Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra

Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra
Armando Cristóvão
Adaptado de "The Tools of Biochemistry" de Terrance G. Cooper
Determinação da Concentração de Proteína Numa Amostra:
O MÉTODO DO BIURETO
A reacção do biureto é uma reacção muito usada para a determinação da
concentração de proteína em materiais biológicos. Foi um dos primeiros ensaios
colorimétricos a ser desenvolvido. A natureza do complexo colorido não é conhecida
em detalhe, no entanto pensa-se que está envolvida a formação de um complexo de
cobre em soluções muito alcalinas com uma ligação peptídica das proteínas e
também com alguns resíduos de tirosina, formando um complexo de cor violeta. Das
substâncias presentes em sistemas biológicos, as proteínas são geralmente as
únicas que dão uma reacção positiva, embora existam várias substâncias que
interferem com a reacção. O Cu2+ também é susceptível de ser reduzido. Isto pode
ser detectado na prática pelo aparecimento de um precipitado vermelho na mistura
de reacção.
A. Preparação do Reagente de Biureto:
1. Coloque 1,5 g de CuSO4·5H2O, 6 g tartarato de Sódio/Potássio (NaKC 4O6.4H2O),
em 500 ml de água num copo de litro com um magnete. (NOTA: Devem
dissolver-se os compostos separadamente, de preferência)
2. Adicione 300 ml de NaOH 10%, previamente efectuada.(NOTA: Esta reacção é
extremamente exotérmica, por isso tenha cuidado para não se queimar).
3. Adicione 1 g de KI de preferência já dissolvido num pequeno volume de água.
Tenha atenção que o volume final é de 1 L
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4. Ajuste o volume para 1 Litro. Se a solução não ficar límpida pode ser filtrada
através de um papel de filtro Whatman.
B. Determinação da concentração de proteína pelo método do Biureto:
1. Ligue o espectrofotómetro de forma a ele aquecer, de acordo com o fabricante.
2. Para preparar a curva padrão numere 5 tubos de 1 a 5. Em cada um adicione as
volumes de uma solução de albumina 0,4%, de acordo com a Tabela I.
3. Ajuste o volume com água de forma a perfazer 1ml de volume final.
4. Adicione o volume de detergente (SDS 10% ou DOC 10%) e de tampão, indicado
na tabela I.
5. Prepare 3 tubos (fica assim com os resultados em triplicado) marcados de 6-8
para determinar a concentração da proteína na amostra (Tabela II), e adicione 50
µl da sua amostra de sinaptossomas.
6. Ajuste o volume com água de forma a perfazer 1ml de volume final.
7. Adicione o volume de detergente (SDS 10% ou DOC 10%), indicado na tabela II.
8. Adicione 4 ml de reagente de Biureto aos tubos marcados de 1-8.
9. Misturar bem os tubos (1-8) tapados com parafilme (ou no vórtex) e deixe reagir
durante 10 minutos
10. Determine a absorvância a um comprimento de onda de 540 nm. Isto deverá ser
feito num intervalo de 1-2horas, pois a partir desta altura a absorvância decresce.
11. Faça um gráfico de Absorvância versus mg proteína (tubos 2-5). Use a curva
construída para determinar a quantidade de proteína existente na sua amostra
(tubo 6-8) e faça a média.
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TABELA I - Volumes de reagentes a colocar nos tubos para fazer a curva padrão.
Tubo
Albumina
Água Detergente a
Tampão da
Reagente
nº
0,4% (ml)
(ml)
amostra (µl)
Biureto
10% (µl)
mg de
ABS
proteína
(ml)
1
0
1
50
50
4
0
2
0
1
50
50
4
0
3
0,25
0,75
50
50
4
4
0,5
0,5
50
50
4
5
1
0
50
50
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TABELA II - Volumes de reagentes a colocar nos tubos que contêm as amostras
com um concentração de proteína desconhecida.
Tubo
Amostra
Água Detergente a
Tampão da
Reagente
nº
Vol. (µl)
(ml)
10% (µl)
amostra (µl) Biureto (ml)
6
50
0,95
50
0
4
7
50
0,95
50
0
4
8
50
0,95
50
0
4
mg de
ABS
proteína
Material necessário:
- Albumina 0,4%
- Cuvetes para espectrofotómetro
- Reagente de Biureto
- Solução tampão em que a amostra está
- Tubos de reacção
armazenada
- Pipetas de vidro 5ml, 2 ml, 1 ml
- Água desionizada.
- Pipetas automáticas 100 µl
- CuSO4·5H2O
- Pontas amarelas
- tartarato de Sódio / Potássio (NaKC4O6
- DOC 10%
.4H2O)
- Amostras
- NaOH 10%
- KI
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B.1. Cálculo da concentração de proteína nas amostras.
Bibliografia
Atkins, P and Jones, Loretta (1997). Chemistry:Molecules,matter and change, 3rd
ed, ed W.H.Freeman New York
Cooper, Terrance G. (1977). The tools of Biochemistry ed Jonh Wiley and Sons, New
York
Layne E. (1957). Methods in Enzymology (Colowick S.P. and Kaplan N. O., Eds).
Academic Press, New York, Vol. 3, 447-441
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