Dissertação EFEITO DO SUCO DE UVA SOBRE O CONTROLE

1
Dissertação
EFEITO DO SUCO DE UVA SOBRE O CONTROLE
AUTONÔMICO DA PRESSÃO ARTERIAL E FREQUÊNCIA
CARDÍACA EM RATOS HIPERTENSOS
Denise Ruttke Dillenburg
2
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL
FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Área de concentração: Cardiologia
Efeito do suco de uva sobre o controle autonômico da pressão
arterial e freqüência cardíaca em ratos hipertensos
Autora: Denise Ruttke Dillenburg
Orientadora: Dra.Maria Cláudia Costa Irigoyen
Co-Orientadora: Dra. Katya Vianna Rigatto
Dissertação submetida como requisito para
obtenção do grau de Mestre ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Cardiologia, da Fundação Universitária de
Cardiologia / Instituto de Cardiologia do Rio
Grande do Sul.
Porto Alegre
2012
3
Aos meus queridos pais, que sempre me mostraram o caminho a seguir.
iv
4
AGRADECIMENTOS
Muitos foram os que contribuíram para a construção desta conquista e
merecem meus agradecimentos.
Agradeço à Instituição e ao Programa de Pós-Graduação pela
oportunidade de crescimento.
À Katya Rigatto, pelas valiosas orientações e aprendizado.
À Maria Cláudia Irigoyen, pelo exemplo de dedicação na área de
pesquisa em hipertensão.
À Silvia Goldmeier, pela ajuda constante.
Às alunas bolsistas Daiane Ferreira e Denielli Bós, pela parceria.
Em especial à minha querida amiga Ana Amélia, por me acompanhar
nesta caminhada.
Ao Tales, pela palavra que me impulsionou a seguir.
v
5
LISTA DE ABREVIATURAS
DCV
Doença Cardiovascular
PA
Pressão Arterial
AVE
Acidente Vascular Encefálico
DIC
Doença Isquêmica do Coração
HAS
Hipertensão Arterial Sistêmica
PAS
Pressão Arterial Sistólica
PAD
Pressão Arterial Diastólica
SNA
Sistema Nervoso Autônomo
NO
Óxido nítrico
EDHF
Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio
L-NAME
L-Nitro-arginina-metil-ester
PAM
Pressão Arterial Média
NOS
Óxido Nítrico Sintase
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato oxidado
NS
Nodo sinusal
FC
Freqüência Cardíaca
AV
Atrioventricular
PF
Polifenóis
LDL
Lipoproteína de Baixa Densidade
vi
6
SUMÁRIO
1. REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 1
1.1 Hipertensão .............................................................................................................. 2
1.2 Endotélio .................................................................................................................... 4
1.3 Óxido Nítrico ............................................................................................................... 6
1.4 Regulação da Freqüência Cardíaca: importância do Sistema Nervoso
Autônomo ......................................................................................................................... 8
1.5 Efeito do Estresse Oxidativo, Resveratrol e Suco de Uva sobre a Pressão
arterial ............................................................................................................................ 10
2. HIPÓTESES .................................................................................................................. 13
3. OBJETIVO..................................................................................................................... 14
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 15
5. ARTIGO......................................................................................................................... 24
6. APÊNDICE I (Aprovação Comitê de Ética) ................................................................... 62
vii
1 REFERENCIAL TEÓRICO
2
1.1 HIPERTENSÃO
As enfermidades cardíacas vêm atingindo proporções epidêmicas em
diversos países, sendo importante causa de mortalidade, principalmente nos
países ocidentais.1 A mortalidade por doença cardiovascular (DCV) aumenta
progressivamente com a elevação da pressão arterial (PA) a partir de 115/75
mmHg de forma linear, continua e independente. Em 2001, cerca de 7,6
milhões de mortes no mundo foram atribuídas a elevação da PA (54% por
acidente vascular encefálico (AVE) e 47% por doença isquêmica do coração
(DIC)), sendo considerada hipertensão arterial sistêmica (HAS) valores de
pressão arterial sistólica (PAS) igual ou superior a 140 mmHg e pressão
arterial diastólica (PAD) igual ou superior a 90 mmHg. 2
De acordo com uma Revisão Sistemática quantitativa de 2003 a 2008,
de 44 estudos em 35 paises, revelou-se uma prevalência global de 37,8% em
homens e 32,1% em mulheres.3
Inquéritos populacionais em cidades brasileiras nos últimos 20 anos
apontaram uma prevalência de HAS acima de 30%.4,5 Em estudo transversal,
tendo como base populacional o Estado do Rio Grande do Sul, realizado
entre 1999 a 2000, obteve como resultado uma prevalência de hipertensão
de 33,7%.6 Entre os fatores de risco mais significantes para a hipertensão,
destacam-se o sedentarismo, obesidade, dislipidemias, diabetes e tabagismo,
entre outros.7,1,8
A hipertensão arterial envolve mecanismos complexos como fatores
genéticos e ambientais 9, sendo resultante de disfunções nos mecanismos de
controle da PA. Essas disfunções são observadas em quase todos esses
mecanismos, sendo difícil estabelecer qual fator é responsável pela
3
manutenção dos valores elevados de pressão.10,
11
A adequada pressão
arterial garante a perfusão dos tecidos tanto em condições de repouso como
em diferentes atividades12 sendo que em condições fisiológicas as alterações
comportamentais não causam grandes variações da PA, pois o controle
reflexo consegue tamponá-las. Porém, em condições patológicas, o prejuízo
no controle reflexo da pressão pode causar não só aumento dos valores de
pressão como também o aumento da variabilidade da PA. 11
De fato, o controle reflexo da PA é realizado pelo sistema nervoso
autônomo (SNA), acionado por diferentes sensores periféricos
12
e que atua
sobre as eferências nervosas simpática e parassimpática 13, determinando as
alterações fisiológicas necessárias para diminuir as variações da PA.10 Essa
regulação promove ajustes através da bradicardia e da taquicardia reflexas
que são moduladas pelos pressorreceptores.14 Os pressorreceptores arteriais
são mecanorreceptores localizados no seio carotídeo e arco aórtico sensíveis
a deformações da parede vascular.15 Atuam no controle tônico da atividade
simpática (inibição) e parassimpática (estimulação), sendo que seu
comprometimento pode levar ao estabelecimento de alterações no controle
da função cardiovascular devido à incapacidade de modular esse sistema.16
4
1.2 ENDOTÉLIO
As artérias são órgãos complexos cuja parede é composta por células
endoteliais, células musculares lisas e fibroblastos, ligados uns aos outros por
uma rede de interações autócrinas e parácrinas, capazes de se adaptar a
múltiplas variações hemodinâmicas e mecânicas. O vaso é sensível às
alterações no seu interior e capaz de se adaptar em longo prazo a
determinadas condições hemodinâmicas, modificando-se por produção local
de mediadores, fatores de crescimento e substâncias vasoativas, que
influenciam tanto estrutura, levando a alteração celular e remodelamento de
matriz, como função, desencadeando um processo complexo e dinâmico
denominado remodelamento vascular. 17
O endotélio participa ativamente da manutenção da homeostase
vascular pelo balanço entre substâncias vasodilatadoras (óxido nítrico (NO),
prostaciclinas, fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)) e
vasoconstritoras
(endotelina,
prostaglandina-H2,
tromboxano-A2,
angiotensina II). Sua importância vem sendo demonstrada na regulação de
várias
respostas
vasculares,
uma
vez
que
as
células
endoteliais
desempenham um importante papel na regulação de propriedades arteriais,
tais como liberação de óxido nítrico (NO), tônus vascular, permeabilidade e,
portanto, na pressão arterial.18 Também regulam a proliferação de
monócitos,19 a inflamação, o metabolismo lipídico,20,21o crescimento celular, a
migração celular e a integração com matriz extracelular através de
mecanismos mediados por receptores. Moléculas de adesão expressas pelo
endotélio agem como iniciadores críticos para a resposta inflamatória,
mediando a passagem de leucócitos da circulação para o tecido.22
5
Alterações nas condições hemodinâmicas ou de fatores humorais
podem resultar no desequilíbrio destas forças moduladoras, favorecendo a
vasoconstrição ou vasodilatação e contribuindo para o aumento da
resistência periférica.23 .
A maioria das complicações cardiovasculares estão relacionadas com
alterações na estrutura e função vascular, e uma perda da função endotelial
está associada ao envelhecimento e à hipertensão.24 A disfunção endotelial
pode, então, ser considerada como uma das mais importantes causas
fisiopatológicas que atuam no desenvolvimento da doença cardiovascular. 25
6
1.3 ÓXIDO NÍTRICO
Desde os primeiros achados de Furchgott e Zawadzki em 1980
26
e pela
comprovação de Moncada em 1991, o óxido nítrico tem sido envolvido em
muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos, incluindo uma variedade de
doenças cardiovasculares.20
O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa e reativa que funciona em
altas concentrações como defesa a patógenos e células tumorais, e em
baixas concentrações como um sinal em diversos processos fisiológicos,
incluindo regulação do fluxo sangüíneo, neurotransmissão, aprendizado e
memória. É um notável sinalizador celular devido a seu baixo peso molecular
e rápida difusão, habilidade para permear as membranas celulares (natureza
lipofílica), propriedade que elimina a necessidade de receptores ou da
presença de enzimas proteolíticas para NO.27 Talvez o efeito mais
importante do NO seja sua propriedade vasodilatadora. 18
Em condições fisiológicas o NO provavelmente atua como um
importante “scavenger” de radical livre, como o ânion superóxido (O2-),
limitando a toxidade associada com estas moléculas, inibindo a agregação
plaquetária e a adesão leucocitária na célula endotelial. A importância do NO
para a homeostase cardiovascular pode ser demonstrada pelo bloqueio
agudo
28,29,30
ou crônico31 da síntese do NO por L-Nitro-arginina-metil-ester
(L-NAME) que levam à hipertensão arterial. Foram observadas alterações no
mecanismo autonômico32,33 e na sensibilidade do barorreflexo 34 envolvidos
no controle cardiovascular na hipertensão induzida por bloqueio da síntese
do NO. Redução na variabilidade da PAM após bloqueio agudo também se
observa em animais submetidos a sobrecarga salina.35 Além disso, muitos
7
estudos têm demonstrado que o modelo experimental de hipertensão por
bloqueio da síntese do NO está freqüentemente associada com resistência
periférica à ação da insulina, sugerindo a necessidade de mais pesquisas que
elucidem as possíveis correlações entre estas alterações fisiológicas..36,37
A biossíntese do NO no organismo ocorre via oxidação da L-arginina
que é catalisada pela enzima NO sintase (NOS), com a participação da forma
reduzida do fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídio (NADPH) como um
doador de elétron. Um esquema geral da reação da NO sintase é ilustrada na
Figura 1, onde observa-se que a conversão da L-arginina para L-citrulina e
NO, catalisada pela NOS, é uma oxidação de cinco elétrons de um dos
nitrogênios guanidínicos da L-arginina. O primeiro passo, a oxidação de dois
elétrons, é uma hidroxilação que forma NG-hidroxi-L-arginina como um
produto intermediário ligado à enzima. O segundo passo, uma oxidação de
três elétrons envolve remoção de elétron, inserção de oxigênio e quebra da
ligação carbono-nitrogênio para formar L-citrulina e NO. O mesmo doador de
elétrons, a forma reduzida do NADPH, é requerido em ambas as etapas. Os
átomos de oxigênio que são incorporados ao NO e à L-citrulina derivam-se de
moléculas distintas de oxigênio.38 Alterações na expressão da NOS têm sido
amplamente associada à hipertensão. 18
L-arginina
NG-Hydroxy-L-arginina
L-citrulina
Óxido Nítrico
FIGURA 1 – Reação de síntese do NO (Andrew & Mayer 1999)
8
1.4 REGULAÇÃO DA FREQUÊNCIA CARDÍACA: IMPORTÂNCIA DO
SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO
O sistema nervoso autônomo controla a PA através de sua influência
sobre o coração e células vasculares musculares lisas.39 Na ausência de
qualquer influência hormonal ou neural, em seres humanos, o nodo sinusal
(NS) gera uma freqüência cardíaca (FC) intrínseca em torno de 100 a 120
batimentos por minuto.40 Em situações fisiológicas este nodo está sob
controle do sistema nervoso simpático e parassimpático. Tanto o nervo vago
direito quanto o esquerdo estimulam o NS, o nodo atrioventricular (AV), bem
como o músculo atrial. A atividade vagal diminui a FC quando predomina o
efeito do nervo vago direito.41 Fibras pós-ganglionares simpáticas inervam
quase todo o coração.42 Da mesma forma, as fibras simpáticas direitas
influenciam mais a FC, enquanto as fibras simpáticas esquerdas apresentam
maior impacto sobre o volume de ejeção. 43
Em seres humanos e em condições de repouso, o SNA está
tonicamente ativado com a dominância da regulação vagal.
42
Alterações
mais rápidas da FC são normalmente causadas pela regulação vagal. 44,45 O
sistema nervoso responde ao comando vagal dentro de 1 ou 2 batimentos
cardíacos, mas o efeito total é de curta duração. As alterações da FC
induzidas pelo vago ocorrem dentro de 5 segundos 42, enquanto as respostas
cardíacas do sistema nervoso simpático ocorrem mais lentamente, iniciando
com um atraso de 5 segundos. A máxima resposta simpática ocorre após 20
a 30 segundos.42,46 Essas diferenças são, em parte, devidas à lenta exocitose
que ocorre para liberação de noradrenalina da terminação nervosa simpática.
Outra diferença se refere à localização dos corpos celulares: o corpo celular
9
do neurônio pós-ganglionar parassimpático se localiza no coração enquanto
o simpático localiza-se na cadeia ganglionar. Além disso, as fibras préganglionares parassimpáticas são mielinizadas enquanto as simpáticas são
amielinizadas. 47
Dessa forma, o estudo da hipertensão com modelos experimentais
permite
aos
pesquisadores
estudar
isoladamente
os
vários
fatores
associados com o controle da PA e determinar os possíveis mecanismos
envolvidos na sua fisiopatogenia. 9
Ratos tratados com N-nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME), um potente
inibidor da síntese de óxido nítrico (NO), constituem um modelo utilizado para
estudo da hipertensão arterial sistêmica. A administração oral crônica de LNAME leva ao desenvolvimento de HAS persistente em ratos, dose e tempodependente. 48
Dessa forma, neste estudo os animais serão tratados com L-NAME após
um período de administração de suco de uva para verificar o possível efeito
preventivo do suco sobre o desequilíbrio entre o sistema nervoso simpático e
parassimpático, que ocorre em situações em que a síntese de óxido nítrico
está diminuída ou inibida.
10
1.5 EFEITO DO ESTRESSE OXIDATIVO, RESVERATROL E SUCO DE
UVA SOBRE A PRESSÃO ARTERIAL
Em sujeitos com fatores de risco para doença cardiovascular ou em
portadores de doenças coronarianas, a função endotelial está prejudicada e a
agressão à parede do vaso reduz ainda mais a biodisponibilidade de NO,
prejudicando a resposta vasodilatadora endotélio-dependente, caracterizando
a disfunção endotelial e favorecendo o aparecimento de hipertensão.
8
Os polifenóis (PF), presentes no vinho tinto, têm demonstrado exercer
efeitos benéficos na prevenção de doenças cardiovasculares como a
hipertensão. Resultados sugerem que o tratamento crônico com PF previne o
aparecimento de hipertensão e de disfunção cardiovascular. Este efeito devese em parte à inibição da atividade da NADPH oxidase, que diminui a
produção de ânion superóxido e o estresse oxidativo, e/ou à redução na
liberação de endotelina (ET-1).49,50 O estresse oxidativo causado pelo ânion
superóxido
presente
nos
vasos,
e
a
inativação
do
óxido
nítrico,
desempenham um papel importante na patogenia da hipertensão.51,52
É sabido que, nas frutas como maçãs e uvas, os derivados fenólicos e
flavonóides com ação anti-oxidante estão presentes predominantemente na
casca, mas não na sua polpa.
53
A casca de uvas frescas contém de 50-100
mg/g resveratrol, enquanto que no suco de uva sua quantidade pode variar
entre 3 e 15 µg/L
54
e 690 a 14.500 µg/L.55 No vinho o resveratrol e seus
derivados podem variar de 0 a 25000 µg/L.56 As quantidades destes
compostos variam consideravelmente nos diferentes tipos de sucos de uva e
vinhos. Dependem da variedade da uva, de fatores ambientais nas videiras e
da forma de preparo do suco ou do vinho.57
11
O Resveratrol, um dos polifenóis encontrado nas uvas, tem sido
apontado como um dos responsáveis pela inibição da oxidação das
lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
58
e pela redução da agregação
plaquetária. 59.
Estudos sugerem que o consumo de uvas e produtos que contêm uva
podem reduzir a pressão arterial através dos efeitos favoráveis dos polifenóis
presentes nas uvas que atuariam sobre a função endotelial e inflamção
podendo reduzir a rigidez arterial.
60
Dessa forma, possivelmente todos os
produtos que contenham na sua formulação parte da casca da fruta, como o
suco da uva, apresentem tais propriedades antioxidantes.61 Um estudo
randomizado mostrou uma redução na pressão arterial em homens coreanos
após o consumo de suco de uva durante 8 semanas. 62
Embora a ingestão de suco de uva apresente algumas vantagens em
relação ao vinho, poucos trabalhos na literatura demonstram sua ação na
hipertensão. Mesmo considerando que o suco de uva possa apresentar
efeitos protetores para o sistema cardiocirculatório de menor intensidade do
que o vinho, o fato de não haver contra-indicação para o consumo diário, em
doses maiores e ao longo da vida, pode representar uma forma de
potencializar os resultados cardiocirculatórios. Além disso, o suco de uva é
uma alternativa mais barata do que o vinho, podendo ser adquirido por uma
parcela maior da população, e ainda, ser recomendado para pessoas que
não devem consumir bebidas alcoólicas, como as crianças.
Dessa forma, este estudo pretende investigar o efeito preventivo da
ingestão de suco de uva sobre o controle autonômico da pressão arterial e da
freqüência cardíaca e sobre o estresse oxidativo no coração de animais
12
hipertensos pelo bloqueio da síntese do óxido nítrico. Com isto, pretendemos
melhor entender seu efeito sobre o controle da pressão arterial através da
introdução de um hábito alimentar saudável.
13
2 HIPÓTESES
H1 : O suco de uva apresenta efeitos antioxidantes preventivos e melhora
o balanço autonômico sobre a pressão arterial e freqüência cardíaca de
animais hipertensos.
H0 : O suco de uva não apresenta efeitos antioxidativos preventivos e não
melhora o balanço autonômico sobre a pressão arterial e freqüência cardíaca
de animais hipertensos.
14
3 OBJETIVOS
O presente estudo propõe-se a estudar o efeito preventivo do suco de uva
sobre o controle autonômico da pressão arterial, da freqüência cardíaca e
estresse oxidativo em ratos hipertensos pelo bloqueio da síntese do óxido
nítrico.
15
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24
5 ARTIGO
Resveratrol e
Suco de
uva
melhoraram
cardiovascular em ratos tratados com L-Name.
a modulação
autonômica
25
Artigo submetido ao European Journal of Pharmacology
RESVERATROL E SUCO DE UVA MELHORARAM A MODULAÇÃO
AUTONÔMICA CARDIOVASCULAR EM RATOS TRATADOS COM L-NAME
RESVERATROL AND GRAPE JUICE DIFFERENTIALLY AMELIORATE
CARDIOVASCULAR AUTONOMIC MODULATION IN L-NAME TREATED
RATS
Denise Ruttke Dillenburg1, Cristiano Mostarda2, Ivana Cinthya Moraes-Silva2,
Daiane Ferreira3, Denielli da Silva Gonçalves Bós3, Ana Amélia Machado
Duarte3, Maria Cláudia Irigoyen2, Katya Vianna Rigatto3.
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL / FUNDAÇÃO
UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
Endereço para correspondência:
Unidade de Pesquisa do IC/FUC – Denise Ruttke Dillenburg
Av. Princesa Isabel, 370 – Santana – Porto Alegre 90620-000
Fone/Fax: 51 3219.2082 – Ramal 24
Email: [email protected]
1
Unidade de Pesquisa, Fundação Universitária de Cardiologia / Instituto de Cardiologia do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
2
Departamento de Hipertensão, Instituto do Coração (InCor), Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil.
3
Departamento de Fisiologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de
Ciências da Saúde de Porto Alegre, RS, Brasil.
26
RESUMO
OBJETIVO: Avaliar os efeitos do resveratrol e do suco de uva sobre o
controle autonômico da pressão arterial e da freqüência cardíaca, parâmetros
redox cardíaco e sensibilidade do barorreflexo.
MÉTODOS: O experimento foi realizado em ratos machos wistar. Os animais
foram divididos em 3 grupos (7 por grupo): Controle (L-NAME), Resveratrol
(L-NAME+R) e Suco de Uva (L-NAME+S) e acompanhados durante 30 dias.
Nos últimos 7 dias, receberam por gavagem 60mg/Kg/dia de L-NAME, um
bloqueador da sintese do óxido nítrico. Sinais de pressão arterial (PA) foram
obtidos através de cateterização arterial, gravados por um período de 30
minutos. O intervalo de pulso (IP) e a variabilidade da pressão arterial
sistólica (VPS) foram analisados no domínio do tempo e da frequência.
Sensibilidade do barorreflexo foi determinada pelo índice alfa. Glutationa
reduzida e oxidada foram determinadas no tecido cardíaco.
RESULTADOS: PA e freqüência cardíaca (FC) não foram diferentes entre os
grupos. Pressão arterial média (PAM) (LNAME=124±4, LNAME+R= 126±3 e
LNAME+S=125±4 mmHg) e FC (LNAME= 380±6.3, LNAME+R= 377±9 e
LNAME+S= 382±8 bpm). A variabilidade do IP (VIP) e a VPS expressa pela
variância foram similares entre os grupos. No entanto, os componentes LF e
HF normalizados da VIP foram menores e maiores, respectivamente, nos
grupos tratados quando comparados ao grupo L-NAME. Além disso, o
equilíbrio simpato-vagal foi significativamente diminuído nos grupos L-NAME
+ R e LNAME + S quando comparado com o grupo L-NAME. A sensibilidade
do baroreflexo (alfa índice) foi melhorada apenas no grupo L-NAME + R e
não foram observadas diferenças entre os grupos L-NAME + S e L-NAME.
CONCLUSÃO: Resveratrol e suco de uva podem promover benefícios
cardiovasculares e redox, mesmo quando a síntese do óxido nítrico está
bloqueada. A melhora adicional observada na modulação simpática dos
vasos (componente LF da VPS) em ratos hipertensos tratados apenas com
resveratrol pode ser atribuída à melhoria da sensibilidade do barorreflexo
observada somente neste grupo.
Palavras-chave:
Resveratrol
Hipertensão,
Controle
autonômico,
Suco
de
Uva,
27
ABSTRACT
OBJECTIVE: Evaluate the effects of resveratrol and grape juice treatments in
cardiac redix parameters, hemodynamics, baroreflex sensitivity and heart rate
(HR) and arterial pressure (PA) variability.
METHODS: Experiment were performed on male Wistar rats. The animals
were divided in 3 groups(n=7/each): Control group (LNAME), Resveratrol
treated (LNAME + R), Grape juice treated (LNAME + G) and accompanied
during 30 days. On the last 7 days they were treated by gavage with
60mg/kg/day of LNAME, a blocker of nitric oxide synthesis. AP signals
obtained by arterial catheterization were recorded over a 30-minute period
and Pulse Interval (PI) and Systolic Arterial pressure (SAPV) variability were
analyzed in the time and frequency domains. Baroreflex sensitivity (BRS) was
determined by alpha index. Oxidized and reduced glutathione concentrations
were determined in cardiac tissue.
RESULTS: AP and HR were not different among groups. Mean AP
(LNAME=124±4, LNAME+R= 126±3 and LNAME+G=125±4 mmHg) and HR
(LNAME= 380±6.3, LNAME+R= 377±9 and LNAME+G= 382±8 bpm). The
variability of PI and SAPV expressed by variance were similar among groups.
However, normalized LF and HF component of PIV were lower and higher,
respectively, in treated groups when compared to L-Name group. In addition,
sympatho-vagal balance was significantly decreased as well as sympathetic
modulation of the vessels (LF from SAPV) was lower in LNAME+R and
LNAME+G groups. BRS was improved only in LNAME+R rats and no
differences were observed between LNAME+G and LNAME rats. GSH/GSSG
ratios were higher in LNAME+R, (41±5) and LNAME+G (39±4 ) than in
LNAME group (18±3 ).
CONCLUSION:Resveratrol and grape juice treatment can promote
cardiovascular and redox benefits even when the nitric oxide is decreased by
the inhibition of nitric oxide synthase. The additional improvement observed in
sympathetic modulation to the vessels (LF component of SAPV) in the rats
treated only with resveratrol may be attributed to the improvement in BRS only
observed in this group.
Key words: Hypertension, Autonomic Control, Grape Juice, Resveratrol
28
Introduction
Hypertension is a clinical condition of high prevalence and difficult
control.
About
7.6 million deaths
worldwide are
attributable
to
the
elevated blood pressure (BP) levels. Among the risk factors for hypertension
are age, gender, ethnicity, overweight, obesity, sedentary lifestyle and
unhealthy
eating habits
(1).
Furthermore, for each 20 mmHg increase in
systolic BP (SBP) or 10 mmHg in diastolic BP (DBP), the risk of mortality from
ischemic heart disease and stroke is doubled. On the other hand, a reduction
of 5 mmHg in DBP and / or 10 mmHg in SBP may lower the risk of stroke by
one-third
and
the
risk of
coronary
heart
disease by
a
sixth.
(2)
Therefore, strategies for changing eating dietary habits and increasing
the consumption of polyphenols have been proposed to prevent or help the
treatment of hypertension. In this context, the properties of resveratrol,
a polyphenol found in red wine and grape juice wiith antioxidant, antiapoptotic and anti-inflammatory effects has been investigated in many
studies, as it seems to prevent endothelial dysfunction. (3)
Indeed, a significant decrease in BP in Korean hypertensive males was
found in male subjects who ingested grape juice for 8 weeks.
(4)
In addition, in
nephrectomized spontaneous hypertensive rats, resveratrol consumption
attenuated hypertension and prevented
endothelial nitric oxide synthase
uncoupling. (5) However, when these rats were treated with resveratrol and LName, these benefits were no longer observed. In contrast, other studies
have shown that the red wine treatment approach may prevent the increase
in BP, cardiovascular remodeling and the oxidative stress in L-Name rats.
(6)
29
Additionally, in rats with heart failure, resveratrol seems to both improve
survival and attenuate systolic dysfunction and BP levels.
(7)
These benefits have been explained by the positive effect of resveratrol
and other polyphenols on
endothelial nitric oxide synthase expression .(8,9)
However, other mechanisms such as redox balance and autonomic
modulation and barorrelfex sensitivity have been poorly explored.
The autonomic functional indexes such as heart rate variability, BP
variability (BPV) and baroreflex sensitivity (BRS) have been regarded as
important markers of mortality and organ damage, regardless of BP
levels.(10,13)Indeed,
this
interaction
between
antioxidant
enzymes,
inflammatory conditions redox parameters and autonomic nervous system has
been shown in recent studies.
(14,15)
However, we have not yet found any
study which well covers the autonomic effects of grape juice and the
association of these effects with redox parameters.
The aim of this study was to evaluate the effects of resveratrol and
grape juice treatments on cardiac redox parameters, BRS, heart rate and BP
autonomic modulation. The demonstration of an improvement in these
parameters would offer a new tool for early prevention of CVD, beginning in
childhood, particulary for those with ancestral background or genetic ancestry.
30
Materials and methods
Animals
Experiments were performed on male Wistar rats (251±10 g), with 12
weeks of age, from the Animal Shelter at Federal University of Pelotas, Rio
Grande do Sul, Brazil, receiving standard laboratory chow and water ad
libitum. The animals were housed in cages with 3 or 4 animals each in a
temperature-controlled room (22 °C) with a 12-h dark–light cycle. All surgical
procedures and protocols used were in accordance with the Guidelines for
Ethical Care of Experimental Animals approved by the International Animal
Care and Use Committee. (Goldim,1997)
The rats were L-Name treated and randomly assigned into 1 of 3
groups: controls, resveratrol treated and grape juice treated.
Concentrations of resveratrol were calculated in order to obtain the
same proportion found in grape juice (Wood Cellar House ®), and were
established after analyzing the juice composition. In this analysis, we
determined the amount of 0.062 mg of resveratrol per 100ml of juice. The
choice of the volume to be administered to the animals was determined based
on the beneficial effects found in the daily intake of 500 ml of grape juice / day
for a healthy individual. (4)
For the 30 days of trial duration,2 ml of the solutions were daily
administered at 17h00min by gavage according to the following regimen
(n=7/each):Control group (L-NAME),Resveratrol treated (L-NAME + R),Grape
juice treated (L-NAME + G).In the last 7 days of treatment,at around 9h00min,
they were given gavage with 60mg/kg/day L-NAME diluted in ~ 1mL of water.
31
Cardiovascular assessments
After the protocol period, 2 catheters filled with 0.06mL saline were
implanted into the femoral artery and vein (PE- 10) in anesthetized animals
(Ketamine 80mg/kg+Xylazine 12 mg/kg) for direct measurements of BP.
Rats were studied 1 day after the catheter placement; they were
conscious and allowed to move freely during the experiments. An arterial
cannula was connected to a strain-gauge transducer (P23Db, Gould-Statham,
Oxnard, CA), and AP signals were recorded over a 30-minute period by a
microcomputer equipped with an analog-to-digital converter board (Windaq, 2
kHz sampling frequency; Dataq Instruments, Inc., Akron,OH). The recorded
data were analyzed on a beat-to-beat basis to quantify changes in mean AP
and heart rate (HR). (16,18)
Heart rate and blood pressure variability
Time-domain analysis consisted of calculating mean pulse interval (PI)
and diastolic BP, PI variability (PIV) and SBP variability (SPV) as the PI and
SP variance from its respective time series. For frequency domain analysis,
the whole 20-min time series of PI and SBP were cubic-spline-interpolated
(250 Hz) and –decimated to be equally spaced in time. Following linear trend
removal, power spectral density was obtained by the autoregressive method
over 16,384 points with a Hanning window (512) and 50% overlapping.
Spectral power for very low- (VLF 0–0.20 Hz), low- (LF 0.20–0.75 Hz), and
high- (HF 0.75–3.0 Hz) frequency bands was calculated by means of power
spectrum density integration within each frequency bandwidth, using a
customized routine (MATLAB 7.0, Mathworks).
32
Given the fact that in freely moving animals the proportional
contribution of the very low frequency component may increase in 20- minlong recordings, data were also submitted to another processing routine,
whereby the 20-min recordings of the decimated PI signal (2048 points) were
segmented in 2.5-min periods, and only steady segments were processed as
above described.
Spectral power within the low frequency component and high frequency
component bands in each animal along the 20-min recordings were averaged
across the 2.5-min segments and used for analysis. (19)
The baroreflex sensitivity was evaluated by alpha index. The alpha
index analysis evaluates short-term changes in the systolic blood pressure
and in the RR interval. The coherence between the PI and the SBP signal
variability was assessed by means of a cross-spectral analysis. The alpha
index in the LF band was calculated only when the magnitude of the squared
coherence between the PI and SBP signals exceeded 0.5 (range, 0-1). After
coherence calculation, the alpha index was obtained from the square root of
the ratio between PI and SBP variability in the two major LF bands
Determination of oxidized (GSSG) and reduced (GSH) glutathione
concentration
To determine oxidized and reduced glutathione concentrations, cardiac
tissue was deproteinized with 2 mol/L perchloric acid, centrifuged for 10 min at
1000 g, while the supernatant was neutralized with 2 mol/L potassium
hydroxide. The medium reaction contained 100 mmol/L phosphate buffer (pH
7.2), 2 mmol/L nicotinamide dinucleotide phosphate acid, 0.2 U/mL
33
glutathione reductase, and 70 µmol/L 5,5' dithiobis (2-nitrobenzoic acid). For
the determination of reduced glutathione, supernatant was neutralized with 2
mol/l potassium hydroxide in order to react with 70 µmol/l 5,5' dithiobis (2nitro benzoic acid), and the absorbance values were measured at 420 nm.
(20)
Statistical analysis
Data are reported as means ±SEM, and ANOVA (one-way) was used
to compare groups, followed by the Student– Newman–Keuls test. Pearson
correlation was used to study the association between variables.
Results
Hemodynamic evaluations
The direct BP evaluation performed at the end of the protocol was not
significant different among groups in SBP (LNAME= 174±2 , LNAME+R=
176±3 and LNAME+G=173±3 mmHg), DBP, (LNAME= 138±3, LNAME+R=
141± 2 and
LNAME+G 140 ±4 mmHg),
mean BP (LNAME=124±4,
LNAME+R= 126±3 and LNAME+G=125±4 mmHg) and heart rate (LNAME=
380±6.3, LNAME+R= 377±9 and LNAME+G= 382±8 bpm). These results
indicate that hemodynamic changes induced by L-Name treatment were not
modified by treatments, resveratrol or grape juice.
PIV and SPV in time and frequency domains
The results of PIV and SPV are presented in Figure 1. The PIV and
SPV in time domain expressed by variance (PIV) were similar among groups.
34
Analyzed in the frequency domain, PIV showed that absolute LF and
absolute HF power components of PIV were similar among groups. However,
the normalized LF component of PIV was lower in LName + R and LNAME +
G when compared to L -Name group. In addition, the normalized LF
component of PIV was similar between L-NAME+R and L-NAME + G groups.
The HF component of PIV was increased in L-NAME +R and LNAME +
G in comparison with L-NAME. However, no significant difference between
normalized HF component of
L-NAME +R and L-NAME+G rats was
observed. Consequently, sympathovagal balance was significantly decreased
in L-NAME+R and LNAME+G groups when compared to the L-NAME group.
The LF component of SPV was lower in L-NAME+R than L-NAME
group while L-NAME + G rats were not different from L-NAME animals.
Similarly, BRS (alpha index) was improved only in L-NAME+R rats and no
differences were observed between L-NAME+G and L-NAME rats.
Cardiac redox Parameters
GSSG values were lower in L-NAME+R (0.0023±0.0008 mmol/gtec)
and L-NAME+G (0.0026±0.0008 mmol/gtec) than in L-NAME (0.0052±0.0005
mmol/gtec) group. However, GSH values were similar among the groups LNAME+G (0.10±0.01 mmol/gtec), L-NAME+R (0.095±0.011 mmol/gtec) and
L-NAME (0.08±0.01 mmol/gtec). Consequently,
GSH/GSSG ratios were
higher in L-NAME+R, (41±5 ) and L-NAME+G (39±4 ) than in L-NAME group
(18±3 ).
35
Analysis of Correlation
Correlation was carried out by associating autonomic and cardiac
redox parameters (Figure 2). A positive correlation was found between
GSH/GSSG ratio and PIV (r=0.88 p=0.0001). Additionally, a positive
correlation was found between GSH/GSSG and alpha index (0.73 p=0.004).
The simpathovagal balance and absolute LF component of SBP
showed a negative correlation with GSH/GSSG (r=0.7 p=0.004 and r=0.63
p=0.01 respectively )
Discussion
The present study have shown that L-NAME rats undergoing
resveratrol and grape juice treatments did not present any significant
attenuation of hypertension compared to those which had not undergone this
treatment. However, resveratrol and grape juice treatments did promote
autonomic and cardiac redox improvements. These results may be explained
in the light of other findings in the literature showing the positive effects of
resveratrol and other polyphenols.
(9)
on endothelial nitric oxide synthase. In
the present study, the benefits of the treatments could probably not be
associated with these positive effects, since all animals received L-NAME, a
known blocker of the isoforms of nitric oxide synthases. Moreover, resvertrol
may act on endothelial cells through different mechanisms such as: 1activation of Sirt 1 (silent mating type information regulation 2 homolog) and
KLF2, (Krüppel-like factor 2), 2-phosphorylation mediated by AMPK
(adenosine monophosphate (AMP) - activated protein Kinase) and ERK1/2
36
(extracellular – signal-regulated kinase) and 3- by enhancing antioxidant
enzymes expression
and lowering reactive oxygen species.
(21)
In this
context, and given the inhibition of NO,, we believe that these other forms of
resveratrol action may partially account for our results in both treated groups,
L-NAME+R and L-NAME+G.
As far as we know, this is the first study showing beneficial effects of
resveratrol and grape juice in autonomic modulation. Our results clearly
demonstrated a decrease in simpathovagal balance in both treated groups,
and an additional decrease in SBP sympathetic modulation and an increase in
alpha index
only in resveratrol group.
This finding is relevant because
several other studies have reported that increased sympathetic modulation
may lower BRS,, and decrease vagal modulation of the heart. These effects
could be associated not only to increase in both mortality and morbidity, but
also to the end organ damage. (11,22,23)
Therefore, strategies wich improve BRS, and as such, attenuate
autonomic disturbance can contribute to greater longevity and less targetorgan damage in hypertension.
The mechanisms by which resveratrol and grape juice would promote
these changes seem to be different, since sympathetic modulation of SBP
and BRS was improved only in L-NAME+R group. Moreover, in our protocol,
no significant difference between GSH/GSSG ratio was observed in either
treated group. This result indicates that other changes in the antioxidant
enzymes such as glutathione
peroxidase, superoxide
dismutase and
thioredoxin may be related to these autonomic improvements. Another
possibility is the fact that resveratrol may attenuate autonomic modulation by
37
reducing both the expression and activity of NADPH oxidase.
(24)
Indeed, it
has been demonstrated that NADPH activation is associated with increased
sympathetic
nervous system modulation in physiopathological conditions
such as in central inflammation.(14). Similarly, other researchers have
suggested that Xanthine oxidase inhibition promotes an increase in the left
ventricular function, a decrease in the catecholamine levels, an attenuation of
arrhythmias
and sympathetic hiperinnervation in postinfarct rat hearts.
(15)
Additionally, our group has shown that exercise training in SHR rats promotes
a decrease in sympathetic modulation associated with decreased lipid
peroxidation, and an increased in both superoxide dismutase activity and total
nitrates/ nitrite ratio. (25)
The positive correlation found between PIV with GSH/GSSG and
barorreflex index with GSH/GSSG reinforces this hypothesis. In fact, the
negative correlation between the simphathovagal balance and sympathetic
modulation with GSH/GSSG suggests an interaction between autonomic
modulation and cardiac redox parameters.
In conclusion, our results indicate
that resveratrol and grape juice
treatment can promote cardiovascular and redox benefits even when the nitric
oxide is decreased by the inhibition of nitric oxide synthase. The additional
improvement observed in sympathetic modulation of the vessels (LF
component of SPV) in the rats treated only with resveratrol may be attributed
to the improvement in BRS wich was only observed in this group.
Further studies should be performed to better understand the
mechanisms involved in the beneficial effects of grape juice, since it may
38
represent an important CVD early prevention tool beginning in childhood and
a significant addition to other prevention strategies for CVD in adults
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43
Figure 1- The results of PIV and SPV are presented in the graphs above. There was
no differences between PIV and SPV in time domain and absolute values in
frequency domain among groups . However normalized index of PIV in frequency
domain and baroreflex index (alpha index) shown to be altered after
treatment.*p<0.05 vs. LNAME
44
Figure 2- The graphs are showing the association between GSH/GSSG ratio
and autonomic indexes: PIV (Pulse Interval Variability, A) and alpha index (B)
were positively correlated with GSH/GSSG raio. LFSPV (Low Frequency
component of systolic pressure variability) and LF/HF (sympathovagal
balance) were inversely associated with GSH/GSSG ratio
45
Introdução
A Hipertensão Arterial Sistêmica é uma condição clínica de alta
prevalência e difícil controle. Cerca de 7,6 milhões de mortes em todo o
mundo são atribuídas a níveis elevados de pressão arterial (PA). Entre os
fatores de risco para hipertensão estão idade, sexo e etnia, sobrepeso,
obesidade, sedentarismo e maus hábitos alimentares.(1) Além disso, para
cada aumento de 20 mmHg na pressão arterial sistólica (PAS) ou 10 mmHg
na pressão arterial diastólica (PAD), dobra o risco de mortalidade por doença
isquêmica do coração e acidente vascular cerebral. Por outro lado, uma
redução de 5 mmHg na PAD e / ou 10 mmHg na PAS diminui o risco de
acidente vascular cerebral em um terço, e o risco de doença cardíaca
coronária por um sexto.(2)
Portanto, estratégias para a mudança de hábitos alimentares e
aumento no consumo de polifenóis têm sido propostos para prevenir ou
ajudar no tratamento da hipertensão. Neste contexto, o Resveratrol é um
polifenol encontrado no vinho tinto e suco de uva com efeitos antioxidantes,
anti-apoptóticos e anti-inflamatórios que tem sido investigado em muitos
estudos no campo cardiovascular e parece prevenir a disfunção endotelial. (3)
Em um estudo com homens coreanos hipertensos, o consumo de
suco de uva por 8 semanas promoveu uma diminuição significativa da PA.
(4)
Além disso,em ratos SHR nefrectomizados o consumo de resveratrol atenuou
a hipertensão e preveniu o desacoplamento da síntese do óxido nítrico
endotelial.(5) No entanto, quando estes ratos foram tratados com resveratrol e
L-NAME, estes benefícios não foram observados. Em contraste, outros
estudos têm mostrado que o tratamento com vinho pode prevenir o aumento
46
da PA, o remodelamento cardiovascular e o estresse oxidativo em ratos
tratados com L-Name.
(6 )
Em ratos com insuficiência cardíaca, o resveratrol
parece melhorar a sobrevida e atenua a disfunção sistólica e os níveis de
PA(7).
Esses benefícios podem ser explicados, pelo efeito positivo do
resveratrol e outros polifenóis na expressão da síntese do óxido nítrico pelo
endotélio
(8,9).
Contudo, outros mecanismos como o balanço redox e a
modulação autonômica e sensibilidade barorrelfexa tem sido pouco
explorados.
Os índices autonômicos funcionais, tais como variabilidade da
freqüência cardíaca, variabilidade da pressão arterial (VPS) e sensibilidade
do
barorreflexo
têm
sido
considerados
importantes
marcadores
de
mortalidade e danos em órgãos, independentemente dos níveis de PA.
(10,13)
De
fato,
a
interação
entre
enzimas
antioxidantes,
condições
inflamatórias, parâmetros redox e sistema nervoso autônomo tem sido
demonstrado em estudos recentes.
significativas sobre os
associação
desses
efeitos
(14,15)
No entanto, não há informações
autonômicos
efeitos
com
do
suco
de
parâmetros
uva
e
a
redox.
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do resveratrol e do suco
de uva sobre o controle autonômico da pressão arterial e da freqüência
cardíaca, parâmetros redox cardíaco e sensibilidade do barorreflexo e se o
bloqueio da síntese do óxido nítrico interfere nestes efeitos. A demonstração
de uma melhora nesses parâmetros poderia oferecer uma nova opção para a
prevenção precoce de doenças cardiovasculares.
47
Materiais e Métodos:
Animais
O experimento foi realizado em ratos Wistar machos (251 ± 10 g), com
12 semanas de idade, provenientes do Biotério da Universidade Federal de
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas
com 3 ou 4 animais cada em uma sala com temperatura controlada (22 ° C)
com um ciclo claro-escuro de 12h. Todos receberam ração padrão e água ad
libitum. Os procedimentos cirúrgicos e protocolos utilizados seguiram as
Diretrizes
de
Ética
em
cuidados
de
animais
experimentais.
Os ratos foram tratados com L-Name e distribuídos aleatoriamente em
1 dos 3 grupos: controle, resveratrol e suco de uva.
As concentrações de resveratrol foram calculadas para representar as
mesmas encontradas no suco de uva (Adega Wood House ®), e foram
estabelecidas após a análise de sua composição. Nesta análise, determinouse a quantidade de 0,062 mg de resveratrol por 100 ml de suco. A escolha do
volume a ser administrado aos animais foi determinada com base nos efeitos
benéficos encontrados na ingestão diária de 500 ml de suco de uva/ dia para
um indivíduo saudável. (4)
Durante os 30 dias do protocolo, diariamente às 17:00, foram
administrados por gavagem 2 ml das soluções de acordo com os tratamentos
(n=7/grupo): grupo controle (L-NAME), Resveratrol (L-NAME + R), suco de
uva (L-NAME + S). Nos últimos 7 dias de tratamento, em torno de 9h00min,
os animais receberam por gavagem 60mg/kg/day L-NAME diluído em ~ 1 mL
de água.
48
Avaliações cardiovasculares
Após o período do protocolo, 2 cânulas preenchidas com 0.06ml de
soro fisiológico foram posicionadas no interior da artéria e veia femoral (PE10) nos animais anestesiados (Ketamina 80 mg/kg + Xilazina 12 mg/kg) para
medidas diretas da PA.
Os animais foram avaliados vinte e quatro horas após a cirurgia de
canulação, acordados e com livre movimentação pela caixa durante os
experimentos. A cânula arterial foi conectada a um transdutor (P23Db, GouldStatham, Oxnard, CA) e os sinais da PA foram gravados por um período de
30 minutos por um microcomputador equipado com um conversor analógicodigital (Windaq, freqüência de amostragem de 2000Hz por canal; Dataq
Instruments, Inc., Akron,OH). Os dados registrados foram analisados
batimento a batimento para quantificar as mudanças na pressão arterial
média (PAM) e freqüência cardíaca (FC). (16,18)
Variabilidades
no
Domínio
da
Freqüência
(Análise
Espectral
Modelamento Auto-Regressivo)
Após obtenção da análise do sinal e obtenção da série de PAS e
intervalo de pulso em formato txt. ,os dados foram utilizados posteriormente
na análise espectral pelo modelamento autorregressivo pelo programa Matlab
7.0 em trechos de 300 bpm, com sobreposição de 50% e modelo da ordem
de 16 ( segundo critério de Akaike) . A faixa de freqüência de interesse para
análise espectral no rato encontra-se no intervalo que vai de 0 até 3Hz. A
potência espectral foi integrada em três faixas de freqüência de interesse:
altas freqüências (AF), entre 0,75 e 3,0 Hz; baixas freqüências (BF), entre
49
0,20 e 0,75 Hz e muito baixas freqüências (MBF), menores que 0,20 Hz.
Devido ao nosso tempo de coleta dos sinais de interesse para a análise
espectral, esse estudo não aborda as faixas de muito baixas freqüências
(MBF). Os resultados foram apresentados em seus valores absolutos e
normalizados (Task Force 1998)
A sensibilidade do barorreflexo foi avaliada pelo índice alfa. Este índice
avalia mudanças na PAS e no intervalo RR. A coerência entre o IP e a
variabilidade do sinal da PAS foi obtida através da análise espectral cruzada.
O índice alfa na banda de LF foi calculado só quando a magnitude do
quadrado da coerência entre o IP e a PAS foi maior do que 0,5 (variação de
0-1). Após o cálculo da coerência o índice alfa foi obtido pela raiz quadrada
da razão entre a variabilidade do IP e da PAS nas duas maiores bandas de
LF.
Determinação da concentração de glutationa oxidada (GSSG) e
reduzida(GSH)
Para determinar a concentração de glutationa oxidada e reduzida, o
tecido cardíaco foi desproteinizado com 2 mol/L de ácido perclórico,
centrifugado por 10 min a 1000 g, enquanto o sobrenadante foi neutralizado
com 2 mol/L de hidróxido de potássio. O meio de reação continha tampão
fosfato 100 mmol/L (pH 7,2), 2 mmol/L de ácido fosfato de nicotinamida
adenina, 0,2 U/mL de glutationa redutase, e 70 mmol/L de ácido
ditionitrobenzóico. Para determinar a glutationa reduzida, o sobrenadante foi
neutralizado com 2 mol/L de hidróxido de potássio, para reagir com 70
mmol/L de ácido ditionitrobenzóico. As reações foram medidas a 420 nm
(Akerboom & Sies 1981 ).
50
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± DP. ANOVA (one-way) foi
utilizada para comparar os grupos, seguido pelo teste de Student-NewmanKeuls. Correlação de Pearson foi utilizada para estudar a associação entre as
variáveis.
Resultados
Avaliações cardiovasculares
A avaliação direta da PA, realizada no final do protocolo não mostrou
diferenças significativas entre os grupos na PAS, assim como a frequência
cardíaca (Tabela 1). Estes resultados indicam que alterações hemodinâmicas
induzidas pelo tratamento com L-Name não foram modificadas por qualquer
um dos tratamentos, resveratrol ou suco de uva.
Variabilidade do Intervalo de Pulso e da Pressão Arterial Sistólica no
domínio do tempo e da freqüência
Os resultados da variabilidade do intervalo de pulso (VIP) e da pressão
arterial sistólica (VPAS) são apresentados na Figura 1. A VIP e a VAPS no
domínio do tempo expressas pela variância foram semelhantes entre os
grupos.
Analisado no domínio da freqüência, a frequência cardíaca mostrou
que o LF absoluto e os componentes absolutos de potência HF da VIP foram
semelhantes entre os grupos. No entanto, o componente LF normalizado da
VIP foi menor nos grupos LName + R e LNAME + S quando comparados ao
51
grupo L-NAME. Além disso, o componente LF normalizado da VIP foi
semelhante entre os grupos L-NAME + R e L-NAME + S.
O componente HF da VIP foi aumentado em L-NAME + R e LNAME +
S quando comparado com L-NAME. No entanto, não houve diferença
significativa entre o componente HF normalizado de L-NAME + R e
L-NAME
+
S.
significativamente
quando
Conseqüentemente,
diminuído
comparado
nos
o
equilíbrio
simpato-vagal
foi
grupos L-NAME + R e LNAME + S
com
o
grupo
L-NAME.
O componente LF da VPS foi menor em L-NAME + R em comparação
ao grupo L-NAME enquanto o grupo L-NAME + S não foi diferente do grupo
L-NAME. Da mesma forma, a sensibilidade do baroreflexo (alpha índice) foi
melhorada apenas no grupo L-NAME + R e não foram observadas diferenças
entre os grupos L-NAME + S e L-NAME.
Parâmetros cardíacos redox
Os valores de GSSG foram menores em L-NAME + R (0,0023 ±
0,0008 mmol / gtec) e L-NAME + S (0,0026 ± 0,0008 mmol / gtec) do que no
grupo L-NAME (0,0052 ± 0,0005 mmol / gtec). No entanto, os valores de GSH
foram semelhantes entre os grupos L-NAME + S (0,10 ± 0,01 mmol / gtec), LNAME + R (0,095 ± 0,011 mmol / gtec) e L-NAME (0,08 ± 0,01 mmol / gtec).
Conseqüentemente, os índices da relação GSH / GSSG foram maiores nos
grupos L-NAME + R, (41 ± 5) e L-NAME + S (39 ± 4) que no grupo L-NAME
(18 ± 3)
Análises de Correlação
52
Análises de correlação foram realizadas associando parâmetros redox
cardíacos e autonômicos (Figura 2). Uma correlação positiva foi encontrada
entre GSH / GSSG e VIP (r = 0,88 p = 0,0001). Além disso, uma correlação
positiva foi encontrada entre GSH / GSSG e índice de alpha (0,73 p = 0,004).
O balanço simpato-vagal e o componente LF absoluto da PAS mostraram
uma correlação negativa com GSH / GSSG (r = 0,7 p = 0,004 e r = 0,63 p =
0,01, respectivamente).
Discussão
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que ratos
tratados com L-NAME submetidos a tratamentos com suco de uva e
resveratrol
não
apresentaram
nenhuma
atenuação
significativa
da
hipertensão em comparação com aqueles que não foram submetidos a este
tratamento. No entanto, os tratamentos com suco de uva e resveratrol
promoveram melhoras autonômicas e cardíacas redox. Estes resultados
podem ser explicados a luz de outros achados na literatura que mostraram os
efeitos positivos do resveratrol e outros polifenóis na síntese do óxido nítrico
endotelial.
(9)
No presente estudo, os benefícios destes tratamentos podem
não estar associados com estes efeitos positivos, devido ao fato de que todos
os animais receberam L –NAME, um conhecido bloqueador de todas as
isoformas das sínteses de óxido nítrico. Além disso, o resveratrol pode agir
em células endotelias por diferentes mecanismos, tais como: ativação de Sirt
1 (Sirtuína do tipo ) e KLF2, (Krüppel-like fator 2); fosforilação mediada por
AMPK (adenosina monofosfato (AMP) - proteína ativada quinase) e ERK1 / 2
(extracelular - sinal-regulado quinase) e pela melhora da expressão de
53
enzimas antioxidantes e reduzindo espécies reativas de oxigênio.(21).Neste
contexto, em função da inibição do NO, acreditamos que essas outras formas
de ação do resveratrol podem explicar parte dos resultados em ambos
os grupos tratados, L-NAME + R e L-NAME + S.
Até onde sabemos pela literatura, este é o primeiro estudo que mostra
os efeitos benéficos do resveratrol e suco de uva na modulação autonômica.
Nossos resultados demonstraram claramente uma diminuição do equilíbrio
simpato-vagal em ambos os grupos tratados, e uma diminuição na
modulação simpática da PAS assim como um aumento do índice de alfa
apenas no grupo resveratrol. Este achado é relevante porque vários outros
estudos têm relatado que o aumento da modulação simpática pode diminuir a
sensibilidade do barorreflexo, e a diminuição da modulação vagal. Esses
efeitos podem estar associados não só ao aumento da mortalidade e
morbidade, mas também a lesões de órgãos alvo.11,22,23
Portanto, estratégias que contribuam para a melhorar a sensibilidade
do baroreflexo, e assim atenuar distúrbios autonômicos, podem contribuir
para uma maior longevidade e menor dano em órgãos-alvo na hipertensão.
Os mecanismos pelos quais o resveratrol e suco de uva poderiam
estar promovendo essas mudanças parecem ser diferentes, uma vez que a
modulação simpática da PAS e a sensibilidade do baroreflexo foram
melhorados apenas no grupo L-NAME + R. Além disso, em nosso protocolo,
não foram observadas diferenças significativas entre a relação GSH / GSSG
em ambos os grupos tratados (L-NAME + R e L-NAME +S). Este resultado
indica que outras mudanças no papel de enzimas antioxidantes como a
glutationa peroxidase, superóxido dismutase e tioredoxina podem estar
54
relacionadas a essas melhorias autonômicas. Outra possibilidade é o fato de
que o resveratrol pode atenuar a modulação autonômica reduzindo tanto a
expressão quanto a atividade da NADPH oxidase.
(24)
De fato, tem sido
demonstrado que a ativação do NADPH é associada com aumento da
modulação
do
sistema
nervoso
simpático
central
em
condições
fisiopatológicas, tais como na inflamação.(14) Da mesma forma, outros autores
têm sugerido que a inibição da xantina oxidase promove um aumento na
função ventricular esquerda, uma diminuição dos níveis de catecolaminas,
uma atenuação de arritmias e hiperinervação simpática em corações de ratos
pós-infarto (15).
A correlação positiva encontrada entre VIP com a relação GSH /
GSSG e índice barorreflexo com relação GSH / GSSG reforça essa hipótese.
De fato, a correlação negativa entre o balanço simpato-vagal e a modulação
simpática com a relação GSH / GSSG sugere uma interação entre a
modulação autonômica e os parâmetros cardíacos redox.
Em conclusão, nossos resultados indicam que os tratamentos com
resveratrol e suco de uva podem promover benefícios cardiovasculares e
redox, mesmo quando a síntese do óxido nítrico está bloqueada. A melhora
adicional observada na modulação simpática dos vasos (componente LF da
VPAS) em ratos hipertensos tratados
apenas com resveratrol pode ser
atribuída à melhoria da sensibilidade do barorreflexo observada somente
neste grupo.
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2008, 21(11):1188-1193.
59
Figura 1- Os resultados da VIP e VPS são apresentadas nos gráficos acima. Não
houve diferença entre VIP e VPS no domínio do tempo e nos valores absolutos no
domínio da freqüência entre os grupos. Entretanto, o índice normalizado de VIP no
domínio da freqüência e o índice do barorreflexo (alfa índice) mostraram alteração
após o tratamento .*p<0.05 vs. LNAME
60
Figura 2- Os gráficos mostram a associação entre a relação GSH/GSSG e
indices autonômicos: VIP (Variabilidade do Intervalo de Pulso) (A) e alfa
índice (B) foram positivamente correlacionados com a relação GSH/GSSG.
LFSPV (Componente LF da variabilidade da pressão sistólica) e LF/HF
(equilíbrio simpato-vagal) foram inversamente associados com a relação
GSH/GSSG.
61
6 APÊNDICE I
62