Construção do Minigenoma do Vírus Oropouche - PPGBAIP
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Construção do Minigenoma do Vírus Oropouche - PPGBAIP
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS) DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA Belém-Pará 2013 DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutora em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes Belém-Pará 2013 DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes Banca Examinadora: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos Seção de Arbovirologia e Febres HemorrágicasIEC Profª. Drª. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Seção de Arbovirologia e Febres HemorrágicasIEC Profª. Drª. Sueli Guerreiro Rodrigues Seção de Arbovirologia e Febres HemorrágicasIEC Profª. Drª. Jeannie Nascimento dos Santos Laboratório de Biologia Celular e Helmitologia, ICB-UFPA Drª. Jannifer Oliveira Chiang (suplente) Seção de Arbovirologia e Febres HemorrágicasIEC Belém, 13 de maio de 2013 “Knowledge is the pathway from slavery to freedom” Frederick Douglass, escritor. Aos meus pais, pelo exemplo, incentivo, carinho e amor. AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida e por ter-me iluminado ao longo dessa jornada; Ao Prof° Dr. Márcio Nunes, pelos ensinamentos a mim repassados; Ao Dr. Richard Elliott da University of Glasgow, por ter me aceitado como coorientanda e ter contribuído com novos conhecimentos científicos para realização desse trabalho; Aos meus amigos e colegas da Escócia Agnieszka, Angela, Basma, Ben, Elina, Gillian, Gjon, Ing, Jill, Ping, Sophie, Steve and Xiaohong pela ajuda, solidariedade, colaboração na troca de conhecimentos, experiências, conselhos e pelo suplemento de sobremesas. Saudades do “tea time” e do “pub time”. Agradecimento extra para Sophie: “Merci, Frenchie!”; A todos da University of St. Andrews, Escócia, que me ajudaram nessa caminhada; Aos meus amigos e colegas de trabalho: Clayton, Janaína, Layanna, Sandro, Keley, Jedson, Davi, Edivaldo, João, João, Cleise, Edna pelo carinho e ajuda nessa caminhada importante na minha vida. Muito Obrigada; Ao Dr. Pedro Vasconcelos da Seção de Arbovirologia do IEC e aos amigos e colegas dessa seção. Obrigada a todos por sempre estarem dispostos a me ajudar. A CAPES, pelo suporte científico e financeiro através da bolsa de Doutorado Sanduíche no Exterior; Ao Instituto Evandro Chagas; A Universidade Federal do Pará; A todos os meus amigos que me ajudaram nessa jornada; Ao Edvaldo Penha por estar sempre comigo em todos os momentos. Obrigada por tudo; Aos meus familiares: meu pai Silva e minha mãe Regina, ao meu irmão Túlio e aos meus tios, tias, primos, avós que torceram por mim; A meu irmão Túlio. Amo-te. Agradeço especialmente aos meus pais por tudo que fizeram e fazem por mim. As dificuldades passadas para que eu pudesse ter o melhor. O melhor eu tive e sempre terei, pois sempre estarão na minha alma, Regina e Silva. Amo vocês. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ 11 LISTA DE QUADROS .......................................................................................................................... 13 RESUMO.............................................................................................................................................. 14 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 15 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 16 1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS ................................................................. 16 1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ......................................................................................................... 18 1.2.1. Estrutura dos vírus da Família Bunyaviridae ................................................................. 20 1.2.2. Organização Genômica e Estratégia de Codificação ..................................................... 20 1.2.2.2. Estratégia de Codificação ............................................................................................. 22 1.2.2.3. Estratégia de Codificação para o Segmento L ............................................................. 23 1.2.2.4. Estratégia de Codificação para o Segmento M ............................................................ 24 1.2.2.5. Estratégia de Codificação para o Segmento S ............................................................. 26 1.2.3. Ciclo Replicativo dos vírus da Família Bunyaviridae..................................................... 28 1.3. GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS .............................................................................................. 30 1.4. VÍRUS OROPOUCHE ............................................................................................................... 32 1.4.1 Ciclo de Transmissão ........................................................................................................ 33 1.4.2 Manifestações Clínicas ...................................................................................................... 34 1.4.3 Epidemiologia..................................................................................................................... 35 1.4.4. Diagnóstico Laboratorial .................................................................................................. 36 1.4.5 Organização Genômica ..................................................................................................... 37 1.5. GENÉTICA REVERSA .............................................................................................................. 37 1.5.1. Genética Reversa de vírus de filamento negativo .......................................................... 38 1.5.2. Genética Reversa dos Bunyavírus e suas aplicações ................................................... 42 1.5.2.1. Sistema de Minireplicon ou Minigenoma ...................................................................... 42 1.5.2.2. “Virus Like Particle” (VLP) ............................................................................................ 43 1.5.2.3. Sistema de Recuperação ............................................................................................. 44 2. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 46 2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................... 46 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 46 3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................... 47 3.1. CULTIVO CELULAR E PROPAGAÇÃO DO VÍRUS .................................................................. 47 3.1.1. Cultivos de células BSR-T7/5 ........................................................................................... 47 3.1.2. Preparação de Estoque Viral ............................................................................................ 47 3.1.3. Infecção viral ....................................................................................................................... 48 3.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA ........................................................................................................ 48 3.3. DNA PLASMIDIAL ..................................................................................................................... 49 3.3.1. Plasmídeos Usados no Estudo ........................................................................................ 49 3.3.2. Amplificação do DNA Plasmidial ..................................................................................... 51 3.3.3. Preparação de Bactérias Competentes ........................................................................... 51 3.3.4. Transformação das Bactérias Competentes E.Coli ....................................................... 51 3.3.5. Preparação do DNA Plasmidial ........................................................................................ 51 3.3.6. Determinação da Concentração do DNA ......................................................................... 52 3.4. MANIPULAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL .................................................................................... 52 3.4.1. Oligonucleotídeos sintéticos ........................................................................................... 52 3.4.2. Subclonagem do DNA Plasmidial do VORO ................................................................... 54 3.4.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) ...................................................... 56 3.4.4. Mutagênese Sítio Específica ............................................................................................ 57 3.4.5. Adição de Desoxiadenosina (DATP) no Produto de PCR e Clonagem T/A .................. 58 3.4.6. Digestão do DNA com Enzimas de Restrições ............................................................... 59 3.4.7. Eletroforese em Gel De Agarose...................................................................................... 59 3.4.8. Purificação do DNA em Gel de Agarose ......................................................................... 60 3.4.9. Desfosforilação do Plasmídeo Linearizado .................................................................... 60 3.4.10. Ligação dos Fragmentos de DNA .................................................................................. 60 3.5. INDUÇÃO DA FORMAÇÃO SINCICIAL EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM GLICOPROTEÍNAS DO VORO POR MUDANÇA DE PH. ................................................................................................ 61 3.6. TRANSFECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO MEDIADA POR LIPOSSOMO.................................. 61 3.7. TESTE DE LUCIFERASE .......................................................................................................... 61 3.8. TESTE DE MINIREPLICON ...................................................................................................... 62 3.9. SEQUENCIAMENTO ................................................................................................................. 62 3.10. EXTRAÇÃO DE RNA DE CULTIVOS CELULARES................................................................ 63 3.11. PREPARAÇÃO DO cDNA ....................................................................................................... 63 3.12. TRANSCRIÇÃO DO RNA IN VITRO ....................................................................................... 64 4. RESULTADOS................................................................................................................................. 66 4.1. ESTRATÉGIA DE CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO CONTENDO OS GENES L, M E S DO VORO............................................................................................................. 66 4.1.1. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene L ....................................... 66 4.1.2. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene M ...................................... 68 4.1.3. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene N e NSs ........................... 70 4.1.4. Construção do plasmídeo de expressão contendo apenas o gene N ......................... 72 4.1.5. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene NSs .................................. 75 4.2. CONSTRUÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO ...................................................................... 78 4.3. RECONSTITUIÇÃO IN VIVO DE RIBONUCLEOPROTEÍNAS RECOMBINANTES ................. 79 4.4. COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIREPLICON DO VORO ........................................................................................................ 80 4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA NUCLEOPROTEÍNA N DO VORO ............................................................................................................................................... 82 4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA POLIMERASE VIRAL L E COMPARAÇÃO DE DOIS DIFERENTES PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA N DO VORO ............................................................................................................................................... 87 4.6. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIGENOMA APÓS COTRANSFECÇÃO COM NOVOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS N E L DO VORO ............................................................................................................................................... 89 4.7. ANÁLISE DA ATIVIDADE DA REGIÃO CODIFICANTE DO SEGMENTO M DO VORO .......... 96 4.7.1. Atividade de distintos plasmídeos de expressão do segmento M no sistema de minireplicon do VORO ................................................................................................................ 96 4.7.2. Titulação da quantidade do plasmídeo de expressão do segmento M co-tranfectado com o sistema de minigenoma do VORO ................................................................................. 98 4.8. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO .............................................................................................................. 99 4.9. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS DO VORO POR IMUNOMARCAÇÃO ..................................... 103 4.10. ANÁLISE DA TRANSFECÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO COM O MINIGENOMA DO VBUN .............................................................................................................................................. 105 4.11. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO VBUN NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO E DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO VORO NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VBUN ................................................................................ 108 5. DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 110 6. CONCLUSÃO ................................................................................................................................ 123 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 124 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Distribuição geográfica dos principais vírus da família Bunyaviridae e doença associada .. 19 Figura 2- Representação do vírion do bunyavírus em seção transversal ............................................ 21 Figura 3- Estratégia de replicação dos segmentos dos genomas dos vírus da família Bunyaviridae.. 23 Figura 4- Estratégia de replicação dos bunyavírus.............................................................................. 30 Figura 5- Desenho esquemático do ciclo de transmissão do VORO. .................................................. 34 Figura 6- Organização genômica do vírus Oropouche. ....................................................................... 37 Figura 7- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. ............................................................................................................................................................. 55 Figura 8- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. ............................................................................................................................................................. 65 Figura 9- Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta fidelidade. ............................................ 66 Figura 10- Análise dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. ...................................... 67 Figura 11- Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 68 Figura 12- Análise dos plasmídeos de expressão pela incubação com enzimas de restrição ............ 69 Figura 13- Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 70 Figura 14- Screening dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. ................................. 71 Figura 15- Construção do plasmídeo de expressão da nucleoproteína N do VORO-pTM1-OROV-N. 72 Figura 16- Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 73 Figura 17- Screening dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição.. ..... 74 Figura 18- Construção do plasmídeo de expressão da proteína não estrutural NSs do VORO-pTM1OROV-NSs.. ......................................................................................................................................... 75 Figura 19- Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta fidelidade.. .................................... 76 Figura 20- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição.. ........... 77 Figura 21- Geração do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla. ............................................................ 78 Figura 22- Esquema e função do sistema de minireplicon do VORO.................................................. 79 Figura 23- Comparação da atividade do gene repórter entre dois sistemas de minireplicon distintos 81 Figura 24- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína N .................................... 83 Figura 25- Alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína N. ........... 84 Figura 26- Continuação da representação do alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína N. ................................................................................................................... 85 Figura 27- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína N do VORO. .................................... 86 Figura 28- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína L. .................................... 88 Figura 29- Análise da atividade de diferentes sistemas de minigenoma do VORO............................. 90 Figura 30 a-b- Alinhamento das sequências da região não codificante do terminal 3’ do segmento M do VORO.. ............................................................................................................................................ 91 Figura 31- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. ............................................................................................................................................. 93 Figura 32- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. ............................................................................................................................................. 94 Figura 33- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. ............................................................................................................................................. 95 Figura 34- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-M-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas ........................ 97 Figura 35- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando diluições seriadas do plasmídeo pTM1-OROV-M eleito pelo estudo ................................................... 98 Figura 36- Análise da atividade da região codificante do segmento S do VORO. ............................. 100 Figura 37- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas................... 101 Figura 38- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando as diluições seriadas do plasmídeo pTM1-OROV-NSs eleito pelo estudo ............................................. 102 Figura 39 a-d- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. ................................................................................................. 103 Figura 40 a-c- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. .................................................................................................................. 104 Figura 41- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. ................... 106 Figura 42- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. ................... 107 Figura 43- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína não estrutural NSs do VORO.. ...... 108 Figura 44- Efeitos da proteína não estrutural NSs.. ........................................................................... 109 LISTA DE QUADROS Quadro 1- Alguns dos membros mais conhecidos da família Bunyaviridae ........................................ 19 Quadro 2- Sistemas de recuperação para vírus de RNA segmentado de filamento negativo ............. 41 Quadro 3- Descrição dos plasmídeos utilizados e construídos para a realização do estudo em genética reversa do VORO .................................................................................................................. 49 Quadro 4- Oligonucleotídeos utilizados para construção do minireplicon do VORO ........................... 52 Quadro 5- Oligonucleotídeos desenhados para amplificação dos genes dos segmentos S, M e L. ... 54 Quadro 6- Reação padrão para o kit KOD hot start polymerase ........................................................ 56 Quadro 7- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR ............................................................. 56 Quadro 8- Reação padrão para o kit GoTaq DNA polymerase ........................................................... 57 Quadro 9- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR ............................................................. 57 Quadro 10- Reação padrão para realização da mutação sítio-específica: .......................................... 58 Quadro 11- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR para realização da mutação sítioespecífica: ............................................................................................................................................ 58 Quadro 12- Reação de adição de desoxiadenosina ............................................................................ 59 Quadro 13- Diferenças nucleotídicas na sequência dos plasmídeos pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-N (A) ........................................................................................................................................................ 92 14 RESUMO O desenvolvimento de sistemas de genética reversa para vírus de RNA de filamento negativo é um campo de pesquisa em constante crescimento e que vem proporcionando avanços nos estudos de diferentes aspectos do ciclo de vida dos vírus. O vírus Oropouche (VORO), família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é um agente infeccioso emergente que tem causado numerosas epidemias de “febre do Oropouche” no Brasil, Peru e Panamá. A “febre do Oropouche” constitui uma das arboviroses de maior importância em saúde pública na região Amazônica. No presente estudo, descrevemos o primeiro sistema de minigenoma para esse orthobunyavírus, como também os obstáculos que ainda existem para o desenvolvimento de tal sistema. Cinco plasmídeos suportes foram construídos que expressavam os genes das proteínas L, N, NSs e M do VORO inseridos no plasmídeo de expressão pTM1, além dos plasmídeos suportes que expressavam as proteínas L e N doados pelo Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha. A estrutura do minigenoma do VORO consistia nas regiões dos terminais 3’ e 5’ do gene do segmento M flanqueado pelo gene repórter codificante da proteína Renilla Luciferase e foi construído para analisar a eficácia dos quatro plasmídeos suportes, pTM1-OROV-L, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-S e pTM1-OROV-M, na replicação e transcrição do genoma viral. Após co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos suportes e o plasmídeo do minigenoma, a replicação do RNA do minireplicon foi avaliada pela determinação da atividade da luciferase. No sistema de minigenoma, a expressão do gene repórter foi detectada. Para elucidar a função da proteína não estrutural NSs do VORO, construiu-se o plasmídeo pTM1-OROV-NSs. A co-expressão da proteína NSs levou a diminuição da atividade da proteína repórter sem afetar a expressão do sistema controle. A proteína NSs de outro membro da família Bunyaviridae, vírus Bunyamwera (VBUN), também inibiu a atividade da Renilla no nosso sistema de minireplicon do VORO, ou seja, a proteína não estrutural NSs dos bunyavírus controla a atividade da polimerase viral por um mecanismo altamente conservado. Os resultados indicam que os plasmídeos suportes foram expressos e formam um complexo funcional de ribonucleoproteínas que direciona efetivamente a transcrição do RNA do minigenoma do VORO. 15 ABSTRACT The development of reverse genetics systems for negative-stranded RNA viruses is a rapidly evolving field that has greatly advanced the study of the many different aspects of the viral life cycle. Oropouche virus (OROV), family Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus, is an emergent infections agent which caused numerous epidemics of “Oropouche fever” in Brasil, Peru and Panamá. Oropouche fever is one of the arboviroses of major importance in health public of the Amazon region. Here, we describe the first successful minigenome system for OROV, as well as many of the obstacles that still exist in the development of such a system. We constructed five helper plasmids expressing the L, N, NSs and M genes of OROV inserted on the expression plasmid pTM1, in addition to the helper plasmids expression the L and N donated by Dr. Manfred, Gottigen University, Germany. The minigenome consisting of the 3’ trailer leader and 5’ trailer regions of the M segment of the OROV flanking a reporter gene encoding Renilla Luciferase was constructed to examine the efficacy of the four helper plasmids, pTM1-OROV-L, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-S, pTM1OROV-M, in viral genome replication and transcription. After co-transfection of BSRT7/5 cells with the helper plasmids and the minigenome plasmid, replication of minigenome RNA was evaluated by determining luciferase activity. In the minigenome system, expression of the reporter gene was detected. In order to elucidate the function of the non-structural protein of OROV, NSs, we constructed the helper plasmid, pTM1-OROV-NSs. The co-expression of NSs led to a decrease in reporter activity without affecting expression of controls. The NSs protein of other member of the Bunyaviridae family, Bunyamwera virus (BUNV), was also inhibitory in our system, in other words, thus, the bunyavirus NSs protein controls the activity of the viral polymerase by a highly conserved mechanism. Our results indicate that the helper plasmids were expressed ad can assemble into a functional ribonucleoprotein complex that effectively directs the transcription of minigenome RNA. 16 1. INTRODUÇÃO 1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS Os arbovírus são vírus ecologicamente distintos mantidos em natureza mediante ciclo biológico envolvendo, em geral, hospedeiros vertebrados primários não humanos e vetor artrópode primário (Gubler, 1996). Os vetores artrópodes de maior relevância para as arboviroses são os mosquitos (ex: Aedes), maruins (ex; Culicoides), moscas (ex: Phlebotominae) e carrapatos (ex: Ixodidae), pequenos marsupiais e aves são considerados os hospedeiros vertebrados de maior importância para o ciclo de manutenção dos arbovírus (Gubler, 1996; Mellor, 2000). A transmissão biológica dos arbovírus pode ser vertical e envolve a transmissão do vírus do vetor fêmea para ambos os descendentes, macho e fêmea. Já a transmissão horizontal pode ser venérea, de um macho infectado através da transmissão vertical para o vetor fêmea, como também, a transmissão pode ser oral de um vetor para um hospedeiro vertebrado através da saliva durante o repasto. O último tipo de transmissão horizontal é o mais comum para a maioria dos arbovírus e envolve a infecção do trato alimentar do vetor imediatamente após o repasto, disseminação do vírus no vetor e eventual replicação viral no intestino. Após replicação, os vírus são regurgitados (Weaver & Reisen, 2010). Os arbovírus têm uma distribuição mundial, porém, a maioria é encontrada em regiões tropicais, certamente por oferecerem fatores ecológicos mais favoráveis, tais como: temperatura, padrões de chuva, e abundância de vetores artrópodes e hospedeiros vertebrados (Karabatsos, 1985; Travassos da Rosa et al., 1997). Os arbovírus são agentes infecciosos emergentes e re-emergentes, dentre os quais, os vírus Chikungunya (VCHK), vírus Dengue (VDEN), vírus da Febre Amarela (VFA), vírus do Oeste do Nilo (VNO) e vírus Oropouche (VORO) constituem exemplos desses agentes virais. Apesar de não serem completamente conhecidos, vários fatores são responsáveis pela re-emergência desses vírus, como, distúrbios ambientais oriundos de atividades antropogênicas (Vasconcelos et al., 2001), mudanças climáticas que afetam a distribuição das populações dos vetores e hospedeiros (Weaver & Reisen, 2010), migração de humanos via transporte aéreo, 17 migração e comércio de animais (Pfeffer & Dobler, 2010) e mutações virais (Weaver & Barrett, 2004; Kuno & Chang, 2005). As principais manifestações clínicas causadas por arbovírus em humanos são: (1) doença febril, uma das mais comuns; (2) doença febril exantemática, inicialmente, caracterizada por febre elevada, cefaléia intensa, mialgias e artralgias, depois, o exantema (manifestação clínica na pele); (3) febre hemorrágica e (4) encefalites, causadas por diferentes arbovírus pertencentes às famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae, e geralmente associadas a elevada taxa de letalidade (Travassos da Rosa et al, 1997). O grupo dos arbovírus está incluído em cinco famílias: Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae e Rhabdoviridae (Travassos da Rosa et al., 1997). Os vírus dessas famílias são predominantemente vírus de ácido ribonucléico (RNA), segmentado ou não, com fita simples ou dupla, no entanto, um único gênero da família Orthomyxoviridae, vírus Thogoto, e um único vírus de ácido desoxirribonucleico (DNA) da família Asfarviridae, vírus da Febre Suína Africana, também são considerados arbovírus (Calisher & Karabatsos, 1988; Karabatsos, 1985; van Regenmortel et al., 2000). O fato dos arbovírus serem quase exclusivamente vírus de RNA pode ser explicado pela necessidade de uma significante plasticidade genética e taxas de mutações altas com o objetivo de sobreviver em ambientes dinâmicos (Weaver, 2006). A taxa de erro da ação da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) está estimada entre 10-3 a 10-5 erros/nucleotídeos/ciclos de replicação (Drake & Holland, 1999). Este fato em conjunto com os rápidos níveis de replicação viral, permite a ligeira distribuição geográfica e produção de variantes virais que pode ter uma vantagem na sobrevivência do vírus em diferentes tipos de hospedeiros (Ciota & Kramer, 2010). Com exceção da família Reoviridae, as demais famílias incluem vírus associados a doenças em humanos, como por exemplo, o vírus Mayaro e vírus Mucambo (família Togaviridae), VFA e VDEN (família Flaviviridae) e o VORO (família Bunyaviridae) (Travassos da Rosa et al., 1997; Travassos da Rosa et al., 1998). 18 1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE A família Bunyaviridae contém mais de 350 membros distribuídos mundialmente (a exceção do continente Antártico) (Fig. 1) e a maioria destes é transmitida por artrópodes com exceção dos hantavírus que são transmitidos pelo aerossol das excretas de roedores contaminados com esses vírus. Esta família foi reconhecida pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral em 1975, tendo sido nomeada de acordo com o vírus Bunyamwera (VBUN), o protótipo da família (Fauquet et al., 2005). Este vírus foi isolado originalmente a partir de um lote de mosquitos do gênero Aedes na floresta de Semliki, situada em Uganda, África, em 1943 (Smithburn et al., 1946). As principais características morfológicas e bioquímicas que incluem um vírus nesta família são: (1) os vírions são envelopados com partículas esféricas entre 80120 nm de diâmetro contendo RNA de filamento simples de sentido negativo ou ambisenso e tri-segmentado; (2) a replicação é restrita ao citoplasma; (3) e a montagem da partícula viral ocorre no Complexo de Golgi que leva a formação de uma bicamada lipídica que incorpora as duas glicoproteínas virais (Schmaljohn & Nichol, 2007). A família Bunyaviridae é constituída por cinco gêneros: Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus (Travassos da Rosa et al., 1997). As orthobunyaviroses, phleboviroses, nairoviroses e tospoviroses são transmitidas principalmente por mosquitos, phlebotomíneos, maruins e piolho de milho. Os vírus desta família infectam vertebrados com exceção das tospoviroses que infectam plantas (Fauquet et al., 2005). Vários membros dessa família, incluindo os vírus La Crosse (VLAC), vírus Hantaan (VHTN), vírus da Febre do Rift Valley (VFRV), vírus da Febre Hemorrágica do Crimean-Congo (VFHCC) e VORO, causam febre, meningite asséptica, encefalite ou febre hemorrágica em humanos (Elliott, 1997; Pinheiro et al., 1997) (Quadro 1), dessa forma, os bunyavírus são conhecidos como sério problema de saúde pública e alguns membros (Ex: VFRV e VFHCC) são considerados como potenciais agentes para ataques de bioterrorismo (Elliott, 1997). Os vírus da família Bunyaviridae também possuem importância econômica, pois podem comprometer a pecuária na África e Ásia (Ex: VFRV e VFHCC), e culturas agrícolas pelo mundo (algumas tospoviroses). 19 EncefaliteLa Crosse Crimean-Congo Febre do Oropouche Crimean-Congo Febre do Rift Valley FHV Encefalite Febre e erupção na pele Outros HFRS: Febre hemorrágica com síndrome renal HPS: Síndrome pulmonar por hantavírus SFTS: Síndrome por trombocitopenia com febre severa Figura 1- Distribuição geográfica dos principais vírus da família Bunyaviridae e doença associada. HFRS= Febre Hemorrágica com síndrome febril. HPS=Síndrome pulmonar hantavírus. SFTS= Febre servera com síndrome trombocitopenia. FHV= Febre Hemorrágica Viral. (Meltzer, 2012) Quadro 1- Alguns dos membros mais conhecidos da família Bunyaviridae Gênero/Vírus Orthobunyavirus vírus Akabane vírus La Crosse vírus Oropouche Phlebovirus vírus da Febre do Rift Valley Nairovirus vírus da Febre do Crimean Congo Hantavirus vírus Hantaan vírus Puumala vírus Sin Nombre Tospovirus vírus do Tomateiro Hospedeiro: Doença Vetor Distribuição Gado: Aborto e Defeitos congênitos Humanos: febre Humanos: doença febril Mosquito Mosquito Mosquito África, Ásia, Austrália América do Norte América do Sul Humanos: encefalite, febre hemorrágica. Ruminantes: aborto, hemorragia, hepatite necrótica. Mosquito África Humano: febre hemorrágica, fatalidade de 20-80%. Carrapato África, Leste Europeu, Ásia Humano: severa febre hemorrágica com síndrome renal, 5-15% de fatalidade. Humano: branda febre hemorrágica com síndrome renal, 0,1% de fatalidade. Humano: síndrome pulmonar, 40% de fatalidade. Camundongo do campo Leste Europeu Rato Oeste Europeu Camundongo América do Norte > 650 espécies de plantas Insetos Escala mundial 20 1.2.1. Estrutura dos vírus da família Bunyaviridae As partículas dos bunyavírus contêm projeções em suas superfícies, denominadas glicoproteínas com tamanhos entre 5 a 10 nm que são revestidas por uma bicamada lipídica de 5 a 7 nm de espessura (Schmaljohn & Nichol, 2007). As projeções, visualizadas no exterior da partícula, são em maioria formadas por duas glicoproteínas. O padrão de organização dessas glicoproteínas é diferente dentro dos bunyavírus. Os vírions do gênero Orthobunyavirus apresentam pequenas estruturas desorganizadas. A falta de organização também é observada nos vírions dos gêneros Nairovirus e Tospovirus. As projeções nas estruturas dos vírions do gênero Hantavirus contêm quatro heterodimêros organizadas na forma de grade, mas sem formar um padrão distinto (Huiskonen et al., 2010). Um padrão organizado na distribuição das glicoproteínas foi demonstrado apenas para vírions do gênero Phlebovirus. As glicoproteínas formam unidades de pacotes redondos organizados em uma simetria icosaédrica (Fig. 2) (Freiberg et al., 2008; Huiskonen et al., 2009). 1.2.2. Organização Genômica e Estratégia de Codificação 1.2.2.1. Estrutura do Genoma Viral O genoma dos bunyavírus é composto por RNA (ácido ribonucléico) trisegmentado (L [Large-Grande], M [Medium-Médio] e S [Small-Pequeno], denominados de acordo com o tamanho de nucleotídeos), fita simples e de polaridade negativa (Elliott, 1990, 1997). O tamanho de cada segmento varia entre os gêneros dessa família. O segmento L dos orthobunyavírus, hantavírus e phlebovírus é de aproximadamente 6,5 kb, sendo que para os tospovírus e nairovírus o tamanho do segmento L está em torno de 8,9 e 12,2 kb, respectivamente. Em relação ao segmento M, o menor tamanho observado foi para os hantavírus, 3,6 kb e o maior 4,8 kb para os tospovírus. Para o menor segmento, S, foi observado um tamanho de 1 kb nos orthobunyavírus, enquanto que para os segmentos S dos hantavírus, nairovírus e phlebovírus, o tamanho encontra-se na faixa de 1,7kb e para os tospovírus, 2,9 kb (Elliott & Blakqori, 2011). 21 As regiões codificantes são flaqueadas por regiões não codificantes (RNC) em que os tamanhos e as sequências variam entre os gêneros, mas em geral, a RNC do terminal 3’ é menor que a RNC do terminal 5’. Os nucleotídeos nas posições finais de ambos terminas 3’ e 5’ das RNC são conservados nos três segmentos para os vírus do mesmo gênero. As sequências dessas regiões conservadas são complementares e resultam em um pareamento de base complementar e não-covalente das extremidades formando uma estrutura em forma de “laço” (Obijeski et al., 1976; Hewlett et al., 1977). Cada complexo do segmento do genoma viral em conjunto com numerosas cópias de proteínas de nucleocapsídeos (N) e poucas cópias de RdRp formam complexos individuais chamados complexo ribonucleoprotéico. Pelo menos um de cada três nucleocapsídeos dos segmentos L, M e S devem ser empacotados em uma partícula viral para conferir infectividade ao vírion (Fig. 2) (Elliott, 2005). Ribonucleocapsídeos Envelope lipídico Carboidratos Gn & Gc Polimerase viral L Figura 2- Representação do vírion da família Bunyaviridade em seção transversal. A superfície contém duas glicoprotéinas, Gn e Gc. Os três nucleocapsídeos helicoidais são circulares e contém cada um único segmento de RNA (L, M e S). Fonte: Whitehouse, 2004, com modificações. 22 1.2.2.2. Estratégia de Codificação Todos os bunyavírus codificam quatro proteínas estruturais: a RdRp codificada do segmento L, as glicoproteínas do envelope viral, Gn e Gc, codificadas do segmento M e a proteína do nucleocapsídeo codificada a partir do segmento S. Alguns vírus dos gêneros Orthobunyavirus, Phlebovirus e Tospovirus também codificam duas proteínas não estruturais, NSm e NSs, advindas dos segmentos M e S, respectivamente, enquanto que alguns hantavírus codificam apenas a proteína não estrutural, NSs (Jääskeläinen et al., 2007; Vera-Otarola et al., 2011). O segmento L dos vírus de todos os gêneros da família Bunyaviridae codificam a proteína L no sentido negativo o qual é a RdRp. Até agora não há evidências de qualquer outra região codificante presente em RNA genômico ou antigenômico (Fig. 3) (Schmaljohn & Nichol, 2007). O segmento M codifica as duas glicoproteínas, Gn e Gc, no sentido negativo. Quando presente, a proteína não estrutural, NSm, é codificada em sentido negativo, com exceção dos tospovírus que codificam a proteína NSm no sentido ambisenso. Não há evidências da presença de uma região codificante para a proteína não estrutural NSm em vírus do gênero Hantavirus (Schmaljohn & Nichol, 2007). No caso dos phlebovírus, a proteína NSm está presente em mosquitos infectados com VFRV, mas ausente no vírus Uukuniemi (VUUK). A proteína NSm foi recentemente relatada para o nairovírus, VFHCC (Fig. 3) (Altamura et al., 2007). Os segmentos S dos nairovírus, alguns hantavírus e orthobunyavírus dentro dos sorogrupos Tete e Anopheles A e B codificam apenas a proteína N no sentido negativo, enquanto que vírus dentro do gênero Phlebovirus, Tospovirus e alguns Orthobunyavirus também codificam a proteína não estrutural NSs. Os orthobunyavírus e hantavírus codificam suas proteínas não estruturais, em uma região de leitura sobreposta em sentido negativo, mas os phlebovírus e tospovírus utilizam uma estratégia ambisensa e codificam suas proteínas não estruturais no sentido positivo do RNA (Fig. 3) (Schmaljohn & Nichol, 2007). 23 Segmento S Segmento M Segmento L Figura 3- Estratégia de replicação dos segmentos dos genomas dos vírus da família Bunyaviridae. Virus Taxonomy, 2012, com algumas modificações. 1.2.2.3. Estratégia de Codificação para o Segmento L As proteínas RdRp da família Bunyaviridae são codificados em sentido negativo e seus tamanhos variam entre 238 kDa para phlebovírus a 460 kDa para tospovírus. Pouca homologia é observada entre proteínas L de vírus pertencentes a gêneros diferentes, mas alinhamentos de sequências aminoacídicas do segmento L revelou a presença de motivos conservados entre gêneros (Aquino et al., 2003; Jin & Elliott, 1991; Müller et al., 1994; Reguera et al., 2010). Quatro domínios, identificados como “módulo polimerase” (Poch et al., 1989) estão presentes dentro da RdRp e foram denominados motivos de A a D. Dois motivos adicionais foram descritos para as polimerases dos bunyavírus e arenavírus. Um precedia o motivo A foi denominado pré-motivo A e o outro sucedia o motivo D foi denominado motivo E (Müller et al., 1994). Os diferentes módulos de polimerase estão localizados aproximadamente ao meio das polimerases dos bunyavírus e seu papel principal, a atividade da polimerase, foi demonstrado por mutagênese de aminoácidos conservados dentro desses motivos (Jin & Elliott, 1992). Jin et al, (1991; 1993), trabalhando com o vírus da Vaccinia Recombinante que expressava a proteína L do VBUN demonstrou que a proteína L foi capaz de 24 realizar tanto as atividades de transcriptase quanto de replicase, dessa forma, produzindo ambas espécies de genomas e antigenomas de ribonucleoproteínas transfectadas (Jin & Elliott, 1991; 1993). Jin & Elliott, 1993, demonstraram que a síntese de RNA de sentido positivo por proteínas L recombinantes continha sequências derivadas das células e do hospedeiro. Assim como os orthomyxovírus, as polimerases dos bunyavírus utilizam o mecanismo “cap snatching” para sintetizar seus RNAm (RNA mensageiro) (Dias et al., 2009). A localização da proteína L em células infectadas foi extensamente estudada para o VTUL utilizando-se a fusão da proteína verde fluorescente (green fluorescente protein-GFP) e para o VBUN e VFRV usando-se a técnica de introdução de epítopos V5 na região do terminal C de cada proteína (Brennan et al., 2011a; Kukkonen et al., 2004; Shi & Elliott, 2009). Em ambos os estudos, as proteínas L foram localizadas no citoplasma das células e formavam um padrão pontual na periferia do núcleo. Este padrão sugere que há associação com a estrutura da membrana intracelular. 1.2.2.4. Estratégia de Codificação para o Segmento M O segmento M tem como função sintetizar duas glicoproteínas do envelope viral. No passado, as glicoproteínas eram denominadas, G1 e G2, de acordo com o seus perfis de migração em gel SDS-PAGE, no entanto, ao notar-se que as funções das glicoproteínas em diferentes gêneros estavam mais relacionadas às suas posições dentro do segmento do que com os seus tamanhos, as gliocoproteínas foram renomeadas como Gn e Gc (Lappin et al., 1994). As duas glicoproteínas são traduzidas como um precursor de poliproteína e seus nomes, Gn e Gc, refletem suas posições dentro desses precursores tanto nos terminais amino quanto carboxi. Pouco se sabe sobre a clivagem do precursor de poliproteína, mas sugere-se que a clivagem ocorra em co-tradução, pois não há evidências da presença de uma proteína com tamanho total em células infectadas (Fazakerley et al., 1988). O mecanismo de clivagem é desconhecido para a maioria dos bunyavírus, mas para ambas as glicoproteínas foi descoberto que o mecanismo de clivagem é precedente por sinais de sequências que poderiam resultar em 25 clivagem por signalase da célula hospedeira (Fazakerley et al., 1988). Para o vírus Hantaan (VHTN), o motivo pentapeptídico, WAASA, precedente da proteína Gc foi identificado como sítio de clivagem (Löber et al.,2001). Após clivagem, os tamanhos das glicoproteínas variam entre 37 a 72 kDa, exceto para os vírus do gênero Orthobunyavirus que apresentam tamanhos entre as glicoproteínas claramente diferentes, com a proteína Gn apresentando um tamanho de 32 kDa e a proteína Gc apresentando um tamanho de aproximadamente de 110 kDa (Persson & Pettersson, 1991; Shi et al., 2005; Shi & Elliott, 2004). As glicoproteínas dos bunyavírus são proteínas de membrana classe I o que significa que seus terminais amino são expostos na superfície do vírion. As proteínas Gn e Gc de todos os bunyavírus são glicosiladas com resíduos asparagino. Além disso, o conteúdo de cisteína alcança uma porcentagem de 5%. Ambos os Nglicanos e ligações disulfetos formadas entre as cisteínas são importantes para o dobramento e tráfico das proteínas (Persson & Pettersson, 1991; Shi et al., 2005; Shi & Elliott, 2004). No retículo endoplasmático, as proteínas Gn e Gc formam heterodímeros que são transportados para o Golgi. O sinal de retenção ou alvo do Golgi foi estudado para o domínio trans-membrana da proteína Gn do VBUN e para a proteína Gc, foi observado que há necessidade da ação da chaperone sob a Gn para que a proteína Gc seja transferida ao Golgi (Shi et al., 2004). A marcação correta das glicoproteínas é crucial para a montagem e ligação, consequentemente para a infectividade do bunyavírus. Os produtos do gene do segmento M diferem entre os gêneros. Os hantavírus produzem apenas as proteínas Gn e Gc enquanto que alguns vírus dentro dos quatro gêneros restantes também codificam a proteína não estrutural NSm. A proteína NSm dos orthobunyavírus é originada da mesma proteína precursora que produz as proteínas Gn e Gc. Provavelmente, a clivagem da proteína precursora que gera a proteína NSm está relacionada à atuação de enzimas furinas e confere um resultado de proteínas com tamahos variando entre 11 a 14 kDa. O papel da proteína NSm dos orthobunyavírus durante infecção não é muito conhecido, mas foi sugerido que a região N-terminal tem um papel importante na montagem do vírion na membrana do Golgi (Shi et al., 2006). A proteína não estrutural NSm também é expressa do mesmo RNAm que as proteínas Gn e Gc em mosquitos infectados com phlebovírus VRVF, mas é ausente 26 em carrapatos infectados com phlebovírus, VUUK. Apesar de não ser bem caracterizado o papel da proteína não estrutural NSm durante a infecção dos bunyavírus, sabe-se que sua presença é dispensável para tal função, pois foi possível produzir um vírus recombinante que não possuía a proteína NSm em seu gene (Bird et al., 2008). O segmento M dos tospovírus usa uma estratégia ambisenso para codificar sua proteína NSm. Esta possui um tamanho aproximado de 34 kDa e há várias características de proteínas envolvidas na movimentação entre células infectadas. A proteínas NSm do vírus “Tomato spotted wilt” (VTWS) que é expressa no estágio prematuro da infecção pode ligar-se ao RNA e permite a movimentação dos vírus dentro das células (Li et al., 2009). 1.2.2.5. Estratégia de Codificação para o Segmento S Dentro da família Bunyaviridae, o tamando da proteína do nucleocapsídeo, N, varia entre 25 kDa para os orthobunyavírus, phlebovírus e tospovírus a 50 kDa para os hantavírus e nairovírus. Pouca homologia entre as sequências foi observada entre os vírus nos diferentes gêneros, mas as funções da proteína aparentemente são similares (Schmaljohn & Nichol, 2007). A nucleoproteína N é a proteína mais abundante encontrada em células infectadas e nos vírions. Essa abundância reflete seu importante papel na replicação dos bunyavírus, que é a proteção do genoma viral e do RNA anti-genômico contra a degradação através da formação das ribonucleoproteínas virais. Além disso, a proteína N possui a função de interagir com a polimerase viral, L e as glicoproteínas (Kaukinen et al., 2003). Para os VBUN, a deleção de porções dos domínios terminais N- e C- inibe a oligomerização da proteína N. Este fato sugere o modelo de multimerização “cabeça-cabeça” e “cauda-cauda” onde o oligômero é formado pela adição uma por uma da proteína N (Leonard et al., 2005). Ao contrário dos hantavírus, uma região central da proteína N do VBUN também pode estar envolvida na interação proteína N-proteína N (Eifan & Elliott, 2009). Em adição à interação protéica, a nucleoproteína N está envolvida na ligação do RNA. Para ambos os hantavírus e orthobunyavírus, a proteína N interage preferencialmente com o terminal 5’ do RNA (Osborne & Elliott, 2000; Severson et 27 al., 2001). Enquanto que o sítio de ligação do RNA do VHTN é localizado na região central da proteína (Severson et al., 2005; Xu et al., 2002). Estudos recentes com análise de mutagênese da proteína N mostraram o papel crítico aminoacídico na posição R94, como também, que aminoácidos na posição R40 e L50 facilitavam a ligação do RNA (Walter et al., 2011). Os membros dos gêneros Tospovirus e Phlebovirus, como também alguns membros dos gêneros Orthobunyavirus e Hantavirus produzem a proteína não estrutural NSs. Os vírus da família Bunyaviridae desenvolveram duas estratégias diferentes para codificar suas proteínas não estruturais NSs. Os orthobunyavírus e os hantavírus, ambos apresentam a proteína NSs com tamanho aproximado de 10 kDa, traduzem a proteína NSs na região codificante sobreposta do mesmo RNAm que a proteína N. Este mecanismo envolve o mecanismo de exploração livre pelos ribossomos no RNAm (Vera-Otarola et al., 2011). Já os phlebovírus e tospovírus, ambos apresentam a proteína NSs com tamanho aproximado de até 50 kDa, traduzem a proteína NSs em uma orientação ambisensa. A proteína não estrutural, NSs, do VRVF acumula-se no núcleo de células infectadas onde é formado estruturas filamentosas (Struthers & Swanepoel, 1982; Yadani et al., 2004). A proteína NSs dos hantavírus tem sido localizada no citoplasma, para o VTUL tem sido localizada em inclusões perinucleares (Virtanen et al.,2009), enquanto que para o vírus Andes (VAND), a proteína NSs foi localizada em grânulos distribuídos ao longo do citoplasma (Vera-Otarola et al., 2011). Análises de imunofluorescência com plasmídeos de expressão marcados com a proteína FLAG mostraram que a proteína NSs do VBUN poderia estar localizada no núcleo e na forma de inclusões citoplasmáticas (Thomas et al., 2004). Não foi observada alguma homologia na sequência da proteína NSs entre os gêneros da família Bunyaviridae e até mesmo dentro de um mesmo gênero, as sequências são pouco conservadas, no entanto, com o avanço da genética reversa, a análise funcional revelou que há papéis semelhantes. A proteína NSs nos distintos gêneros aparentemente contém proteínas multifuncionais envolvidas na replicação dos bunyavírus e na interação do vírus com a célula hospedeira. Na técnica do minireplicon, a ausência da proteína não estrutural NSs aumentou a atividade do gene repórter para ambos os vírus, VBUN e VLAC, enquanto que a superexpressão da proteína NSs inibe a atividade de minireplicon (Blakqori, 2003; Weber et al., 2001).Essa característica sugere que a proteína NSs possa ser conservada, ao 28 menos entre os orthobunyavírus, pois também foi observado o mesmo resultado para os vírus Guaroa (VGRO) e vírus Lumbo (Weber et al., 2001). Em adição, sugere-se que a proteína NSs tenha influência negativa na atividade da polimerase viral. A relevância deste efeito inibitório observado no sistema de minireplicon não é completamente entendida. A proteína NSs parece ser não essencial para replicação dos vírus em cultivo celular, pois foi observado que vírus recombinantes com a proteína NSs deletada, como VBUN, VLAC e vírus AkabaneI, VAKA, foram resgatados por sistema de recuperação de células infectadas (Weber et al., 2001). Vírus que não expressavam a proteína NSs foram atenuados em linhagens de células interferon competentes comparados aos vírus selvagens, logo, a proteína NSs foi identificada como sendo um fator virulento e antagonista do sistema de interferon (Blakqori et al., 2007). Estudo com a proteína NSs do VRVF mostraram que o clone 13, um isolado que contém uma grande e deletada região codificante da NSs, foi um inibidor da produção de interferon (Bouloy et al., 2001). O papel da proteína NSs durante a infecção do VRVF foi depois estudada usando o vírus recombinante que não continha a região codificante da proteína NSs (Billecocq et al., 2004; Bird et al., 2008). 1.2.3. Ciclo Replicativo dos vírus da família Bunyaviridae Os bunyavírus se ligam a célula hospedeira através das glicoproteínas (Fig. 4), no entanto, não se sabe quais são as estruturas celulares que são reconhecidas pelas glicoproteínas virais. A entrada dos bunyavírus nas células é mediada por fusão da glicoproteínas virais com a membrana celular dependente de pH e via o mecanismo de endocitose, fato observado para os VLAC e VORO (Jacoby et al., 1993; Santos et al., 2008). Quando as ribonucleoproteínas são liberadas no citoplasma, a polimerase viral L inicia a transcrição primária a partir do RNA viral (RNAv) encapsulado. A polimerase viral possui a atividade de endonuclease que permite a clivagem da estrutura 5’ cap do RNAm da célula hospedeira que em resposta é usado para começar a síntese de RNAm viral. Os bunyavírus necessitam de 10 a 18 de seus nucleotídeos dos RNAm situados no citoplasma que sofreram 29 “cap-snatching” para inicializar a replicação do genoma viral (Patterson et al., 1984). A remoção do terminal cap 5’ dos RNAm das células podem contribuir para a interrupção da síntese protéica da célula hospedeira (Raju et al., 1989). Como outros vírus de RNA de filamento negativo, a transcrição dos bunyavírus termina em sequências ricas em GU, mas a poliadenilação do RNAm não é observada (Bouloy et al., 1990). A transcrição primária originadas dos segmentos L e S são traduzidas em ribossomos livres no citoplasma o que leva a produção da polimerase viral, nucleoproteína e no caso dos orthobunyavírus, a proteína não estrutural, respectivamente (Schmaljohn & Nichol, 2007). O RNA cópia (RNAc) serve como modelo para transcrição ambisenso dos genes das proteínas não estruturais, NSm, para os tospovírus e NSs para os tospovírus e plebovírus. O RNAm primário do segmento M codifica a poliproteína precursora das glicoproteínas Gn, Gc e NSm. Esta última para os orthobunyavírus e plebovírus é traduzida no retículo endoplasmático (RE). A clivagem co-transducional leva a liberação das proteínas de membrana para o RE onde são N-glicosiladas em várias posições e formam heterodímeros que as translocam para o complexo de Golgi (Schmaljohn & Nichol, 2007). Novos vírions são formados em sítios da membrana do Golgi onde houve acumulação das glicoproteínas virais (Schmaljohn & Nichol, 2007). O progênio do vírus liga-se ao lúmen do Golgi e é liberado através de vias secretórias. Por serem vírus tri-segmentados, o rearranjo em células infetadas por dois vírus é possível e pode levar a origem de novas variantes virais com propriedades diferentes (Dunn et al., 1995; Gerrard et al., 2004). Este processo natural é chamado de “antigenic shift” e pode levar ao re-cap dos genes em laboratório (Cheng et al., 1999). 30 7. Liberação 1. Ligação Corpos de inclusão 2. Entrada 3. Transcrição Primária 5. Replicação 4. Tradução Montagem alternativa e liberação RE 6. Montagem Núcleo Figura 4- Estratégia de replicação dos bunyavírus. 1. Ligação via glicoproteínas. 2. Receptor mediado por endocitose. 3. Trasncrição primária. 4. Tradução das proteínas dos vírus. 5. Replicação e formação de novas ribonucleoproteínas. 6. Montagem na membrana do Golgi. 7. Liberaçao dos progênios virais. N= núcleo, RE= retículo endoplasmático, G= Golgi. Fonte: Whitehouse, 2004, modificado. 1.3. GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS O gênero Orthobunyavirus possui a maior quantidade de integrantes dentre os cinco gêneros da família Bunyaviridae, contendo mais de 170 vírus conhecidos (Elliott & Blakqori, 2011). Este gênero possui três características que os distinguem dos demais: (1) o padrão dos tamanhos dos 3 segmentos de RNA; (2) o padrão dos tamanhos das estruturas das proteínas virais e (3) a sequência consenso nos terminais 3’ e 5’ dos segmentos de RNA. Vários estudos sorológicos através de testes de fixação de complemento, neutralização e inibição de hemaglutinação agruparam os orthobunyavírus em 18 sorogrupos (Anopheles A, Anopheles B, Bakau, Bunyamwera, Bwamba, Grupo C, Capim, California, Gamboa, Guamá, Koongol, Minatitlan, Nyando, Olifanstlei, Patois, 31 Simbú, Tete e Turlock), cada sorogrupo contém vírus que são antigenicamente distintos, mas relacionados (Bishop, 1990; Calisher, 1996). O gênero Orthobunyavirus, assim como a família Bunyaviridae, tem como protótipo o VBUN. Este vírus tem sido isolado de humanos em várias regiões da África Subsahariana, sendo que a infecção por este pode levar a uma doença febril aguda. O VBUN foi o primeiro bunyavírus o qual o genoma completo foi sequenciado (Lees et al., 1986; Elliott, 1989a; 1989b) e foi o primeiro vírus de filamento negativo em que o vírus infeccioso foi recuperado por transfecção de células com clones de cDNA (Bridgen & Elliott, 1996). Na América do Norte, a principal causa de encefalite por arbovírus é resultado da infecção por dois membros do sorogrupo Califórnia, o VLAC que afeta crianças e o vírus Jamestown Canyon que causa, principalmente, doenças em adultos (McJunkin et al., 2001). O VLAC é transmitido essencialmente pelo mosquito Aedes triseriatus e os esquilos são seu hospedeiro natural. A infecção dos esquilos é assintomática, mas a viremia atinge títulos que são suficientes para infectar um mosquito ao se alimentar do animal. Após o repasto do sangue virêmico, as células epiteliais do mosquito são infectadas pelos vírus ingeridos (Beaty et al., 1982). Como resultado, as partículas virais são liberadas da lâmina basal e disseminada pelo corpo do mosquito. Entre os tecidos infectados, as glândulas salivares e os ovários possuem um papel determinante na distribuição do vírus e sua manutenção na natureza (Reese et al., 2010). A replicação nas glândulas salivares permite a transmissão do hospedeiro vertebrado durante a alimentação, enquanto que a replicação nos ovários resulta na transmissão do vírus do mosquito fêmea a sua progênie. Alguns vírus do gênero causam importantes doenças em bovinos, como o vírus Cache Valley (VCV), na América do Norte, vírus Schmalleberg (VSB) na Europa (Hoffmann et al., 2011) e os vírus Aino e VAKA na Austrália e na Ásia (Tsuda et al., 2004; Kim et al., 2011) são responsáveis por abortos e anormalidades congênitas em bovinos, carneiros e cabras. No Brasil, a febre do Oropouche, causada pelo VORO, é a segunda infecção por arbovírus mais comum logo após a febre do Dengue. O VORO é transmitido por picadas de culicóides e diferente de outros orthobunyavírus, a viremia em humanos é suficiente para infectar maruins após a picada em humanos infectados (Azevedo et al., 2007). 32 1.4. VÍRUS OROPOUCHE O VORO é um arbovírus, membro da família Bunyaviridae, por ter características inerentes a família, está incluído no grupo Simbu (Karabatsos, 1985), sendo pátogeno de uma doença febril aguda, a febre do Oropouche, muito parecida com Dengue e que tem acometido milhares de pessoas na Amazônia brasileira nos últimos 50 anos (Travassos da Rosa et al., 1997, Pinheiro et al, 2004, Vasconcelos et al., 2009). Sua principal característica é a capacidade de provocar epidemias em centros urbanos de áreas tropicais da América do Sul e América Central, sendo assim, constitui uma das arboviroses mais importantes para saúde pública na Amazônia, pois o número de casos de infecção pelo VORO é apenas superado pelo da VDEN (Borborema et al., 1982; Travassos da Rosa et al., 1997). Dentre suas características físico-químicas e biológicas, este arbovírus possui uma hemaglutinina ativa contra eritrócitos de gansos, a qual é obtida a partir do soro de hamsters infectados (Pinheiro, 1997). Em diversos cultivos celulares, tais como VERO (células de rim de macaco Cercophitecus aethiops), BHK-21 (células de rim de hamster) e embrião de galinha, causam efeito citopático (ECP) bem evidente (Pinheiro, 1981). Possui a capacidade de causar infecção letal em camundongos lactentes inoculados pelas vias intracerebral (i.c.) e intra-peritoneal (i.p.), com tropismo preferencial para o Sistema Nervoso Central (SNC) (Araújo, et al., 1986). De fato, em cérebro de camundongos albinos recém-nascidos inoculados com o VORO, foi encontrado um pequeno número de partículas virais no citoplasma de neurônios, mais particularmente, em cisternas dilatadas do retículo endoplasmático sem apresentar alterações perceptíveis no fígado (Araújo et al., 1986) desses animais. No entanto, a inoculação do VORO em hamsters adultos pelas vias i.c., i.p. ou subcutânea (s.c.), resultou em hepatotropismo (Dias, 1986). Atualmente são conhecidas quatro linhagens filogenéticas deste vírus denominadas de genótipos I, II, III e IV. O genótipo I é encontrado em Trinidad e predominantemente no Brasil. O genótipo II é encontrado no Peru e Brasil. O genótipo III encontra-se distribuído no Panamá e Brasil e o genótipo IV apenas no Brasil (Saeed et al., 2000; Nunes et al., 2005; Azevedo et al., 2007; Nunes et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009). 33 1.4.1 Ciclo de Transmissão O primeiro isolamento do VORO em artrópodes foi obtido a partir de lotes de Coquillettidia venezuelensis em Trinidad &Tobago, subseqüentemente foi isolado de Culex quinquefasciatus (espécie comumente encontrada em áreas urbanas na Amazônia) em 1961 e 1968, em Belém. Posteriormente o VORO foi isolado de Culicoides paraensis, popularmente chamado de maruím na região Amazônica brasileira (Robert et al., 1981). O VORO é mantido em natureza através de dois ciclos distintos: ciclo urbano e o ciclo silvestre (Pinheiro et al., 1981a). No ciclo urbano ou epidêmico, o vírus é transmitido de pessoa a pessoa através da picada do inseto Culicoides paraensis. Estudos demonstraram que esse inseto, após alimentar-se de pacientes virêmicos, foi capaz de transmitir o VORO para hamsters, após cinco ou mais dias após incubação (Pinheiro et al., 1982a). Este fato também foi observado na transmissão do VORO pela picada do vetor Culex quinquefasciatus aos hamsters, no entanto, eram necessários níveis virêmicos muito altos para que essa transmissão ocorresse (Pinheiro et al., 1981b). No ciclo silvestre, acredita-se que, as preguiças, primatas não-humanos e algumas espécies de aves sejam os hospedeiros vertebrados (Travassos da Rosa et al., 1997). Provavelmente, o homem é o vínculo entre esses dois ciclos, por adquirir a infecção em áreas epizoóticas e retornar ao setor urbano em fase virêmica, dessa forma, servindo de fonte de infecção para os maruíns (Pinheiro et al., 1981a; Nunes et al., 2005a). O vírus replica-se nos tecidos desses artrópodes que passam a infectar outros humanos. Além disso, pode ocorrer a transmissão de humanos para outros maruíns, levando a um ciclo de infecção que pode desencadear uma epidemia (Fig. 5) (Travassos da Rosa et al., 1997). 34 Ciclo Urbano Ciclo Silvestre Preguiça Aves Mosquito Mosquitos Homem Macaco Preguiça Mosquitos Maruíns Mosquitos Maruíns Maruoíns Homem Homem Figura 5- Desenho esquemático do ciclo de transmissão do VORO. Adaptado de Hervé., J.P et al., 1986. 1.4.2 Manifestações Clínicas Após um período de incubação, que costuma variar de três a oito dias (Dixon et al., 1981), foi observado na maior parte dos casos, uma síndrome febril aguda cujo período varia de três a seis dias de duração e é caracterizada por temperaturas elevadas (39º a 40ºC). De maneira geral, os pacientes podem apresentar as seguintes manifestações clínicas: calafrios, cefaléia, artralgia (Vasconcelos et al., 1989), anorexia, diarréia, tonturas e fotofobia (Borborema et al., 1982), calafrios, (Travassos da Rosa et al., 1997), astenia, dores musculares, vômitos e muito raramente se observa presença de exantema e mais raramente nistagmo (Pinheiro et al., 1997), atingindo ambos os gêneros de qualquer idade, com ligeiro predomínio do feminino (Pinheiro, 2004). Não se observa icterícia, hepato ou esplenomegalia e, ocasionalmente, constata-se a presença de linfonodos ingurgitados nas regiões submaxilar e occipital, embora, sua constatação possa não estar relacionada com a virose (Pinheiro et al., 1997). A intensidade das manifestações clínicas pode variar (Pinheiro et al., 1997) e costumam regredir após três a cinco dias, podendo ocorrer recorrência dos sintomas após o término de quadro febril. Não se tem registro de óbito ou seqüela grave causado pelo VORO (Pinheiro et al., 1997; Pinheiro et al, 2004). 35 1.4.3 Epidemiologia Após o primeiro isolamento do VORO no ano de 1955, o vírus só foi novamente detectado em 1960, no Estado do Pará (Brasil) em amostras de sangue de um espécime de bicho preguiça, Bradypus tridactylus, capturada em uma área silvestre, durante a construção da rodovia Belém-Brasília, bem como, a partir de mosquitos Oschlerotus serratus capturados próximo a área da construção (Pinheiro et al., 1961). Em 1961, houve uma grande epidemia da febre do Oropouche, na cidade de Belém, Pará, Brasil, onde mais de onze mil pessoas foram infectadas pelo VORO (Pinheiro et al., 1962). A maioria das epidemias ocorreu no Estado do Pará, sendo somente a partir dos anos de 1980 e 1981 que foram registrados casos de febre do Oropouche fora do território paraense, quando ocorreram epidemias em Manaus e Barcelos (Estado do Amazonas) e em Mazagão, antigo território Federal do Amapá. Posteriormente, em 1988, foram registrados casos nos Estados do Maranhão e Goiás (Vasconcelos et al., 1989). Nos anos 1980, vestígios da presença do VORO, em centros urbanos mais afastados da Região Amazônica, foram observados a partir do teste de inibição de hemaglutinação para o VORO, em dois moradores do município de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo (Figueiredo, 1999). A febre do Oropouche tem se manifestado com uma abrangência com epidemias de grande magnitude, como as que ocorreram nas cidades de Ariquemes e Ouro Preto D'Oeste, no Estado de Rondônia (Travassos da Rosa et al., 1996). Recentemente, após mais de 20 anos sem alguma evidência epidemiológica, surtos de febre do Oropouche foram observados nos anos de 2003 e 2004, nos municípios paraenses de Parauapebas e Porto de Moz e em 2006, nos municípios paraenses de Maracanã, Igarapé-Açu, Magalhães Barata e Viseu (Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009). Essa dispersão viral acometeu populações de Trinidad & Tobago (Anderson et al.,1961) e Peru (Baisley et al., 1998) mostrando uma evolução históricogeográfica de amplificação do raio de propagação de epidemias. A evolução desse quadro de dispersão parece necessitar de mecanismos intermediários de transferências entre hospedeiros, como primatas não-humanos que desenvolveram imunidade para o VORO sugestivo de que o vírus está presente, muito embora não 36 gere sinais clínicos correspondentes, caso particular ocorrido na Colômbia (Pinheiro et al., 1997), mas, que não resultou em nenhum registro de evolução clínica da doença em humanos. Finalmente, foi estimado que pelo menos 356.413 pessoas no mundo foram acometidas por este arbovírus desde 1961 (Pinheiro et al., 1997), embora atualmente tenha sido sugerido que pelo menos 500.000 pessoas foram infectadas pelo VORO (Pinheiro et al., 2004, Vasconcelos et al., 2009). 1.4.4. Diagnóstico Laboratorial O diagnóstico da febre do Oropouche, assim como de outras arboviroses, é realizado por meio de provas laboratoriais específicas para a virose. A comprovação da virose é realizada com o isolamento do vírus a partir do sangue dos pacientes ou através do uso de testes sorológicos específicos para a infecção (Pinheiro et al, 1981). Para que seja efetuado o isolamento do vírus, as amostras de sangue devem ser colhidas até o quinto ou sexto dia da doença, entretanto, o material coletado nos dois primeiros dias é o mais indicado para análise, pois nesse período a viremia provavelmente se faz presente em 100% dos casos (Pinheiro et al., 1997). O vírus pode ser isolado mediante a inoculação do sangue pelas vias i.c. e i.p. em camundongos lactentes ou em hamsters jovens, estes últimos também pela via s.c.. O isolamento também pode ser obtido utilizando-se cultivos celulares, tais como VERO ou BHK-21. A identificação do vírus é efetuada por meio do teste de fixação do complemento (FC) ou do teste de neutralização (TN), utilizando anti-soro ou fluido ascítico específico para o vírus. O diagnóstico sorológico é efetuado com a comprovação de viragem sorológica em amostras pareadas de soro colhidas nas fases agudas e de convalescença da virose; para este fim, as técnicas de inibição de hemaglutinação, FC ou TN podem ser utilizadas (Pinheiro et al., 1997). O teste imunoenzimático (Mac ELISA) para detecção de anticorpos IgM, RT-PCR (Moreli et al., 2001) e RT-PCR em tempo real (Weidmann et al., 2003) para detecção do genoma viral são métodos bastante sensíveis e específicos que podem ser utilizados com sucesso para o rápido diagnóstico das infecções causadas pelo VORO. 37 1.4.5 Organização Genômica O genoma do VORO, assim como os demais orthobunyavírus, é constituído por três moléculas de RNA fita simples, polaridade negativa, denominados SRNA, MRNA e LRNA correspondentes aos segmentos pequeno, médio e grande, respectivamente (Fauquet et al., 2005). Em relação aos seus tamanhos, há variações em cada segmento sendo, o SRNA constituído por 754 nucleotídeos (nts) e os segmentos M e L constituídos por 4.385 e 6.846 nts, respectivamente (Saeed et al., 2000; Aquino et al., 2003; Aquino et al., 2004). Estes segmentos são responsáveis pela codificação de seis proteínas: a proteína de nucleocapsídeo (N) e a proteína não estrutural NSs são codificadas pelo segmento SRNA ao longo de duas CALs (cadeia de leitura aberta) (Saeed et al., 2000). As duas glicoproteínas de superfície (Gn e Gc) e uma proteína não estrutural NSm são codificadas pelo segmento MRNA ao longo de uma única CAL, assim como a proteína L (RdRp) codificada pelo segmento LRNA (Fauquet et al., 2005) (Fig. 6). Apesar dos grandes avanços moleculares no que tange o sequenciamento nucleotídico de diferentes cepas do VORO, o que culminou na caracterização dos quatro genótipos (I, II, III e IV) circulantes nas Américas do Sul e Central (Saeed et al,, 2000; Nunes et al., 2005; Azevedo et al., 2007; Nunes et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009), pouco se sabe a respeito dos mecanismos de replicação e empacotamento viral. Figura 6- Organização genômica do vírus Oropouche. Fonte: Adaptado de Fauquet et al., 2005. 1.5. GENÉTICA REVERSA 38 1.5.1. Genética Reversa de vírus de filamento negativo Na genética clássica, as pesquisas têm como objetivo a busca de genes que são responsáveis por determinar um genótipo específico. A genética reversa corresponde ao objetivo contrário: verificar a função de um gene específico modificando-o por processo mutagênico indutivo para análise dos efeitos fenotípicos. Mais especificamente na virologia molecular, a genética reversa refere-se à geração de um vírus infeccioso a partir de um cDNA clonado, dessa forma, esta técnica permite várias possibilidades de manipulação dos genomas virais permitindo estudos básicos de uma simples proteína e sequências regulatórias até a identificação de fatores de virulência e geração de vacinas de vírus atenuados (Neumann et al., 2002). Os sistemas de genética reversa utilizam a tecnologia de DNA recombinante para introduzir alvos com modificações genéticas que podem ser posteriormente estudados in vivo ou in vitro, assim sugerindo uma ligação entre um fenótipo observado e modificações genéticas (Kawaoka, 2004). Atualmente, existem três diferentes métodos para estudar os vírus de RNA de filamentos negativos usando a genética reversa. Primeiro, o sistema de minireplicon ou minigenoma consiste no genoma de um vírus similar ao vírus selvagem flanqueado em regiões regulatórios do vírus o qual é co-transfectado em cultivo celular com plasmídeos que expressam as proteínas virais necessárias à replicação. Segundo, o método de Partículas Semelhantes a Vírus- “Virus Like Particle” (VLP) que é a extensão do sistema de minireplicon, com a adição de plasmídeos que expressam glicoproteínas virais que permitem o empacotamento e transferência do gene repórter. Terceiro, o sistema de recuperação que gera partículas virais infecciosas que contém modificações genéticas específicas (Elliott & Blakqori, 2011). A recuperação de partículas virais infecciosas é obtida de forma mais fácil para vírus de RNA de filamento positivo do que para vírus de RNA de filamento negativo, pois a transfecção do cDNA é suficiente para alcançar a expressão do genoma viral devido o RNAm dos vírus de RNA de filamento positivo ser funcional,dessa forma, infeccioso. O primeiro vírus de RNA, o bacteriófago Q, teve seu cDNA transfectado em E.coli (Taniguchi et al., 1978). Anos depois, o poliovírus 39 foi recuperado por transfecção em células de mamíferos com plasmídeos que continham a cópia do cDNA do genoma viral (Racaniello & Baltimore, 1981). A recuperação de vírus de RNA de filamento negativo parece ser mais complicada, pois nem o genoma e nem o antigenoma viral são suficientes se obter a replicação viral, ou seja, não são infecciosos. A estrutura mínima necessária para esse objetivo é a ribonucleoproteína intacta formada pelo RNA genômico ou antigenômico encapsulado em conjunto com a RdRp. O primeiro passo para se obter o sistema de recuperação de vírus de RNA de filamento negativo foi realizado por Luytjes et al em 1989, quando eles reconstituíram com sucesso as ribonucleoproteínas do vírus influenza in vitro. O grupo utilizou um minigenoma que consistia na presença do gene da proteína CAT (chloramphenicol acetyltransferase) no sentido negativo flanqueado pela região não codificante do gene NS do vírus Influenza A o qual foi transcrito in vitro. As ribonucleoproteínas foram construídas por combinação das proteínas virais, NP, PA, PB1 e PB2 que foram posteriormente transfectadas em células que estavam infectadas com um vírus acessório. Neste sistema, o gene repórter foi amplificado, expresso e empacotado em partículas virais. Apesar do sucesso, somente após 10 anos que o primeiro vírus Influenza foi recuperado inteiramente do cDNA (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999). Um vírus da raiva foi o primeiro vírus não segmentado que foi recuperado com sucesso a partir do cDNA e este sucesso estava relacionado a novas técnicas implementadas na área de genética reversa, entre elas, a transfecção de plasmídeos que contem o genoma viral no sentido positivo, ou seja, o antigenoma (Schnell et al., 1994). Utilizando-se dessa inovação para o vírus da Raiva, outros grupos conseguiram com sucesso a recuperação de distintos vírus não segmentados, como o vírus da Estomatite Vesicular (VSV) (Whelan et al., 1995) e o vírus Sendai (Garcin et al., 1995). Schnell e colaboradores em 1994, utilizaram o promotor T7 para promover a transcrição do genoma viral do cDNA pela RNA polimerase dependente de DNA do bacteriófago T7 (T7RNAP). A T7RNAP pode ser expressa em larga escala de linhagens celulares e não apenas em células de mamíferos e, esta enzima está localizada no citoplasma onde a maioria dos vírus de filamento negativo se replica, no entanto, a T7RNAP deve ser fornecida na forma trans, para isso, deve ser utilizado tanto um vírus Vaccinia Recombinate, um plasmídeo de expressão ou uma linhagem celular transgênica que expressa constitutivamente esta enzima. O uso do 40 T7RNAP tem suas limitações, pois o início da transcrição é mais eficiente em amostras que contem seu genoma começando com uma guanosina (G) e o término da transcrição não é preciso (Milligan et al., 1987; Kuzmine et al., 2003). A adição de uma guanosina extra no final 5’ da amostra viral garante um maior nível transcricional, mas pode resultar em um menor reconhecimento pela polimerase viral. Como os genomas dos bunyavírus começam com adenosina (A) ou Uracila (U), os transcritos possuem, geralmente, um ou dois nucleotídeos G adicionais para garantir altos níveis transcricionais. Apesar de haver tolerância na presença de nucleotídeos extras em alguns sistemas de recuperação, eles podem diminuir o reconhecimento pela polimerase viral ou pela nucleoproteína e possivelmente dificultar o sistema de recuperação para alguns bunyavírus. Este problema pode ser superado por cortes pós transcricional de ribozimas para se obter terminais 5’ e 3’ autênticos (Elliott & Blakqori, 2011). A RNA-polimerase I dependente de DNA (RNAPI) pode alcançar uma transcrição mais precisa, mas suas sequências promotoras são espécie específica, restrigindo assim, a escolha de linhagens celulares, além disso, a RNAPI está localizada no núcleo. Essa localização nuclear pode ter um impacto nas modificações pós-transcricionais do transcrito viral (Neumann et al., 1999). O número de sistemas de recuperação para os bunyavírus ainda é muito limitado. As dificuldades advêm do número de plasmídeos que devem ser transfectados nas células, assim como, na padronização da quantidade correta de cada plasmídeo que deve ser transfectado e que levará a reprodução de uma infecção viral em célula. A construção do VBUN partir de clone de cDNA por Bridgen & Elliott em 1996 foi o primeiro sistema de recuperação realizado para qualquer vírus de RNA tri-segmentado de filamento negativo. O sistema construído necessitava de seis plasmídeos, três plasmídeos genômicos e três plasmídeos suporte para conseguir a recuperação do vírus, no entanto, após alguns anos, Lowen e colaboradores, em 2004, desenvolveram um sistema de recuperação em que era utilizado apenas três plasmídeos genômicos. Anos mais tarde, um sistema completamente diferente, utilizando-se a RNAPI e RNAPII foi utilizado para recuperar vírus Influenza de cDNA. O cDNA de cada segmento viral foi clonado sob o controle do promotor RNAPI humano, enquanto que, os plasmídeos de expressão para as três subunidades da polimerase viral e a nucleoproteína foram clonados sob o promotor RNAPII (Fodor et al., 1999; Neumann 41 et al.,1999). O grupo de Neumann utilizou um terminador RNAPI de camundongo enquanto que o grupo de Fodor utilizou como terminador a ribozima do vírus da Hepatite Delta. O sistema de recuperação de doze plasmídeos foi depois reduzido para oito plasmídeos, por Hoffman e colaboradores, em 2000. Para conseguir o sistema de recuperação do vírus Influenza com apenas oito plasmídeos transfectados, um sistema de transcrição bidirecional, pol I-pol II foi construído. O cDNA viral foi inserido no sentido negativo entre o promotor RNAPI e a sequência terminal, depois este cassete foi inserido no sentido positivo entre os promotores RNAPII e a calda sinalizadora poli (A), dessa forma, ambos o RNAm e o RNA genômico foram transcritos do mesmo plasmídeo (Hoffmann & Webster, 2000). Abaixo segue um quadro demonstrando diferentes sistemas de recuperação para vírus de RNA segmentado de filamento negativo (Quadro 2). Quadro 2- Sistemas de recuperação para vírus de RNA segmentado de filamento negativo Vírus Sistema Proteína fornecidas em Referência Promotor trans Bunyamwera T7RNAP L, N, Gn e Gc La Crosse T7RNAP nenhuma nenhuma Influenza A hRNAPI CMV hRNAPIhRNAPII Influenza B hRNAPIhRNAPII Coriomeningite T7RNAP linfocítica hRNAPII T7RNAP Rift Valley T7RNAP mRNAPI T7RNAP Akabane mRNAPI CMV Lassa T7RNAP Junin RNAPI RNAPII Schmallenberg T7RNAP PA, PB1, PB2 e NP (Bridgen & Elliott, 1996) (Lowen et al., 2004) (Blakqori & Weber, 2005) (Fodor et al.,1999) nenhuma (Neumann et al., 1999) (Hoffmann, 2002) L, NP e GP (Sanchez, 2006) L, N, Gn e Gc LeN (Ikegami et al., 2006) (Billecocq et al., 2008) nenhuma L, N, Gn e Gc (Bird et al., 2008) (Ogawa et al., 2007) nenhuma LeN (Albarino et al., 2011) (Emonet et al., 2011) nenhuma (Elliott et al., 2012) nenhuma 42 1.5.2. Genética Reversa dos Bunyavírus e suas aplicações 1.5.2.1. Sistema de Minireplicon ou Minigenoma O sistema de minigenoma ou minireplicon é caracterizado por um gene repórter (ex. gene da proteína verde fluorescente - GFP; clorafenicol acetiltransferase -CAT; ou luciferase) clonado entre as regiões terminais 3’ e 5’ não codificantes. O sistema de minigenoma pode ser transcrito e replicado pela coexpressão com as proteínas virais (Elliott & Blakqori, 2011). A vantagem da utilização da GFP como marcador biológico está no fato de a fluorescência desta proteína não necessitar de um co-fator ou nenhum outro substrato. O cromóforo da GFP é formado pela ciclização pós-traducional e oxidação de um tripeptídeo codificado. Além disso, como não há necessidade de permeabilização para entrada e fixação do substrato com a finalidade de localizar a GFP, proteínas, organelas e células marcadas com esta proteína podem ser analisadas em tecido vivo (Shimomura, 2006). A enzima clorafenicol acetiltransferase é codificada pelo gene CAT e confere resistência ao clorafenicol a vários tipos de bactérias. A luciferase é uma enzima que catalisa a conversão de um substrato a um produto com a produção concomitante de luz que pode facilmente ser medida. Há dois tipos principais de luciferase: Firefly Luciferase e Renilla luciferase derivadas dos organismos Photinus pyralis e Renilla reniformis, respectivamente (Avison, 2007). O sistema de minireplicon foi estabelecido para os orthobunyavírus, VBUN, VLAC e VAKA (Blakqori, 2003; Dunn et al., 1995; Ogawa et al., 2007). Tanto a utilização da RNAPI para o VLAC quanto o uso da T7RNAP para o VBUN garantem a transcrição de um antigenoma semelhante ao do vírus. No sistema de minigenoma do VBUN, o cDNA semelhante ao do vírus contém a região codificante de um gene repórter, CAT ou Renilla Luciferase, flanqueada pela região não codificante do vírus. Este minireplicon fica sobre o controle das sequências da região promotora e terminal da T7RNAP e, a sequência da ribozima da hepatite localizada abaixo da região não codificante do terminal 3’ do VBUN garante a exata sequência terminal do vírus (Bridgen & Elliott, 1996). Os plasmídeos que expressam proteínas (ou plasmídeos suportes) contem a região codificante viral sob controle do promotor T7RNAP e permite a expressão de proteínas virais que são necessárias para transcrição e replicação viral. Em todos os sistemas, a expressão do gene repórter 43 requer a presença da nucleoproteína N e da polimerase viral L, o que confirma o conceito que somente as ribonucleoproteínas e não o RNA sozinho serve como modelo para transcrição e replicação da polimerase. Além disso, a adição da proteína NSs no sistema de minireplicon possui um efeito inibitório na expressão do gene repórter (Weber et al., 2001; Blakqori, 2003). O desenvolvimento do sistema de minigenoma para hantavírus e para nairovírus provou ser mais difícil para ser desenvolvido devido ao alto “background” da atividade do gene repórter (Flick et al., 2003; Zhang et al., 2008; Bergeron et al., 2009). O sistema de minireplicon é um passo essencial para o sucesso na construção de um sistema de recuperação de um vírus infeccioso a partir do cDNA do vírus. Esse sistema também é uma ferramenta importante para estudar atividade e conhecer o papel da nucleoproteína N e da polimerase viral L. 1.5.2.2. “Virus Like Particle” (VLP) O sistema de VLP é uma extensão do sistema de minireplicon com a diferença que há adição de plasmídeos que expressam as glicoproteínas Gn e Gc, o genoma de minigenoma pode ser empacotado em uma partícula infecciosa semelhante ao vírus. Os VLPs podem infectar novas células, mas não conseguem proliferar ou produzir progênios de vírus. Na transfecção inicial, os genomas do plasmídeos que expressam as proteínas dos segmentos L e N são fornecidos, mas as glicoproteínas são fornecidas apenas como plasmídeos de expressão. Os VLPs têm sido usados para o estudo do empacotamento do genoma viral tanto a nível protéico quanto a nível genômico (Overby et al., 2006; Shi et al., 2007; Eifan & Elliott, 2009; Shi et al., 2009). Interessante notar que os VLPs purificados do phlebovírus Rift Valley iniciam uma reposta imune protetora em camundongos (Näslund et al., 2009). Esse tipo de proteção ainda não foi observado para membros do gênero Orthobunyavirus. 44 1.5.2.3. Sistema de Recuperação O sistema de recuperação (rescue system) tem como base a capacidade dos vírus infecciosos serem recuperados de células transfectadas com um determinado cDNA (codificador do gene alvo) (Elliott & Blakqori, 2011). O primeiro sistema de recuperação para um bunyavírus, VBUN, requeria muito tempo e era ineficiente. Neste procedimento, as células HeLa eram primeiramente infectadas com um vírus Vaccinia Recombinante que expressava T7RNAP no citoplasma celular. Em seguida, as células eram transfectadas com três plasmídeos suportes que codificavam todas as proteínas do VBUN. Após incubação, outros três plasmídeos, estes codificavam os segmentos completos L, M e S no sentido antigenômico, eram transfectados. Estes plasmídeos eram semelhantes ao minigenoma, descrito anteriormente, com a região codificante do vírus substituída pela sequência do gene repórter. Para isolar o VBUN do vírus da Vaccinia Recombinante, o sobrenadante das células transfectadas sofria passagens para células C6/36, em que o vírus da vaccínia não se replica, sendo assim, o VBUN liberado era purificado em placa em células BHK-21. O procedimento continha uma média de 10 a 100 placas por 107 de células transfectadas (Bridgen & Elliott, 1996). A eficiência do sistema de recuperação foi aprimorada. O primeiro passo para esse melhoramento foi a criação de uma célula derivada de BHK que expressa constitutivamente a T7RNAP, a células BSR-T7/5 (Buchhol et al., 1999). O sistema foi então simplificado pela redução do número de plasmídeos transfectados na célula, de seis para três plasmídeos, usando-se apenas plasmídeos suportes que expressavam as proteínas N e L (Lowen et al.,2004). O sistema de recuperação baseado em três plasmídeos e com a utilização do T7RNAP foi utilizado com sucesso para os VLAC e o VRVF (Blakqori & Weber, 2005; Ikegami et al., 2006). Curiosamente, para o VLAC, a adição de plasmídeos suporte na mistura do transfectado eliminou a recuperação do vírus. O sistema de recuperação por RNAPI do VAKA requer a transfecção de plasmídeos suportes para as proteínas N e L (Ogawa et al., 2007). A necessidade de transfecção de cinco plasmídeos também foi observada para o VRVF quando usado o promotor da RNAPI (Billecocq et al., 2008). A razão para estas diferenças não está completamente elucidada, mas pode explicar diferentes níveis transcricionais entre as enzimas T7RNAP e do RNAPI. 45 A genética reversa é uma ferramenta importante para estudar a função gênica e a replicação dos bunyavírus. Esta tecnologia tem sido usada para caracterizar o papel da proteína NSs durante o ciclo replicativo de vários vírus incluindo o VBUN, VRFV e o VLAC (Streitenfeld et al., 2003; Weber et al., 2002; Billecocq et al., 2004; Blakqori et al., 2007). O papel da outra proteína não estrutural, NSm, na apoptose e na montagem do vírus tem sido estudado usando o VRVF e o VBUN geneticamente modificados, respectivamente (Won et al., 2007; Shi et al., 2006). A facilidade para manipular o genoma viral também permitiu a fusão de marcadores, como o marcador V5 ou a proteína fluorescente eGFP, em diferentes proteínas virais. Além disso, a localização celular de proteínas virais pode ser definida utilizando-se microscópio confocal (Brennan et al., 2011; Shi & Elliott, 2009) ou imagem de células in vivo (Shi et al., 2010). A manipulação das RNC resulta em vírus atenuados tanto em células quando em camundongos, no entanto, mais estudos devem ser feitos para melhor compreensão do potencial desses vírus como unidades para fabricação de vacinas (Lowen et al., 2005), como o estudo com o VRVF recombinante que não continha as regiões codificantes das proteínas não estruturais, NSm e NSs, e foi observado que esse vírus recombinante conferia imunidade em camundongos e em ovelhas após inoculação com esse vírus recombinante (Bird et al., 2012; Bird et al., 2008). Recentemente, a genética reversa tem sido usada para construir vírus atenuados que possam atuar como potenciais unidades de vacinas. 46 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Desenvolver um sistema de genética reversa para o vírus Oropouche. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Construir o sistema de minireplicon para VORO. - Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo segmento S (N e NSs) do VORO in vitro. - Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo segmento M (Gn, Gc e NSm) do VORO in vitro. - Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo segmento L (L) do VORO in vitro. -Investigar o papel da proteína não-estrutural NSs na replicação do VORO em cultivos celulares. 47 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. CULTIVO CELULAR E PROPAGAÇÃO DO VÍRUS 3.1.1. Cultivos de células BSR-T7/5 As células BSR-T7/5 são oriundas de cultivos de células BHK-21 transgênicas que expressam constitutivamente o fago RNA polimerase T7. Estas células foram gentilmente doadas por Klaus Conzelmann (Conzelmann, K.K, et al., 1999). As monocamadas celulares foram mantidas em garrafas de cultivos celulares de tamanho médio (75 cm2), grande (125 cm2) ou placas de cultivos de seis ou doze poços contendo meio “Dulbecco´s modified Eagle´s medium” (DMEM-) com 10% de NaHCO3, 100 mM de piruvato de sódio, 250 mM de glutamina e 1 M de NaOH suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) e antibióticos (50 E/mL de penicilina e 50 µg/Ml de estreptomicina. Além disso, foi adicionado ao meio celular 1 µg/mL do antibiótico seletivo geneticina (G418-Life Technologies). As células foram incubadas a 37ºC na presença de 5% de CO2. A passagem de células foi realizada regularmente utilizando-se Tripsina/EDTA, no entanto, antes da tripsinização, a monocamada celular foi lavada com tampão fosfato (PBS) com volume de 3 mL ou 5 mL para as garrafas médias ou grandes, respectivamente. Após adição da tripsina, os cultivos foram incubados por até 20 minutos para dissociar as células das superfícies das garrafas. Para remoção da Tripsina/EDTA, a mistura foi centrifugada por 3000 rpm, 5 minutos. O “pellet” celular foi ressuspendido em um novo meio DMEM suplementado com SBF e 1/8 das células foram transferidas para uma nova garrafa. 3.1.2. Preparação de Estoque Viral Para preparar o estoque do VORO, células BHK-21 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 até atingirem 70% de confluência. Em seguida, lavadas com PBS para retirar resquícios na monocamada celular de SBF. As células foram infectadas com VORO a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 por 1 hora a 37ºC e 5% de CO2. O meio foi trocado por meio DMEM contendo 10% de SBF e as células 48 foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 por 48 a 72 horas, até a observação do ECP. Os sobrenadantes foram coletados em tubos Falcon de 50 mL (Becton Dickinson) e centrifugados por 3000 rpm a 4ºC para remoção de debris celulares. Alíquotas do estoque viral foram estocadas a -70ºC. 3.1.3. Infecção viral A infecção do VORO a determinados MOI foi realizada em meio DMEM sem SBF. Antes de qualquer infecção, os cultivos celulares foram lavados com PBS para remoção de resquícios de soro. A diluição viral de 200 µL foi adicionada as monocamadas celulares. Estas foram incubadas por 1 hora a 37ºC e 5% de CO 2 sendo gentilmente agitadas por 15 minutos. O inóculo foi removido e o meio DMEM sem SBF foi adicionado a células em que foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2 por tempo determinado de acordo com cada experimento. 3.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA Células subconfluentes cresceram em lamínulas colocadas em placas de 24 poços. Estas células foram transfectadas com plasmídeos de expressãoe também células não transfectadas foram obtidas como controle negativo, não foram transfectadas. Após 24 horas de transfecção, as células foram fixadas com 3% de paraformaldeído por 5 minutos seguido de três etapas de lavagem com PBS. As células foram permeabilizadas através da incubação com Triton X-100 (Sigma) a 0,5% em PBS por 5 minutos e, depois, lavadas 3 vezes com PBS para completa remoção do detergente. As células foram incubadas com anticorpo primário específico para o VORO. Os anticorpos foram diluídos 1:200 a 1:1000 em PBS contendo 1% de SBF para atuar como bloqueador. Após 1 horas de incubação a temperatura ambiente (TA), as células foram lavadas três vezes com PBS com 1% de SBF para remover anticorpos primários que se ligaram inespecificamente. Depois, as células foram incubadas com anticorpos secundários espécie-específico. Estes continham fluorôcromos ligados covalentemente que foram diluídos de 1:50 a 1:200 em PBS com 1% de SBF. Para corar o DNA foi utilizado o corante DAPI (1:500) incluído na mix com anticorpo secundário. As células foram incubadas com 49 anticorpo secundário por 1 hora e lavadas três vezes com PBS. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com água deionizada, as lamínulas onde se depositavam as células foram enxutas e montadas em lâminas para observação em microscópio com uma gota de meio para montagem (Fluorsave; Calbiochem). A lâmina foi observada ao microscópio confocal Leica TCS SP2. 3.3. DNA PLASMIDIAL 3.3.1. Plasmídeos Usados no Estudo Os plasmídeos pTVT7-OROV-S, pTVT7-OROV-M, pTVT7-OROV-L e pTVT7OROV-delNSs foram usados como modelo para amplificação do genoma viral, como também, para subclonagem do inserto em outro plasmídeo, no caso o vetor de expressão, pTM1. Outros plasmídeos foram construídos no laboratório de Biologia Estrutural e Molecular da Universidade de St. Andrews, Escócia (Quadro 3). Quadro 3- Descrição dos plasmídeos utilizados e construídos para a realização do estudo em genética reversa do VORO Plasmídeos Descrição Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região codificante do segmento L do OROV (TRVL 9760). Este pTM1-OROV-L (A) plasmídeo foi construído no Laboratório de Virologia Molecular do grupo do Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região pTM1-OROV-L codificante do segmento L do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região pTM1-OROV-M codificante do segmento M do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região pTM1-OROV-S codificante do segmento S do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da pTM1-OROV-N (A) nucleoproteína do OROV (TRVL 9760). Este plasmídeo foi construído no Laboratório de Virologia Molecular do grupo 50 do Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da pTM1-OROV-N nucleoproteína do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da pTM1-OROV-NSs proteína NSs do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. pTM1-FF-Luc Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Ampr, promotor T7-Pol, Plasmídeo minireplicon Luciferase flanqueado ribozima contendo pela da Hepatite o gene sequência Delta. da Renilla regulatória do quimérica do segmento M do VORO (TRVL 9760). Por quimérica entenda que as primeiras 30 bases da região não pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL codificante do terminal 5’ foi oriunda da cepa TRVL 9760 do VORO e o restante da sequência oriunda da cepa BeAn 19991. A sequência do terminal 3’ foi oriunda completamente da cepa TRVL 9760. Este plasmídeo foi construído no Laboratório de Virologia Molecular do grupo do Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha. Ampr, pTVT7-OROV-M-Renilla (A) promotor T7-Pol, Plasmídeo minireplicon Luciferase flanqueado ribozima contendo pela da Hepatite o gene sequência da Delta. Renilla regulatória do segmento M do VORO (BeAn 19991). Este plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews. Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém pTVT7-OROV-S a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento S do VORO (BeAn 19991). Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém pTVT7-OROV-M a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento M do VORO (BeAn 19991). Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém pTVT7-OROV-L a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento L do VORO (BeAn 19991). Legenda: pTM1-OROV-L (A) e L/pTVT7-OROV-L: expressa a polimerase viral L; pTM1-OROV-M e pTVT7-OROV-M: expressa as glicoproteínas, Gn, Gc e a proteína não estrutural, NSm; pTM1-OROVS: expressa a nucleoproteína, N e a proteína não estrutural, NSs; pTM1-OROV-N (A) e N: expressa somente a nucleoproteína, N; pTM1-OROV-NSs: expressa somente a proteína não estrutural, NSs; pTVT7-OROV-M-Renilla (A) e pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL: Expressa a proteína repórter Renilla; pTM1-FF-Luc: expressa a proteína repórter Fifefly Luciferase. 51 3.3.2. Amplificação do DNA Plasmidial Para amplificação do DNA plasmidial, bactérias Escherichia coli (E.coli), cepa JM109, foram mantidas em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) contendo 10 g/L de bacto-triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, pH 7,5 ou plaqueadas em meio LB sólido suplementado com 1,5% de ágar. O meio foi suplementado com ampicilina (100 µ/mL) para seleção. 3.3.3. Preparação de Bactérias Competentes As bactérias competentes foram preparadas usando o kit “Z-Competent Escherichia.coli (E.coli) Transformation kit” (Zymo Research). Um volume de 50 mL de meio SOB foi inoculado em 500 µL de cultivo de E.coli overnight e incubado a 30ºC a 200 rpm em um agitador orbital até que OD560 atingisse 0,4-0,6. O cultivo bacteriano foi incubado no gelo por 10 minutos e depois centrifugado por 6 minutos a 3000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido em 5 mL em tampão previamente congelado. Em seguida, o cultivo foi centrifugado e finalmente ressuspendido em 5 mL de tampão competente (Zymo Research). Alíquotas de 0,2 mL do cultivo bacteriano foram estocadas a -70ºC. 3.3.4. Transformação das Bactérias Competentes E.coli Para transformar as bactérias E.coli JM109, 50-100 ng de DNA plasmidial foi adicionado a 100 µL de células competentes e espalhados ao meio LB contendo ampicilina. A reação foi homogeneizada e incubada por 30 minutos no gelo. Após a incubação, o volume total da reação de transformação foi plaqueado em meio ágar pré-aquecido a 37ºC contendo ampicilina por 12-16 horas. 3.3.5. Preparação do DNA Plasmidial Para a preparação de pequenas quantidades de DNA plasmidial (~20 µg) foi coletada uma única colônia de células E.coli transformadas e, em seguida, foram 52 cultivadas em 10 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 µg/mL), incubadas a 37ºC overnight a 200 rpm em um agitador orbital. O sedimento de 3 mL das células cultivadas overnight foi usado para isolar o DNA plasmidial usando o kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QUIAGEN) tanto manualmente ou usando o equipamento QIACube de acordo conforme o protocolo do fabricante. O DNA foi diluído em 50 µL de água. Para a preparação de grandes quantidades de DNA plasmidial (>100 µg), 50 mL de células bacterianas foram cultivadas durante a noite a 37ºC em um agitador. O DNA foi extraído utilizando-se o kit QUIAGEN Plasmid Maxi Kit de acordo com as instruções do fabricante. 3.3.6. Determinação da Concentração do DNA A quantidade de DNA utilizado foi determinada pela medição da absorbância (Abs260) utilizando-se o espectofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). A pureza da amostra de DNA foi estimada pelo cálculo da razão entre Abs 260/Abs280. Valores de razão maiores que 1,8 foram considerados aceitáveis. 3.4. MANIPULAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL 3.4.1. Oligonucleotídeos sintéticos Para a construção dos minireplicons, utilizou-se o conjunto de oligonucleotídeos desenhados com base na sequência da cepa BeAn 19991 do VORO empregando no programa computacional descrito na seção 3.4.3 (Quadros 4 e 5). Quadro 4- Oligonucleotídeos utilizados para construção do minireplicon do VORO Oligonucleotídeo Sequência (5’ 3’) OROVM-REN-FW1 TTATTTATATGAATTTTATTTATACCTGATTTTAGACCTGCCT ACCCTTTTTAGCCAAATTTACTGCTCGTTCTTCAGCA OROVM-REN-RV1 TGCTACCGGCAACAAACAGTGACAATGGCTTCCAAGGTGT 53 ACGA GACAGAGAAGACATACCCAGTAGTGTGCTACCGGCAACAA OROVM-REN-RV2 ACAGTGA OROVM-REN-FW2g GACAGAGAAGACGTTATAGAGTAGTGTGCTACCGACAACA ATTTTTGACTTTATTTATATGAATTTTATTTATA GACAGAGAAGACGTTATAAGTAGTGTGCTACCGACAACAAT OROVM-REN-FW2a TTTTGACTTTATTTATATGAATTTTATTTATA OROV-N-SUB-FW-ORF ACGTAGTCGTCTCCCATGTCAGAGTTC OROV-N-SUB-RV-ORF TGCTGATGAGCTCCTATATGTCAATTCCG OROV-N-SUB-FW ACGTAGTCGTCTCCCATGGAGTAGTGTGC OROV-N-SUB-RV TGCTGATGAGCTCAGTAGTGTG pTM1-OROVS-FW-1409 AAACACGATAATACCATGTCAGAGTTCATTTTCAACGATGTA CCAC pTM1-OROVS-RV-2096 CTATATGTCAATTCCGAATTGGCGCAAGAAGTCTCTTGCTG C pTM1-OROVM-FW-1409 AACACGATAATACCATGGCGAATTTAATAATTATTTCAATGG TTC pTM1-OROVM-RV-5663 CTACTTGATTTTCTGCTCCATGGCATATTCTATTTCATGTCT GATT pTM1-OROVL-FW-1409 AAAACACGATAATACCATGTCACAACTGTTGCTCAACCAAT ATCG pTM1-OROVL-RV-8159 TACAAATTCTGCCAATGATCTTTTCTCATTTTTCATACACTC Legenda: OROV: vírus Oropouche; pTM1: plasmídeo de expressão; L: segmento L; M: segmento M; N: segmento N; S: segmento S; REN: Renilla; FW: “forward”; RV: “reverse”; ORF: “open reading framing”. Os plasmídeos construídos foram nomeados da seguinte forma: pTM1OROV-L (expressa a polimerase viral L), pTM1-OROV-M (expressa as glicoproteínas, Gn, Gc e a proteína não estrutural, NSm), pTM1-OROV-S (expressa a nucleoproteína, N e a proteína não estrutural, NSs), pTM1-OROV-N (expressa somente a nucleoproteína, N) e pTM1-OROV-NSs (expressa somente a proteína não estrutural, NSs). Os oligonucleotídeos foram desenhados a partir das sequências publicadas no site do Genbank com os seguintes números de acesso: 54 NC_005777.1 (segmento S), NC_005775.1 (segmento M) e NC_005776.1 (segmento L), ver quadro 5. Quadro 5- Oligonucleotídeos desenhados para amplificação dos genes dos segmentos S, M e L. Segmento Nº Genbank Comprimento Genes clonados Oligonucleotídeos* (nt) L NC_005776.1 M NC_005775.1 S NC_005777.1 6846 4385 754 RNA pTM1OROVL.1409.FW Polimerase (L) pTM1OROVL.8159.RV Proteínas Gn, pTM1OROVM.1409.FW Gc e NSm pTM1OROVM.5663.RV Nucleoproteína pTM1OROVS.1409.FW N e proteína pTM1OROVS.2096.RV não estrutural NSm S NC_005777.1 S NC_005777.1 754 754 Nucleoproteína pTM1OROVS.1409.FW N pTM1OROVS.2096.RV Proteína não OROV-NSs-FW-2 estrutural NSs OROV-NSs-RV-2 *Para ver as sequências dos oligonucleotídeos utilizados ver quadro 4 3.4.2. Subclonagem do DNA Plasmidial do VORO Para a subclonagem de fragmentos de DNA do VORO foi utilizado o kit InFusion HD Cloning Kits (Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante (http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Kits/ Cloning_Kits-HD-Liquid). O kit “In-Fusion HD Cloning”-Clontech foi utilizado para clonar os genes L, M, S, N e NSs do VORO. Este protocolo contém a enzima InFusion que liga fragmentos de DNA, para isso as sequências geradas de PCR e vetores linearizados são reconhecidos precisamente e eficientemente por sequências que se sobrepõem com tamanhos de 15 pb cada em suas sequências terminais. Esta sequência de 15 pb foi construída através do desenho de oligonucleotídeos para amplificação da sequência dos genes do VORO (Fig. 7). 55 Geração de um vetor linearizado Desenho primer gene-específico com 15 pb de extensão homólogas as sequências terminais do vetor (pTM1r) 15 pb Amplificação do gene de interesse (VORO-L, M, S, N e NSs) 15 pb Produto do PCR Adiciona-se 2 µL de “Cloning Enhancer” a 5 µL do Produto de PCR e incubar a 15 minutos a 37ºC, 15 minutos a 80ºC OU Purifica-se o gel Reação do kit “In-Fusion cloning” 2 µL 5X InFusion-Enzyme Premix x µL Vetor Linearizado x µL do Inserto x µL de água deionizada Volume total: 10 µL 15 minutos a 50ºC Incubação da reação de clonagem Transformação em bactérias competentes com a reação anterior Busca por clones Figura 7- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7Pol. A figura ilustra a clonagem dos genes L, M, S, N e NSs do VORO através da utilização do kit “In-Fusion HD Cloning”. O desenho de oligonucleotídeos contendo a sequências com tamanho de 15 pb, os quais fazem sobreposição com os terminais de cada sequência, foi essencial para o sucesso da clonagem dos genes do VORO de interesse no plasmídeo pTM1. Após incubação, screening de no máximo 24 colônias colhidas do cultivo bacteriano foram realizados, á 37ºC. Após purificação, análises com enzimas de restrições e sequencimento foram realizadas para determinar se o inserto contendo o gene de interesse foi corretamente inserido ao vetor pTM1. 56 3.4.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) O PCR foram realizados utilizando-se a polimerase com atividade revisora “KOD hot start polymerase” da marca Merck. As reações de PCR foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante utilizando tubos de 0,5 mL em volumes específicos para serem utilizados em termocicladores, Em resumo, o mix de PCR foi composto por 1X do tampão da polimerase KOD Hot Start, 1,5 mM de MgSO4, 0,2 mM de cada dNTP, 0,3 µM de iniciador na direção senso, 0,3 µM de iniciador na direção anti-senso e 0,02 U/mL da polimerase KOD Start. A amostra de DNA foi adicionada a um volume final de 50 µL de água (Quadro 6). De acordo com o protocolo do fabricante, a polimerase KOD Start foi adicionada ao final do primeiro passo de desnaturação. Os ciclos de PCR foram realizados conforme descrito no Quadro 7. O PCR padrão e os ciclos foram realizados de acordo com os Quadros 8 e 9. Quadro 6- Reação padrão para o kit KOD hot start polymerase (Merck) (volume de reação para 50 µL): Tampão 10X 5 µL dNTPs (10 mM cada) 5 µL Mg2SO4 2,5 µL Amostra (10-50 ng) X µL Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL Oligonucleotídeo reverse (20 µM) 1,25 µL Polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL Adição de H2O (volume final: 50 µL) Y µL Quadro 7- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR Ativação da polimerase 95ºC 2 min Desnaturação 95ºC 30 segundos Anelamento Ajuste aos iniciadores 30 segundos Extensão 70ºC 30 segundos/kb Extensão final 70ºC 10 minutos “Hold” 10ºC ∞ 18-40ciclos 57 Quadro 8- Reação padrão para o kit GoTaq DNA polymerase (Promega) (volume de reação para 50 µL): Tampão 5X (verde ou sem cor) 10 µL dNTPs (10 mM cada) 1 µL Amostra (10-50 ng) X µL Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL Oligonucleotídeo reverse (20 µM) 1,25 µL Go Taq Polimerase (5 U/µL) 0,25 µL Adição de H2O (volume final: 50 µL) Y µL Quadro 9- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR (GoTaq polimerase) Ativação da polimerase 95ºC 2 min Desnaturação 95ºC 30 segundos Anelamento Ajuste aos primers 30 segundos Extensão 72ºC 30 segundos/kb Extensão final 72ºC 10 minutos “Hold” 10ºC ∞ 25-35ciclos 3.4.4. Mutagênese Sítio Específica O kit “QuickChange site-directed mutagenesis” foi utilizado para introduzir mutação de ponto na sequência dos segmentos do VORO. Para isso, dois primers complementares contendo a mutação desejada foram utilizados na reação de PCR. O kit “KOD hot start polymerase” foi utilizado como DNA polimerase. Após a transformação dos plasmídeos, a amostra foi tratada com a enzima DpnI para digerir o plasmídeo metilado parental. Os plasmídeos recém-sintetizados não são metilados, dessa forma, não são alvos da ação da enzima DpnI. Após a amplificação e preparação do plasmídeo, o sequenciamento foi realizado para garantir a inserção da mutação de ponto, conforme descritos nos quadros 10 e 11. 58 Quadro 10- Reação padrão para realização da mutação sítio-específica: Tampão 10X 5 µL dNTPs (10 mM cada) 5 µL Mg2SO4 (25 mM) 2,5 µL Amostra (10-50 ng) X µL Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL Oligonucleotídeo reverso (20 µM) 1,25 µL polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL H2O destilada (volume final: 50 µL) Y µL Quadro 11- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR para realização da mutação sítio-específica: Tampão 10X 5 µL dNTPs (10 mM cada) 5 µL Mg2SO4 (25 mM) 2,5 µL Amostra (10-50 ng) X µL Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL Oligonucleotídeo reverso (20 µM) 1,25 µL Polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL H2O destilada (volume final: 50 µL) Y µL 3.4.5. Adição de Desoxiadenosina (DATP) no Produto de PCR e Clonagem T/A Os fragmentos de DNA que foram gerados com polimerases “revisoras” necessitam da adição de uma única desoxiadenosina logo ao final 3’ da sequência amplificada para clonagem em vetores T/A. Para tal finalidade, o DNA amplificado foi purificado com Taq polimerase, que contém a atividade terminal transferase. A reação encontra-se sumarizada no quadro 12: 59 Quadro 12- Reação de adição de desoxiadenosina Tampão Taq polimerase 10X 5 µL Vetor DNA (PCR) 50 µL dATP (5 mM) 5 µL Taq DNA polimerase (0,5 U/ µL) 1 µL A reação foi incubada por 15 minutos a 72ºC para logo depois ser utilizada na clonagem T/A. Em seguida, 1-2 µL do DNA foi clonado em vetores PGEM-T ou PGEM-T Easy de acordo com as instruções do fabricante. 3.4.6. Digestão do DNA com Enzimas de Restrições Digestões com enzimas de restrição foram realizadas em reações de 20 µL de acordo com o protocolo das respectivas enzimas. Essas foram oriundas de diferentes companhias, como Fermentas, New England Biolabs e Promega. Uma reação final contendo 2 µL de tampão 10X, 1 µL de BSA, 1 unidade de enzima/ µg de DNA foi utilizada além da adição de água para obtenção de um volume final de 20 µL. As reações foram incubadas a TA, 30ºC, 37ºC ou 55ºC de acordo com os protocolos dos fabricantes. 3.4.7. Eletroforese em Gel de Agarose O DNA foi separado em cubas horizontais de eletroforese contendo gel de agarose com concentração variando entre 1-2% dependendo do tamanho dos fragmentos de DNA. Os géis eram compostos por agarose (Invitrogen) em tampão TAE, suplementado com 4 µg/mL de brometo de etídio. Os géis foram imersos em tampão TAE 1X e as amostras misturadas com corante de corrida foram adicionadas em cada poço do gel. As corridas foram realizadas a uma velocidade de 100 V por 30 a 60 minutos. Os fragmentos de DNA foram posteriormente visualizados em um transiluminador de ultravioleta (260 nm) onde foi possível registrar os resultados por fotoimagem. 60 3.4.8. Purificação do DNA em Gel de Agarose Os produtos de DNA ou as reações de digestão por endonuclease foram separados no gel de agarose, como descrito anteriormente. A banda contendo o fragmento de DNA de interesse foi cortada do gel com auxílio de uma navalha. A purificação do DNA foi realizada utilizando-se o kit “PCR purification kit” (Quiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. 3.4.9. Desfosforilação do Plasmídeo Linearizado A enzima “Shrimp alkaline phosphatase” (SAP; Roche) foi utilizada para remover a parte 5’ fosfatase do vetor plasmidial linearizado com a finalidade de prevenir a recircularização durante a ligação das reações entre o vetor e o DNA estudado. Dessa forma, o DNA plasmidial purificado e digerido (1-5 µg) foi incubado em uma quantidade de 1 U de SAP por 1 hora a 37ºC no tampão de defosforilação (Roche). A reação foi finalizada por uma segunda incubação por 15 minutos a 65ºC. Os vetores defosforilados foram imediatamente usados para subsequente ligação. 3.4.10. Ligação dos Fragmentos de DNA Moléculas de DNA recombinantes foram geradas pela formação de ligações fosfodiésteres entre fragmentos de DNA utilizando-se a DNA ligase do bacteriófago T4. (Invitrogen). Concentrações equimolares, como também, a razão 1:3, entre os vetores e o inserto de DNA, foram misturadas em um volume total de 8 µL de água destilada. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 55ºC e novamente por 10 minutos a TA. Em seguida, 2 µL do tampão 5X e 0,5 U de DNA ligase T4 foram adicionados. Após 30 minutos, a TA, as amostras foram incubadas a 16ºC “overnight”. A reação foi interrompida por aquecimento por 5 minutos a 65ºC para inativar a DNA ligase T4. Uma alíquota de 5 µL da reação de ligação foi transformada em células competentes E.coli. Uma ligação mais rápida foi realizada com a utilização do kit “Rapid Ligation kit” (Roche), que contém um tampão mais específico e adequado para a enzima ligase. 61 3.5. INDUÇÃO DA FORMAÇÃO SINCICIAL EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM GLICOPROTEÍNAS DO VORO POR MUDANÇA DE PH. As células BHK-21 foram cultivadas em lamínulas para transfecção de 1 µg de pTM1-VORO-M e 0,5 µg de pTM1-GFP. Após 16 horas pós-transfecção, o meio DMEM foi trocado pelo tampão de fusão (10 mM de HEPES; 0,2% de SBF em solução salina balanceada Earle’s-Sigma, pH 5,5) e incubados por 5 minutos a TA. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas com meio DMEM contendo 10% de SBF a 37ºC. Após 4 horas, as células foram observadas ao microscópio de epiluminescência para visualização da formação de sincício. 3.6. TRANSFECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO MEDIADA POR LIPOSSOMO Este método foi utilizado para adicionar o DNA plasmidial nos cultivos celulares. As células foram cultivadas em placas de 12 poços até atingir uma confluência de 60-80% Duas soluções foram preparadas em meio (OptiMEM; Gibco) sem SBF. Para a primeira solução, os ácidos nucléicos transfectados foram diluídos em 125 µL de OptiMEM. A segunda solução consistia de 125 µL de OptiMEM contendo 2 µL de agente de transfecção, lipofectamina (Life Technologies) para cada µg de ácido nucléico. As duas soluções foram misturadas, brevemente homogeneizadas e incubadas por 30 minutos a TA para formação dos lipossomos. Durante a incubação, o meio da monocamada celular foi trocado por meio DMEM sem SBF. O volume de 200 µL do transfectado foi adicionado cuidadosamente à conta gotas em cada um dos 12 poços. O cultivo foi incubado em estufa a 37ºC por 24 horas para posterior leitura em espectofotômetro. 3.7. TESTE DE LUCIFERASE O kit “Dual Luciferase Assay System” (Promega) foi utilizado para detecção de luciferase, conforme recomendação do fabricante (http://www.promega.com.br/protocols/techicalmanuals/0/dualluciferasereporter). 62 3.8. TESTE DE MINIREPLICON O teste de minireplicon foi realizado de acordo com o Weber e colaboradores, 2001. As células BSR-T7/5 foram co-transfectadas com os plasmídeos de expressão da nucleoproteína N e da proteína L do VORO, pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-L e com plasmídeos que codificavam a luciferase, o minigenoma. O plasmídeo pTM1FF-Luc, que expressava o gene da Firefly Luciferase sob o controle do promotor T7, foi transfectados para servir como controle interno. Resumidamente, após transfecção, o minigenoma foi transcrito pela polimerase T7 produzindo um segmento de RNA parecido com o vírus. A proteína N encapsula o RNA genômico para formar o complexo RNA-proteína N que foi reconhecido pela polimerase L. A polimerase sintetizou o antigenoma e o RNA do modelo genômico. O RNAm da proteína repórter Renilla Luciferase foram produzidos somente quando a polimerase viral realizou a transcrição e replicação. As células BSR-T7/5 foram cultivadas em placas de 12 poços (8 x 104 células/poço) ou em placas de 24 poços (4 x 104 células/poço). As transfecções foram realizadas de acordo como descrito adiante, os plasmídeos foram transfectados, nos poços de cultivo, em uma quantidade que variava de 200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL, dependendo do objetivo de cada teste. Após 24 horas de transfecção, as células foram lisadas para ser realizado o teste de luciferase (Seção 3.7). O valor da Renilla do controle positivo foi considerado 100% em relação a atividade de luz e todos os outros valores foram normalizados contra esse valor total para ser calculado a porcentagem. 3.9. SEQUENCIAMENTO O sequenciamento dos clones de DNA e dos produtos de PCR foi realizado no laboratório “DNA Sequencing Service” da Universidade de Dundee, Escócia, Reino Unido, como parte da atividade do Doutorado Sanduíche. O sequenciamento foi realizado em ambos os sentidos, com os oligonucleotídeos específicos anteriormente descritos (Quadro 4). O método descrito foi em reação em cadeia (Sanger et al., 1977). O sequenciamento foi realizado em sequenciador automático modelo ABI 3130 (Applied Biosystems). 63 3.10. EXTRAÇÃO DE RNA DE CULTIVOS CELULARES O RNA total de células infectadas e não infectadas foi isolado utilizando o reagente TriFast (Peqlab) de acordo com protocolo do fabricante. As células cultivadas foram lisadas com 1 mL de Trifast, transferidas para um tubo de 1,5 mL e incubadas por 5 minutos a TA. Em seguida, 0,2 mL de clorofórmio foram adicionados, homogeneizado, sendo a mistura novamente incubada por 5 minutos. Após incubação, a amostra foi centrifugada por 5 minutos a 12.000 rpm a 4ºC. A parte aquosa foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, homogeneizada com 0,7 volumes de isopropanol e incubada por pelo menos 10 minutos a -80ºC para precipitar o RNA. O RNA foi sedimentado por 10 minutos e centrifugado por 12.000 rpm a 4ºC e lavado duas vezes com etanol a 75%. O sedimento foi deixado a TA para secagem, dissolvido em 50 µL de água para posterior quantificação de RNA em espectofotômetro. 3.11. PREPARAÇÃO DO cDNA O método utilizado foi usado para produzir a primeira fita de cDNA a partir do RNA. Primeiro, 1 µg de RNA foi incubado com DNase I (Fermentas) para degradação de possível contaminante DNA cromossomal. Para esta finalidade, foi realizada a seguinte reação: Tampão da reação 10X 1 µL RNA purificado (1 µg) X µL DNase I (1U) 1 µL Adição água ao volume final de Y µL 10 µL A amostra foi incubada por 30 minutos a 37ºC. Em seguida, a reação foi parada pela adição de 1 µL de EDTA (25 Mm) e aquecida a 65ºC por 10 minutos. Hexanucleotídeos randômicos (100 ng) foram adicionados e anelados ao RNA a 65ºC por 5 minutos, seguido por 10 minutos de incubação a TA. A seguinte reação foi realizada: 64 Tampão da reação 5X 4 µL dNTP (10 mM) 2 µL DTT(100 mM) 2 µL Inibidor RNase (40 U) 1 µL Depois de 2 minutos de incubação a 42ºC, foi adicionado a mistura 0,5 µL (100 U) de “Superscript II reverse transcriptase” (Invitrogen). Após 1 hora de incubação a 42ºC, a primeira fita de DNA foi terminada pelo aquecimento a 95ºC por 5 minutos. O cDNA foi estocado a -20ºC. 3.12. TRANSCRIÇÃO DO RNA IN VITRO O DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrições apropriadas antes da síntese de RNA se nenhum sinal terminal T7 fosse verificado. Cada reação de restrição foi composta pelos seguintes reagentes: Tampão da reação 5X 10 µL DNA plasmidial (2 µg) 10-20 µL DTT(100 mM) 5 µL BSA (10 mg/µL) 0,5 µL Inibidor RNase (40 U) 1 µL dNTP (10 mM) 10 µL RNA polimerase T7 (2 U) 2 µL Adicionar água até 50 µL A reação foi realizada a 37ºC por 2 horas. Em seguida, 2 µL (2 U) de DNase I foi adicionada para degradar o molde do DNA plasmidial. Após 15 minutos, foi adicionada 500 µL de água e o RNA foi purificado, como descrito anteriormente. 65 Infecção dos cultivos celulares Extração RNA viral Síntese do cDNA Construção dos plasmídeos pTVT7- OROV-L/M/S/delNSs IRES T7 PCR Inserto 5’ 3’ pTM1 VORO cDNA PT7 EMCVIRES T T7 VORO cDNA Figura 8- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. O RNA foi isolado de cultivos celulares infectados com VORO (BeAN 19991). A primeira fita de cDNA foi construída a partir dos plasmídeos pTVT7-OROV-L/M/S previamente construídos e cedidos pelo Dr. Elliott da University of St. Andrews. PT7= Promotor T7, TT7= Terminador T7 66 4. RESULTADOS 4.1. ESTRATÉGIA DE CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO CONTENDO OS GENES L, M E S DO VORO 4.1.1. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene L Para construir os plasmídeos que expressavam a RNA polimerase viral L foram utilizados os oligonucleotídeos, pTM1OROVL.1409.FW e pTM1OROVL.8159.RV para amplificação do gene que codifica a proteína de interesse. O plasmídeo modelo utilizado foi o pTVT7-OROV-L. A amplificação da região codificante do fragmento L do VORO (6752 pb) foi confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente 7000 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do gene L do VORO (Fig. 9). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-L, foi realizado uma busca de colônias bacterianas selecionadas após incubação “overnight” e purificação, com as enzimas de restrição SalI e HindIIl nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 10). 6752 pb Figura 9- Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximadamente 7000 pb. 67 (a) (b) (c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Figura 10- Análise dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-L. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, cinco fragmentos, entre 6041 a 401 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1-OROV-L com ambas as enzimas mencionadas. (b) Já para a incubação do plasmídeo controle, plasmídeo pTM1rsem inserto, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas três bandas entre 3873 a 412. (c) As amostras selecionadas em caixa brancas estão de acordo com a predição realizada pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (8, 10 e 12) quanto para o plasmídeo controle (13). 68 4.1.2. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene M Para construir os plasmídeos que somente expressavam a poliproteína Gn, Gc e a proteína não estrutural NSm foram utilizados os oligonucleotídeos , pTM1OROVM.1409.FW e pTM1OROVM.5663.RV para amplificação do gene que codifica as proteínas de interesse. A amplificação da região codificante do fragmento M do VORO (4262 pb) foi confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente 4250 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do gene M do VORO (Fig. 11). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-M, foi realizado uma busca de colônias bacterianas selecionadas após incubação durante a noite e purificação, com as enzimas de restrição PmlI e Xbal nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 12). 4262 pb Figura 11- Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 4250 pb. 69 (a) (b) (c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Figura 12- Busca dos plasmídeos de expressão pela incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição PmlI e XbaI dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-M. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4333 pb e 1026 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1-OROV-M com ambas as enzimas de restrição. (b) Controle pTM1-r sem inserto incubados com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas duas bandas, 8455 pb, 1026 pb e 139 pb (Esta última não visível ao gel). (c) As bandas observadas estão de acordo com a predição pelo software, Serial Cloner 2.5, tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-10) quanto para o plasmídeo controle (11). 70 4.1.3. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene N e NSs Para construir os plasmídeos que expressavam a nucleoproteína N e a proteína não estrutural NSs foram utilizados os oligonucleotídeos, pTM1OROVS.1409.FW e pTM1OROVS.2096.RV para amplificação do gene S que codifica as proteínas de interesse. A amplificação da região codificante do fragmento S do VORO (695 pb) foi confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente 700 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do gene S do VORO (Fig. 13). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-S, foi realizado um screening de colônias bacterianas selecionadas após incubação overnight e purificação, com as enzimas de restrição SalI e Xbal nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 14). 695 pb Figura 13- Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 695 pb. 71 (a) (b) (c) 1 2 3 4 5 6 Figura 14- Busca dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e XbaI dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-S. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4011 pb e 1348 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1r-sem inserto com ambas as enzimas de restrição mencionadas anteriormente. (b) Já para a incubação do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-S, com as mesmas enzimas utilizadas, deveriam ser observadas duas bandas, 4011 pb e 2042 pb (c) Os tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo software, Serial Cloner 2.5, tanto para os plasmídeos contendo o inserto (2-6) quanto para o plasmídeo controle (1). 72 4.1.4. Construção do plasmídeo de expressão contendo apenas o gene N Para construir plasmídeos que somente expressavam a nucleoproteína VORO-N, a expressão da proteína não estrutural NSs no gene do plasmídeo pTVT7OROV-delNSs foi ab-rogada. Para isso, foram feitas três mudanças nucleotídicas no começo da sequência do segmento VORO-S (nucleotídeo 24, T para C, nucleotídeo 69, T para C e nucleotídeo 72, G para A), ver figura 25. Estas mudanças foram realizadas pelo kit de mutagênese (Fig. 15). A alteração não afetou a sequência aminoacídica da proteína N. O plasmídeo recém-construído foi designado pTM1OROV-N. N NSs T T7 PT7 pTVT7-OROV-delNSs IRES ACG C…A PCR N PT7 pTM1-OROV-N Clonagem em pTM1 T T7 IRES Figura 15- Construção do plasmídeo de expressão da nucleoproteína N do VORO-pTM1-OROV-N. O produto do PCR que contém alterações nucleotídicas codificadas pelo oligonucleotídeos desenhados na região de sobreposição entre os genes N e NSs foram gerados utilizando-se os pares de oligonucleotídeos pTM1OROVS.1409.FW/pTM1OROVS.2096.RV indicados pelas cabeças de setas e o plasmídeo pTVT7-OROV-delNSs como template. PT7= Promotor T7 e TT7= Terminador T7. 73 A amplificação da região codificante do fragmento N do VORO (695 pb) foi confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente 700 pb foram confirmadas. Este tamanho foi semelhante ao da região codificante do gene S do VORO (Fig. 16). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, foi realizada análise de colônias bacterianas selecionadas após incubação overnight e purificação, com as enzimas de restrição HindIII e SalI nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 17). 695 pb Figura 16- Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 695 pb. 74 (a) (b) (c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Figura 17- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-N. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, três fragmentos, 3873 pb, 1074 pb e 412 pb deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1rsem inserto com ambas as enzimas de restrição. (b) Já para a incubação do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas duas bandas de 3873 pb e 1106 pb de acordo com o software (c) Os tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-12) quanto para o plasmídeo controle (13). 75 4.1.5. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene NSs Para construir plasmídeos que somente expressavam a proteína não estrutural NSs do VORO foram utilizados os oligonucleotídeos OROV-NSs-FW-2 e OROV-NSs-RV-2 para amplificação do gene NSs que codifica a proteína de interesse. O plasmídeo modelo utilizado foi, anteriormente construído, pTM1-OROVS em que não houve ab-rogação do gene NSs (Fig. 18). N NSs PT7 pTM1-OROV-S T T7 IRES ATG PCR Clonagem em pTM1 NSs pTM1-OROV-NSs T T7 PT7 IRES ATG Figura 18- Construção do plasmídeo de expressão da proteína não estrutural NSs do VORO-pTM1-OROV-NSs. O produto do PCR foram gerados utilizando-se os pares de oligonucleotídeos OROV-NSs-FW-2 e OROV-NSs-RV-2 indicados pelas cabeças de setas e o plasmídeo pTM1-OROV-S como template. PT7= Promotor T7 e TT7= Terminador T7. 76 A amplificação da região codificante do fragmento NSs do VORO foi confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente 300 pb foram observadas. Este tamanho foi condizente com o tamanho da região codificante do gene NSs do VORO, a qual traduz a NSs e abrange 275 nucleotídeos (Fig. 19). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-NSs, foi realizado um screening de colônias bacterianas selecionadas após incubação overnight e purificação, com as enzimas de restrição PstI e Xbal nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 20). 275 pb Figura 19- Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 275 pb. 77 (a) (b) (c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Figura 20- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-NSs. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4039 pb e 1320 pb deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1rsem inserto com ambas as enzimas de restrição. (b) Já para a incubação do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas uma banda de 5633 pb (c) Os tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-12) quanto para o plasmídeo controle (13). 78 4.2. CONSTRUÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO A atividade das proteínas recombinantes do VORO foi analisada pelas suas habilidades em inicializar a transcrição e replicação do minireplicon. Os minireplicons gerados no estudo foram transcritos pela polimerase celular T7 que continha o gene repórter Renilla luciferase. O minireplicon do VORO foi construído em dois passos. Primeiramente, o gene repórter foi amplificado por PCR de alta resolução de um plasmídeo modelo, pHRL-CMV, para depois ser fusionado com a região consenso da região não codificante do segmento M do VORO. O minireplicon construído foi designado pTVT7-OROV-M-Renilla (Fig. 21). OROVM-REN-FW1 Renilla Luciferase pHRL-CMV OROVM-REN-RV1 PCR 1 OROVM-REN-FW2g Renilla Luciferase OROVM-REN-RV2 PCR 2 BbsI VORO-M-5’RNC ECORV Renilla Luciferase VORO-M-3’RNC Clonagem em pTVT7 T7 T pol-I VORO-M-5’RNC Renilla Luciferase VORO-M-3’RNC pTVT7-OROV-M-Renilla Figura 21- Geração do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla. O gene repórter da Renilla Luciferase foi amplificado do plasmídeo modelo pHRL-CMV usando-se os oligonucleotídeos OROVM-REN-FW1 e OROVM-REN-RV1. O produto do primeiro PCR serviu como modelo para o segundo PCR o qual foram utilizados os oligonucleotídeos, OROVM-REN-FW2 e OROVM-REN-RV2, para introduzir no gene Renilla com RNAc do segmento M e os sítios de restrição ECORV. O produto final foi clonado no plasmídeo pTVT7 no sítio restrição BbsI e ECORV. 79 4.3. RECONSTITUIÇÃO IN VIVO DE RIBONUCLEOPROTEÍNAS RECOMBINANTES A atividade dos genes L e N, como também, dos genes S, NSs e M, em experimentos divergentes, do VORO foi testada no sistema de minireplicon. Para conseguir este objetivo, os plasmídeos que expressavam os genes L e N foram coexpressos com um plasmídeo-minireplicon que continha o gene repórter no sentido genômico (pVT7-OROV-M-Renilla). Os transcritos de sentido negativo construídos deste plasmídeo não são traduzidos, dessa forma, o RNAm do gene Renilla Luciferase no sentido positivo foi exclusivamente gerado pelo complexo de polimerase recombinante do VORO e a quantidade de proteínas traduzidas do gene repórter refletiu na atividade da reconstituição de ribonucleoproteínas virais. A expressão do T7-Pol, que é necessária para a síntese do RNAm viral, foi gerada pela linhagem celular, BSR-T7/5, que expressa constitutivamente o fago RNA polimerase T7. O esquema abaixo mostra o resumo do sistema de minireplicon do VORO (Fig. 22). pTM1-OROV-N pTM1-OROV-L 1 RENv pTVT7-OROV-M-Renilla 3 5 Núcleo 4 OROV-RENc L+N 6 7 2 RNAm Ren T7-Pol BSR-T7/5 8 Teste de Luciferase Figura 22- Esquema e função do sistema de minireplicon do VORO. 1. Tranfecção das células BSR-T7/5 com plasmídeos de expressão e minigenoma do VORO. 2+3. Expressão das proteínas L e N mediada pela enzima T7-Pol no citoplasma. 4. Transcrição do minireplicon do VORO. 5+6. Replicação e Transcrição da ribonucleoproteína- Renilla reconstituídas pelas proteínas virais levando a síntese do RNAm da Renilla Luciferase. 7. Síntese da proteína Renilla Luciferase. 8. As células foram lisadas e a atividade da luciferase quantificada em experimentos in vitro. 80 4.4. COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIREPLICON DO VORO Antes da análise da atividade do minigenoma do VORO pela co-transfecção dos plasmídeos de expressão, pTM1-OROV-L/M/S/N e NSs e do minireplicon pTV7OROV-M-Renilla construídos neste trabalho, foi realizada a comparação na atividade do gene repórter da Renilla luciferase de diferentes sistemas de minigenoma do vírus em estudo. Os plasmídeos usados para esta finalidade foram anteriormente construídos pelo Laboratório de Biologia Molecular de vírus de RNA de sentido negativo (LBMVRSN) da Universidade de St. Andrews, Escócia, como também, pelo Departamento de Virologia da University Medical Center Gottingen, Alemanha. As células BSR-T7/5 foram co-transfectadas com os plasmídeos L, S, N e com dois distintos sistemas de minireplicon do VORO, pTVT7-OROV-M-Renilla (construído em St. Andrews) e pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (construído na Alemanha) (Quadro 3). O controle negativo foi representado pela co-transfecção dos plasmídeos N e minireplicon do VBUN e o controle positivo foi representado pela cotransfecção dos plasmídeos de expressão L, N e minigenoma do VBUN. A figura 23 mostra que a co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos suporte, pTV7-OROV-N, pTV7-OROV-L e minireplicon do VORO, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (Gráfico: coluna 4) resultou em um aumento de 185,4% da atividade da transcrição do gene repórter, Renilla comparada a atividade observada na co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos controle. Em relação às outras combinações de plasmídeos, a atividade da transcrição do gene repórter, Renilla, foi equivalente à observada ao resultado do controle negativo, que no caso, a omissão da expressão do plasmídeo L aboliu completamente a atividade repórter da proteína. 81 Plasmídeos-Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 pT7ribo BUNV-M (500) + + pTM1-BUNV-N (500) + + pTM1-BUNV-L (500) + pTVT7-OROV-M-Renilla (500) + pTVT7-OROV-S (300) + pTVT7-OROV-L (1000) + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL + + + pTM1-OROV-N (A) (300) + + + pTM1-OROV-L (A) (1000) + + + Figura 23- Comparação da atividade do gene repórter entre dois sistemas de minireplicon distintos. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos L e N e minireplicon do VORO oriundos de fontes distintas. 1. Controle negativo. 2. Controle positivo. 3-7: comparação da atividade do gene repórter, Renilla, entre diferentes combinações com posterior co-transfecção dos plasmídeos suporte. média ± DPM (desvio padrão da média) 82 4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA NUCLEOPROTEÍNA N DO VORO A construção do plasmídeo que expressava a nucleoproteína N do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 15 representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109, após 18 horas de incubação a 37ºC, onze colônias dessas células contendo ou não o inserto de interesse foram selecionadas para serem purificadas e extraídos os plasmídeos de expressão da nucleoproteína N. Estes plasmídeos foram denominados pTM1-OROV-N-1 a 11. A figura 24 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após co-transfecção do plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-L (A), minireplicon pT7riboSM2-OROVvMpro-vRL com os respectivos plasmídeos de expressão da nucleoproteína N recém-construídos, pTM1-OROV-N-1 a 11. Para este experimento foi considerado o controle positivo a co-transfecção dos plasmídeos de expressão L, N e minigenoma do VBUN. A co-transfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-1 levou a uma diminuição de 40% na atividade do gene repórter Renilla comparado ao sistema de minigenoma do VBUN. Em relação aos outros plasmídeos de expressão, pTM1OROV-N-2 a 11, a atividade da Renilla teve uma taxa de aumento entre 11 a 60% comparado ao controle. A comparação das atividades do gene repórter entre a cotranfecção das células com os plasmídeos pTM1-OROV-N-1 e os plasmídeos, pTM1-OROV-N-2 a 11, mostrou que o plasmídeo suporte pTM1-OROV-N-1 teve uma diminuição de no mínimo 40% e no máximo 60% na atividade do minigenoma do VORO. Entretanto, comparando a atividade da Renilla entre os plasmídeos pTM1-OROV-N-2 a pTM1-OROV-N-11, observou-se que não houve diferenças significativas. Diante dos resultados obtidos, um plasmídeo foi selecionado para ser cultivado em bactéria JM109, repicado e purificado para servir de estoque e utilizado em procedimentos posteriores. O plasmídeo escolhido para esta finalidade foi o pTM1-OROV-N-11(Figs. 24 e 25). As figuras 25 e 26 mostram o alinhamento entre os genomas dos plasmídeos de expressão construídos, pTM1-OROV-N-2/11/12 e da sequência genômica da cepa do VORO BeAn 19991 a qual foi utilizada como modelo para construção dos mesmos. Observa-se a confirmação das mudanças nucleotídicas realizadas que foram necessárias para a ab-rogação da proteína não estrutural NSs do VORO, 83 consequentemente, levando a expressão apenas da nucleoproteína N do VORO (ver item 4.1.4). A análise das sequências genômicas dos plasmídeos construídos, pTM1OROV-N-1/11 com a sequência genômica da cepa do VORO BeAn 19991 mostrou que a sequência do plasmídeo pTM1-OROV-N-1 estava truncada no terminal 3’ quando comparado às sequências dos outros plasmídeos construídos e do vírus selvagem, BeAn 19991 (Figs 25 e 26). Este fato pode ter levado a diminuição de 40% da atividade de minireplicon no cultivo celular co-transfectado com este plasmídeo (Figs. 25 e 26). A sequência do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-11, apresentou uma mudança nucleotídica, C para T, na posição 38 o que levou a uma mudança traducional de uma proteína, T para I, no genoma desse plasmídeo suporte (Fig. 27). Além disso, outras três mudanças nucleotídicas foram observadas na sequência dos plasmídeos construídos em relação a sequência da cepa selvagem, nas posições 543 (G→A), 544 (A →C) e 558 (T→C) (Fig. 26). Figura 24- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína N. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão das proteínas N e L (A) e minireplicon (A) do VORO. 1. Controle positivo: Transfecção dos plasmídeos pT7ribo BUNV-N, pT7ribo BUNV-L e minireplicon pT7ribo BUNV-M-Renilla. 212.Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-L(A), miniregenoma do VORO, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL com os plasmídeos de expressão construídos, pTM1OROV-N-1 a pTM1-OROV-N-11, colunas 2 a 12, respectivamente. 84 Figura 25- Alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína N. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 85 Figura 26- Continuação da representação do alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína N. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 86 Figura 27- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína N do VORO. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa preta. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 87 4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA POLIMERASE VIRAL L E COMPARAÇÃO DE DOIS DIFERENTES PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA N DO VORO A construção do plasmídeo que expressava a proteína estrutural L do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 8 representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18 horas de incubação a 37ºC, 23 colônias dessas células foram selecionadas para serem purificadas e a partir destas extraídos os plasmídeos de expressão da proteína L. Após digestão com as enzimas HindIII e SalI e análise do gel de agarose, apenas três plasmídeos mostraram um padrão de bandas semelhante ao projetado pela programa Serial Cloner 4.1 (Figs. 10 a-c), dessa forma, a continuação do protocolo de co-transfecção dos plasmídeos de expressão da polimerase viral L foi realizada somente com esses três plasmídeos que apresentaram este resultado condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram designados pTM1-OROV-L-1 a 3. A Figura 28 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após cotransfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N (A), pTM1-OROV-L (A), minireplicon pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL como controle positivo, como também, a transfecção dos plasmídeos pTVT7-OROV-M-Renilla (A), pTM1-OROV-N com os respectivos plasmídeos de expressão L recém-construídos, pTM1-OROV-L-1 a 3. A co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos PTM1-OROV-L-1 a três levou a um aumento de 267%, 472% e 587%, respectivamente, da atividade do minireplicon do VORO, comparado ao controle. Adicionalmente, observamos que este aumento significativo pode ter sido elevado devido a co-transfecção com o plasmídeo de expressão da proteína N recém-construído o que nos leva a crer que a expressão das proteínas N e L dos plasmídeos recém-construídos é maior do que a observada nos plasmídeos de expressão, pTM1-OROV-N (A) e pTM1-OROV-L (A) (Fig. 28). 88 Plasmídeos-Concentração (ng/µL) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-OROV-N (A) (300) pTM1-OROV-L (A) (1000) pTM1-OROV-N (300) pTM1-OROV- L-1 (1000) pTM1-OROV- L-2 (1000) pTM1-OROV- L-3 (1000) 1 + + + 2 + 3 + 4 + + + + + + + Figura 28- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína L. As células foram cotransfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos N, minireplicon (A) do VORO com os respectivos plasmídeos PTM1-OROV-L-1 a 3 recém-construídos. 1. Controle positivo: Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-L (A), pTM1-OROV-N (A) e minireplicon pTV7 OROVM-Renilla (A). 2-4.Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-N, minigenoma do VORO, PTVT7OROV-M-Renilla (A) com os plasmídeos de expressão construídos, pTM1-OROV-L-1 a pTM1OROV-L-3, respectivamente. Média ± DPM (desvio padrão da média) 89 4.6. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIGENOMA APÓS CO-TRANSFECÇÃO COM NOVOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS N E L DO VORO Após a construção dos plasmídeos de expressão das proteínas L e N, pTM1OROV-L e pTM1-OROV-N, respectivamente, como também a constatação que o minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla não apresentou um nível de atividade satisfatória quando co-transfectado com os plasmídeos pTVT7-OROV-L e pTVT7OROV-N (Fig 23), foi realizado a comparação da atividade dos minigenomas do VOROV, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (as primeiras 30 bases da região não codificante do terminal 5’ foi oriunda da cepa TRVL 9760 do segmento M do VORO e o restante da sequência oriunda da cepa BeAn 19991. A sequência do terminal 3’ foi oriunda completamente da cepa TRVL 9760) e pTVT7-OROV-M-Renilla (BeAn 19991) co-transfectados em células BSR-T7/5 com os diferentes plasmídeos de expressão recém-construídos (pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N) e com os plasmídeos doados gentilmente pelo Dr. Manfred (pTM1-OROV-L (A) e pTM1OROV-N (A)). A figura 29 mostra ausência da atividade do minireplicon quando não houve a co-transfecção com o plasmídeo de expressão da polimerase viral L, pTM1-OROV-L (controle negativo-coluna 1). A atividade do minigenoma pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL co-transfectado com o plasmídeo de expressão da proteína L e N, pTM1-OROV-L (A) e pTM1OROV-N diminuiu em 53,4% (coluna 4) quando comparado com o controle (coluna 2), no entanto, houve um aumento na atividade deste minigenoma em 303% e 403% quando houve co-transfecção das células com o plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-N em conjunto com pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N (A) em conjunto com pTM1-OROV-L, respectivamente (colunas 5 e 6) (Fig. 29). Em relação a atividade do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla, houve uma diminuição da mesma em 66% e 75% quando houve co-transfecção das células com o plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-N (A) + pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N + pTM1-OROV-L (A), respectivamente (coluna 7 e 8) (Fig. 29). 90 Plasmídeo-Concentração(ng/µL) 1 2 pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-OROV-N (A) (300) pTM1-OROV-L (A) (1000) pTVT7-OROV-M-Renilla (500) pTM1-OROV-N (300) pTM1-OROV-L (1000) + + + + + 3 4 5 6 7 + + + + + + + + + + + + + + 8 + + + + Figura 29- Análise da atividade de diferentes sistemas de minigenoma do VORO. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Transfecção de diferentes combinações de plasmídeos de expressão do VORO e os 2 sistemas de minigenoma construídos. Esses resultados mostraram que a atividade do minireplicon, pT7riboSM2OROV-vMpro-vRL, resultou em alta expressão da proteína do gene repórter Renilla, fato não observado em relação a atividade do minireplicon, pTVT7-OROV-M-Renilla. Também observamos uma diferença de 100% no aumento da atividade do plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-N (A), comparado ao plasmídeo suporte pTM1-OROV-N. Além disso, observamos que o plasmídeo de expressão da proteína L do VORO construído no presente estudo, pTM1-OROV-L, possui uma atividade maior comparada a plasmídeo suporte construído pelo grupo da Alemanha, , pTM1OROV-L (A) (Fig. 29). A comparação entre as sequências dos genes dos minireplicons, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL e pTVT7-OROV-M-Renilla, revelou que houve apenas uma mudança nucleotídica na posição 15 na sequência dentro da região não 91 codificante do terminal 5’ do segmento M do VORO (Fig. 30a), no entanto o alinhamento das sequências nucleotídicas do terminal 3’ de ambos minigenomas mostrou que houve duas alterações nas posições 9 e 15 (Fig. 30b). a Consenso Conservação b Consenso Conservação Figura 30 a-b- Alinhamento das sequências da região não codificante do terminal 3’ do segmento M do VORO. a. Uma mudança nucleotídicas foi observada na sequência do terminal 5’ do segmento M entre os minigenomas do VORO, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL e pTVT7-OROV-M-Renilla b. Duas mudanças nucleotídicas foram observadas em ambas as sequências genômicas dos minigenomas do VORO. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa preta. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. A sequência dos genes funcionais dos segmentos L, S (contendo a abrogação de três nucleotídeos da sequência que codifica a proteína não estrutural NSs) e a sequência de ambos os minigenomas foram determinadas. Observamos diferenças nucleotídicas dos genes dos plasmídeos pTM1-OROV-N e pTM1-OROVN (A) em seis posições (ver quadro 13), no entanto, essas diferenças não afetaram as sequências nucleotídicas de ambos os produtos. 92 Quadro 13- Diferenças nucleotídicas na sequência dos plasmídeos pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-N (A) pTM1-OROV-N pTM1-OROV-N (A) Posição nucleotídeo Nucleotídeo Nucleotídeo 72 A G 102 C A 105 T C 543 A G 544 C A 552 C T A comparação da sequência do gene do pTM1-OROV-L com a sequência do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991, disponível no GenBank mostrou diferenças nucleotídicas entre ambas, sendo que estas diferenças resultaram em 15 mudanças aminoacídicas na composição genômica do plasmídeo (Fig 31, 32 e 33 [caixas pretas]). Nenhuma diferença aminoacídica estava presente em alguma das regiões referentes aos quatro motivos conservados da RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Por outro lado, a comparação da sequência do gene do pTM1-OROV-L (A) com a sequência do segmento L da cepa do VORO, TRVL 9760, disponível no GenBank, mostrou diferenças nucleotídicas entre as ambas, sendo que estas diferenças resultaram em 33 mudanças aminoacídicas na composição genômica do plasmídeo suporte pTM1-OROV-L (A) (Fig 31, 32 e 33 [caixas vermelhas]). Observamos mudanças aminoacídicas nas regiões referentes aos motivos um e dois (1 modificação) e três (2 modificações) conservados da RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Adicionalmente, entre os plasmídeos de expressão da polimerase viral L, houve 20 mudanças aminoacídicas, sendo que na posição 1021, essa mudança também foi diferente daquela observada nas sequências das cepas selvagens (Fig 32 [caixa verde]). 93 Figura 31- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa vermelha. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 94 Figura 32- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pelas caixas vermelhas e pretas. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 95 Figura 33- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pelas caixas vermelhas, pretas e caixa verde. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 96 4.7. ANÁLISE DA ATIVIDADE DA REGIÃO CODIFICANTE DO SEGMENTO M DO VORO 4.7.1. Atividade de distintos plasmídeos de expressão do segmento M no sistema de minireplicon do VORO A construção do plasmídeo que expressava as proteínas traduzidas do segmento M do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 8 representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18 horas de incubação a 37ºC, dez colônias dessas células foram selecionadas para serem purificadas e a partir destas extraídos os plasmídeos de expressão advindos do segmento M. Após digestão com as enzimas PmlI e XbaI e análise do gel de agarose, os nove plasmídeos mostraram um padrão de bandas semelhante ao projetado pela programa Serial Cloner 4.1 (Figs. 12 a-c), dessa forma, a continuação do protocolo de co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas traduzidos do segmento M do VORO foi realizado com os mesmos que apresentaram o resultado condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram designados pTM1-OROV-M-1 a 9. A figura 34 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após cotransfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L, minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla (A) como controle positivo, como também, a transfecção dos plasmídeos pTVT7-OROV-M-Renilla (A), pTM1-OROV-N com os respectivos plasmídeos de expressão das proteínas traduzidas do segmento M recém-construídos, pTM1-OROV-M-1 a 9. A co-transfecção das células BSR-T7/5 com o plasmídeo de expressão pTM1OROV-M-1 mostrou uma atividade do minigenoma do VORO 80% menor comparado ao controle positivo. Além disso, observamos que para a co-transfecção das células com os plasmídeos de expressão pTM1-OROV-M 2 a 9 e o minireplicon do VORO houve uma drástica diminuição na atividade do sistema em estudo (entre 88% e 92% (Fig. 34). Diante da análise do resultado do gráfico representativo da atividade do minigenoma quando co-transfectado com os plasmídeos de expressão da proteína M do VORO, o plasmídeo pTM1-OROV-M-1 foi escolhido para ser repicado em bactéria JM109 e estocado para ser utilizado em experimentos posteriores. O plasmídeo recém-construído foi denominado pTM1-OROV-M. 97 Plasmídeo-Concentração(ng/µL) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-OROV-N (1000) pTM1-OROV-L (1000) pTM1-OROV-M-1 (1000) pTM1-OROV-M-2 (1000) pTM1-OROV-M-3 (1000) pTM1-OROV-M-4 (1000) pTM1-OROV-M-5 (1000) pTM1-OROV-M-6 (1000) pTM1-OROV-M-7 (1000) pTM1-OROV-M-8 (1000) pTM1-OROV-M-9 (1000) 1 + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 + 7 + 8 + 9 + 10 + 11 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Figura 34- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a expressão dos plasmídeos PTM1-OROV-M-1 a 9 obtidos das colônias selecionadas. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento M/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Co-transfecção de distintos plasmídeos PTM1OROV-M-1 a 9. 98 4.7.2. Titulação da quantidade do plasmídeo de expressão do segmento M cotranfectado com o sistema de minigenoma do VORO Após a construção e análise do plasmídeo, pTM1-OROV-M, que presumivelmente, expressa as proteínas estruturais, Gn e Gc e a proteína nãoestrutural NSm, foi realizado a co-transfecção com diluições seriadas e progressivas de 200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL, desse plasmídeo em células BSR-T7/5 conjuntamente com os plasmídeos pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L e o minireplicon do VORO. O controle negativo (coluna 1) não mostrou atividade da proteína Renilla confirmando que a presença da polimerase viral L é vital para a construção do sistema de minigenoma do VORO. A adição das diluições de 200 a 600 ng/µL de pTM1-OROV-M para co-transfecção em cultivo celular resultou em uma diminuição de 37% da atividade do minireplicon do VORO, no entanto, para as diluições de 800 e 1000 ng/µL, foi observado uma diminuição de 64% e 79%, respectivamente, na atividade da proteína repórter Renilla (Fig. 35). Plasmídeo-Concentração(ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 pTM1-OROV-L + + + + + + pTM1-OROV-N + + + + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL + + + + + + + pTM1-OROV-M (200 ng/µL) + pTM1-OROV-M (400 ng/µL) + pTM1-OROV-M (600 ng/µL) + pTM1-OROV-M (800 ng/µL) + pTM1-OROV-M (1000 ng/µL) + Figura 35- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-M eleito no estudo. As células foram co-transfectadas com diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) plasmídeo de expressão do segmento M em conjunto com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeos PTM1OROV-M. Média ± DPM (desvio padrão da média). 99 4.8. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO A construção do plasmídeo que expressava as proteínas traduzidas do segmento S do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 8 representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18 horas de incubação a 37ºC, cinco colônias dessas células foram selecionadas para serem purificadas e extraídos os plasmídeos de expressão advindos do segmento S. Após digestão com as enzimas SalI e XbaI e análise do gel de agarose, os cinco plasmídeos mostraram um padrão de bandas semelhante ao projetado pelo programa Serial Cloner 4.1 (Figs. 14 a-c), dessa forma, a continuação do protocolo de co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas traduzidos do segmento S do VORO foi realizado com os mesmos que apresentaram o resultado condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram designados pTM1-OROV-S-1 a 5. Para a construção do plasmídeo que somente expressava a proteína estrutural NSs do VORO foram realizados os mesmos procedimentos descritos anteriormente, no entanto, as enzimas de digestão SalI e HindIII foram utilizadas e oito plasmídeos foram escolhidos por demonstrarem padrões de bandas adequados ao previsto pelo software Serial Cloner 4.1 (Figs. 20 a-c). Os plasmídeos recémconstruídos foram denominados pTM1-OROV-NSs-1 a 8 Os plasmídeos, pTM1-OROV-S-1 a 5, presumivelmente expressavam as duas proteínas, a nucleoproteína N e a proteína não-estrutural NSs. Para determinar o papel da proteína não-estrutural NSs, na expressão do gene viral, o plasmídeo de expressão destas proteínas, pTM1-OROV-S-1 a 5, foram comparados a um plasmídeo que expressava apenas a nucleoproteína, pTM1-OROV-N. A figura 36 mostra que a substituição do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-S-1 a 5 com igual quantidade do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N resultou em um aumento de 88% a 93% da atividade de proteína repórter Renilla. O papel inibitório da proteína não-estrutural NSs foi confirmado pela expressão do sistema do minireplicon do VORO em conjunto com o plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N. A adição de 1000 ng/µL do plasmídeo pTM1-OROVNSs-1 a 8 a mistura de transfecção levou a diminuição drástica na atividade da Renilla (Fig. 37). Como não houve diferenças significativas entre atividade do plasmídeo pTM1-OROV-NSs-1 a 8 no sistema de minigenoma do VORO, o pTM1- 100 OROV-NSs-1 foi escolhido para ser repicado em bactéria JM109 e estocado para ser utilizado em experimentos posteriores. O plasmídeo recém-construído foi denominado pTM1-OROV-NSs. Ao utilizarmos diluições seriadas (200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL) da quantidade de plasmídeos que expressavam a proteína não-estrutural NSs cotransfectado com pTM1-OROV-N no sistema de minireplicon do VORO, o papel inibitório da proteína NSs do VORO foi comprovado novamente. Diminuições drásticas da atividade da Renilla foram observadas, independente das diluições utilizadas do plasmídeo que expressava somente a proteína NSs (Fig. 38). Estes resultados sugerem que a proteína NSs do VORO é um regulador negativo da expressão do gene viral. Plasmídeo- Concentração (ng/µL) pTM1-OROV-L (1000) pTM1-OROV-N (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-OROV-S-1 (1000) pTM1-OROV-S-2 (1000) pTM1-OROV-S-3 (1000) pTM1-OROV-S-4 (1000) pTM1-OROV-S-5 (1000) 1 + + 2 + + + 3 + 4 + 5 + 6 + 7 + + + + + + + + + + + Figura 36- Análise da atividade da região codificante do segmento S do VORO. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento S/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Cotransfecção de distintos plasmídeos pTM1-OROV-S-1 a 5. 101 Plasmídeo- Concentração (ng/µL) pTM1-OROV-L (1000) pTM1-OROV-N (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-Vrl (500) pTM1-OROV-NSs-1 (1000) pTM1-OROV-NSs-2 (1000) pTM1-OROV-NSs-3 (1000) pTM1-OROV-NSs-4 (1000) pTM1-OROV-NSs-5 (1000) pTM1-OROV-NSs-6 (1000) pTM1-OROV-NSs-7 (1000) pTM1-OROV-NSs-8 (1000) 1 + + 2 + + + 3 + + + + 4 + + + 5 + + + 6 + + + 7 + + + 8 + + + 9 + + + 10 + + + + + + + + + Figura 37- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas.. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento M/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Co-transfecção de distintos plasmídeos PTM1-OROV-NSs-1 a 8. + 102 Plasmídeo- Concentração (ng/µL) pTM1-OROV-L (1000) pTM1-OROV-N (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-OROV-NSs (200) pTM1-OROV-NSs (400) pTM1-OROV-NSs (600) pTM1-OROV-NSs (800) pTM1-OROV-NSs (1000) 1 + + 2 + + + 3 + + + + 4 + + + 5 + + + 6 + + + 7 + + + + + + + Figura 38- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs eleito no estudo. As células foram co-transfectadas com diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) plasmídeo que expressava a proteína não-estrutural NSs em conjunto com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-OROV-NSs. Média ± DPM (desvio padrão da média). 103 4.9. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS DO VORO POR IMUNOMARCAÇÃO A imunomarcação anti-antígeno viral dos cultivos de células BSR-T7/5 não transfectados com plasmídeo algum ou transfectado com os plasmídeos de expressão PTM1-OROV-L/M e NSs foi negativa (Figs. 39 a-d) Ao passo que, a replicação viral foi confirmada através da imunomarcação usando soro homólogo hiperiume contra OROV. Os cultivos transfectados com pTM1-OROV-N, PTM1OROV-L e N e co-transfectados com pTM1-OROV-L/N e o minigenoma do VORO mostraram uma imunomarcação positiva (Figs. 40 a-c). Observamos que esta positividade foi observada nos cultivos que continham o plasmídeo que expressava a nucleoproteína do VORO. b a 50 µm 50 µm d c 50 µm 50 µm Figura 39 a-d- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. Transfecção do cultivo celular com os seguintes plasmídeos: a) pTM1-rsem inserto; b) pTM1-OROV-L; c) pTM1-OROV-NSs e d) pTM1-OROV-M. 104 a 20 µm b 20 µm c 50 µm Figura 40 a-c- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. Transfecção do cultivo celular com os seguintes plasmídeos: a) pTM1-OROV-N; b) pTM1-OROV-N + pTM1-OROV-L; c) Co-transfecção pTM1-OROV-N + pTM1-OROV-L e minigenoma do OROV 105 4.10. ANÁLISE DA TRANSFECÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO COM O MINIGENOMA DO VBUN O VBUN é o protótipo da família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, assim como o VORO, apresenta padrões genotípicos e fenotípicos semelhantes. Diante desse fato, realizamos diferentes combinações entre os minigenomas do VBUN e dos dois distintos minigenomas do VORO aqui em estudo para analisarmos a habilidade replicativa de uma possível quimera dos vírus em questão. As figuras 41 e 42 mostram que a atividade do minigenoma do VBUN é 2000 vezes maior que a atividade do gene repórter, Renilla luciferase, comparado a ambos e distintos sistemas de minireplicon do VORO, atividade em unidades de luz para ambos os sistemas, 119 e 238,3, respectivamente (1, 2 e 3). Observamos que a co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas L e N do VBUN, pTM1--BUNV-L e pTM1-BUNV-N com os dois minigenomas do VORO, pTVT7OROV-M-Renilla e pTVT7-OROV-M-Renilla (A) resultou na transcrição de ambos minireplicons o que levou a expressão do gene repórter (5 e 11), apesar das diferenças observadas na quantificação do sistema, 113,2 e 3075 unidades de luz, respectivamente (Fig. 41). O resultado da quantificação da atividade do minireplicon do VBUN co-transfectado com os plasmídeos de expressão das proteínas L e N do VORO, pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N, foi 1000 vezes maior e 2000 vezes menor que os resultados descritos em texto anterior, respectivamente (Fig. 41). Em um experimento separado, a combinação do minigenoma do VBUN com os plasmídeos pTM1-OROV-L (A) e pTM1-OROV-N (A) também levou a ativação do gene repórter, no entanto, em uma escala mais baixa, 87,48 unidades de luz (Fig. 42). 106 Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pTM1-BUNV-N (1000) pTM1-BUNV-L (1000) pTVT7-BUNV-M-Renilla (500) pTM1-OROV-N (1000) pTM1-OROV-L (1000) pTVT7-OROV-M-Renilla (500) pTM1-OROV-N (A) (1000) pTM1-OROV-L (A) (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Figura 41- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. As células foram co-transfectadas com diferentes combinações de plasmídeos de expressão das proteínas L e nucleoproteínas, além dos mingenomas do VORO e VBUN 1. Controle positivo: minigenoma VBUN. 2. Controle positivo: minigema VBUN. 3. Controle positivo minireplicon VORO (A) 4 a 12. Diferentes combinações dos plasmídeos em estudo para transfecção em células BSR-T7/5. 107 Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pTM1-BUNV-N (1000) pTM1-BUNV-L (1000) pTVT7-BUNV-M-Renilla (500) pTM1-OROV-N (1000) pTM1-OROV-L (1000) pTVT7-OROV-M-Renilla (500) pTM1-OROV-N (A) (1000) pTM1-OROV-L (A) (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Figura 42- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. As células foram co-transfectadas com diferentes combinações de plasmídeos de expressão das proteínas L e nucleoproteínas, além dos mingenomas do VORO e VBUN 1. Controle positivo: minigenoma VBUN. 2. Controle positivo: minigema VBUN. 3. Controle positivo minireplicon VORO (A) 4 a 11. Diferentes combinações dos plasmídeos em estudo para transfecção em células BSR-T7/5. 108 4.11. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO VBUN NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO E DA PROTEÍNA NÃOESTRUTURAL NSs DO VORO NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VBUN Para investigarmos uma possível função nos elementos das sequências conservadas entre os vírus VBUN e VORO, pertencentes ao gênero Orthobunyavirus, na regulação na reconstituição da polimerase do VORO e VBUN, nós observamos o efeito da proteína NSs entre ambos os membros do genêro em estudo em seus respectivos sistemas de minireplicon. A sequência da proteína NSs do VBUN e VORO possuem 24% de identidade aminoacídica, no entanto, algumas regiões conservadas foram observadas (Fig. 43) Ao utilizarmos diluições seriadas (200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL) da quantidade de plasmídeos que expressavam a proteína não-estrutural NSs do VORO e do VBUN co-transfectados com pTM1-BUNV-N, pTM1-BUNV-L e minigenoma do VBUN, assim como, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L e minireplicon do VORO, respectivamente, observou-se que a expressão da proteína não-estrutural NSs do VBUN é um inibidor mais potente na atividade do minigenoma que a expressão da proteína não-estrutural do deste vírus. O papel inibitório da proteína NSs do VORO e do VBUN foi observado. (Fig. 44). Figura 43- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína não estrutural NSs do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-BUNV-NSs e pTM1-OROV-NSs. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pelas caixas pretas. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência. 109 Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pTM1-OROV-N (1000) pTM1-OROV-L (1000) pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) pTM1-BUNV-NSs (200) pTM1-BUNV-NSs (400) pTM1-BUNV-NSs (600) pTM1-BUNV-NSs (800) pTM1-BUNV-NSs (1000) pTM1-BUNV-N (1000) pTM1-BUNV-L (1000) pTVT7-BUN-M-Renilla (500) pTM1-OROV-NSs (400) pTM1-OROV-NSs (600) pTM1-OROV-NSs (800) pTM1-OROV-NSs (1000) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Figura 44- Efeitos da proteína não estrutural NSs. As células foram co-transfectadas com diluições seriadas (400 a 1000 ng/µL) do plasmídeo que expressava a proteína não-estrutural NSs do VORO ou VBUN em conjunto com pTM1-BUNV-N e minireplicon do VBUN 1 e com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1, respectivamente. Controle negativo. 2. Controle positivo. 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-BUNV-NSs. 8. Controle positivo. 9-12. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-OROV-NSs. + 110 5. DISCUSSÃO O passo inicial em direção a construção de um sistema de recuperação viral é a geração de um sistema de minireplicon que permite a reconstituição intracelular de ribonucleoproteínas recombinantes do vírus em estudo. Esses sistemas são ferramentas importantes para análise da replicação viral sem a necessidade da realização de uma infecção viral. No caso do VORO, um vírus tri-segmentado, os minigenomas correspondem a segmentos artificiais semelhantes ao do vírus original que consistem nos genes repórter flanqueados pelas regiões não codificantes do vírus. Essas regiões não codificantes contêm os sinais regulatórios para transcrição e replicação da polimerase viral. No sistema de minireplicon, as ribonucleoproteínas recombinantes que contêm segmentos parecidos com os dos vírus são reconstituídas in vivo pela expressão da polimerase L e nucleoproteína do VORO. A proteína N engloba o RNA viral e somente as ribonucleoproteínas servem como modelo para ação da polimerase viral L. A replicação e a transcrição das ribonucleoproteínas resultam na expressão do minigenoma repórter que indica a funcionalidade de ambos a região não codificante viral e expressão das proteínas (Fig. 22) (Dunn et al., 1995). Os sistemas de minireplicon são instrumentos sofisticados para estudar a transcrição, replicação e empacotamento de vírus de RNA de filamento negativo. Para se obter um genoma de RNA de sentido negativo, um RNAm de sentido positivo complementar e com a sequência completa, o antigenoma, deve ser sintetizado. Esta molécula difere do RNAm de sentido positivo por não possuir o iniciador para o começo da extensão no terminal 5’ e para extensão no terminal 3’ ao terminal 5’, do modelo do RNA genômico (Dunn et al., 1995). Para o VORO (Bunyaviridae, Orthobunyavirus), o segundo arbovírus mais importante em termos de saúde pública depois do VDEN, o sistema de minireplicon foi o primeiro a ser descrito para este agente viral. Os bunyavírus replicam-se no citoplasma (Schmaljohn, 1996). Devido a este fato, o primeiro sistema de minireplicon construído para os bunyavírus, VBUN e VRVF, recaem na utilização da T7RNAP, que se localiza no citoplasma, para a transcrição dos seus respectivos minigenomas (Dunn et al., 1995; Lopez et al., 1995), no entanto, os minireplicons do 111 VUUK e VLAC foram construídos sob o controle do promotor da enzima RNAPI, localizada no núcleo das células (Flick & Pettersson, 1989a; Blakqori et al., 2003). A enzima T7RNAP foi escolhida para a transcrição do minireplicon e dos genes do VORO por ser funcional em vários tipos celulares e por localizar-se no citoplasma, além disso, a razão pelo qual a RNAPI não foi escolhida foi em decorrência de que as sequências promotoras dessa enzima são espécieespecíficas o que restringe as opções de uma determinada linhagem celular em que um sistema de minigenoma pode ser usado. Adicionalmente, os transcritos dos sistemas de genética reversa que são construídos sob o controle da RNAPI podem sofrer splicing (emendas) no núcleo e os minireplicons tendem a apresentar baixo sinal de atividade (Elliott & Blakqori, 2011). Neste trabalho, um segmento modelo do VORO sob o controle da T7RNAP consistindo do gene da Renilla Luciferase posicionado no sentido negativo e flanqueado pela região consenso das regiões 3’ e 5’ não codificantes do segmento MRNA foi eficientemente transcrito na presença dos segmentos dos genes do VORO expressos, segmento L (polimerase viral L), segmento S (proteínas N e NSs) e segmento S ab-rogado na região codificante da proteína não estrutural NSs (proteína N apenas) (Figs. 23, 28, 29), Tal resultado confirmou que a enzima T7RNAP foi uma escolha adequada para a construção do sistema de minireplicon do VORO. A enzima tem sido utilizada para a construção de minigenomas para outros bunyavírus, tais como o VBUN, VLAC e VRVF (Bridgen & Elliott, 1996; Blakqori & Weber, 2005; Ikegami et al., 2006). O transcrito do minireplicon e do RNAm da Renilla luciferase foram exclusivamente produzidos pelo complexo de replicação do vírus, dessa forma, a ativação da Renilla luciferase observada no sistema de minireplicon reflete a replicação e transcrição das ribonucleoproteínas recombinantes do VORO reconstituídas in vivo. Este resultado indica que a replicação e a transcrição do VORO necessitam de ambas as proteínas, a polimerase viral L e a nucleoproteína N, o que também foi observado para outros sistemas de minireplicon de bunyavírus, e, assim como no presente estudo, esses trabalhos também utilizaram a região consenso da região não codificante do segmento M para construção dos seus respectivos sistemas de minigenoma (Figs. 24, 28 e 29) (Dunn, et al., 1995; Lopez, et al., 1995) 112 A escolha do promotor do segmento M para construção do minigenoma do VORO deveu-se ao fato de experimentos com outros minigenomas de bunyavírus terem comparado a eficiência dos promotores existentes nos três segmentos virais (S, M e LRNA). Estes experimentos demonstraram que em células de mamíferos o promotor do segmento M foi o mais ativo, sendo que o promotor do segmento L demonstrou um padrão de ativação intermediário e o promotor do segmento S mostrou-se com o menor nível de ativação (Barr et al., 2003; Kohl et al., 2004). Interessante notar que em células de mosquitos, o promotor do segmento M foi novamente mais ativo, no entanto, os promotores dos segmentos S e L demonstraram um padrão de atividade similar (Barr & Wertz, 2004; Kohl et al., 2004). Os dois minigenomas do VORO utilizados neste trabalho apresentaram níveis de atividades divergentes para a proteína Renilla. O minigenoma, pT7riboSM2OROV-vMpro-vRL, mostrou-se ativo comparado ao minigenoma construído neste estudo, pTVT7-OROV-M-Renilla (Figs. 23 e 29). Mesmo quando o minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla foi co-transfectado com plasmídeos de expressão da proteína N e L não houve uma aumento satisfatório da atividade do sistema (Fig. 29). Comparando as sequências das regiões não codificantes dos terminais 5’ e 3’ observou-se que houve mudanças nucleotídicas na posição 9 no terminal 3’ e na posição 15 para ambos os terminais do minigenoma pTVT7-OROV-M-Renilla comparado com as sequências das regiões não codificantes do vírus, BEAN 19991 e do minigenoma pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (Figs. 30a-b). Sabe-se que os 11 nucleotídeos das regiões terminais de cada segmento genômico são aparentemente altamente conservados para todos os orthobunyavírus (Elliott et al.,1990). Logo após a sequência terminal conservada, pequenas sequências específicas dos segmentos são encontradas, em torno de 3 ou 4 nucleotídeos downstream, que são conservadas entre vírus do mesmo sorogrupo e, após esses nucleotídeos, as sequências são altamente variáveis entre segmentos, tanto entre cepas diferentes quanto segmentos análogos do mesmo vírus (Elliott et al.,1990). As diferenças nas atividades da Renilla entre os minireplicons podem ter sido observadas pela mudança nucleotídica na região altamente conservada da sequência da região não codificante do terminal 3’, posição 9, como também, das outras duas alterações apresentadas anteriormente no minigenoma pTVT7-OROVM-Renilla. Korl e colaboradores (2003 e 2004) demonstraram que uma única 113 mutação de ponto dentro da região promotora pode ocasionar eliminação ou aumento da atividade promotora. Nesse trabalho, análises mutagênicas foram realizadas nos 15 primeiros nucleotídeos das terminais 3’ e 5’ do segmento S do VBUN. A maioria das alterações dentro dessa região diminuiu drasticamente a atividade da proteína repórter CAT utilizada no estudo. Flick e colaboradores (2004) introduziram mutações de ponto nas regiões promotoras do segmento M do VUUK um membro da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus. O estudo em questão observou duas regiões regulatórias importantes dentro da região promotora (posições 3 a 5; posições 2 a 4 e posição 8). Mudanças nucleotídicas complementares na região promotora, o que manteve a possibilidade de pareamento nucleotídico entre os terminais 3’ e 5’, demonstrou que os nucleotídeos nas duas regiões descritas eram essenciais para o reconhecimento de um padrão base-específico, logo, a preservação do pareamento de base formando a estrutura em forma de “panhandle” entre os terminais 5’ e 3’ não foi suficiente para ativar o promotor. Em resumo, o estudo demonstrou que ambos os terminais do segmento M constroem uma região promotora e estão envolvidos no reconhecimento específico da polimerase viral L. Outro fator que pode ter ocasionado as diferenças entre as atividades da proteína repórter, Renilla, é a complementariedade, que junto com a definição da sequência correta dos nucleotídeos, são necessárias para o funcionamento do promotor (Barr & Wertz, 2004; Kohl et al., 2004). Trabalhos realizados com vírus de RNA de filamento negativo demonstraram que os segmentos S, M e L dos bunyavírus possuem uma complementariedade entre os terminais 3’ e 5’ das regiões não codificantes. Essa característica foi confirmada pela visualização da conformação circular das ribonucleoproteínas dos bunyavírus, como também, análises bioquímicas demonstraram que os nucleotídeos dos terminais 3’ e 5’ das regiões não codificantes dos bunyavírus pareiam-se em bases entre si (Pettersson et al., 1975; Obijeski et al., 1976; Raju et al., 1989). Esse pareamento permite a formação de estruturas “panhandle” (forma de cabo e raquete ou cabo de caçarola) que são características de vírus segmentados de filamento negativo (Elliott et al., 1991). Estudos adicionais realizados com o VBUN demonstraram que a atividade da proteína repórter CAT foi apenas observada quando 14 a 16 nucleotídeos eram complementares entre si nas regiões terminais 3’ e 5’ do segmento S do vírus 114 demonstrando que complementariedade ultrapassada aos 11 nucleotídeos das regiões conservadas é crítica para formação de estruturas secundárias nos terminais para permitir a sinalização aos processos de transcrição e replicação (Barr & Wertz, 2004; Kohl et al., 2004) A eficiência do minigenoma do VORO, ao ser co-transfectado com os plasmídeos de expressão da polimerase L, em torna-se partícula viral foi alta, variou entre 267%, 472% e 587% em relação ao controle positivo (Fig 28). Uma comparação mais aprofundada utilizando-se combinações diferentes entre os sistemas de minigenomas do VORO e plasmídeos suportes demonstrou que a cotransfecção com o plasmídeo de expressão pTM1-OROV-L (A) diminuiu em 53,4% a atividade da proteína repórter (coluna 4) comparado a co-transfecção do minireplicon com o plasmídeo suporte pTM1-OROV-L, construído nesse estudo (colunas 5 e 6) (Fig. 29). Uma primeira comparação da sequência da região codificante da polimerase L descrita no presente estudo com as sequências da região codificante do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L (A) com as sequências dos vírus protótipo e topótipo do VORO, TRVL 9760 e BeAn19991 obtidas do Genbank, mostrou 33 e 15 mudanças aminoacídicas, respectivamente (Figs. 31, 32 e 33). A região codificante do segmento L do VORO obtida neste estudo foi amplificada em um único experimento utilizando-se o kit “KOD hot-start polymerase”. Este kit contém uma enzima KOD DNA polimerase proof-reading o que facilitou a clonagem do gene L no plasmídeo pTM1_, pois esta enzima produz produtos de PCR sem nucleotídeos protudentes, dessa forma, prontos para serem ligados ao vetor. Além disso, a DNA polimerase KOD possui alta fidelidade nas sequências amplificadas o que nos leva a crer que as mutações ressaltadas para o plasmídeo pTM1-OROV-L pode ter sido de artefatos mediados pelo RT-PCR. Essa desvantagem na técnica foi observada por outros estudos e deve ser levada em consideração quando houver tentativa de amplificar corretamente fragmentos longos de DNA (Yount et al., 2003). As 33 mudanças aminoacídicas notadas entre a sequência do plasmídeo pTM1-OROV-L (A) e da cepa TRVL 9760, foram observadas nas regiões referentes aos motivos um e dois (1 modificação) e três (2 modificações) conservados da RNA polimerase dependente de RNA do VORO (Figs. 31, 32 e 33). Essas mutações 115 podem ter ocasionado as alterações da atividade da proteína repórter observadas quando houve co-transfecção com os plasmídeos de expressão pTM1-OROV-L (A) e pTM1-OROV-L (Fig. 29). Análises das sequências do segmento L do VBUN identificou seis motivos (premotivo A e motivos de A a E) que estão localizados no centro da molécula e são comuns para todos as RNA polimerases dependentes de RNA (Poch et al.,1989). A grande semelhança entre a subunidade da polimerase PB1 e os vírus Influenza sugere que esta região contém funções importantes da polimerase como a ligação do RNA viral, adição de nucleotídeos e clivagem da região cap (Aquino et al., 2003). Dunn e colaboradores em 1995 demonstraram que alterações de aminoácidos altamente conservados nos motivos A, B ou C na proteína L do VBUN ab-rogou a atividade da polimerase viral no sistema de minireplicon. Nenhuma alteração nesses motivos foi observada para a sequência do plasmídeo pTM1OROV-L construído neste estudo evidenciando, desta forma, a perfeita atividade da construção. Blakqori et al (2001) introduziram mutações nos motivos A e B do segmento L do VLAC o que levou a um leve aumento na atividade repórter do sistema de minigenoma desse vírus, sendo esta alteração favorável ao funcionamento da polimerase viral L no sistema de minireplicon. Outro estudo que determinou os efeitos de mutações introduzidas ao acaso em genomas virais, refere-se a insersões de mutações no genoma do VSV (vírus de RNA de filamento negativo). O trabalho evidenciou que a combinação de mutações criou um genótipo não viável, um caso extremo de “letalidade sintética”-mudanças realizadas em genes leva a morte celular ou do organismo (Sanjuan et al., 2004). Não se sabe ao certo se as mutações observadas neste estudo afetaram a transcrição, a replicação ou ambos os processos. Estudos futuros no que tange a obtenção de concentrações do RNA viral, das espécies de RNAm do minigenoma através da técnica de Northen blot tornam-se necessários para a obtenção de respostas sobre a ação das mutações nos processos de transcrição e replicação viral. O modelo para transcrição e replicação dos vírus de RNA de filamento negativo não é o RNA, mas o RNA encapsulado pela proteína do nucleocapsídeo viral, nucleoproteína N, na forma de complexos ribonucleoprotéicos (ribonucleoproteínas). Tanto o RNA genômico quanto o antigenômico são 116 encontrados apenas na forma de ribonucleoproteínas, indicando que a encapsulação do RNA é cotranscricional, no entanto, o RNAm viral não é encapsulado pela proteína N para permitir o acesso da transcrição protéica. A proteína N tem um papel importante na mudança da atividade de transcrição para a atividade de replicação da polimerase viral L (Elliott, 2005) Neste trabalho foi construído o plasmídeo de expressão da nucleoproteína N do VORO, pTM1-OROV-N, pela ab-rogação de nucleotídeos, por mutagênese sítio específico, nas posições 24 (T→ C), 69 (T→C) e 72 (G→A) do gene do segmento S contendo a sequência codificadora da proteína NSs, assim, permitindo a construção de um plasmídeo suporte que expressava apenas a nucleoproteína N do VORO (Figs. 15, 16 e 17). Os diferentes clones construídos neste estudo apresentaram mudanças nucleotídicas e aminoacídicas em suas sequências genômicas quando comparados a sequência do VORO, cepa BeAn 19991. A sequência do plasmídeo pTM1-OROVN-1 mostrou-se truncada a nível do terminal 3’ quando comparado às sequências dos outros plasmídeos construídos e do vírus selvagem, BeAn 19991, sendo observada a diminuição em 40% da atividade do minigenoma do VORO (Figs. 24, 25 e 26). Já a sequência do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-11, apresentou uma mudança nucleotídica (C →T) na posição 38 o que levou a uma mudança traducional de uma proteína (T→ I) (Fig 27). Além disso, outras três mudanças nucleotídicas foram observadas nas posições 543 (G→A), 544 (A →C) e 558 (T→C) (Fig. 26). Aparentemente, as mudanças não acarretaram alterações na expressão da proteína N do VORO no sistema de minigenoma. Eifan & Elliott, 2009, utilizaram o sistema de minigenoma do VBUN para estudar os efeitos de mutações de ponto em 10 resíduos do terminal N e em 17 resíduos do terminal C na proteína N do VBUN em relação a síntese de RNA. Este estudo mostrou diferentes níveis de atividades dos mutantes das proteínas N do VBUN no sistema de minigenoma pode ter ocorrido devido a proteína mutante N ser defeituosa e não acontece o empacotamento das ribonucleoproteínas, montagem do virion ou a proteína N é instável ou é pouco expressa pelo plasmídeo. Após transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos de expressão das proteínas N, L, NSs, M, observamos que após marcação com o anticorpo policlonal anti-VORO, a imunofluorescência mostrou-se positiva apenas quando o cultivo estava transfectado com a nucleoproteína N, com a proteína N combinada a 117 proteína L ou com o sistema de minireplicon do VORO (Figs. 40 a-c), não sendo observado marcação nos outros experimentos realizados (Figs. 39 a-d), o que demonstrou a expressão da proteína N e o papel importante dessa nucleoproteína e da polimerase L na replicação e a transcrição do VORO. A produção de partículas semelhantes a vírus, “virus-like particles”, e sua utilização no processo de expressão de proteínas recombinantes tem mostrado ser uma técnica importante para estudo da relação vírus/célula em termos da ligação parasita/hospedeiro (Palucha et al., 2005). A ligação do vírus na célula provavelmente necessita de todos os componentes da replicação viral, incluindo proteínas estruturais e não estruturais, assim como, o genoma viral ou seu análogo. No presente estudo, utilizou-se a incorporação do segmento do minigenoma do VORO para realizar a medição da atividade da Renilla e determinam indiretamente a produção de VLP. Primeiramente, as células transfectadas com o minigenoma, pT7riboSM2OROV-vMpro-vRL, em conjunto com os plasmídeos de expressão da polimerase viral L (pTM1-OROV-L) e da nucleoproteína N (pTM1-OROV-N) (Fig. 34, coluna 1) ou com os plasmídeos de expressão das proteínas L, N e das glicoproteínas Gn/Gc (pTM1-OROV-M) (Fig. 34, coluna 2) demonstrou que houve uma atividade da proteína repórter Renilla. Resultados semelhantes foram observados para o VUUK, no entanto, os experimentos para geração de VLP desse vírus foram caracterizados pela utilização de outra proteína repórter, a proteína CAT (Overby et al., 2006). Como a concentração das proteínas Gn/Gc é essencial para geração de VLP, foi realizado no presente estudo, a análise da dependência do VLP em relação a distintas concentrações das glicoproteínas do VORO. Diferentes quantidades de plasmídeos que expressavam as glicoproteínas Gn/Gc, pTM1-OROV-M (concentrações entre 200 a 1000 ng/µL), juntamente com os plasmídeos que expressavam as proteínas L e N e o minireplicon do VORO foram co-transfectados em células BSR-T7/5 (Fig. 35). Diferentemente dos resultados observados por Overby e colaboradores (2006) para o VUUK, na construção do minireplicon contendo as proteínas Gn/Gc para o VORO não foi observado um aumento dosedependente da atividade das proteínas repórter nas células transfectadas em relação ao aumento da quantidade de glicoproteínas. A diminuição da atividade da Renilla observada em todas as concentrações utilizadas do plasmídeo pTM1-OROV-M pode ter sido causada por alterações nas 118 sequências nucleotídicas e aminoacídicas nesse plasmídeo. Shi e colaboradores, 2006, demonstraram que deleções no segmento completo NSm ou das regiões dos domínios I, II, III ou V do segmento precursor da poliproteína M do VBUN não produziram VLPs, no entanto, houve a recuperação de VLPs de plasmídeos que continham deleções no domínio IV. Em relação às glicoproteínas virais, Overby et al (2006) encontraram dois mecanismos diferentes responsáveis pela ausência de atividade da proteína repórter mediada por VLP. Eles demonstraram que dois resíduos da cauda citoplasmática da proteína Gn, L23 e L24, são importantes para geração e montagem de VLP na membrana do Golgi. Outros três resíduos na cauda Gn, L46, E47 e L50, foram considerados importantes na localização intracelular de ambas as glicoproteínas, além disso, mutações nesses resíduos preveniu a ação efetiva dessas duas glicoproteínas ao Golgi e subsequente formação de VLPs. Novos estudos são necessários para análise de VLP do VORO e para o aprimoramento da construção desse sistema para esse vírus. Recentemente, as VLPs têm sido desenvolvidas para o VRVF, como também utilizadas como um modelo de vacina em camundongos (Habjan et al., 2009; Naslund et al., 2009). Essas VLPs, quando analisadas ao microscópio eletrônico, tem uma morfologia semelhante às partículas de VRVF. Além disso, essas VLPs contém glicoproteínas virais em seu envelope, proteínas estas que são reconhecidas por antissoro e contém um minigenoma ativo, mas não se replicam ou produzem progenes (Habjan et al., 2009). Em geral, as VLPs possuem propriedades similares a cepas virulentas de seus agentes correspondentes, pois os antígenos estruturais predominantes são apresentados ao sistema imune na conformação nativa (Grgacic & Anderson, 2006). As vacinas disponíveis contra o VRVF são baseadas em preparações com vírus inativados. Apesar de algumas desvantagens terem sido relatadas sobre esta vacina (Lubroth et al., 2007), um candidato a vacina “viva” contra VRVF foi produzido em que era observado a deleção no genoma viral de dois fatores de virulência, as proteínas não estruturais NSs e NSm (Bird et al., 2008). Como houve a completa deleção desses dois genes envolvidos na virulência, acredita-se que seja improvável que o vírus possa reverter e tornar-se virulento novamente, no entanto, outras desvantagens de vacinas “vivas” são a necessidade de aumentar o nível de biossegurança para produção das mesmas e o risco de utilizar vírus atenuados em indivíduos imunocomprometidos (Naslund et al., 2009). 119 Este estudo demonstrou que a proteína não estrutural NSs do VORO regula negativamente a polimerase viral no sistema de minireplicon que reconstitui o nucleocapsídeo do VORO a partir do cDNA transfectados. A proteína NSs mostrouse altamente ativada, com a concentração plasmidial de 200 ng/mL a 1000ng/mL resultando em 90% na redução da atividade da Renilla (Fig. 38). Para o VBUN foi observado uma redução de aproximadamente 60% da atividade no sistema de minigenoma (Weber et al., 2001). Em outro experimento com células de mamíferos, a proteína NSs foi detectada até 6 horas após infecção e o nível de expressão foi considerado semelhante ao da nucleoproteína N do VBUN que é traduzida do mesmo RNAm (Scallan & Elliott, 1992). A proteína não estrutural NSs é ativa em baixa concentração plasmidial, assim como, em relação ao contexto natural da expressão do gene do segmento S do VORO (Fig. 36) o que sugere que o efeito é autêntico e pode também ser funcional na infecção do VORO, fato este também observado para o VBUN e VLAC (Weber et al., 2001; Blakqori et al., 2003). Interessante notar que para o VRVF não foi observado o efeito inibitório da proteína não estrutural NSs em relação ao sistema de minigenoma, pelo contrário foi observado aumento da atividade do gene repórter (Ikegami et al., 2005). Fato este distinto daqueles observados por outros dois grupos de pesquisa que demostraram um efeito inibitório da proteína NSs no minireplicon do VRVF (Ikegami et al., 2005; Bouloy & Weber, 2010; Brennan et al., 2011). O efeito inibitório da proteína NSs pode depender da presença de uma região codificante intacta, o que foi observado neste estudo, já que as mutações de códons de iniciação em um plasmídeo suporte do segmento S do VORO aboliu os efeitos da proteína NSs (Fig. 37). Este episódio demonstra evidências que o efeito foi mediado pela proteína NSs em vez de ter sido mediado pelo RNA. Em outro estudo, houve relato que proteína NSs do VBUN afeta os promotores dos três segmentos virais, no entanto, é possível que a proteína NSs iniba a atividade básica da polimerase viral, tanto por interação direta quanto por ação de cofatores celulares (Scallan & Elliott, 2000). No presente estudo, testou-se tendo sido observado que a mesma possui um papel inibitório na polimerase do VORO (Fig. 44), indicando um mecanismo altamente conservado que pode agir entre os limites do gênero do Orthobunyavirus. Iroegbu & Pringle (1981) observaram que o rearranjo entre vírus compatíveis do 120 gênero Orthobunyavirus ocorre exclusivamente na fase inicial do ciclo replicativo. Estudos anteriores com VBUN mostraram que a proteína NSs se acumula nas células durante a infecção viral e está localizada no citoplasma, onde ocorre a replicação da maioria do bunyavírus. Dessa forma, é possível que altos níveis da proteína NSs alcançados durante a infecção possa suprimir o crescimento de um segundo bunyavírus na mesma célula (Scallan & Elliott, 1992; Weber et al., 2001). Um estudo com a proteína não estrutural do VRVF, membro do gênero Phlebovirus, mostrou que a mesma não produz um efeito negativo em sistema de minireplicon VBUN (Lopez et al., 1995). A proteína NSs dos vírus desses dois gêneros da família Bunyaviridae são diferentes, em tamanho, sequência primária, e no modo de codificação, sugerindo uma diversidade funcional; dessa forma, é possível que as proteínas não estruturais NSs desses dois gêneros diferentes tenham adotado funções diferentes ou que se sobrepõem em relação a replicação viral (Scallan & Elliott, 2000). Interessante notar que a proteína NSs mostrou-se não essencial para viabilidade dos vírus em sistemas de recuperação deficientes em NSs, VBUN, VLAC e VAKA (Bridgen et al., 2001; Blakqori & Weber, 2005; Ogawa et al., 2007). A relevância do efeito inibitório da proteína NSs no sistema de minireplicon não é totalmente clara, pois a ausência da proteína não afeta a titulação do VBUN em células BHK e não causa detrimento para o VLAC em células VERO. (Bridgen et al., 2001; Blakqori et al., 2007). Além disso, estudos recentes mostraram que ambas as proteínas NSs do VBUN e VRVF possuem papel antagonista na resposta ao interferon em camundongos IFN competentes e células mamárias, sendo esta proteína identificada como um fator virulento e antagonista do sistema do interferon (Haller et al., 2000; Bridgen et al., 2001). As viroses com genomas segmentados podem trocar segmentos genômicos, dando origem a viroses heterotípicas. Recombinações de segmentos de RNA entre vírus com genomas segmentados pertencentes ao mesmo gênero ou sorogrupo foram mostradas para membros da família Bunyaviridae tanto in vivo quanto in vitro (Pringle, 1996; Sall et al., 1999). Com objetivo de avaliar a base molecular da recombinação entre VORO e VBUN, ambos orthobunyavírus, em um modelo heterólogo, nós investigamos se os respectivos complexos de transcrição seriam ativos. 121 No presente trabalho, as células BSRT-7/5 foram transfectadas com determinadas combinações possíveis entres os plasmídeos de expressão das nucleoproteínas N, polimerase viral L e minigenomas do VORO e VBUN. A proteína repórter Renilla foi detectada quando houve co-transfecção das células com os plasmídeos de expressão das proteínas N e L do VBUN com transfecção com o minigenoma do VORO ou quando houve co-transfecção das células com os plasmídeos de expressão das proteínas N e L do VORO com transfecção com o minigenoma do VBUN (Fig. 41, colunas 7 e 11; Fig 42), mostrando que o complexo de transcrição de ambos os vírus podem reconhecer o terminal das sequências genômicas do VORO e VBUN. Adicionalmente, observamos que não houve atividade da proteína repórter quando houve substituição da nucleoproteína N do VORO pela proteína L do VBUN, quando houve substituição da nucleoproteína L do VORO pela proteína N do VBUN ou vice-versa (Figs. 41 e 42). Presume-se que complexos funcionais de proteínas de nucleocapsídeos heterólogas não tenham sido formados. Chandrika e colaboradores, 1995, relataram que foi possível trocar a nucleoproteína do vírus Sendai pela nucleoproteína do vírus do Sarampo, ambos Paramixovírus (vírus de RNA, não segmentado, filamento negativo) sem dano a síntese dos respectivos genomas. Várias tentativas foram realizadas para investigar se os complexos de replicação de vírus de RNA de filamento negativo poderiam reconhecer modelos de RNA heterólogos. Dimock & Collins (1993) demonstraram que a recuperação do minigenoma do hPIV tipo 3 não foi suportada pelo RSV, como também, pelo PIV bovino tipo 3. Para o VSV, foi demonstrado que a substituição de partículas defeituosas entre dois sorotipos diferentes, New Jersey e Indiana, foi apenas possível quando o complexo replicativo foi fornecido pelo sorotipo do VSV- New Jersey e o minigenoma do VSV-Indiana (Moyer, 1989), dessa forma, parecem que na maioria dos casos os complexos de replicação são altamente específicos para RNA homólogos. Ressaltamos que nossos resultados mostraram que o minigenoma do VORO foi aceito como modelo para o complexo de replicação do VBUN e vice-versa, ou seja, houve empacotamento, replicação, transcrição para ambos os vírus. A transcrição do terminal 3’ e 5’ de ambos os vírus indica que os sinais de inicialização e de parada não são altamente específicos para o VORO e VBUN, mas podem ser reconhecidos para os dois orthobunyavírus. 122 Por fim, o sistema de minireplicon desenvolvido para o VORO constitui o primeiro sistema genético construído para um vírus brasileiro e pode ser utilizado para reconstruir geneticamente as regiões não codificantes e os genes virais objetivando estudar as funções de determinadas regiões do genoma e regiões gênicas ao longo de diferentes períodos do ciclo replicativo viral, tais como a transcrição, replicação e empacotamento das ribonucleoproteínas. Ademais, o sistema de minireplicon para o VORO pode constituir uma poderosa ferramenta para a construção de proteínas recombinantes e desenvolvimento de antivirais em potencial que possam ser utilizados em terapias antivirais em nível de saúde pública. 123 6. CONCLUSÃO Este trabalho descreveu pela primeira vez o sistema de minireplicon para um importante agente patogênico, o VORO, o segundo arbovírus causador de doença em humanos, após o VDEN; Primeiro sistema genético construído para um vírus brasileiro; A enzima T7RNAP foi funcional para a transcrição do minireplicon e dos genes do VORO; O promotor do segmento M foi eficiente para ativação do sistema de minigenoma do VORO; A polimerase viral L e a nucleoproteína N do VORO mostraram-se funcionais no sistema de minireplicon demostrando a formação das ribonucleoproteínas; Os terminais do segmento M constroem uma região promotora e estão envolvidos no reconhecimento da polimerase viral L; Efeito autêntico e funcional da proteína não estrutural NSs; A proteína não estrutural NSs do VORO regula negativamente a polimerase viral no sistema de minireplicon dess vírus. Tanto a proteína não estrutural NSs do VORO quanto a proteína não estrutural do VBUN regularam negativamente o sistema de minigenoma do VORO; O sistema de minireplicon para o VORO pode constituir uma poderosa ferramenta para a construção de proteínas recombinantes e desenvolvimento de antivirais em potencial que possam ser utilizados em terapias antivirais em nível de saúde pública; Melhorar o entendimento da transcrição, do ciclo replicativo do genoma e das funções das proteínas não estruturais e estruturais do VORO, levando a geração de um sistema de recuperação capaz de formar um vírus atenuado que poderá ser utilizado como modelo para futuras fabricações de vacinas contra esse importante vírus. 124 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDERSON, C. R., SPENCE, L., DOWNS, W.G., AITKEN, T.H. Oropouche virus: a new human disease agent from Trinidad, West Indies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 10: n.1, p. 574- 578, 1961. ALBARINO, C. G., BIRD, B. H., CHAKRABARTI, A. 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