Low Throughput HLA Typing Protocol

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Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
550 West Avenue, Stamford, CT 06902 EUA
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FOLHETO
INFORMATIVO
Kit de Tipagem HLA MIA FORA™ NGS
Para utilização em diagnósticos In Vitro
ÍNDICE
Definições dos Símbolos…………………………….….
1
Recolha e Preparação da Amostra…………………
4
Reagentes por número de catálogo…………..………
2
Procedimento……………………………………………
5
Utilização Prevista………………………………….……
3
A. Materiais Fornecidos………………………………
5
Sumário e Explicação……………………………………
3
B. Materiais Necessários, mas não Fornecidos.....
5
Princípios do Procedimento………………………….…
3
Instruções de Utilização………………………………..
5
Reagentes………………………………………………...
3
Controlo de Qualidade………………………………….
12
A. Identificação…………………….………………...
3
Limitações do Procedimento…………………………..
12
B. Advertências e Precauções.................................
3
Características de Desempenho Específicas………..
13
C. Instruções de Armazenamento…………………..
4
Resolução de Problemas………………………………
14
D. Purificação ou Tratamento para a Utilização…...
4
Licenças Limitadas……………….………….…………
15
E. Indicações de Instabilidade……………………..
4
Informação do Fabricante…………………………..…
15
Requisitos dos Instrumentos…………………………..
4
Marcas Registadas Utilizadas…………………………
15
Definições dos Símbolos
Limites de
temperatura
Código do Lote
Número de Catálogo
Utilizar até
Número de Série
Precaução
Consulte as instruções
antes de utilizar
Fabricante
Representante
Autorizado na
Comunidade Europeia
Dispositivo Médico para
Diagnóstico In Vitro
Contém
NS
Suficiente para N
testes
CONT
Conformidade Europeia
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REAGENTES POR NÚMERO DE CATÁLOGO
Peça do Kit Principal HLA MIA FORA NGS Número SR-800-10377 consistindo num Kit de Reagente de Tipagem HLA MIA
FORA NGS (SR-800-10365) e num Kit de Esferas Magnéticas HLA MIA FORA NGS (SR-800-10379).
Kit de Reagente de Tipagem HLA (SR-800-10365) MIA FORA NGS:
a)
Reagentes da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase): Consistem em nove (9) frascos-ampola individuais
Número de
Produto
Reagente
1
Mistura PCR HLA-A
SR‐800‐00326
2
Mistura PCR HLA-B
SR‐800‐00327
3
Mistura PCR HLA-C
SR‐800‐00328
4
Mistura PCR HLA-DPA1
SR‐800‐00329
5
Mistura PCR HLA-DPB1
SR‐800‐00330
6
Mistura PCR HLA-DQA1
SR‐800‐00331
7
Mistura PCR HLA-DQB1
SR‐800‐00332
8
9
b)
Mistura PCR HLADRB1-S
Mistura PCR HLADRB1-L
Armazenamento
450µl
-20 a -80°C
24
SR-800-00333
SR-800-00334
Reagentes de Preparação da Biblioteca: Consistem em doze (12) frascos-ampola individuais
Reagente
10
11
12
13
14
Enzima de
Fragmentação
Tampão de
Fragmentação
Tampão STOP
Mistura de Enzima de
Reparação Final
Tampão de Reparação
Final
Número de
Produto
Volume de
Enchimento
SR-800-00335
67 µl
SR-800-00336
168 µl
SR-800-00337
225 µl
SR-800-00338
34 µl
SR-800-00339
168 µl
15
Enzima de cauda poli-A
SR-800-00340
17µl
16
Tampão de cauda poli-A
SR-800-00341
118 µl
17
Enzima de Ligase
SR-800-00342
34 µl
18
Tampão de Ligase 2X
SR-800-00343
917 µl
SR-800-00344
84 µl
SR-800-00345
12 µl
SR-800-00362
85 µl
19
20
21
c)
Volume de
Enchimento
Enzima /Mistura
Tampão da PCR
Iniciadores (primers) de
Amplificação
Água sem nucleases
Armazenamento
24
-20 a -80°C
Placa Adaptadora (SR-800-00349):
Descrição
Placa Adaptadora Indexadora
Três colunas preenchidas de
uma placa de 96 poços
Número da Peça
Volume de
Enchimento
Armazenamento
SR-800-00349
5 µl/poço
-20 a -80°C
Kit de Esferas Magnéticas (SR-800-10379):
a)
Esferas Magnéticas: Consistem em um (1) frasco-ampola
Descrição
Número da Peça
Volume de
Enchimento
Armazenamento
Frasco-ampola Preenchido,
Esfera XP Agencourt®
AMPure®
SR-800-00378
5ml
2 a 8°C
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UTILIZAÇÃO PREVISTA
TM
O kit de tipagem HLA MIA FORA NGS serve para a amplificação e sequenciação de genes HLA, HLA -A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 e -DPB1 na plataforma de sequenciação Illumina NGS. O software MIA FORA destina-se a ser
usado na determinação da tipagem HLA a partir dos dados gerados com o kit de biblioteca HLA MIA FORA NGS. Este teste
destina-se a ser usado num laboratório competente nos procedimentos de amplificação e sequenciação de ADN.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A tipagem baseada em sequência de exões de genes HLA amplificados pela PCR é um procedimento laboratorial comum. A
amplificação pela PCR é usada para enriquecer as sequências-alvo e a tipagem HLA subsequente é determinada para as
regiões selecionadas. Outros métodos, como por exemplo sondas de oligonucleótidos específicas de sequências (SSOP),
ensaios de extensão de iniciadores específicos de sequências (SSP) também foram utilizados para determinar a tipagem HLA.
O sistema de tipagem HLA MIA FORA NGS é uma nova metodologia de tipagem HLA que tira partido da capacidade de cobrir
todas as regiões relevantes do lócus HLA através da PCR de longo alcance. Nove misturas principais da PCR que contêm
todos os componentes necessários para amplificar cada gene, inclusive as enzimas, os tampões, as dNTPs e os iniciadores
para a amplificação pela PCR de longo alcance são fornecidos no kit. O ADN amplificado pode depois ser processado através
do kit de biblioteca HLA MIA FORA NGS para gerar uma biblioteca de ADN para a sequenciação na plataforma de
sequenciação Illumina. O kit permite a sequenciação de 24 amostras de forma múltipla através da plataforma de sequenciação
Illumina.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O kit de tipagem HLA MIA FORA NGS foi concebido para determinar a tipagem de lócus HLA de Classe I e Classe II através da
sequenciação do gene inteiro ou dos exões e intrões com mais informação. O kit de tipagem HLA MIA FORA NGS faz uso da
PCR de longo alcance para capturar e enriquecer os principais genes HLA, HLA -A, -B, -C,-DQA1,-DQB1, -DPA1 –DPB1, e –
DRB1/3/4/5. O kit de reagentes de Preparação de Biblioteca MIA FORA NGS gera uma biblioteca para o ADN amplificado para
sequenciação na plataforma de sequenciação Illumina. O software de tipagem HLA MIA FORA NGS oferece a sequenciação
dos genes HLA relevantes e informação da fase para conseguir uma tipagem HLA de alta resolução.
REAGENTES
A. Identificação
Consulte as tabelas na secção de Reagentes por Número de Catálogo para uma lista completa de produtos e números de
catálogo.
B. Advertências e Precauções
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Apenas para a Utilização em Diagnósticos In Vitro dentro da União Europeia.
O resultados obtidos a partir destes kits não deverão ser usados como o único critério para a tomada de uma decisão
clínica que afete o doente.
Deverão ser designados laboratórios ou espaços laboratoriais fechados diferentes para manipulações Pré-PCR assim como
para manipulações Pós-PCR.
Deverão ser designadas pipetas diferentes para manipulações Pré-PCR assim como para manipulações Pós-PCR.
Perigo biológico: Todas as amostras de material biológico ou de sangue deverão ser tratadas como potencialmente
infeciosas. Utilize as Precauções Universais quando as manusear.
Nunca deve pipetar com a boca. Evitar o contacto dos reagentes e das amostras com a pele ou com membranas mucosas.
Eliminar os materiais usados de acordo com os regulamentos locais e/ou institucionais para a eliminação de materiais
potencialmente perigosos biologicamente.
A tecnologia PCR é suscetível de contaminação, principalmente do próprio produto. Os aerossóis dos amplicões da PCR
que são gerados durante os passos pós-PCR são uma fonte frequente de contaminação. Por isso, deverão ser tomadas
precauções para evitar salpicos ou geração de aerossóis excessivos. Os procedimentos laboratoriais padrão para a PCR
que incluem a limpeza das superfícies de trabalho, antes do processamento ou a preparação de amostras PCR, com lixívia
a 10% recentemente preparada, a utilização de luz ultravioleta (UV) em hottes ou em câmaras de fluxo laminar entre
utilizações, a separação em tempo e espaço das atividades pré e pós-PCR, a utilização de reagentes PCR divididos em
partes iguais, a utilização de controlos positivos e negativos, etc. também deverão ser seguidos durante a utilização do kit.
A utilização de uma técnica consistente e cuidadosa em conjunto com uma incorporação e monitorização liberal dos
controlos irá assegurar uma abordagem atenta e pró-ativa a fim de controlar e monitorizar a contaminação da PCR.
Os laboratórios deverão validar os seus próprios procedimentos de limpeza.
A contaminação de reagentes ou espécimes poderá causar resultados errados; por isso, deverão ser tomados cuidados
para evitar a contaminação deste produto durante a sua utilização. Não utilize reagentes contaminados.
Utilize os líquidos do kit conforme foram fornecidos. Qualquer diluição ou alteração poderá gerar resultados errados. Não
misture reagentes entre lotes diferentes.
Não utilize frascos-ampola com fugas ou sem rótulo.
Amostras ou reagentes previamente congelados deverão ser misturados totalmente e centrifugados após descongelação e
antes da realização do teste. Evite a formação de espuma e de bolhas nas amostras.
Durante a utilização, mantenha todas as enzimas e misturas principais em gelo ou num recipiente criogénico (2 - 8°C),
enquanto estão a descongelar.
Para evitar evaporação, antes da amplificação assegure-se de que o tubo da amostra está devidamente selado.
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16. Devido a diferenças inerentes nos mecanismos de desempenho do termociclador, poderão ocorrer variações nos resultados
quando os perfis térmicos definidos são transferidos entre instrumentos termocicladores de diferentes marcas ou modelos.
Em alguns casos, a especificidade e a sensibilidade da reação poderá ser comprometida, levando à falsa interpretação e
leitura dos dados. Termocicladores e perfis alternativos terão de ser validados pelo utilizador.
17. Os tempos de incubação ou temperaturas diferentes daqueles especificados poderão dar resultados errados.
18. Qualquer incumprimento das instruções de utilização recomendadas poderá resultar num desempenho do produto inferior
ao ideal. Dependendo da natureza e da gravidade do incumprimento, poderão ocorrer falhas no ensaio (em amostras
individuais assim como falhas na execução) e/ou resultados errados. Por exemplo, determinámos que uma limpeza
insuficiente/inativa das esferas durante o ensaio poderá resultar numa alta incidência de falhas de chamadas no adaptador
indexador.
19. Recomenda-se que se realize uma eletroforese em gel para a análise dos produtos de amplificação do gene HLA por
tamanho. Os produtos de PCR deverão serão visualizados com brometo de etídio ou GelRed; outros corantes poderão
apresentar bandas mais ténues.
20. As esferas magnéticas são utilizadas em vários passos do protocolo. É importante remover o etanol antes de continuar o
passo de eluição sem permitir que as esferas fiquem demasiado secas. A superfície das esferas magnéticas deverá ter um
aspeto vítreo sem fundos líquidos visíveis. O tempo apropriado de secagem poderá ser determinado empiricamente para
cada ambiente laboratorial (5-10 minutos).
21. Utilize etanol a 80% diluído recentemente para a limpeza de cada esfera.
22. Depois de cada limpeza da esfera existe um ponto de paragem de segurança durante o qual as amostras ou a biblioteca
poderão ser armazenadas a -20ºC até 4 dias.
23. Proteja as placas PicoGreen® da luz para evitar a descoloração.
24. É fundamental que a reação de fragmentação não exceda os 20 minutos e que a limpeza da esfera seja executada
imediatamente, de forma a assegurar uma gama de tamanho de fragmentação correta.
25. A placa de cauda poli-A deverá seguir diretamente para o passo de ligação ao adaptador.
26. Ao preparar a placa de ligação ao adaptador indexador, use luvas novas enquanto estiver a manusear a placa do
adaptador. Remova cuidadosamente a selagem da placa. Verifique se todas as cavidades nas colunas 1, 2 e 3 contêm
cerca de 5 µl de solução.
27. A biblioteca amplificada deverá ser purificada no prazo de uma hora após a amplificação.
28. Os passos de pós-amplificação da biblioteca deverão ser realizados numa sala de sequenciação ou numa caixa PCR
AirClean para evitar a contaminação entre o ADN ligado com o adaptador-indexador e os produtos finais que contêm os
clusters de sequências Illumina.
29. A configuração para a quantificação da biblioteca por qPCR deverá ser efetuada numa hotte de PCR e com um tampão de
diluição preparado na altura para evitar contaminação.
30. Leve a cabo uma desnaturação MiSeq® da amostra com hidróxido de sódio 0,2N preparado na altura
31. Leve a cabo todas lavagens pós-corrida e manutenção de MiSeq®, assim como as limpezas regulares.
C. Instruções de Armazenamento
1.
2.
3.
Armazene o kit de tipagem HLA MIA FORA NGS abaixo de -20ºC num congelador manual sem gelo.
Não use componentes após a sua data de validade.
Armazene as esferas magnéticas entre 2 e 8ºC.
D. Purificação ou Tratamento Necessário para a Utilização
Ver "Recolha e Preparação da Amostra."
E. Indicações de Instabilidade
1.
Caso os sais tenham precipitado fora da solução durante a expedição ou armazenamento, ressolubilize-a completamente
antes da utilização misturando em vórtex à temperatura ambiente (18 a 30ºC).
REQUISITOS DOS INSTRUMENTOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Termociclador equipado com uma tampa de aquecimento, tempos de rampa ajustáveis e uma gama térmica mínima entre 2ºC e
100ºC, com uma precisão de pelo menos +/- 0,5°C. As condições para os termocicladores poderão precisar de ser alteradas de
forma a otimizar os seus perfis. Foi validado o termociclador Veriti da Applied Biosystems, quando operado no modo pré-definido
com uma taxa de rampa de (3,9ºC/seg).
Foi validado um leitor de placa fluorescente apropriado com um filtro de excitação de ~ 485 nm e um filtro de emissão de ~ 535 nm
para medir a concentração de ADN, como por exemplo o Victor X2, X3.
Método/aparato apropriado para o isolamento e purificação de fragmentos de ADN de cerca de 400-500 pares de bases de tamanho.
Foi validado um destes instrumentos de seleção de tamanho Pippin PrepTM.
Sistema opcional para manuseamento de líquidos para a construção semi-automática de bibliotecas. Foi validado um desses
sistemas, o Biomek 4000.
Foi validada uma plataforma de sequenciação Illumina, como por exemplo o instrumento MiSeq®.
Servidor e Software MIA FORA NGS: Número de Peça Immucor SR-790-00017.
RECOLHA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA


O ADN genómico humano pode ser purificado a partir de sangue total e camadas leucocitárias através de um método validado que
satisfaça os seguintes critérios. O ADN extraído do sangue preservado em EDTA foi testado e ficou demonstrado que tem o
desempenho esperado para a realização deste ensaio. O ADN extraído do sangue preservado em heparina não pode ser usado
neste ensaio.
O ADN isolado deverá estar em 10 mM TRIS-HCl, pH 8,0-9,0, ou em água livre de nucleases. Se um agente quelante, como por
exemplo o EDTA, estiver presente, a concentração final do agente quelante não deverá exceder os 0,5 mM.
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



A concentração final do ADN deverá situar-se entre os 5 e os 15 ng/µl.
As medidas da absorvância da amostra de ADN nos 260 e nos 280 nm deverão dar uma razão entre 1,65 e 2,0.
O ADN poderá ser usado imediatamente após o isolamento ou armazenado a –20ºC durante até 1 ano. O
congelamento/descongelamento repetido deve ser evitado, dado que pode resultar na degradação do ADN.
Pelo menos 50% das amostras de ADN genómico deverão ter fragmentos superiores a 10 kb para uma amplificação PCR de longo
alcance bem sucedida.
PROCEDIMENTO
A. Materiais Fornecidos (Consultar a tabela na secção de Reagentes por Número de Catálogo para informações específicas)


Reagentes de PCR
Reagentes para preparar a biblioteca, a placa de adaptador indexador e as esferas magnéticas Ampure®
B. Materiais, Reagentes e Equipamentos Necessários, mas Não Fornecidos



























Termocicladores: O Termociclador ABI Veriti ® foi validado.
Suportes magnéticos para a eluição de baixo volume em placas de 96 poços: A Alpaqua Magnum FLX foi validada.
O suporte magnético para a separação magnética de tubos de microcentrifugadora: o DynaMag-2 Magnet foi validado
Centrifugadora de placa de mesa e microcentrifugadora de tubos.
Pipetas, pipetas multicanal e pontas (1-20µl, 20-200µl, 1000µl)
o.
o.
Vedantes adesivos para placas PCR. O filme adesivo PCR Accuseal (E & K Scientific cat. n T796150, 4titude cat. n 4ti-0500) foi
validado
Tubos de centrifugação de 1,5ml e tiras de tubos PCR.
Misturador em vórtice
Placas com semi-saia de 96 poços, rígidas, de altura máxima (E & K Scientific cat. no. EK-75012, 4titude cat. no. 4ti-0770/C)
Placa de 96 poços Preta PP, estilo chaminé, fundo em v (E & K Scientific cat. no. 21209, Greiner Bio-One cat. no. 651209)
Placa de Reação Ótica de 96 poços MicroAmp® (ThermoFisher cat. no. N8010560)
Fita de selagem ótica, adesivo avançado MicroAmp® (E & K Scientific cat. no. T796400, ThermoFisher cat. no. 4311971)
Reservatórios de reagente
Fitas almofada transparentes de vedação
Fitade Selagem de Alumínio
Papel para lentes
Pontas de pipeta descartáveis (resistentes a aerossóis) e com filtro que cobrem a gama entre 0,1μl e 1000μl
Etanol (teor alcoólico 100%) de qualidade para biologia molecular
10mM Tris-HCl pH 8,0
100% Tween 20
Hidróxido de Sódio, 1N
Água sem nucleases
1,5% Agarose, sem corante, padrões internos, Pippin PrepTM , 250 bp -1,5kb, (Sage Science,CDF1510)
PhiX Control, v3 (Illumina cat. no. FC-110-3001)
Reagentes para a determinação da concentração de ADN fluorescente: O Kit de Ensaio Quant-iT™ Picogreen® dsDNA foi validado
Kit cíclico MiSeq® V2 300 (Illumina cat. no. MS102-2002)
Kit/método de precisão para a quantificação da biblioteca: O Kit de Quantificação da Biblioteca KAPA foi validado
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
O ensaio pode ser processado com o uso de um protocolo manual descrito abaixo ou um protocolo automatizado com o uso de um
manipulador líquido. O protocolo automatizado em detalhe com o uso do Biomek 4000 e os protocolos de ensaio manual estão disponíveis no
seu Especialista de Vendas Técnicas de Immucor.
NOTAS:
•
•
•
•
Seja extremamente cuidadoso no processo de divisão em partes iguais. Utilize pipetas calibradas. Se não o fizer, isso poderá
resultar na perda do reagente e no fracasso do ensaio.
Todas as temperaturas têm de ser mantidas com precisão.
Leve as esferas magnéticas até à temperatura ambiente antes de as utilizar.
O produto amplificado pode ser armazenado até 4 dias a -20ºC antes de ser utilizado. O produto amplificado apenas pode
ser congelado e descongelado uma vez. O congelamento e o descongelamento repetidos poderão resultar na degradação
do produto amplificado e poderão proporcionar resultados de má qualidade se este for usado para gerar uma biblioteca.
A. Purificação do ADN Genómico
Purifique o ADN genómico através do seu método preferido. Os requisitos para a amostra de ADN são os seguintes:

As amostras de ADN genómico devem ser extraídas a partir de sangue total ou de um camada leucocitária através de um
método de extração de ADN que consiga gerar uma massa molecular de ADN elevada.

O ADN deve ser diluído em água livre de nucleases e armazenado a -20ºC ou temperatura inferior.

A concentração final de ADN deverá estar entre 5-15 ng/µl, mantendo todas as amostras a concentrações semelhantes. Se
necessário, ajustar com água livre de nucleases.

Pelo menos 50% dos fragmentos de ADN genómico extraídos deverão ter um tamanho de 10 Kb ou mais para uma PCR de
longo alcance bem sucedida.
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B. Amplificação de ADN (PCR)
Configuração da PCR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Preencha um Ficheiro de Amostra de Código de Barras (um ficheiro de Windows separado por vírgulas: CSV) com os nomes
das amostras e as atribuições de código de barras, conforme apresentado na Figura 1.
Figura 1. Exemplo de Ficheiro de Amostra de Código de Barras
Crie um projeto no software MIA FORA depois de criar uma ficha de amostra de código de barras com os nomes da amostra e
os códigos de barras. Este nome de projeto é necessário para o nome de corrida MiSeq®.
Coloque etiquetas em três placas PCR de 96 poços com semi-saia de revestimento duro.
Prepare uma placa de amostra com 100 µL de ADN genómico por poço para cada amostra com uma concentração de 5-15
ng/µl diluída em água livre de nucleases.
A placa de amostras deverá ser organizada em colunas 1, 2 e 3 de um placa de 96 poços, conforme demonstrado na placa de
amostras da Figura 2. O poço A1 deverá ser o controlo negativo (NTC) com 10mM Tris-HCl pH 8,0 e sem qualquer ADN,
seguido da amostra 1 em B1, da amostra 2 em C1 e sequencialmente até à amostra 23 em H3 (Figura 2, PLACA DE
AMOSTRAS).
Descongele as misturas principais de PCR (P1-P9), misture por inversão ou agite brevemente em vórtex e centrifugue.
Centrifugue a placa de amostras do passo 4 numa centrifugadora com um suporte de placa durante 2 min, para assegurar que
o ADN genómico fica no fundo do poço.
Pipete 15 µl das misturas PCR P1-P9 nas colunas 1-9 de cada uma das três placas PCR de 96 poços com semi-saia de
revestimento duro para que cada poço de uma coluna tenha a mesma mistura de PCR (Figura 2).
Pipete cuidadosamente para evitar bolhas na mistura principal de PCR.
Pipete as amostras a partir da placa de amostra com uma pipeta multicanal da seguinte forma (Figura 2):
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl de NTC e as amostras 1-7 na coluna 1 (A1-H1) em cada uma das nove colunas
da Placa 1 de PCR.
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl das amostras 8-15 na coluna 2 (A2-H2) em cada uma das nove colunas da Placa
2 de PCR.
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl das amostras 16-23 na coluna 3 (A3-H3) em cada uma das nove colunas da Placa
3 de PCR.
NOTA: as amostras têm de ser misturadas delicadamente para evitar bolhas na mistura principal de PCR, conforme
apresentado na Figura 2.
Vede as placas PCR com fita adesiva para PCR. Centrifugue brevemente as placas PCR, coloque-as em 3 termocicladores
diferentes e execute o programa HLA_PCR MIA FORA usando a definição de tampa aquecida; Ver Tabela 1.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
Os produtos PCR podem ser armazenados a -20ºC até 4 dias até estarem prontos para o passo de equalização genética.
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Figura 2. Esquema de amostras e configuração de PCR
Tabela 1. Condições do Termociclador para a amplificação
Ciclos (20)
Ciclos (15)
Espera inicial
0
94 C /30seg
11.
Desnaturação
0
94 C /1min15seg
Hibridação
0
60 C /30seg
Extensão
0
66 C /7min30seg
Desnaturação
0
94 C /30seg
Hibridação
0
60 C /30seg
Extensão
0
66 C /7min30seg
Extensão final
0
66 C /10 min
Espera
0
4 C/∞
Opcional: A amplificação pode ser confirmada ao correr algumas amostras representativas em gel de agarose a 0,8% com
brometo de etídio ou GelRed. A eletroforese deverá ser conduzida a 90 volts durante 40 minutos. Os fragmentos PCR poderão
variar entre as amostras devido a diferenças nos intrões. Os tamanhos aproximados para os produtos PCR são apresentados
na Tabela 2.
Tabela 2: Tamanhos dos produtos de amplificação
Lócus HLA
Tamanho (kb)
HLA-A
3,2
HLA-B
4,1
HLA-C
4,4
HLA-DPA
5,0
HLA-DPB
5,2
HLA-DQA
5,8
HLA-DQB
6,3
HLA-DRB1
0,9
HLA-DRB2
5,6
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C. Equalização e Agregação (Pooling) Produtos de PCR
A concentração de cada produto de PCR pode ser determinada utilizando um reagente apropriado de quantificação de ADN
fluorescente, como por exemplo o PicoGreen®.
Com base nas medições de fluorescência, os produtos PCR de todas as novas reações de PCR para cada amostra são equilibradas
TM
e agregadas de acordo com o resultado do SironaQuant , disponível no Sistema HLA MIA FORA NGS. As amostras agregadas são
depois purificadas na preparação para a amplificação.
Equalização e Agregação
Figura 3. Configuração do Ensaio PicoGreen®
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Quantifique os produtos PCR utilizando o reagente PicoGreen®: Deixe o reagente PicoGreen® atingir a temperatura
ambiente e dilua-o com um tampão 1X TE (50µL PicoGreen®+ 7450µL 1xTE). Agite em vórtex para misturar e proteja-o
da luz até utilizar. Nota: Siga as instruções do folheto informativo dos reagentes, se forem usados outros reagentes para
a quantificação PCR.
Prepare padrões diluídos em série em tubos de microcentrifugação usando o controlo de 100ng/µl fornecido com o kit
PicoGreen®. Distribua 20 µl de cada padrão pelos poços A10 –E12 da Placa 1 PicoGreen® (placas de medição de saia
completa preta), conforme demonstrado na Figura 3. Transfira 20 µl de tampão 1xTE nos poços F10, F11, F12 da Placa
1 PicoGreen®, conforme demonstrado na Figura 3.
Adicione 20µl de PicoGreen® diluído a cada poço das três placas PicoGreen®, inclusive aos poços padrão na placa 1,
conforme demonstrado na Figura 3.
Adicione 19 µl de tampão 1xTE a três placas PicoGreen® no mesmo formato das três placas de PCR. Adicione 1 µl de
produtos PCR às três placas PicoGreen®, para que a combinação corresponda às placas de PCR originais para
produzir uma diluição 1:20 de produtos de PCR. O volume final é de 40µl em todos os poços medidos.
Centrifugue a placa e incube-a à temperatura ambiente durante pelo menos 5 min. Proteja as placas da luz durante a
incubação.
Meça a fluorescência com um filtro de excitação a ~ 485 nm / emissão a ~ 535 nm, 0,1s (Victor X3).
Guarde o ficheiro de saída utilizando a seguinte convenção para o nome: (Nota: Windows: utilize Texto Separado por
Tab; MacOs: utilize Texto Formatado para Windows).
Project_Plate#_COLUMN1_Date.txt (p.ex. ProjectX_01_COLUMN1_123115.txt)
Execute o Programa de Equalização SironaQuant no software MIA FORA. O valor pmol recomendado é entre 0,00035 e
0,0009 pmol.
Centrifugue as placas PCR e rotule uma nova placa para o próximo passo com "Project_pooled PCR_date"
Dilua os produtos PCR de cada lócus com um Tampão 10mMTris HCl de pH 8,0, segundo o resultado do SironaQuant
antes de agregação.
Consolide os produtos PCR de todas as 9 reações PCR para cada amostra transferindo os volumes especificados no
resultado do SironaQuant.
Sele as placas e armazene-as a -20ºC se não prosseguir de imediato para o passo de limpeza das esferas.
Leve as esferas magnéticas até à temperatura ambiente e misture as esferas magnéticas agitando-as em vórtex para
ressuspender homogeneamente as esferas.
Adicione 55 µl de esferas por poço de amostras consolidadas. Misture bem o ADN e as esferas pipetando para cima e
para baixo pelo menos 10 vezes.
Incube a Mistura de Esferas de ADN à temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfira a placa para o misturador
magnético durante 5 minutos.
Enquanto a placa está no misturador magnético, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as esferas.
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16. Mantenha a placa no misturador magnético para os passos de lavagem com etanol. Adicione 200µL de etanol diluído
recentemente a 80% a cada poço, incube durante 30 segundos e depois remova cuidadosamente e descarte o etanol.
17. Repita a lavagem com etanol mais duas vezes (dando um total de 3 lavagens). Remova todos os vestígios de etanol
após a terceira lavagem.
18. Retire a placa do misturador magnético e deixe as esferas secarem ao ar. A superfície das esferas magnéticas deverá
ter um aspeto vítreo sem quaisquer poços de líquido visíveis. O tempo apropriado para a secagem poderá ser
determinado empiricamente em cada ambiente laboratorial (5 – 10 minutos).
19. Adicione 35 µl de 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente a cada poço. Misture bem pipetando e incube durante
5 minutos.
20. Coloque a placa no misturador magnético e incube durante 5 minutos ou até a solução ficar límpida.
21. Com a placa no misturador magnético, transfira 30 µl de eluato para a nova placa PCR de 96 poços rotulada:
Projeto_Equalizada_limpa_data.
As amostras agregadas e limpas podem ser armazenadas a -20ºC até 4 dias até estarem prontas para o passo de Fragmentação.
D. Construção de uma Biblioteca de Sequenciação
a. Fragmentação
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Inicie um temporizador laboratorial para 20 minutos antes do passo 8.
Faça alíquotas de 20ul do tampão de paragem do tubo 12 em cada poço da coluna 11 da nova placa de 96 poços
rotulada como placa de fragmentação. Mantenha a placa em gelo até ao passo 8.
Prepare a mistura principal de fragmentação transferindo 134 µl do tubo 11 (Tampão de Fragmentação) para o tubo 10
(Enzima de Fragmentação). Misture bem agitando em vórtex e centrifugando brevemente.
Pipete 23 µl da mistura principal de fragmentação preparada no passo 3 em cada poço da coluna 12 da placa de
fragmentação, de forma a criar uma coluna "reservatório" da mistura principal.
A partir da coluna 12, transfira 6 µL da mistura principal de fragmentação para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa
de fragmentação.
Transfira 14 µl de amostra da coluna 1 da placa agregada e limpa com esferas da secção anterior
(Projeto_Equalizada_limpa_data) para a coluna 1 da placa de fragmentação. Misture pipetando para cima e para baixo
5 vezes.
5 vezes.
5 vezes.
Transfira a placa de fragmentação para o cimo da bancada, INICIE O TEMPORIZADOR e incube à temperatura
ambiente durante 20 minutos. É vital que a reação não exceda os 20 minutos.
Depois de 20 minutos de incubação, transfira imediatamente 5 µl do tampão de PARAGEM a partir da coluna 11 para
as colunas 1, 2 e 3 e misture totalmente pipetando para cima e para baixo 5 vezes após cada adição.
Pipete 200 µl de esferas magnéticas à temperatura ambiente para cada poço da coluna 10 da placa de amostra
fragmentada ou para uma tira de tubos de PCR limpos.
A partir da coluna 10, adicione 40 µl de esferas magnéticas a cada poço do ADN fragmentado e misture lentamente
pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Incube a Mistura de Esferas de ADN à temperatura ambiente durante 10
minutos.
Transfira a placa para o misturador magnético durante 5 minutos para ligar as esferas às paredes dos poços e descarte
cuidadosamente o sobrenadante utilizando a pipeta.
Mantenha a placa no misturador magnético para os passos de lavagem com etanol. Lave cada poço com 200 µl de
etanol a 80%, incube durante 30 segundos e remova cuidadosamente o líquido com uma pipeta multicanal, sem
perturbar as esferas.
Repita a lavagem com etanol mais uma vez (totalizando 2 lavagens).
Remova a placa do misturador magnético e seque ao ar para evaporar o etanol em excesso até que o pellet das
esferas magnéticas tenha um aspeto vítreo.
Remova a placa do misturador magnético. Adicione 20 µl de tampão 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente às
esferas, misture através de pipetagem e incube durante 5 minutos fora do misturador magnético.
Coloque a placa no misturador magnético e incube durante 5 minutos.
Transfira 15 µl de eluato para as novas placas PCR de 96 poços de revestimento duro rotuladas com
Projeto_Fragmentado_Limpo_Data e sele a placa. As amostras estão agora prontas para o passo de Reparação Final.
As amostras fragmentadas e limpas podem ser armazenadas a -20ºC até estarem prontas para o passo de Reparação Final. Poderá
armazenar com segurança a placa, com os poços selados, fragmentada e limpa até 4 dias a -20ºC.
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b. Reparação Final
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Volte a rotular a placa previamente fragmentada e limpa como Projeto_Reparaçãofinal_Data.
Prepare a mistura principal de Reparação Final adicionando 136 µl do tubo 14 (Tampão de Reparação Final) ao tubo
13 (Enzima de Reparação Final), agite em vórtex, centrifugue brevemente e coloque o tubo em gelo.
Pipete 18,5 µl da mistura principal de Reparação Final preparada no passo 1 à coluna 12 da placa de Reparação Final
rotulada Projeto_Reparaçãofinal_Data, para criar uma coluna "reservatório".
A partir da coluna 12, transfira 5 µl da mistura principal de Reparação Final às colunas 1, 2 e 3 de ADN equalizado,
fragmentado e limpo rotulado como Projeto_Fragmentado_Limpeza_Data preparadas na secção anterior e misture
pipetando 5 vezes.
Sele a placa com fita adesiva para PCR e centrifugue brevemente para assegurar que todo o líquido fica no fundo do
poço.
Transfira a placa de Reparação Final rotulada como Projeto_Reparaçãofinal_Data para um termociclador e execute o
programa de Reparação Final MIA FORA, conforme indicado na tabela 3.
Mantenha a placa a -20ºC até estar pronta para a Adenilação.
Tabela 3: Programa do Termociclador para a Reparação Final
Reparação_Final_MIA FORA
20°C durante 30 min
Espera a 4ºC ∞
c. Adenilação
1.
2.
3.
4.
5.
Prepare a mistura principal de cauda poli-A ao adicionar 85 µl do tubo 16 (Tampão Cauda Poli-A) ao tubo 15 (Enzima
Cauda Poli-A), agite em vórtex, centrifugue brevemente e coloque o tubo em gelo.
Pipete 12 µl da mistura principal de cauda poli-A preparada no passo 1 à coluna 11 da placa já com a Reparação Final
para criar uma coluna "reservatório".
A partir da coluna 11, transfira 3 µl da mistura principal de cauda poli-A para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa já
com reparação final rotulada como Projeto_Reparaçãofinal_Data vinda da secção anterior. Misture pipetando para cima
e para baixo 5 vezes. Volte a rotular a placa como Projeto_Cauda poli-A_Data.
Coloque a placa no termociclador e execute o programa A-tail MIA FORA conforme apresentado na tabela.
PROCEDA DIRETAMENTE PARA O PASSO DE LIGAÇÃO DO ADAPTADOR INDEXADOR antes de terem
passado 30 minutos.
Tabela 4: Programa do Termociclador para Adenilação
MIA FORA_Cauda poli-A
Espera a 4ºC ∞
d. Ligação ao Adaptador Indexador
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Utilize luvas novas ao manusear a placa adaptadora. Centrifugue a placa adaptadora brevemente antes de remover o
selante da placa. Remova cuidadosamente o selo da placa da placa adaptadora. Verifique que todas as cavidades nas
colunas 1, 2 e 3 contêm aproximadamente 5 µl de solução.
Prepare a mistura principal de Ligação ao adicionar 850 µl do tubo 18 (Tampão de Ligase) para o tubo 17 (Enzima de
Ligase), agite em vórtex, centrifugue brevemente e coloque o tubo em gelo.
Pipete 95 µl da mistura principal de Ligação preparada no passo 2 para a coluna 10 da placa de cauda Poli-A rotulada
como Projeto_Cauda poli-A_Data da secção anterior, para criar uma coluna "reservatório". Volte a rotular a placa como
Projeto_Ligação_Data.
A partir da coluna 10, transfira 26 µl da mistura principal de Ligação para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa de
cauda Poli-A e misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 5 vezes.
Transfira 2,5 µl do adaptador para os poços correspondentes da placa de ligação.
Misture bem e sele a placa com uma fita adesiva de PCR. Centrifugue brevemente.
Transfira a placa de ligação para um termociclador e execute o programa de ligação MIA FORA, conforme apresentado
na tabela 5.
Tabela 5: Programa do Termociclador para a Ligação por Adaptador
MIA FORA_Ligação
Espera a 4°C ∞
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e. Consolidação dos Produtos Ligados ao Adaptador
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Combine 20 µl a partir de cada poço da placa rotulada Projeto_Ligação_Data da secção anterior para um único tubo
Eppendorf de 1,5 ml. Rotule o tubo com "Projeto-Data-Consolidado."
Adicione 865 µl de esferas magnéticas ao tubo da microcentrifugadora rotulado como Projecto-Data-Consolidado.
Misture completamente no misturador em vórtex. Incube durante 10 minutos.
Transfira o tubo para o suporte magnético até a solução ficar límpida, 5 – 8 min. Remova e descarte o sobrenadante.
Enquanto ainda estiver no misturador magnético, adicione 1 ml de etanol a 80% e incube durante 30 segundos. Remova
o etanol a 80% sem perturbar as esferas ligadas.
Repita a lavagem com etanol (passo 4), para um total de 2 lavagens. Retire o máximo possível de etanol do tubo.
Remova o tubo do suporte magnético e permita que as esferas sequem ao ar durante 5-10 minutos até que o pellet das
esferas magnéticas tenha um aspeto vítreo.
Ressuspenda as esferas em 63 µl de 10mMTris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente. Agite em vórtex e incube durante 5
minutos.
Coloque o tubo no misturador magnético até a solução ficar límpida e transfira 60 µl de eluato que contenha amostras
ligadas por adaptador limpas para dentro de um tubo de microcentrifugação limpo.
As amostras ligadas por adaptador Agregadas e Limpas (Biblioteca) podem ser armazenadas a -20ºC, até estarem prontas para
realizar a Seleção de Tamanho, durante até 4 dias.
f. Seleção de Tamanho e Amplificação da Biblioteca de Tamanho Selecionado (Pippin Prep)
NOTA: A biblioteca amplificada deverá ser purificada no prazo de 1 hora após a amplificação.
1.
2.
3.
4.
5.
Aplique um método apropriado de seleção de tamanho na preparação biblioteca para isolar fragmentos de
aproximadamente 400-500 pares de bases. Siga o manual de instruções do produto se não utilizar o Pippin Prep.
Misture 30 µl da Biblioteca com 10 µl do marcador apropriado e carregue a mistura em uma das faixas da cassete
Pippin.
Crie e execute um programa para selecionar a Biblioteca com um tamanho de fragmento entre 400-500 pares de bases.
Descongele os módulos de Amplificação do kit de preparação de Biblioteca, tubos 19, 20 e 21 e faça a montagem da
reação em gelo numa tira de tubo PCR de 0,2 ml da seguinte forma:
Misture 25 µl da mistura de amplificação a partir do tubo 19, 2 µl de iniciadores do tubo 20, 18 µl de água livre de
nucleases do tubo 21 e 5 µl da eluição selecionada por tamanho.
Misture gentilmente e centrifugue. Transfira para o termociclador e amplifique através do PCR Biblioteca MIA FORA
conforme apresentado na tabela 6.
Tabela 6: PCR Biblioteca MIA FORA
Ciclo (1)
Espera inicial
980C /30 seg.
Ciclos (12)
Desnaturação
Hibridação
980C /15 seg.
650C /30 seg.
Extensão
720C /30 seg.
Ciclo(1)
Ext. Final
720C/5 min
Espera
40C ∞
E. Preparação da Sequenciação para o MiSeq®
NOTA: Abra e realize todos os passos de Pós-amplificação numa secção designada do laboratório. Preferivelmente, numa
câmara de fluxo laminar de PCR para evitar a contaminação das superfícies de trabalho e dos reagentes de sequenciação.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Transfira 50 µl da Biblioteca amplificada para um tubo de microcentrifugação. Adicione à Biblioteca 50 µl de esferas
magnéticas à temperatura ambiente. Misture totalmente e incube durante 10 minutos.
Após 10 minutos, coloque o tubo no suporte magnético até a solução ficar límpida, cerca de 5-8 min. Remova e descarte o
sobrenadante.
Enquanto ainda estiver no misturador magnético, adicione 200 µl de etanol a 80% e incube durante 30 segundos. Remova o
etanol a 80% sem perturbar as esferas ligadas.
Repita a lavagem com etanol (passo 3) totalizando 2 lavagens. Remova o máximo etanol possível de dentro do tubo.
Retire o tubo do suporte magnético e deixe as esferas secar ao ar durante 5 – 10 minutos até que o pellet das esferas
magnéticas tenha um aspeto vítreo.
Ressuspenda as esferas em 17 µl de 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente. Misture em vórtex e incube durante 5
minutos.
Coloque o tubo no misturador magnético até que a solução fique límpida e transfira 15 µl de eluato que contenha uma
biblioteca de sequenciação limpa e amplificada para um tubo de microcentrifugação limpo.
As amostras eluídas podem ser conservadas a -20ºC durante até 4 dias.
8.
9.
Determine a concentração da Biblioteca através de métodos que meçam com precisão a concentração de ADN. A Immucor
recomenda os métodos qPCR para obter uma estimativa da concentração da Biblioteca.
A biblioteca amplificada tem de ter uma concentração mínima de 10 nM. A distribuição de tamanho da biblioteca pode ser
determinada através da eletroforese com gel de agarose ou qualquer sistema de eletroforese capilar para verificar o
tamanho das bibliotecas resultantes.
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10. Dilua a biblioteca até 4 nM e depois prepare uma biblioteca desnaturada final de 12 pM para sequenciação. A biblioteca
pode ser marcada com um controlo PhiX a 5% se for desejável.
11. Carregue a Biblioteca desnaturada na cassete e execute um Sistema de Sequenciação MiSeq®.
12. Siga as instruções MiSeq® para a sequenciação da biblioteca utilizando um kit MiSeq® V2 de 300 ciclos. Certifique-se de
que o nome do ficheiro na ficha de amostra MiSeq® corresponde ao nome de projeto gerado durante a configuração PCR.
F. Análise de Dados
Os ficheiros fastq gerados pelo instrumento MiSeq® deverão ser analisados com o software MIA FORA para criar a tipagem
HLA. A ficha da amostra com os nomes e os códigos de barras da amostra e os ficheiros fastq correspondentes deverão ser
carregados no ficheiro de projeto do software MIA FORA. Para utilizar o software MIA FORA, siga o Guia de Utilizador do
Software.
RESULTADOS
1. Amplificação por PCR:
2.
3.
A análise de gel de agarose não deverá apresentar produto no controlo negativo (NTC) para que a corrida seja válida. O gel
de agarose dos produtos amplificados poderá apresentar variações no tamanho com base nas diferenças nas sequências
intrónicas. Consulte a Tabela 2 para informações sobre o tamanho aproximado das bandas.
Preparação da Biblioteca:
O Kit Biblioteca deverá gerar uma biblioteca quando o nível de entrada de ADN no SironaQuant tiver uma valor entre 0,0009
e 0,0035 pmol.
A concentração final da biblioteca deverá ser de pelo menos 10 nM e deverá ser quantificado com precisão antes da
sequenciação. As bibliotecas deverão ser diluídas até 4 nM antes da desnaturação.
O clustering nos kits MiSeq® V2 poderá variar dependendo do grau de precisão da quantificação. Tipicamente, as
densidades dos clusters das bibliotecas de 12 pM deverão oscilar entre 600-800 K/mm2
Deverão ser tomadas as devidas precauções para quantificar com precisão a biblioteca. Todos os produtos posteriores à
ligação por adaptador deverão ser contidos numa câmara de fluxo de PCR ou numa área designada. Também deverão ser
preparados imediatamente antes os reagentes de diluição para evitar contaminação.
A tipagem HLA é gerada pelo Software MIA FORA NGS e é apresentada num relatório. Consulte o Guia de Utilizador do
Software MIA FORA para a análise de dados de tipagem HLA.
CONTROLO DE QUALIDADE
É obrigatório o uso de um controlo negativo e um controlo conhecido opcional para cada teste, como por exemplo um de água desionizada e
uma amostra tipada previamente, respetivamente. Deverá ser tido o máximo de cuidado ao remover os selos das placas e as placas devem
ser centrifugadas antes de serem abertas. Devem ser usados selos de placas novos em cada passo onde as placas precisem de ser seladas.
As pontas de pipetas usadas deverão ser colocadas nos recipientes apropriados e descartadas. A configuração PCR deverá ser realizada
numa sala Pré-PCR a partir da qual os produtos amplificados são manuseados. Todo o ADN genómico tem de ser diluído em água livre de
nucleases. Após a seleção de tamanho e amplificação do ADN, a biblioteca amplificada deve ser manuseada numa área separada, de
preferência numa câmara de fluxo de PCR, e usando um conjunto diferente de pipetas. Deverão ser tomadas as precauções devidas para
não contaminar as áreas de trabalho com bibliotecas amplificadas. O ensaio deverá ser executado conforme recomendado neste folheto
informativo e seguindo qualquer outro procedimento de controlo de qualidade em conformidade com os requisitos locais, distritais, nacionais
ou de agências de acreditação.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1.
A PCR e o ensaio descritos neste folheto informativo requerem condições rigorosamente controladas. Qualquer desvio destes
parâmetros validados poderá levar a falhas no produto.
2. Caso pelo menos 50% dos fragmentos de ADN iniciais sejam menos de 10kB, pode não ser gerada uma quantidade suficiente do
produto de PCR de longo alcance.
3. Se a concentração da biblioteca final for abaixo de 10 nM, podem não ser gerados resultados de sequenciação precisos.
4. Vão ser observadas ambiguidades no 4º campo devido à falta de cobertura na região intrónica.
5. Aditivos na mistura PCR poderão interferir com alternativas não tóxicas ao brometo de etídio frequentemente utilizadas na
eletroforese com gel de agarose e poderão levar a uma intensidade menor das bandas.
6. Os géis de agarose corados a verde SYBR® não funcionam com os produtos PCR. O brometo de etídio ou GelRed™ deverão ser
usados para a visualização dos produtos de PCR.
7. O iniciador DPB1 não amplifica nem o exão 1 nem o 5. Consequentemente, quaisquer polimorfismos nestes exões não serão
sequenciados. Estes serão assinalados como ambiguidades no relatório.
8. A falta de sequências de referência genómicas para DPB1 e para os níveis baixos de polimorfismo no intrão 2 (entre o exão 2 e o 3)
faz com que seja difícil realizar análises de faseamento para amostras heterozigóticas. Consequentemente, poderá ocorrer uma
ambiguidade de genótipos que não pode ser resolvida.
9. O iniciador frente para o DPB1 sobrepõe-se com algumas das primeiras bases no exão2. Consequentemente, os polimorfismos
nessas sequências não serão identificados pela sequenciação.
10. Os lócus DRB são amplificados como dois fragmentos – um que amplifica o exão 1 e outros que amplificam os exões 2 a 6. O intrão
1 não é amplificado na sua totalidade. Consequentemente, o faseamento do lócus inteiro não é possível para o DRB1/3/4/5 e os
polimorfismos presentes no Intrão 1 vão resultar em ambiguidades no 4º campo.
11. O primer inverso para os exões DRB 2 a 6 sobrepõe-se á ponta 3' do exão 6 e, por essa razão, os polimorfismos dessas sequências
não serão determinadas pela sequenciação.
12. Na maior parte dos casos, os produtos de amplificação do exão 1 do DRB1/3/4/5 mapeiam fracamente com o exão 1 das sequências
de referência conhecidas do DRB5; o contig. para o exão 1 provavelmente não vao ser gerado para DRB5. Uma vez que não se
conhecem polimorfismos do exão 1 para DRB5, isto não causa qualquer ambiguidade na tipagem HLA do DRB5.
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13. Devido à natureza complexa da tipagem HLA, os técnicos qualificados deverão rever a interpretação dos dados e tarefas de
tipagem.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS
Estudos clínicos foram realizados em três locais para avaliar o desempenho do kit de tipagem HLA MIA FORA NGS. O desempenho deste
ensaio foi comparado com as tipagens anteriores que, sempre que disponíveis, incluíam as Tipagens por Sequência (SBT) e a tipagem de
baixa resolução, em casos em que as SBT estavam indisponíveis. As amostras foram selecionadas pelos locais dos ensaios para
representar um conjunto diversificado de tipos HLA que seriam encontrados durante o curso normal das operações. Foram testadas um total
de 206 amostras pelos locais, cada um em 3 corridas e utilizando dois lotes de reagentes. A tipagem HLA foi determinada para os lócus
HLA-A, -B, -C, -DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1, e -DRB 1/3/4/5. Foram avaliados um total de 3692 alelos com estas 206 amostras. Os
resultados mostraram que os tipos HLA obtidos pelo ensaio MIA FORA, sem um novo teste às falhas e aos lócus discordantes, são de
99,34%. Depois de voltar a testar o lócus falhado e o dissonante, a concordância total foi de 99,74%.
Local
Tabela 8: Sumário da Concordância Total
Número de Número de
Número de alelos
amostras
lócus testados para análise de concordância
Concordância após o novo teste
Local1
68
748
1223
1220 (99,75%)
Local2
69
759
1064
1063 (99,91%)*
Local3
69
759
1241
1236 (99,59%)
* Não foi levada a cabo nenhuma repetição neste local. Um dos lócus DQB1 não tinha dados suficientes.
Tabela 9: Sumário do Ensaio Clínico por Lócus
Lócus HLA
Concordância Inicial
Concordância após o Reteste**
HLA-A
100,00%
100,00%
HLA-B
99,76%
99,76%
HLA-C
99,51%
100,00%
DPA1
99,72%
100,00%
DPB1
99,44%
99,72%
DQA1
99,26%
100,00%
DQB1
98,48%
99,27%
DRB1
98,54%
99,03%
DRB3/4/5
99,43%
100,00%
Total
99,34%
99,74%
** As repetições de testes incluem chamadas que foram assinaladas para revisão e
que não puderam ser resolvidas através da inspeção manual dos dados. As
chamadas que não foram efetuadas devido a dados insuficientes (11/1854
amplificações) também voltaram a ser testadas.
Nota: Para consultar características de desempenho detalhadas e específicas, por favor ligue para a Immucor Transplant
Diagnositcs, Inc. através do 1- 888-329-0255.
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RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
PROBLEMA
Não aparecem
bandas no gel depois
da amplificação PCR.
POSSÍVEL CAUSA
Qualidade ou quantidade
do ADN
Razão DO 260/280 inferior a 1,65
Repurificar o ADN para remover impurezas.
ADN fragmentado
Pelo menos 50% do ADN deverá ser
maior do que 10Kb
Volte a extrair o ADN da amostra
ADN diluído em Tris-HCL ou TE.
Dilua as amostras em água.
Baixa concentração do modelo de ADN
As alternativas ao etídio usadas no gel
de agarose
Saída da amplificação
Bandas múltiplas ou
manchas de bandas
após a amplificação
de PCR
Inclinação das rampas
Condições do
Termociclador
Temperatura
Qualidade do ADN
Valores fluorescentes
baixos para todos os
lócus
Reagente PicoGreen®
Seleção incorreta do
tamanho do ADN
Instrumento Pippin
Fotobranqueamento do reagente
PicoGreen®
Diluição incorreta do reagente
Padrões diluídos incorretamente
Verifique o perfil de eluição para
assegurar que a eluição ocorreu sem
erros.
Instrumento não calibrado
Reutilização do cartucho Pippin
KAPA PCR
2
qPCR R < 0,95
Causada por um valor discrepante
nítido
Contaminação nos reagentes
O etanol não foi completamente
removido
Esferas armazenadas incorretamente
Limpeza das esferas
magnéticas
Etanol não preparado recentemente
Esferas demasiado secas.
Baixa concentração
da biblioteca
amplificada
Utilização de uma concentração errada de Tris-HCl
O Pippin prep não elui o
ADN
Verifique a pré e a pós eluição para
produtos ligados com adaptador
Produto amplificado perdido durante a
limpeza da esfera
Clustering MiSeq®
inferior ao esperado
SOLUÇÃO
Erro na Fragmentação
através dos passos de
Ligação
Problemas de fragmentação
Quantificação incorreta
da Biblioteca
Kapa qPCR
Reagentes Illumina
Problemas com células de fluxo,
instrumentos ou reagentes.
Certifique-se de que a concentração de ADN é de 50 - 15
ng/reação.
Utilize o brometo de etídio se as bandas do gel de agarose
estiverem fracas, visto quealguns corantes fluorescentes
poderão ficar extintos devido à composição da mistura PCR
Repetir para as saídas de amplificação de PCR utilizando
reagentes de sobra, dos quais existe o suficiente para quatro
amostras. Os reagentes de sobra armazenados a 2-8ºC ficam
estáveis durante uma semana.
Assegure-se que a inclinação da rampa é igual à especificada
no protocolo.
Calibre o aparelho de PCR para verificar o desempenho dos
aparelhos de PCR.
Assegure-se de que o ADN é diluído em água e está
descontaminado.
Siga de perto das instruções dos fabricantes. Os reagentes
devem ser protegidos da luz.
Dilua o reagente PicoGreen® segundo as instruções.
Dilua os padrões segundo as instruções.
Siga o guia de resolução de problemas da Sage Science para
determinar se o instrumento tem o desempenho segundo as
especificações.
Corra 2 µl de um marcador 1 kb ou mais (ThermoFisher) com
um protocolo de excisão de 400-600 pares de bases. Corra 15
µl de produto eluído no gel de agarose para visualizar a
eluição de um fragmento de 500 pares de base.
O cartucho Pippin deverá ser utilizado apenas uma vez.
Repita a análise omitindo o valor discrepante.
Repita a KAPA PCR com padrões novos.
Remova o etanol enquanto as placas estão no suporte
magnético. Remova todos os vestígios de etanol,
principalmente após a última lavagem.
Armazena as esferas entre 2 e 8ºC – NÃO CONGELAR
O etanol a 80% deverá ser preparado recentemente antes de
cada utilização.
O tempo de secagem poderá depender da temperatura
ambiente e da humidade. Monitorize de perto as esferas para
assegurar que as esferas não secam demasiado e ajuste o
protocolo conforme for necessário.
Certifique-se de que o tampão Tris-HCl tem 10mM e um pH
de 8,0
Amplifique 1 µl de bibliotecas limpas por agrepagação prépippin com metade dos reagentes para amplificação da
biblioteca. Corra os produtos amplificados (sem purificação
necessário) num gel de agarose a 2% para determinar se está
presente uma mancha de fragmentos.
Volte a amplificar 5 µl da eluição. Se a biblioteca for > 25nM,
os produtos poderão ser visualizados ao corer 5 µl num gel de
agarose.
Purifique 20 µl de 2-3 amostras ligadas e NTC utilizando o
protocolo de limpeza de esferas com 36 µl de esferas. Elua os
produtos em 10 µl e procure for fragmentação num gel de
agarose a 2%. Se a fragmentação não tiver ocorrido, telefone
para o apoio técnico para receber instruções adicionais para
resolver o problema.
Siga as instruções do fabricante, dando especial atenção às
diluições, verificando que a curva padrão é correta e que os
valores Ct estão dentro do intervalo linear da curva padrão.
Contacte o apoio técnico da Illumina para resolver problemas
relativos a reagentes e instrumentos.
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LC1618CEPT.1 (06/16)
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IMPORTANTE — LEIA ATENTAMENTE: Este Contrato de Licença de Rótulo ("Contrato") é o contrato legal entre você (doravante denominado "Titular da
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seguir. A titularidade dos Reagentes não será transferida para o Titular da Licença. A Immucor retém todos direitos que não são expressamente concedidos e
que não existem licenças implícitas concedidas por estas disposições.
2. Utilizações Não Previstas. Nenhuma permissão é garantida nos termos deste contrato para que o Titular da Licença utilize Reagentes além dos designados
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Última revisão e emissão deste documento: Rev 1, 08 Junho 2016
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A MIA FORA e a SIRONAQUANT são marcas registadas da Sirona Genomics, Inc.
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