aglutinações.
RESULTADOS NÃO INTERPRETÁVEIS
A reacção não é interpretável se a amostra se aglutinar com os controlos
negativos de látex (R2 ou R9) e/ou com mais do que um reagente de látex do
kit. Neste caso, é aconselhável repetir o teste com outra amostra e aguardar
pelo resultado da cultura. (É muito raro uma infecção ficar a dever-se a duas
espécies bacterianas diferentes).
10- PROCEDIMENTO: AGRUPAMENTO DE ESTIRPES DE BACTÉRIAS
ISOLADAS NO AGAR (Colónias de uma cultura recente e pura)
O látex Y/W135 não pode ser utilizado para este agrupamento de estirpes
de bactérias. Para determinar estes grupos, recomenda-se a utilização de
anti-soro convencional (Kit Y,W135, 29E: Ref. # 58704, 3 x 1 ml)
Para uma orientação provável antes de realizar o teste:
• Verifique a morfologia e a coloração de Gram.
• No caso das bactérias Gram-negativas, teste a oxidase (Positiva para
N. meningitidis, negativa para E. coli K1).
• No caso dos cocos Gram positivos realize um teste de catalase. (Não teste
as estirpes positivas para a catalase).
As estirpes não encapsuladas de S. pneumonia e Haemophilus influenzae não
podem ser identificadas através desta técnica.
a) Agrupamento: N. meningitides (Apenas A, B, C), H. influenzae, E. coli,
S. pneumoniae
• Coloque uma gota de 30 µl de solução salina estéril num círculo da placa
descartável.
• Amostra:
- No caso de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzea e Escherichia
coli, o equivalente a uma ansa de 1 µl, que consiste num máximo de 2 a
3 colónias.
- No caso de Streptococcus pneumoniae, o equivalente a uma ansa de
5 µl, que consiste num mínimo de 10 a 12 colónias.
• Emulsione cuidadosamente as colónias recolhidas para amostra de forma a
obter uma suspensão homogénea.
• Agite suavemente o frasco de reagente de látex escolhido para a
identificação; segurando o frasco na vertical, coloque uma gota deste látex
na periferia da gota da suspensão bacteriana.
• Misture o látex e a suspensão utilizando uma vareta.
• Rode a placa (~120 rpm).
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• Observe a ocorrência de qualquer aglutinação evidente em menos de
2 minutos,
• Confirme a identificação da espécie utilizando testes bioquímicos
convencionais.
b) Agrupamento: Estreptococos B (colónias ß-hemolíticas)
• Suspenda 5 colónias em 2 ml de caldo de Todd Hewitt.
• Incube em banho-maria a 37°C durante 2 a 3 horas.
• Centrifugue durante 5 minutos a 3.000 g.
• Coloque uma gota (40 a 50 µl) de sobrenadante num círculo da placa
descartável.
• Agite suavemente o frasco de reagente de látex; segurando o frasco na
vertical, coloque uma gota deste látex na periferia da gota de sobrenadante.
• Misture o látex e a amostra utilizando uma vareta.
• Rode a placa (~120 rpm).
• Observe a ocorrência de qualquer aglutinação evidente em menos de
1 minuto.
• Confirme a identificação da espécie utilizando testes bioquímicos
convencionais.
Para uma extracção directa a partir de colónias isoladas, use o kit
PASTOREX™ STREP (Código 61721)
11- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE
Os reagentes de látex devem estar completamente homogéneos após a
agitação.
O controlo polivalente positivo R10 é utilizado para verificar cada
imunoreactividade ao látex.
• Para realizar este teste de controlo de qualidade, coloque uma gota (40 µl)
de controlo positivo (R10) em cada círculo da placa descartável.
• Agite suavemente os frascos de reagente de látex.
• Segurando o frasco na vertical, coloque uma gota de cada reagente de
látex na placa descartável, seguindo o padrão de distribuição indicado: R9,
R6, R7, R1 e R2 nos círculos brancos e o R8, R3, R4 e R5 nos círculos
pretos.
• Misture os reagentes de látex e a amostra utilizando uma vareta, trocando
de vareta para cada látex.
• Rode a placa a ~120 rpm durante 10 minutos. Durante este período de
10 minutos, verifique a ocorrência de aglutinação visível a olho nu
(compare as reacções do teste de látex com as dos controlos negativos do
látex).
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A intensidade da aglutinação e a rapidez de ocorrência depende da avidez
antigénio / anticorpo. Consequentemente, as reacções observadas com cada
látex variam. As reacções do látex NmB / Coli K1 são mais ligeiras do que as
de outros.
• Uma solução salina ou o diluente (código 61717) controla a ausência de
aglutinação não específica de cada látex.
Para realizar este teste de controlo de qualidade, é utilizada solução salina
fisiológica ou diluente R11 (código 61717) de acordo com o protocolo para
o controlo polivalente positivo (comparar com o procedimento anterior).
• Os reagentes de látex não devem ser utilizados quando não se aglutinam
com o controlo polivalente positivo (R10), ou quando se aglutinam de forma
não-específica com a solução salina ou o diluente (código 61717) (tal pode
dever-se a condições de conservação inadequadas do kit ou a uma
contaminação do reagente de látex).
12- CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE
Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são
submetidos a um sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das
matérias primas até à comercialização do produto final.
Cada lote do produto final é objecto de um controlo da qualidade, sendo
comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de
aceitação.
A documentação relativa à produção e controlo de cada lote é arquivada pelo
fabricante.
13- DESEMPENHO DO TESTE
SENSIBILIDADE
A sensibilidade de cada reagente do kit foi determinada por análise de:
• antigénios purificados diluídos em solução salina
• amostras clínicas de fluido cerebrospinal documentadas pelas técnicas de
análise convencionais (cultura, exame microscópico)
• estirpes isoladas da cultura em agar de Mueller Hinton, chocolate + agar
PVS, Columbia + agar com 5% de sangue de ovelha.
72
Antigenio ou bactéria Antigénio diluído
presente na amostra
(NaCl, 9 ‰)
FCS
Estirpes
Concentração
limite detectada
número
analisado
n° de positivos
em látex
N. meningitidis A
2,5 ng/mL
12
12
N. meningitidis B
62,5 ng/mL
ND
E. coli K1
N. meningitidis C
número
analisado
2,5 ng/mL
3
3
n° de positivos
em látex
22
22
10
10
1
1
16
16
-
N. meningitidis Y
5 ng/mL
ND
-
N. meningitidis W
2,5 µg/mL
ND
-
-
S. pneumoniae
95 ng/mL
22
15
15
24
Streptococcus B
20 ng/mL
1
1
15
15
H. influenzae type b
0,1 ng/mL
34
33
17
17
ESPECIFICIDADE
A especificidade de cada reagente foi determinada através da análise de:
• FCS estéril (a) ou FCS contaminado com as bactérias responsáveis pela
meningite e diferentes das detectadas pelo teste látex (b).
• Estirpes pertencentes a genuses Neisseria, Branhamella, Moraxella,
Acinetobacter, Kingella, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus testadas
com látex heterólogo.
Antigenio ou bactéria
presente na amostra
FCS estéreis (a)
FCS contaminados (b)
Estirpes (c)
número
n° de
número
n° de
número
n° de
analisado negativos em analisado negativos em analisado negativos
látex
látex
em látex
N. meningitidis A
52
52
N. m. B / E. coli K1
25
25
N. meningitidis C
52
52
50
50
ND
56
56
122
122
41
40*
127
127
S. pneumoniae
60
60
39
39
33
33
Streptococcus B
49
49
58
58
17
17
H. influenzae type b
61
32
31
31
-
-
N. meningitidis Y/W 135
61
32
FCS «tudo incluído»
número analisado
número de negativos
em látex
40
40
*1 estirpe de Klebsiella pneumoniae apresentou uma reacção não específica.
73
CULTURAS DE SANGUE
O desempenho do PASTOREXTM MENINGITIS foi testado em culturas de
sangue. Os resultados da avaliação são os seguintes:
• Sensibilidade: 100 % (4/4 incluindo 2 estirpes de S. pneumoniae e
2 estirpes de Streptococcus B).
• Especificidade : 100 % (37/37). Para reagente R3, R4, R5, R6, R7 e R8.
• Especificidade : 98,2% (54*/55). Para reagente R1. *Das 19 estirpes de
estafilococos coagulase negativa testadas, 1 estirpe apresentou reacção
não específica, resultado não confirmado na estirpe testada da subcultura
de agar seguindo o procedimento de agrupamento.
14- LIMITES DA TÉCNICA
• Em diversos casos, a técnica de látex imunológico permite um diagnóstico
de probabilidade do organismo. No entanto, a concentração de antigénio
na amostra pode ser inferior ao limite mais baixo da detecção do látex e
produzir um resultado negativo. Neste caso, pode ser útil repetir a amostra
mais tarde.
• Esta técnica não pode substituir o cultivo da bactéria, que por si só permite
a determinação de um resultado de susceptibilidade antimicrobiana.
• Considerando a grande variedade de meios de cultura de sangue, não é
possível garantir desempenhos para todos os meios. (Cf. 7-D).
• Actualmente, os dados clínicos e bibliográficos referentes à detecção de
antigénios nos soros e na urina utilizando reagentes látex são limitados.
• Foram relatados alguns exemplos de bactérias não relacionadas portadoras
dos mesmos antigénios. Deve sempre considerar-se a possibilidade de
reacções cruzadas (1, 4, 5).
• O diagnóstico final, relativamente a todos os diagnósticos laboratoriais, não
se pode basear nos resultados de um só teste, mas sim num resumo dos
dados clínicos e dos resultados bioquímicos, citológicos e imunológicos.
• A detecção de antigénio solúvel em cultura de sangue bem como
agrupamento de estirpes isoladas em agar, devem ser concluídas através
de uma identificação de espécie da estirpe bacteriana
15- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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26
98
99
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
06/2008
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