TERBINAFINA NO CONTROLE DO OOMICETO Saprolegnia

Transcrição

I CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA AGROPECUÁRIA,
AGRÍCOLA E AMBIENTAL (CBMAAA)
09 a 12 de maio de 2016 - Centro de Convenções da UNESP,
Câmpus de Jaboticabal, SP
TERBINAFINA NO CONTROLE DO OOMICETO Saprolegnia
aenigmatica EM CONDIÇÕES in vitro
TERBINAFINE FOR OOMYCETE Saprolegnia aenigmatica
CONTROL in vitro CONDITIONS
Silvia Patrícia Carraschi (1)
Mayara Galatti Tedesque (2)
Guilherme Carnio Della Torre (3)
Claudinei da Cruz (4)
Maria José Tavares Ranzani-Paiva (5)
Resumo
Espécies de Saprolegnia tem causado infecções micóticas em peixes adultos e seus ovos. O
objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a concentração efetiva 50% (CE50;72h) e a
concentração mínima da terbinafina que causa 100% de inibição (MIC100) para o patógeno
causador de dermatomicose em peixes, Saprolegnia aenigmatica . A cepa do fungo foi
isolada de água de piscicultura e identificada por biologia molecular (GenBank KP941579).
As concentrações utilizadas no ensaio de CE50 foram de 1,0 a 157,30 mg L-1 e no ensaio de
MIC100 foram de 50 a 150 µg mL-1 , além do grupo controle. Nestes ensaios o fungicida foi
diluído em meio de cultivo BDA (batata dextrose ágar) e após solidificação, um amostra de 6
mm do fungo foi disposto na posição central e mantido à 25°C por 72 horas. CE50;72h
observada da terbinafina foi 8,82 mg L-1 (7,46 - 10,41 mg L-1) pois com 1,0 mg L-1 não
ocorreu inibição; com 2,75 mg L-1 ocorreu 17,78%, seguindo-se correlação positiva até chegar
a 100% de inibição, com 157,3 mg L-1. A MIC foi considerada 125 µg mL-1, pois para
concentrações de 50µg mL-1, 75µg mL-1 e 100µg mL-1 ocorreu 83,56%, 85,11% e 87,11% de
inibição, sendo 100% a partir de 125 µg mL-1. A terbinafina demonstrou potencial para inibir
o crescimento deste oomiceto e posteriormente deve ser avaliada sua eficácia em condições in
vivo, assim com, o sua toxicidade para os peixes.
Palavras-chave: Fungo. Peixe. Saprolegniales. Toxicidade. Tratamento.
Abstract
Saprolegnia species have been implicated in significant fungal infections of fish and their
eggs. The aim of this research was evaluate, in vitro, the 50% effective concentration
(EC50;72h) and the minimum inhibitory concentration (MIC100) of terbinafine for pathogen
which causes dermatomycosis in fish, Saprolegnia aenigmatica. The strain was isolated from
fish farming water and it was identified according to molecular technique and deposited in
GenBank as KP941579 code. The concentrations used in the EC50 were from 1.0 at 157.30
1
Pós Doutoranda do Instituto de Pesca de São Paulo, SP, Brasil [http://www.pesca.sp.gov.br].
Bióloga pela Faculdade de Taquaritinga (FGTA), SP, Brasil [http://www.faculdadedetaquaritinga.edu.br].
Estudante de biologia da UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil [www.fcav.unesp.br].
4
Professor Doutor da Fundação Educacional de Barretos, SP, Brasil [www.unifeb.edu.br].
5
Professora Doutora do Instituto de Pesca de São Paulo, SP, Brasil [http://www.pesca.sp.gov.br]
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mg L-1 and in the MIC100 were from 50 at 150 µg mL-1, besides a control. IN this assay the
fungi was diluted in PDA (potato dextrose agar) medium and after solidification a sample of 6
mm was disposed in the central position and kept at 25 0C by 72 hours. EC50;72h of
terbinafine was 8.82 mg L-1 (7.46 – 10.41 mg L-1) because with 1,0 mg L-1 there was no
inhibition; 2.75 mg L-1 occurred 17.78% following the positive correlation until 100% iwith
157.3 mg L-1. MIC was 125 µg mL-1 because with 50, 75 and 100 µg mL-1 occurred 83.56%,
85.11% and 87.11% of inhibition, being 100% from 125 µg mL-1. Terbinafine showed
potential to inhibit the growth of this oomycete and after should be tested in vivo conditions to
control Saprolegnia aenigmatica and his toxicity for the fish.
Keywords: Fungi. Fish. Saprolegniales. Toxicity. Treatment.
1 Introdução
O gênero Saprolegnia sp. é um oomiceto que causa doenças micóticas em ovos e peixes
adultos, geralmente em épocas de temperaturas baixas (CHUKANHOM et al., 2004). Neish
(1997) sugere que a imunossupressão causada por estressores ambientais proporciona este
organismo normalmente não patogênico se tornar patogênico. Saprolegniaceae compreende
fungos com hifa cenocítica, um ou dois tipos de zoósporos móveis, zoosporângio terminal,
subterminal ou intercalar e reprodução sexual com gametângios distintos, sendo o feminino
chamado de oogônia, o qual produz oosferas haplóides e o masculino, chamado de anterídeo, que
se desenvolve na ponta de outros filamentos do mesmo indivíduo e produz núcleos
masculinos. No micélio, o anterídio cresce próximo à oogônia e forma expansão filamentosa
denominada tubo de fecundação. O núcleo masculino passa por este tubo, encontra-se com o
feminino e ocorre a fecundação. A partir da fusão forma-se um zigoto de parede espessa
(oósporo) (ALEXOPOULOS, MIMS e BLACKWELL, 1996; VEGA-RAMÍREZ et al.,
2013).
Saprolegnia sp. infecta pele, brânquias e ovos dos peixes, manifestando-se como micélio
branco-acinzentado, facilmente visíveis a olho nu. Este parasita causa destruição da pele e das
nadadeiras devido à necrose celular causada pela penetração das hifas na epiderme e derme
(FREGENEDA-GRANDES,
FERNANDEZ
DIEZ
e
ALLER
GANCEDO,
2007),
ocasionando perdas massivas com sérios prejuízos econômicos aos piscicultores (Das et al.,
2012; Corrêa et al., 2013).
A utilização de fármacos no tratamento das enfermidades na aquicultura é
indispensável, porém há poucos produtos com registro no Brasil (DAS et al., 2012), sendo
que especialmente para fungo, estes registros ainda não existem. Assim, o uso de produtos
químicos sem eficácia comprovada, sem controle de dose/concentração, tempo de exposição,
dias de tratamento e monitoramento de resíduo no ambiente e no peixe se torna uma prática
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comum, tornando emergencial a prospecção de moléculas para a aquicultura para o controle
dos principais patógenos que acometem os peixes de criação.
Esse fato incentiva o desenvolvimento de pesquisas que buscam um químico eficaz com
baixa toxicidade para os animais e seguro para ambiente (FUANGSAWAT, ABKING e
LAWHAVINIT, 2011). Neste contexto, o antifúngico terbinafina atua como composto
fungicida ceratinofílico, altamente lipofílico, pertencente ao grupo das alilaminas (Costa e
Górniak, 2002), com efetividade contra dermatófitos in vitro e in vivo (Ghannoum e Rice,
1999; DAVIS, BALFOUR e TERBINAFINE, 1995), fungos filamentosos, dimórficos e
dematiáceos e algumas espécies de leveduras (Balfour e Faulds, 1992) e fungos invasivos,
tais como espécies de Candida, Aspergillus e Penicillium marneffei (MOORE, WALLS e
DENNING, 2001; RYDER, WAGNER
e LEITNER, 1998). A terbinafina age
especificamente numa etapa precoce da biossíntese do ergosterol com a inibição da enzima
esqualeno epoxidase, resultando em deficiência de esterol na membrana celular fúngica,
acúmulo intracelular de esqualeno e consequentemente a morte celular (N’Diaye et al.,
2006).
Assim, o presente estudo avaliou a concentração efetiva 50% (EC50;72h) e a
concentração mínima da terbinafina que causa 100% de inibição (MIC100) do crescimento
micelial do oomiceto Saprolegnia sp., em condições in vitro.
2 Material e Métodos
A cepa utilizada foi NESS1, código GeneBank KP941579, isolada de água de piscicultura
e identificada por biologia molecular como Saprolegnia aenigmatica. Uma amostra da cepa
foi disposta no centro de uma placa de petri contendo o meio BDA (batata dextrose ágar) e
mantida por 24 horas em estufa de demanda biológica de oxigênio a 25 ± 2°C.
Inicialmente foi avaliada a sensibilidade do fungo ao dicromato de potássio, como
substância referência, utilizando as concentrações 18,4; 44,0; 101,6; 238,0 e 560,0 mg L-1,
sendo a CE50;72h de 136,28 mg L-1, com intervalo de confiança de 121,3 a 153,11 mg L-1.
Após a validação da sensibilidade da cepa, foram realizados ensaios preliminares com a
terbinafina para determinar o intervalo de concentração que causam zero e 100% de inibição.
Nos ensaios definitivos para determinar a CE50 foram utilizadas as concentrações: de 1,0;
2,75; 7,6; 20,8; 57,2 e 157,30 mg L-1 e para o MIC100: 50; 75; 100; 125 e 150 µg mL-1.
A terbinafina foi inicialmente dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO), água destilada e
por último em BDA a 45°C, conforme a descrição da norma NCCLS M38 A2 (2008). A
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mistura de cada concentração em meio BDA foi vertida em placas de petri e após a
solidificação um disco de 6 mm de diâmetro do cultivo do oomiceto foi disposto na posição
central da placa e mantida em estufa bacteriológica a 25°C, durante 72 horas. Além das
concentrações da terfinafina os ensaios apresentaram um grupo controle contendo 1% de
DMSO e um grupo controle somente com BDA, com cinco repetições por tratamento.
Diariamente o crescimento micelial de Saprolegnia spp. foi avaliado por meio da medida
do diâmetro do halo de crescimento em dois eixos (cm). Ao final de 72 horas foi estimada a
CE50;72h utilizando o software Trimmed Spearman Karber (HAMILTON, RUSSO e
THURSTON, 1977) e o MIC100 foi determinada como a concentração que inibiu 100% o
crescimento do fungo.
3 Resultados e Discussão
A CE50;72h estimada da terbinafina foi de 8,82 mg L-1 com limite inferior de 7,46 e
superior de 10,41 mg L-1. O controle com meio BDA e com 1% de DMSO foram similares,
com crescimento total da placa em 72 horas, ou seja, 9x9 cm (63,6 m2). Com 1,0 mg L-1 não
ocorreu inibição do crescimento do fungo, sendo o crescimento similar aos controles. Já com
157,30 mg L-1 ocorreu 100% de inibição (Figura 1 e 3).
Figura 1. Relação concentração resposta da terbinafina para o oomiceto Saprolegnia
aenigmatica em ensaio de CE50;72h.
Em relação a MIC100, a menor concentração que causa 100% de inibição do
crescimento do fungo é 125 µg mL-1, pois com - . !/
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(Figura 2) .
Figura 2. Relação concentração resposta da terbinafina para o oomiceto Saprolegnia
aenigmatica em ensaio de MIC100.
Os oomicetos foram considerados auxotróficos de esterol, o que significa que são
dependentes deste nutriente, porém devido à ausência da enzima CYP51 utilizam esteróis do
ambiente ou do hospedeiro (Marshall et al., 2001). Isto explica a ineficácia de antifúngicos
azóis para muitas espécies de oomicetos. Porém recentes descobertas indicam que
Aphanomyces euteiches (Madoui et al., 2009) e Saprolegnia parasitica apresenta uma via de
metabolismo de esterol, incluindo o gene CYP51 (Warrilow et al., 2014).
Warrilow et al., (2014) relata a dificuldade de controle de Saprolegnia sp. após a
proibição do verde malaquita devido ao seu efeito teratogênico e carcinogênico (Hu et al.,
2013). Esta realidade é observada mundialmente na aquicultura uma vez que a o ozônio não é
prático na cura de peixes infectados (Fornerisa et al., 2003); o formaldeído é perigoso para o
ambiente e para a saúde ocupacional (GIESEKER, SERFLING e REIMSCHUESSEL, 2006;
Khodabandeh e Abtahi, 2006); o peróxido de hidrogênio, o sulfato de cobre e o diquat são
utilizados como profiláticos para inibir zoósporos (FITZPATRICK, SCHRECK e
CHITWOOD, 1995; MARKING, RACH e SCHREIER, 1994; Mitchell e Collins, 1997) e é
desconhecido o efeito tóxico dos óleos essenciais para os peixes (Pirbalouti et al., 2009).
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Figura 3. Inibição de crescimento do fungo Saprolegnia aenigmatica exposto a terbinafina
em ensaio de CE50;72h.
A CE50;72h da terbinafina foi superior (8,82 mg L-1) que da azaxistrobin e do
kresomim-metil, com CE50;48h de 0,21 e 0,24 mg L-1 para Saprolegnia sp. (Hu et al., 2013).
Já a MIC100 (125 µg ml-1) da terbinafina foi similar a apresentada por outros fungicidas à
Saprolegnia sp., como propiconazol, tiabendazol e diniconazol (100 µg mL-1) (Hu et al.,
2013), porém, mostrou-se mais eficaz que epoxiconazol, fluconazol, itraconazol e
posaconazol (MIC100 > 256 µg mL-1) (Warrilow et al., 2014).
Vários fungicidas vêm sendo estudados na busca de uma molécula capaz de controlar
o oomiceto Saprolegnia sp. com eficácia ao menos similar ao verde malaquita. Clotrimazol
demonstra grande potencial devido ao seu baixo MIC100;72h variando de 1 a 2 µg ml-1 para
espécies de Saprolegnia, um MIC similar ao do verde malaquita (1 µg mL-1) (Warrilow et al.,
2014).
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Altos valores de MIC100 são provavelmente devido a pobre absorção ou a um
eficiente efluxo dos fármacos pelas células. Além disso, para um antifúngico ser eficaz ele
precisa ter uma forte interação com a enzima CYP51(Warrilow et al., 2014).
A próxima etapa envolve a avaliação in vivo, porém esta transposição nem sempre é
possível devido às variáveis ambientais e individuais. Hu et al. (2013) encontraram
antifúngicos como kresomim-metil e azaxistrobin eficazes contra Saprolegnia, com MIC de
1,0 e 0,5 mg L-1, respectivamente, porém estes compostos são tóxicos para os peixes,
destacando o problema de transposição de experimentos in vitro para eficácia in vivo.
4 Conclusões
A terbinafina tem potencial terapêutico para tratamento contra infecções por
Saprolegnia aenigmatica, porém são requeridos estudos in vivo antes do uso prático deste
fungicida na aquicultura.
5 Agradecimentos/ Apoio financeiro
Fapesp/Proc. 2013/25113-2 e 2015/10645-4
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