Total Testosterone
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Total Testosterone ® Coat-A-Count Total Testosterone English Intended Use: Coat-A-Count Total 125 Testosterone is a solid-phase I radioimmunoassay designed for the quantitative measurement of testosterone in unextracted serum or heparinized plasma. Coupled with an acid hydrolysis procedure, it is also suitable for assaying urine samples. It is intended strictly for in vitro diagnostic use as an aid in the diagnosis and management of conditions involving excess or deficiency of this androgen. Catalog Numbers: TKTT1 (100 tubes), TKTT2 (200 tubes), TKTT5 (500 tubes). The 100-tube kit contains less than 4 microcuries (148 kilobecquerels) of 125 radioactive I testosterone; the 200-tube kit contains less than 8 microcuries (296 kilobecquerels), and the 500-tube kit contains less than 20 microcuries (740 kilobecquerels). Summary and Explanation In the male, testosterone is mainly synthesized in the interstitial Leydig cells and the testis, and is regulated by the interstitial cell stimulating hormone (ICSH), or luteinizing hormone (LH) of the anterior pituitary (the female equivalent of ICSH). Testosterone is responsible for the development of secondary sex characteristics, such as the accessory sex organs, the prostate, seminal vesicles and the growth of facial, pubic and axillary hair. Testosterone measurements have been very helpful in evaluating hypogonadal states. Increased testosterone levels in males can be found in complete androgen 10 resistance (testicular feminization). Common causes of decreased testosterone levels in males include: hypogonadism, orchidectomy, estrogen therapy, Klinefelter's syndrome, hypopituitarism, and hepatic cirrhosis. In the female, testosterone levels are normally found to be much lower than those encountered in the healthy male. Testosterone in the female comes from 2 three sources. It is secreted in small quantities by both the adrenal glands and the ovaries, and in healthy women 50–60% of the daily testosterone production arises from peripheral metabolism of prehormones, chiefly androstenedione. Common causes of increased serum testosterone levels in females include polycystic ovaries (SteinLeventhal syndrome), ovarian tumors, adrenal tumors and adrenal hyperplasia. Virilization in women is associated with the administration of androgens and endogenous overproduction of testosterone. There appears to be a correlation between serum testosterone levels and the degree of virilization in women, although approximately 25% of women with varying degrees of virilism have serum testosterone levels that fall within the female reference range. Principle of the Procedure The Coat-A-Count procedure is a solid-phase radioimmunoassay, based on testosterone-specific antibody immobilized to the wall of a polypropylene tube. 125 I-labeled testosterone competes for a fixed time with testosterone in the patient sample for antibody sites. The tube is then decanted, to separate bound from free, and counted in a gamma counter. The amount of testosterone present in the patient sample is determined from a calibration curve. Reagents to Pipet: 1 Total Incubation Time: 3 Hours Total Counts at Iodination: approximately 60,000 cpm Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator designated for incoming radioactive materials. Dispose of in accordance with applicable laws. Do not use reagents beyond their expiration dates. Some components supplied in this kit may contain human source material and/or Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) other potentially hazardous ingredients which necessitate certain precautions: Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dL, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Water: Use distilled or deionized water. Radioactivity A copy of any radioisotope license certificate (Specific or General) issued to a US customer must be on file with Siemens Healthcare Diagnostics before kits or components containing radioactive material can be shipped. These radioactive materials may be acquired by any customer with the appropriate Specific license. Under a General license these radioactive materials may be acquired only by physicians, veterinarians in the practice of veterinary medicine, clinical laboratories and hospitals — and strictly for in vitro clinical or laboratory tests not involving external or internal administration of the radioactive material or its radiation to human beings or other animals. Its acquisition, receipt, storage, use, transfer and disposal are all subject to the regulations and a (General or Specific) license of the U.S. Nuclear Regulatory Commission or a State with which the NRC has entered into an agreement for the exercise of regulatory control. Handle radioactive materials according to the requirements of your General or Specific license. To minimize exposure to radiation, the user should adhere to guidelines set forth in the National Bureau of Standards publication on the Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) and in subsequent publications issued by State and Federal authorities. Wipe up spills promptly and decontaminate affected surfaces. Avoid Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) generation of aerosols. Dispose of solid radioactive waste according to license requirements. General licensees (holders of NRC Form 483) may dispose of solid radioactive waste as nonradioactive waste, after removing labeling. Specific licensees (NRC Form 313) should refer to Title 10, Code of Federal Regulations, Part 20. Licensees in Agreement States should refer to the appropriate regulations of their own state. General licensees may dispose of liquid radioactive waste of the type contained in this product through a laboratory sink drain. Licensees must remove or deface labels from empty containers of radioactive materials before disposal of solid waste. Specific licensees may dispose of small quantities of liquid radioactive waste of the type used in this product through a laboratory sink drain. Refer to the appropriate regulations applicable to your laboratory. Materials Supplied: Initial Preparation It has been found that testosterone adsorbs to rubber surfaces; hence rubber containers and caps should be avoided in handling the reagents supplied. Total Testosterone Ab-Coated Tubes (TTT1) Polypropylene tubes coated with antibodies to testosterone and packaged in zip-lock bags. Store refrigerated and protected from moisture, carefully resealing the bags after opening. Stable at 2–8°C until the expiration date marked on the bag. Color: yellow. TKTT1: 100 tubes. TKTT2: 200 tubes. TKTT5: 500 tubes. 125 I Total Testosterone (TTT2) 105 mL of Iodinated testosterone. Stable at 2–8°C for 30 days after opening, or until the expiration date marked on the vial. The tracer must be at room temperature (15–28°C) and thoroughly mixed by gentle inversion before use. TKTT1: 1 vial. TKTT2: 2 vials. TKTT5: 5 vials. Total Testosterone Calibrators (TTC3–8) Six vials of testosterone calibrators, ready to use. The zero calibrator A contains 4.0 mL, and the remaining calibrators B 3 through F contain 1.0 mL each. Stable at 2–8°C for 30 days after opening, or for 6 months (aliquotted) at –20°C. TKTT1: 1 set. TKTT2: 1 set. TKTT5: 2 sets. The calibrators contain, respectively, 0, 20, 100, 400, 800 and 1,600 nanograms of testosterone per deciliter (ng/dL) in processed human serum; equivalently: 0, 0.7, 3.5, 14, 28 and 55 nanomoles per liter (nmol/L). Intermediate calibration points may be obtained by mixing calibrators in suitable proportions. EDTA plasma yields results which are on average about 10% lower. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed samples may indicate mistreatment of a specimen before receipt by the laboratory; hence the results should be interpreted with caution. Gamma counter – compatible with standard 12x75 mm tubes Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. Coat-ACount Total Testosterone has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Vortex mixer Volume Required: 50 µL per tube. Materials Required But Not Provided Urine Hydrolysis See the Sample Preparation: Urine Hydrolysis section. Radioimmunoassay Plain 12x75 mm polypropylene tubes — for use as NSB tubes, available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: PPO) Micropipets: 50 µL and 1.0 mL Waterbath — capable of maintaining 37°C — neither an oven nor a heat block is suitable Foam decanting rack – available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: FDR) Logit-log graph paper A tri-level, human serum-based immunoassay control, containing testosterone as one of over 25 assayed constituents, is available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: CON6). Specimen Collection Serum and Heparinized Plasma: The patient need not be fasting, and no special preparations are necessary. 8 Collect blood by venipuncture into plain (without anticoagulant) or heparinized tubes, noting the time of collection, and separate the serum or heparinized plasma from the cells by centrifugation. 4 Storage: 2–8°C for 7 days, or 2 months at 9 –20°C. Before assay, allow the samples to come to room temperature (15–28°C) and mix by gentle swirling or inversion. Aliquot, if necessary, to avoid repeated thawing and freezing. Do not attempt to thaw frozen specimens by heating them in a waterbath. Urine: Obtain a 24-hour sample, keeping the specimen refrigerated during collection. Record the total volume. Unless the analysis is to be carried out immediately, reserve a well-mixed aliquot after adding 1.0 gram of boric acid per 100 mL urine. Volume Required: 1.0 mL (for hydrolysis procedure). Storage: 7 days at 2–8°C or 1 month at –20°C. Sample Preparation: Urine Hydrolysis 1 Label one glass or plastic uncoated tube for each urine sample. Do not use antibody-coated tubes. 2 Pipet 1.0 mL of each urine sample into the appropriate tube. If the sample is cloudy, or if a precipitate has formed, first centrifuge the urine and work with the clear supernatant. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 3 4 Add 200 µL of concentrated HCl (12N, not supplied) to every tube. Loosely cap and incubate in a boiling water bath for 15 minutes. Calibrators ng/dL A (MB) 0 0 B 20 0.7 Dilute each hydrolyzed sample 1-in-25 with the zero calibrator: for example, add 10 µL of hydrolyzed sample to 240 µL of zero calibrator. C 100 3.5 D 400 14 E 800 28 F 1,600 55 Do not use water to dilute the hydrolyzates; the zero calibrator must be used. 2 Proceed with the radioimmunoassay procedure, as described below in the Radioimmunoassay Procedure section. If not assayed immediately, the hydrolyzates should be stored tightly capped at –20°C for no more than 7 days. Volumes may be scaled up, if desired, providing the proportions specified in the hydrolysis procedure remain unchanged. 1 Plain Tubes: Label four plain (uncoated) 12x75 mm polypropylene tubes T (total counts) and NSB (nonspecific binding) in duplicate. 3 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 125 Add 1.0 mL of I Total Testosterone to every tube. Vortex. Laboratories equipped with a reliable pipettor-diluter may handle steps 2 and 3 simultaneously, but care should be taken to avoid carryover from sample to sample. No more than 10 minutes should elapse during the dispensing of the tracer. Set the T tubes aside for counting (at step 6); they require no further processing. 4 Incubate for 3 hours at 37°C. 5 Decant thoroughly. Removing all visible moisture will greatly enhance precision. Using a foam decanting rack, decant or aspirate the contents of all tubes (except the T tubes) and allow them to drain for 2 or 3 minutes. Then strike the tubes sharply on absorbant paper to shake off all residual droplets. Because nonspecific binding in the Coat-A-Count procedure is characteristically low, the NSB tubes may be safely omitted without compromising accuracy or quality control. Coated Tubes: Label twelve Total Testosterone Ab-Coated Tubes A (maximum binding) and B through F in duplicate. Label additional antibody-coated tubes, also in duplicate, for controls and patient samples. Pipet 50 µL of the zero calibrator A into the NSB and A tubes, and 50 µL of each remaining calibrator, control and patient sample (serum or heparinized plasma) into the tubes prepared. Pipet 50 µL of each urinary hydrolyzate into appropriately labeled tubes. Pipet directly to the bottom. Patient samples expected to contain testosterone concentrations greater than the highest calibrator (1,600 ng/dL) should be diluted in the zero calibrator. Radioimmunoassay Procedure A single calibration curve provides the basis for determining testosterone concentrations in serum (or heparinized plasma) and in urine. Accordingly, both urinary hydrolyzates and untreated serum samples may be processed in the same assay. The calibrators are ready to use; only urine samples must be subjected to hydrolysis, as described in the Sample Preparation: Urine Hydrolysis section. All components must be at room temperature (15–28°C) before use. nmol/L 6 Count for 1 minute in a gamma counter. Calculation and Quality Control To calculate total testosterone concentrations from a logit-log representation of the calibration curve, first calculate for each pair of tubes the 5 average NSB-corrected counts per minute: Net Counts = (Average CPM) minus (Average NSB CPM) Then determine the binding of each pair of tubes as a percent of maximum binding (MB), with the NSB-corrected counts of the A tubes taken as 100%: Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts) × 100 The calculation can be simplified by omitting the correction for nonspecific binding; samples within range of the calibrators yield virtually the same results when Percent Bound is calculated directly from Average CPM. Using logit-log graph paper, plot Percent Bound on the vertical (probability) axis against Concentration on the horizontal (logarithmic) axis for each of the nonzero calibrators, and draw a straight line approximating the path of these points. Results for the unknowns may then be read from the line by interpolation. Although other approaches are acceptable, data reduction by the logit-log method just described has certain advantages in this context – for example, in allowing easier recognition of deviant calibration points – since the Coat-A-Count Total Testosterone procedure has been optimized for linearity in that representation. Urine Samples: Divide the result in "ng/dL" as read from the calibration curve by 100, to convert to ng/mL; then multiply by 30, to obtain the testosterone concentration, in ng/mL, of the original, unhydrolyzed urine sample. (A factor of 30 is used, because the urine samples are diluted 1-in-1.2 with the hydrochloric acid, then 1-in-25 with the zero calibrator.) Multiply by the total volume in liters to report the 24-hour testosterone output in micrograms per day. Dilute patient serum and heparinized plasma samples expected to contain testosterone concentrations greater than the highest calibrator (1,600 ng/dL) with the zero calibrator before assay. All samples, including the calibrators and controls, should be assayed in duplicate. It is good practice to use a disposable-tip micropipet, changing the tip between samples, in order to avoid carryover contamination. Pairs of control tubes may be spaced throughout the assay to help verify the absence of significant drift. Inspect the results for agreement within tube pairs, and take care to avoid carryover from sample to sample. It has been found that testosterone adsorbs to rubber surfaces; hence rubber containers and caps should be avoided in handling the reagents supplied. Controls: Controls or serum pools with at least two total testosterone concentration levels (low and high) should routinely be assayed as unknowns, and the results charted from day to day as described in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Repeat samples are a valuable additional tool for monitoring interassay precision. Data Reduction: It is good practice to construct a graph of the calibration curve as a visual check on the appropriateness of the transformation used, even where the calculation of results is handled by computer. See further Davis SE et al. Radioimmunoassay data processing with a small programmable calculator. J Immunoassay 1980;1:15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:126471. Q. C. Parameters: We recommend keeping track of these performance measures: T = Total Counts (as counts per minute) Record Keeping: It is good laboratory practice to record for each assay the lot numbers of the components used, as well as the dates when they were first reconstituted or opened. %NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total Counts) Sample Handling: The instructions for handling and storing patient samples and components should be carefully observed. 20% = Concentration at 20 Percent Bound, etc. 6 %MB = 100 × (Net Counts / Total Counts) And the 20, 50 and 80 percent "intercepts," where Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Example Run: For illustration only, not for calculating results from another run. (See “Example Run” table.) Expected Values In a reference range study, 87 male serum samples and 81 female serum samples were assayed by the Coat-A-Count Total Testosterone procedure, with the following results in ng/dL. Median Central 95% n (ng/dL) Range Absolute Range Females Ovulating 41 24 ND–80 ND–81 Oral 13 contraceptives 15 — ND–28 Postmenopausal 27 20 4.0–62 4.0–74 20–49 yrs 68 630 262–1,593 245–1,836 > 50 years 19 427 181–758 181–772 Males ND: not detectable Comparison of the Coat-A-Count 50 µL Total Testosterone procedure with its predecessor suggests the following urinary testosterone reference ranges: 25 to 125 µg/day (with a median of approximately 75 µg/day) for adult males, and 5 to 35 µg/day (with a median of approximately 15 µg/day) for adult females. Intraassay Precision (Within-Run): A precision-dose profile is displayed, based on 17 to 21 degrees of freedom per point and depicting the CVs to be expected for samples assayed in duplicate. (See “Precision Profile” graph.) Interassay Precision (Run-to-Run): Statistics were calculated for each of seven samples from the results of pairs of tubes in 20 different assays. (See “Interassay Precision” table.) Specificity: The Coat-A-Count Total Testosterone antiserum is highly specific for testosterone. Percent crossreactivity was calculated on a weight-per-weight basis at approximately 50% binding. (See "Specificity" table for representative data.) Linearity: Samples were assayed under various dilutions. (See "Linearity" table for representative data.) End-of-Run Effect: None up to approximately 300 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.) Recovery: Samples spiked 1 to 19 with three Testosterone solutions (5,000, 10,000 and 20,000 ng/dL) were assayed. (See "Recovery" table for representative data.) Bilirubin: Presence of bilirubin in concentrations up to 200 mg/L has no effect on results, within the precision of the assay. Laboratories should consider these results as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges. Hemolysis: Presence of packed red blood cells in concentrations up to 30 µL/mL has no effect on results, within the precision of the assay. Performance Data Lipemia: The high calibrator (1,600 ng/dL) was serially diluted with a lipemic serum pool. This causes the degree of lipemia to increase as the testosterone concentration (due primarily to the contribution of the calibrator) decreases. These dilutions were assayed along with the unspiked lipemic pool. The results show that even severe lipemia has no clinically significant effect on the assay. See Tables and Graphs for data representative of the Coat-A-Count Total Testosterone kit's performance. Total testosterone results in the sections below are expressed as ng/dL. Unless otherwise specified, the results in the following sections have been generated on serum samples. Conversion Factor: ng/dL × 0.03467 → nmol/L Reportable Range: 4 – 1,600 ng/dL. Calibration Range: 20 – 1,600 ng/dL (0.7 – 55 nmol/L). Analytical Sensitivity: 4 ng/dL (0.14 nmol/L). Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Alternate Sample Type: To determine whether anticoagulants interfere with the assay, blood was collected from 23 volunteers into plain, heparinized and EDTA vacutainer tubes. All samples were assayed by the Coat-A-Count Total Testosterone procedure. By linear regression. 7 (Heparin) = 1.02 (Serum) – 1.0 ng/dL r = 0.998 Means: 273 ng/dL (Heparin) 270 ng/dL (Serum) (EDTA) = 0.91 (Serum) + 3.0 ng/dL r = 0.997 Means: 250 ng/dL (EDTA) 270 ng/dL (Serum) The results show that heparinized plasma yields virtually the same results as serum in the Coat-A-Count Total Testosterone procedure, whereas EDTA plasma yields results which are on average about 10% lower. SHBG Effect: To determine whether the procedure is affected by variations in the endogenous sex hormone-binding globulin (SHBG) level, the calibrators from IRMACount SHBG kit were each spiked 1-in201 with a testosterone spiking solution, and then assayed, both spiked and unspiked, by the Coat-A-Count Total Testosterone procedure. The fourth column shows the apparent testosterone values (in ng/dL) of the spiked SHBG calibrators after correction for the observed testosterone concentrations of the unspiked calibrators. The final column was calculated taking as 100% the average corrected apparent testosterone concentration of the spiked SHBG calibrators. (See "SHBG Effect" table for representative data.) Protein Effect: To simulate various protein concentrations, experiments were performed in which 2.0 mL aliquots of a human serum pool were freeze-dried and then reconstituted with various volumes of water (1.3, 2.0 and 3.0 mL). Each reconstituted aliquot was then assayed by the Coat-A-Count Total Testosterone procedure. (The factor to correct for reconstitution volume is tabulated.) Observed and expected total testosterone values are tabulated in ng/dL. (See "Protein Effect" table for representative data.) Method Comparison: In a patient comparison study, Coat-A-Count Total Testosterone kit was compared with two commercially available testosterone radioimmunoassays, one a doubleantibody assay (Kit A), and the other a coated-tube assay (Kit B). Results from 37 8 male and 46 female serum samples were combined, yielding the following relationships. (TKTT) = 1.10 (Kit A) + 19 ng/dL r = 0.981 Means: 269 ng/dL (TKTT) 227 ng/dL (Kit A) (TKTT) = 1.23 (Kit B) + 16 ng/dL r = 0.987 Means: 269 ng/dL (TKTT) 206 ng/dL (Kit B) References 1) Abraham GE, editor. Handbook of radioimmunoassay. Marcel Dekker, 1977. 2) DeGroot LJ, editor. Endocrinology. Grune and Stratton, 1980. 3) Jaffe BM, Behrman NR, editors. Methods of hormone radioimmunoassay. Academic Press, 1974. 4) Yen SSC, Jaffe RB, editors. Reproductive endocrinology. W.B. Saunders, 1978. 5) Testosterone. Slide/Seminar Program – Bioeducational Publications, 1980. 6) Testosterone. Mini-Seminar. Diagnostic Products Corporation, 1982;5(2). 7) Ismail AAA, et al. The role of testosterone measurements in the investigation of androgen disorders. Ann Clin Biochem 1986;23:113-34. 8) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. 4th ed. NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, 1998. 9) Demetriou JA. Testosterone. In: Pesce AJ, Kaplan LA, editors. Methods in clinical chemistry. St. Louis: The C. V. Mosby Company, 1987: 268. 10) Wilson JD, Foster DW, editors. Williams textbook of endocrinology. Philadelphia: Saunders, 1992: 923-6. Technical Assistance In the United States, contact Siemens Healthcare Diagnostics Technical Services department. Tel: 877.229.3711. To place an order: Tel: 800.255.3232. Outside the United States, contact your National Distributor. www.siemens.com/diagnostics The Quality System of Siemens Healthcare Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Interassay Precision (ng/dL) Tables and Graphs Example Run Tube 1 T7 NSB8 Total Duplicate Average Percent Testo. 2 3 4 5 CPM CPM Net CPM Bound ng/dL6 62,509 62,875 298 300 A 20,453 (MB)9 20,529 62,692 299 0 20,491 20,192 100% 0 B 17,659 17,755 17,707 17,408 86.2% 20 C 13,483 13,697 13,590 13,291 65.8% 100 D 8,168 8,100 8,134 7,835 38.8% 400 E 5,868 5,960 5,914 5,615 27.8% 800 F 4,138 4,128 4,133 3,834 78 X2 9,075 9,195 9,135 8,836 43.8% 320 X3 6,315 6,127 6,221 5,922 29.3% 750 Quality Control Parameters:11 T7 = 62,692 cpm %NSB8 = 0.5% %MB9 = 32% 20% Intercept12 = 1,390 ng/dL 50% Intercept = 230 ng/dL 80% Intercept = 40 ng/dL 11% 1 76 8.7 2 93 11 12% 3 264 17 6.4% 4 401 27 6.7% 5 594 35 5.9% 6 672 40 6.0% 7 1,300 95 7.3% 1 31 29 38 37 28 2 116 112 116 118 112 3 164 174 164 167 159 4 306 292 294 307 300 5 429 439 420 447 416 6 738 726 733 737 724 7 839 811 831 836 830 Dilution1 Observed2 Expected3 %O/E4 Linearity (ng/dL) 1 2 Precision Profile 3 4 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) CV3 Tubes Tubes Tubes Tubes Tubes1 110– 190– 270– 348– 361 283 203 30–43 123 Unknowns10 X1 SD2 End-of-Run Effect (ng/dL) 19.0% 1,600 14,465 14,544 14,245 70.5% 14,623 Mean1 8 in 8 730 — — 4 in 8 349 365 96% 2 in 8 170 183 93% 1 in 8 78 91 86% 8 in 85 732 — — 4 in 8 346 366 95% 2 in 8 174 183 95% 1 in 8 83 92 90% 8 in 8 797 — — 4 in 8 378 399 95% 2 in 8 189 199 95% 1 in 8 87 100 87% 8 in 8 1,582 — — 4 in 8 855 791 108% 2 in 8 401 396 101% 1 in 8 183 198 92% 9 Recovery (ng/dL) Protein Effect Spiking Solution1 Observed2 Expected3 1 2 3 4 5 %O/E4 Approx Observed Expected Expt. Factor1 g/dL2 ng/dL2 ng/dL4 O/E5 — 44 — — 1.50× ~ 10.5 71 83 A 294 292 101% 1.00× ~ 7.0 55 — — B 512 542 95% 0.67× ~ 4.7 40 37 108% 91% 1 86% C 1,001 1,042 96% 1.50× ~ 10.5 350 383 — 165 — — 1.00× ~ 7.0 255 — — A 418 407 103% 0.67× ~ 4.7 200 171 117% 87% 2 B 665 657 101% 1.50× ~ 10.5 577 660 C 1,111 1,157 96% 1.00× ~ 7.0 440 — — — 287 — — 0.67× ~ 4.7 355 295 120% A 512 523 98% B 762 773 99% C 1,247 1,273 98% — 512 — — A 697 736 95% B 1,008 986 102% C 1,471 1,486 99% — 636 — — A 872 854 102% B 1,063 1,104 96% C 1,494 1,604 93% 3 SHBG Effect CAC Total Testosterone (ng/dL) IRMACount SHBG Spiked1 Calibrator Unspiked Observed Corrected % nmol/L2 ng/dL3 ng/dL4 ng/dL5 Corr./Avg. 6 A–0 0 404 404 96% B – 1.0 0 434 434 103% C – 3.0 2.0 438 436 104% D – 30 14 448 434 103% E – 90 40 465 425 101% F – 180 88 473 385 92% Avg: 420 10 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Specificity Compound1 ng/dL Added2 Apparent % Crossng/dL3 reactivity4 Aldosterone 800,000 ND 0 5β-Androstan-3α,17βdiol 200,000 740 0.4% Androstenedione 100,000 490 0.5% 5α-Androstan-3β,17βdiol 100,000 38 0.04% 5-Androsten-3β,17β-diol 25,000 57 0.2% 5α-Androstan-3,17-dione 100,000 54 0.05% Androsterone 10,000,000 430 0.004% Corticosterone 500,000 9.0 0.002% Cortisol 800,000 43 0.005% Cortisone 800,000 150 0.02% Danazol 20,000 17 0.09% 11-Deoxycortisol 100,000 ND 0 Dexamethasone 800,000 26 0.003% 1,000,000 15 0.002% 100,000 6.0 0.006% 5,000 164 3.3% 2,500 77 3.1% 1,250 35 2.8% 625 21 3.4% DHEA DHEA-sulfate 5α-Dihydrotestosterone Estradiol 100,000 18 0.02% 5(10)-Estren-17α-ethinyl17β-ol-3-one 5,000 11 0.2% 4-Estren-7α-methyl-17βol-3-one 100,000 1,100 1.1% 4-Estren-17-ol-3-one 10,000 2,000 20% (19-Nortestosterone) 5,000 1,000 20% 1,000 220 22% Estrone 50,000 7.0 0.01% Ethisterone 5,000 37 0.7% 500,000 67 0.01% 2,000 2.0% Fluoxymesterone ("Halotestin") 19100,000 Hydroxyandrostenedione 11-Ketotestosterone 1,300 210 16% Methyltestosterone 3,000 52 1.7% Norethindrone 5,000 5.0 0.1% Norethyrodrel 5,000 13 0 Prednisone 80,000 ND 0 Progesterone 100,000 ND 0 Spironolactone 100,000 ND 0 11β-Hydroxytestosterone 200,000 1,600 0.8% 100,000 1,200 1.2% 5,000 11 0.2% Triamicinolone ND: not detectable5 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent Bindung, 6Ca. Gesamt Testosteron, ng/dl, 7Total, 8 %NSB, 9%MB, 10Unbekannte, 11 Qualitätskontrollparameter, 1220% Intercept. End-of-Run Effect: 1Röhrchen. Interassay Precision: 1Mittelwert, 2SD (Standardbereich), 3 CV (Variationskoeffizient). Linearity: 1 Verdünnung, 2Beobachten (B), 3Erwarten (E), 4 % B/E, 58 in 8. Recovery: 1Lösung, 2 Beobachten (B), 3Erwarten (E), 4% B/E. Specificity: 1Verbindung, 2zugesetzte Menge, 3 Ausgewiesene Konzentration, 4% Kreuzreaktivität, 5NN: Nicht nachweisbar. Protein Effect: 1Rekonstitution, 2Ca. Konzentration, 3Beobachten (B), 4Erwarten (E), 5 % B/E. SHBG Effect: 1Versetzt, 2Kalibrator, 3 Ohne Zugabe von, 4Beobachten, 5Korrigiert, 6 % Korrigiert./ Mittelwert. Español. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Media CPM, 4 CPM Netas, 5Porcentaje de unión, 6Testosterona Total, aprox., ng/dl, 7 Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconocido, 11 Parámetros del control de calidad, 12Corte al 20%. End-of-Run Effect: 1Tubos. Interassay Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Linearity: 1 Dilución, 2Observado (O), 3Esperado (E), 4 %O/E, 58 en 8. Recovery: 1Solución, 2 Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E. Specificity: 1Compuesto, 2Cantidad añadida, 3 Concentración aparente, 4% Reacción cruzada, 5 ND: no detectable. Protein Effect: 1 Reconstitución, 2Concentración Aprox., 3 Observado (O), 4Esperado (E), 5%O/E. SHBG Effect: 1Cargadas, 2Calibrador, 3Sin añadir, 4 Observado, 5Corregidos, 6% Corregidos/ Media. Français. Exemple Série: 1Tube, 2Duplicate CPM, 3 CPM moyen, CPM corrigé, 5 Pourcentage lié, 6Approx. Testostérone Totale, ng/dl, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Patients, 11 Paramètres Contrôle de Qualité, 1220% Intercept. Effet de la position des tubes 1 Tubes. Interassay Precision: 1Moyenne, 2SD, 3 CV. Linearity: 1Dilution, 2Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A, 58 dans 8. Recovery: 1Solution, 2 Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A. Specificity: 1 Composé, 2ajouté, 3 Concentration apparente, 4 Réaction croisée%. 5ND: non détectable. Protein Effect: 1Reconstitution, 2Concentration environ, 3Observé (O), 4Attendu (A), 5%O/A. SHBG Effect: 1Chargés, 2Calibrateur, 3Non chargés, 4Observé, 5Corrigés, 6% Corrigés/ moyen. Italiano. Seduta Esemplificativa: 1Provetta, CPM in duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti, 5 Percentuale di Legato, 6Appross. Testosterone Totale, ng/dL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10 Campioni Non Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità, 12Intercetta al 20%. Effetto fine Seduta: 1Provette. Interassay Precision: 1 Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione). Linearity: 1 Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A, 5 8 in 8. Recovery: 1Soluzione, 2Osservato (O), 3 Atteso (A), 4%O/A. Specificity: 1Composto, 2 11 2 quantità aggiunta, 3 Concentrazione apparente, Percentuale di Crossreattività, 5ND: non determinabile. Protein Effect: 1Ricostituzione, 2 Concentrazione ca., 3Osservato (O), 4Atteso (A), 5%O/E. SHBG Effect: 1Aggiunta, 2 Calibratore, 3Semplice, senza, 4Osservato, 5 Corretti, 6% Corretti/ Medio. 4 Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem de Ligação, 6Aprox. Testosterona Total ng/dL, 7 Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconhecidas, 11 Parâmetros do controlo de qualidade, 1220% Intercepção. Efeito fim-de-série: 1Tubos. Interassay Precision: 1Média, 2Desvio padrão, 3 Coeficiente de variação. Linearity: 1Diluição, 2 Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E, 58 em 8. Recovery: 1Solução, 2Observado (O), 3 Esperado (E), 4%O/E. Specificity: 1Composto, 2 Quantidade adicionada, 3Apparent Concentration, 4Percentagem de reacção cruzada, 5ND: não detectável. Protein Effect: 1 Reconstituição, 2Aproximadamente Concentration, 3Observado (O), 4Esperado (E), 5 % O/E. SHBG Effect: 1Adicionadas, 2 Calibrador, 3Não adicionada, 4Observado, 5 Corrigidos, 6% Corrigidos/Média. Deutsch Coat-A-Count Gesamt Testosteron Anwendung: Festphasen Radioimmunoassay (beschichtete Röhrchen) zur direkten quantitativen Bestimmung des Testosterons im nicht extrahierten Serum oder Heparin-Plasma. Nach saurer Hydrolyse ist die Bestimmung im Urin ebenfalls möglich. Der Assay ist ausschließlich in der in-vitro Diagnostik zur Diagnose und Beurteilung von Zuständen, die mit Überschuss oder Mangel dieses Androgens einhergehen, einzusetzen. Artikelnummern: TKTT1 (100 Tests), TKTT2 (200 Tests), TKTT5 (500 Tests). Die Packung mit 100 Röhrchen enthält weniger als 4 Microcurie (148 Kilobequerel) an 125 radioaktivem I-markiertem Testosteron; die Packung mit 200 Röhrchen enthält weniger als 8 Microcurie (296 Kilobecquerel) und die Packung mit 500 Röhrchen enthält weniger als 20 Microcurie (740 Kilobecquerel). 12 Klinische Relevanz Beim Mann wird Testosteron hautsächlich in den interstitiellen Leydig-Zellen des Hodens gebildet. Die Synthese wird durch das Interstitialzellen stimulierende Hormon (ICSH) oder Luteinisierende Hormon (LH, dem weiblichen Äquivalent des ICSH) der Hypophyse reguliert. Testosteron ist verantwortlich für die Entwicklung der männlichen sekundären Geschlechtsmerkmale, der akzessorischen Sexualorgane, der Prostata, Samenblase, sowie für die Entwicklung der Gesichts-, Schamund Achselbehaarung. Die Bestimmung des Testosterons ist von Bedeutung bei der Beurteilung von Hypogonadismus. Erhöhte Testosteronspiegel können bei Männern mit Androgenresistenz gefunden 10 werden (testikuläre Feminisierung). Beim Mann können folgende Ursachen für erniedrigte Testosteronspiegel verantwortlich sein: Hypogonadismus, Orchidectomie, Östrogentherapie, Klinefelter Syndrom, HypophysenUnterfunktion und Leberzirrhose. Bei Frauen werden normalerweise sehr viel niedrigere Testosteronspiegel als bei Männern gefunden. Bei Frauen stammt das Testosteron aus drei Quellen. Es wird in geringen Mengen von den Nebennieren und den Ovarien synthetisiert. Bei gesunden Frauen stammen 50–60% der täglichen Testosteron-Produktion von der Metabolisierung der Vorstufen und zwar hauptsächlich des Androstendions. Häufige Ursachen für erhöhte Testosteronspiegel bei Frauen sind Polyzystische Ovarien (Stein-Leventhal Syndrom), Ovariatumoren, Nebennierentumoren und Nebennierenhyperplasien. Virilisierungserscheinungen bei Frauen sind assoziiert mit Androgengaben und endogener Testosteronüberproduktion. Der Serum-Testosteronspiegel scheint mit dem Virilisierungsgrad bei Frauen zu korrelieren, obwohl 25% der Frauen mit unterschiedlich stark ausgeprägter Virilisierung einen Testosteronspiegel innerhalb des Referenzbereiches für Frauen haben. Methodik Im Coat-A-Count RIA zur Bestimmung des 125 Gesamt Testosteron konkurriert Imarkiertes Testosteron eine vorgegebene Zeit mit dem Testosteron im Patientenserum um die Bindung an Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Testosteron-Antikörper, die auf die Innenwand von Polypropylen-Röhrchen fest aufgebracht sind. Um die freie von der gebundenen Fraktion zu trennen, wird das Röhrchen dekantiert. Anschließend erfolgt die Messung im Gamma-Counter. Die Konzentration des Testosteron in der Patientenprobe wird an einer Standardkurve bestimmt. Zu pipettierende Reagenzien: 1 Testdauer: 3 Stunden Totalaktivität zum Zeitpunkt der Markierung: ca. 60 000 cpm Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Zur In-vitro-Diagnostik. Reagenzien: Die Packung mit den Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem Kühlschrank gelagert werden, der für radioaktives Material ausgewiesen ist. Die Entsorgung muss nach den jeweils gültigen Gesetzen erfolgen. Die Reagenzien dürfen nur bis zum Verfallsdatum verwendet werden. Einige Komponenten des Kits können Material humanen Ursprungs und/oder in anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe enthalten, die es unbedingt notwendig machen die folgenden Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten: Die generell geltenden Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten und alle Komponenten als potenziell infektiös zu behandeln. Alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wurden auf Syphilis, Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2, Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Hepatitis-C-Antikörper untersucht und negativ befundet. Bestimmten Komponenten wurde Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um die Bildung von explosiven Metallaziden in Blei- und Kupferrohren zu vermeiden, sollten die Reagenzien nur zusammen mit großen Wassermengen in die Kanalisation gespült werden. Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes Wasser benutzen. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Radioaktivität Der Umgang mit radioaktivem Material ist in Deutschland genehmigungspflichtig. Deshalb muss der Siemens Healthcare Diagnostics eine Kopie der aktuellen gültigen Umgangsgenehmigung des Kunden vorliegen, bevor radioaktive Reagenzien versendet werden dürfen. Die Strahlenschutzverordnung ist zu beachten. Das radioaktive Material ist gemäß der jeweiligen Umgangsgenehmigung zu handhaben. Die Strahlenexposition ist zu minimieren. Spritzer sind sofort aufzuwischen und die betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden. Flüssiger und fester radioaktiver Abfall sind unter Beachtung der gültigen Richtlinien zu entsorgen. Bestandteile der Testpackung: Vorbereitung Es wurde gezeigt, dass Testosteron an Gummi-Oberflächen adsorbiert. Behälter und Stopfen aus Gummi sollten deshalb bei der Handhabung der gelieferten Reagenzien nicht verwendet werden. Gesamt Testosteron Antikörper beschichtete Röhrchen (TTT1) Polypropylen-Röhrchen beschichtet mit Antikörpern gegen Testosteron, verpackt in wiederverschließbaren Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor Feuchtigkeit schützen und nach dem Öffnen wieder sorgfältig verschließen. Lagerung bei 2–8°C bis zum Verfallsdatum. Farbe: gelb. TKTT1: 100 Röhrchen. TKTT2: 200 Röhrchen. TKTT5: 500 Röhrchen. 125 I Gesamt Testosteron (TTT2) 105 ml jodiertes Testosteron. Lagerung bei 2–8°C. Haltbar bis 30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum Verfallsdatum auf der Flasche. Den Tracer vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen (15–28°C) und durch vorsichtiges Umdrehen mischen. TKTT1: 1 Flasche. TKTT2: 2 Flaschen. TKTT5: 5 Flaschen. Gesamt Testosteron Standards (TTC3–8) 6 Flaschen mit Testosteron Standards, gebrauchsfertig. Der Nullstandard (A) 13 enthält 4,0 ml während die Standards B F je1,0 ml enthalten. 30 Tage nach dem Öffnen bei 2–8°C haltbar oder 6 Monate bei –20°C (aliquotiert). TKTT1: 1 Set. TKTT2: 1 Set. TKTT5: 2 Sets. Die Standards enthalten 0, 20, 100, 400, 800 und 1 600 ng/dl Testosteron in humanem Serum; bzw.: 0; 0,7; 3,5; 14; 28 und 55 nmol/l. Weitere Standardkurvenpunkte können durch mischen der Standards hergestellt werden. Erforderliche Laborgeräte und Hilfsmittel Gammacounter – kompatibel mit 12x75 mm Röhrchen Wirbelmischer Urin Hydrolyse Siehe Probenvorbereitung: Urin Hydrolyse Radioimmunoassay Unbeschichtete 12x75 mm PolyprophylenRöhrchen - für T und NSB Röhrchen, erhältlich bei Siemens Healthcare Diagnostics (Artikelnummer: PPO) Mikropipetten: 50 µl und 1,0 ml. Wasserbad – bei 37°C – Heizöfen oder Heizblöcke dürfen nicht verwendet werden. Dekantierständer – erhältlich bei Siemens Healthcare Diagnostics (Artikelnummer: FDR). Logit-Log-Papier Immunoassay-Kontrolle (> 25 Parameter, 3 Konzentrationen) (Artikelnummer: CON6). Probengewinnung Serum und Heparin Plasma: Es ist keine besondere Vorbereitung der Patienten nötig. Blutentnahme durch 8 Venenpunktion in Röhrchen ohne Zusätze (ohne Antikoagulantien) oder Heparin-Röhrchen, Trennung des Serums oder Heparin-Plasma von den Blutzellen, Abnahmezeitpunkt notieren. EDTA Plasma liefert Ergebnisse, die durchschnittlich 10% niedriger sind. 14 Der Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur Klärung von lipämischen Proben empfohlen. Bei hämolysierten Proben besteht die Möglichkeit einer unsachgemäßen Handhabung vor Eintreffen im Labor, daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu interpretieren. Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen Herstellern können differierende Werte verursachen. Dies hängt von den verwendeten Materialien und Additiven (Gel oder physische Trennbarrieren, Gerinnungsaktivatoren und /oder Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count Gesamt Testosteron sind nicht mit allen möglichen Röhrchenvariationen ausgetestet worden. Details der getesteten Röhrchenarten sind dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu entnehmen. Erforderliche Menge: 50 µl pro Röhrchen. Lagerung: Bei 2–8°C für 7 Tage, oder für 9 2 Monate bei –20°C. Die Proben vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen und vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei Bedarf portionieren. Gefrorene Proben dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad aufgetaut werden. Urin: Die Probe sollte während des Sammelzeitraums (24 Stunden) gekühlt gehalten werden. Notieren Sie das Gesamtvolumen. Wenn sich die Bestimmung nicht sofort anschließt, ist dem Urin 1,0 g Borsäure pro 100 ml Urin als Konservierungsmittel zuzusetzen. Erforderliche Menge: 1,0 ml (für das Hydrolyse-Verfahren). Lagerung: 7 Tage bei 2–8°C oder für 1 Monat bei –20°C. Probenvorbereitung: UrinHydrolyse 1 Beschriften Sie für jede Urin Probe ein unbeschichtetes Glas oder Plastikröhrchen. Keine Antikörper-beschichtete Röhrchen verwenden. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 2 Jeweils 1,0 ml Urin in die vorbereiteten Röhrchen pipettieren Falls die Probe ausflockt oder sich ein Niederschlag gebildet hat, sollte der Urin vorher zentrifugiert werden und der klare Überstand zur Bestimmung herangezogen werden. 3 4 Jeweils 200 µl konzentrierte Salzsäure (HCl 12N, nicht im Lieferumfang) in jedes Röhrchen pipettieren. Die Röhrchen locker verschließen und im kochenden Wasserbad 15 Minuten erhitzen. deshalb auch auf das Mitführen der NSB-Röhrchen verzichtet werden. Beschichtete Röhrchen: Jeweils 2 Testosteron Antikörper-beschichtete Röhrchen mit A (maximale Bindung, 0Standard) und von B bis F beschriften. Jeweils 2 weitere Antikörper-beschichtete Röhrchen für Kontrollen und Patientenproben beschriften. Jede hydrolysierte Probe 1 : 25 mit dem Nullstandard verdünnen: z. B., 10 µl des Hydrolysats und 240 µl Nullstandard. Für diese 1 : 25 Verdünnung unbedingt Nullstandard und kein Wasser verwenden. 2 Mit der Durchführung des Radioimmunoassays fortfahren, so wie in dem Abschnitt RadioimmunoassayVerfahren beschrieben. Schließt sich die Bestimmung nicht sofort an, sollten die Hydrolysate fest verschlossen maximal 7 Tage bei –20°C eingefroren werden. Wenn gewünscht können die Volumina erhöht werden, vorausgesetzt das Verhältnis, wie in der Hydrolyseprozedur beschrieben, bleibt unverändert. 1 Unbeschichtete Röhrchen: Jeweils 2 unbeschichtete 12x75 mm Polypropylen-Röhrchen mit T (Totalaktivität) und NSB (unspezifische Bindung) beschriften. Da die unspezifische Bindung im Coat-A-Count RIA normalerweise niedrig ist hat sie keinen signifikanten Einfluss auf die Messwerte. Es kann Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) ng/dl A (MB) 0 nmol/l 0 B 20 0,7 C 100 3,5 D 400 14 E 800 28 F 1 600 55 Jeweils 50 µl des 0-Standards A in die NSB und A Röhrchen und jeweils 50 µl der restlichen Standards, Kontrollen und Patientenproben (Serum oder Heparin-Plasma) in die vorbereiteten Röhrchen pipettieren. Jeweils 50 µl Urinhydrolysate in die entsprechend beschrifteten Röhrchen pipettieren. Direkt auf den Boden des Röhrchens pipettieren. Patientenproben mit Konzentrationen oberhalb des Messbereichs (1 600 ng/dl) müssen mit dem 0Standard verdünnt werden. Testansatz und Durchführung Die Testosteronkonzentrationen im Serum (oder Heparin-Plasma), sowie im Urin können an der gleichen Standardkurve ermittelt werden. Dementsprechend können Urin-Hydrolysate und Serumproben im gleichen Testansatz eingesetzt werden. Die Standards sind gebrauchsfertig; nur Urinproben müssen vorher der im Kapitel „Urin-Hydrolyse“ beschriebenen Prozedur unterzogen werden. Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15– 28°C) bringen. Standards 3 125 Jeweils 1,0 ml I Testosteron hinzufügen. Mischen. Mit Hilfe eines Pipettor-Dilutors können die Schritte 2 und 3 auch gleichzeitig durchgeführt werden. Dabei sollte aber darauf geachtet werden, dass es zu keiner Verschleppung von Probe zu Probe kommt. Das Verteilen des Tracers sollte nicht länger als 10 Minuten dauern. Die T-Röhrchen bis zur Messung (siehe Schritt 6) beiseite stellen; sie bedürfen keiner weiteren Behandlung. 4 Für 3 Stunden bei 37°C inkubieren. 5 Vollständig dekantieren. Vollständiges Entfernen der Flüssigkeit verbessert die Präzision deutlich. Mit Hilfe eines Dekantierständers alle Röhrchen 15 (außer die T-Röhrchen) dekantieren oder absaugen und 2–3 Minuten umgedreht stehen lassen. Anschließend werden die Röhrchen kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um alle restlichen Tröpfchen zu entfernen. 6 Alle Röhrchen 1 Minute im GammaCounter messen. Berechnung und Qualitätskontrolle Um die Konzentrationen aus der Logit-Log Darstellung der Standardkurve zu berechnen, werden zunächst die Mittelwerte der Röhrchenpaare, bereinigt um den Mittelwert der NSB Counts pro Minute (cpm) berechnet: Netto Counts = (Mittelwert CPM) minus (Mittelwert NSB CPM) Anschließend wird die Bindung jedes Röhrchenpaars als Prozent der Maximalbindung (MB, B0) bestimmt. Hierzu werden die mittleren CPM des AStandards korrigiert um die mittlere NSB als 100% gesetzt: Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB Counts) × 100 Die Berechnung kann durch weglassen der Korrektur um die NSB vereinfacht werden. Für Proben innerhalb des Standardbereichs werden nahezu identische Konzentrationen berechnet, wenn B/B0 direkt aus den CPM ermittelt wird. Die so ermittelten B/B0 aller Standards außer des 0-Standards werden auf der yAchse auf Logit-Log Papier gegen die Konzentration auf der x-Achse (logarithmisch) aufgetragen. Die Punkte werden mit bestmöglicher Annäherung durch eine gerade Linie verbunden. Die Ergebnisse der unbekannten Proben können dann durch Interpolation an der Kurve abgelesen werden. Obwohl andere Berechnungsverfahren prinzipiell ebenfalls möglich sind, ist dennoch der oben beschriebenen Berechnung nach der Logit-Log Methode der Vorzug zu geben, da diese einige Vorteile aufzuweisen hat. Beispielsweise können abweichende Kurvenpunkte einfacher erkannt werden, da der Testosteron Coat-A-Count RIA für einen 16 linearen Standardkurvenverlauf in dieser Darstellung optimiert wurde. Urin Proben: Dividieren Sie die von der Kurve abgelesenen Werte in ng/dl durch 100, um die Werte in ng/ml umzurechnen. Diese Werte werden mit 30 multipliziert, um die Konzentrationen in ng/dl für die ursprüngliche, unhydrolysierte Urinprobe zu erhalten. (Ein Faktor von 30 ergibt sich durch die 1:1,2 Verdünnung der Urinprobe mit HCl und die anschließende 1:25 Verdünnung mit dem 0-Standard). Zur Berechnung der Testosteron Ausscheidung in µg/24 Stunden ist anschließend mit dem 24-StundenUrinvolumen (in Litern) zu multiplizieren. Dokumentation: Es ist gute Laborpraxis die Chargennummern, sowie das Datum der ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der verwendeten Komponenten zu protokollieren. Proben-Handhabung: Die Anweisungen zur Handhabung und Lagerung von Proben und Komponenten müssen beachtet werden. Patientenproben mit erwarteten Konzentrationen über dem höchsten Standard (1 600 ng/dl) müssen vor dem Einsatz in den Test mit 0Standard verdünnt werden. Alle Proben, inklusive Standards und Kontrollen, sollten in Doppelbestimmung gemessen werden. Es ist gute Laborpraxis Pipetten mit Einmalspitzen zu verwenden und die Spitze von Probe zu Probe zu wechseln um Verschleppung zu vermeiden. Kontrollpaare sollten an verschiedenen Stellen des Testansatzes platziert werden, um eine eventuelle Drift zu erkennen. Die Einzelergebnisse der Duplikate sollten auf Übereinstimmung überprüft und Verschleppung von Probe zu Probe vermieden werden. Es wurde gezeigt, dass Testosteron an Gummi-Oberflächen adsorbiert. Behälter und Stopfen aus Gummi sollten deshalb bei der Handhabung der gelieferten Reagenzien nicht verwendet werden. Kontrollen: Kontrollen mit mindestens 2 Gesamt Testosteron Konzentrationen (niedrig und hoch) sollten routinemäßig als unbekannte Proben eingesetzt und von Tag zu Tag protokolliert werden. Wiederholungsmessungen von Proben sind ein wertvolles Hilfsmittel in der Beurteilung der Interassay Präzsion. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Datenberechnung: Es ist gute Laborpraxis die Standardkurve grafisch darzustellen (auch wenn die eigentliche Berechnung durch ein Computerprogramm erfolgt) um visuell zu überprüfen, ob für die Standardkurve die geeignete Transformation verwendet wurde und um eventuell abweichende Standardkurvenpunkte zu entdecken. Siehe auch: Davis SE et al. Radioimmunoassay data processing with a small programmable calculator. J Immunoassay 1980;1:15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:126471. Qualitätskontroll-Parameter: Es wird empfohlen die folgenden Parameter zu protokollieren: T = Totalaktivität (als Counts pro Minute) %NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total Counts) %MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts) und die 20, 50 und 80 Prozent "intercepts," wobei Im Labor sollten diese Ergebnisse lediglich als Richtwerte betrachtet werden. Jedes Labor sollte seine eigenen Referenzbereiche etablieren. Leistungsdaten Im folgenden Abschnitt sind Daten gezeigt, die für die Leistung des Gesamt Testosteron Coat-A-Count RIA repräsentativ sind. Die Ergebnisse sind in ng/dl angegeben. Wenn keine anderen Angaben gemacht werden, wurden die nachfolgenden Ergebnisse in Serumproben gemessen. Umrechnungsfaktor: ng/dl × 0,03467 → nmol/l Messbereich: 4 – 1 600 ng/dl 20% = Konzentration bei 20 Prozent Bindung, etc. Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient nur zur Veranschaulichung und ist nicht dazu geeignet Werte aus einem anderen Testansatz damit zu ermitteln. (siehe Tabelle "Example Run"). Referenzwerte In einer Referenzbereichsstudie wurden 87 Serumproben von Männern und 81 Serumproben von Frauen mit dem Testosteron Coat-A-Count RIA mit den nachfolgenden Ergebnissen in ng/dl gemessen. n Ein Vergleich des Coat-A-Count 50 µl Testosteron Verfahrens mit dem Vorgänger lässt folgende Referenzbereiche im Urin erwarten: 25 bis 125 µg/Tag (Median ca. 75 µg/Tag) für erwachsene Männer und 5 bis 35 µg/Tag (Median ca. 15 µg/Tag) für erwachsene Frauen. Median Zentraler Absoluter (ng/dl) 95% Bereich Bereich Frauen Ovulation 41 24 NN–80 NN–81 Orale Kontazeptiva 13 15 — NN–28 Postmenopausal 27 20 4,0–62 4,0–74 20–49 Jahre 68 630 262–1 593 245–1 836 > 50 Jahre 19 427 181–758 181–772 Männer Standardbereich: 20 – 1 600 ng/dl (0,7 – 55 nmol/l). Analytische Sensitivität: 4 ng/dl (0,14 nmol/l). Intraassay-Präzision: Das gezeigte Präzisionsprofil basiert auf 17 bis 21 Freiheitsgraden pro Punkt und zeigt die zu erwartenden VK´s für Proben in Doppelbestimmung. (Siehe Diagramm “Precision Profile”.) Interassay-Präzision: Statistische Berechnung der Ergebnisse von 7 Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in mehreren Ansätzen gemessen wurden. (Siehe Tabelle “Interassay Precision”.) Spezifität: Das Coat-A-Count GesamtTestosteron Antiserum ist hochspezifisch für Testosteron. Die Kreuzreaktivität in % wurde auf Basis der Konzentrationen bei ca. 50% Bindung ermittelt. (Repräsentative Daten siehe Tabelle „Specificity“) Linearität: Proben wurden in verschiedenen Verdünnungen getestet. (Repräsentative Daten siehe Tabelle „Linearity“.) NN: Nicht nachweisbar Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 17 "End of Run" Effekt: Tritt bis ca. 300 Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle "End-of-Run Effect"). Wiederfindung: Proben wurden 1:19 mit 3 Testosteron Lösungen (5 000, 10 000 und 20 000 ng/dl) versetzt und gemessen. (Repräsentative Daten entnehmen Sie bitte der Tabelle „Recovery“.) Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der größer als die Impräzision des Assays selbst ist. Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml keinen Einfluss auf die Messung, der größer als die Impräzision des Assays selbst ist. Lipämie: Der Standard mit der höchsten Konzentration (1 600 ng/dl) wurde seriell mit einem lipämischen Serumpool verdünnt. Dies führt zu einem Anstieg des Lipämie-Grades während die Testosteron Konzentration (primär durch den geringeren Anteil des Standards bedingt) abfällt. Die Verdünnungen wurden zusammen mit dem nativen lipämischen Serumpool gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass selbst eine starke Lipämie keinen klinisch signifikanten Einfluss auf den Assay hat. Einfluss von Antikoagulantien: Um den Einfluss von Antikoagulantien zu überprüfen, wurde 23 Freiwilligen Blut in Röhrchen ohne Zusatz, Heparinröhrchen und EDTA-Vacutainer-Röhrchen entnommen. Alle Proben wurden im Gesamt-Testosteron Coat-A-Count Verfahren gemessen. Durch lineare Regression: (Heparin) = 1,02 (Serum) – 1,0 ng/dl r = 0,998 Mittelwerte: 273 ng/dl (Heparin) 270 ng/dl (Serum) (EDTA) = 0,91 (Serum) + 3,0 ng/dl r = 0,997 Mittelwerte: 250 ng/dl (EDTA) 270 ng/dl (Serum) Die Ergebnisse zeigen, dass HeparinPlasma im Gesamt-Testosteron Coat-ACount RIA praktisch die gleichen Resultate ergibt wie Serum, während EDTA-Plasma zu im Mittel 10% niedrigeren Werten führt. 18 SHBG Einfluss: Um zu überprüfen, ob unterschiedliche endogene Konzentrationen an Sexualhormonbindendem Globulin (SHBG) das Verfahren beeinflussen, wurden die Standards des SHBG IRMACount jeweils 1:201 mit einer Testosteron Lösung versetzt und anschließend nativ, sowie mit Zusatz im Gesamt-Testosteron Coat-A-Count RIA gemessen. In der 4. Spalte sind die Testosteron Werte (in ng/dl) in den SHBG Standards mit Zusatz nach Korrektur um die Testosteron Konzentration in den Standards ohne Zusatz aufgelistet. Zur Berechnung der Werte in der letzten Spalte wurde die mittlere, korrigierte Testosteron Konzentration der SHBG Standards mit Zusatz als 100% gesetzt. (Repräsentative Daten siehe Tabelle "SHBG Effect") Protein Einfluss: Um unterschiedliche Proteinkonzentrationen zu simulieren, wurden 2,0 ml Portionen von einem humanem Serumpool gefriergetrocknet und in unterschiedlichen Volumina (1,3; 2,0 und 3,0 ml) mit Wasser aufgelöst. Jede aufgelöste Portion wurde anschließend im Gesamt-Testosteron Coat-A-Count RIA gemessen. (Der jeweilige Faktor, um das Auflösevolumen zu korrigieren, ist in der Tabelle aufgelistet.) Die beobachteten und erwarteten Gesamt-Testosteron Konzentrationen sind in ng/dl angegeben. (Repräsentative Daten siehe Tabelle "Protein Effect") Methodenvergleich: In einer Vergleichstudie mit Patientenseren wurde der Testosteron Coat-A-Count RIA mit zwei kommerziell verfügbaren Testosteron Radioimmunoassays verglichen, einem Doppelantikörper Assay (Kit A) und einem Assay mit beschichteten Röhrchen (Kit B). Die Ergebnisse von 37 männlichen und 46 weiblichen Serumproben wurden kombiniert und ergaben die folgenden Korrelationen. (TKTT) = 1,10 (Kit A) + 19 ng/dl r = 0,981 Mittelwerte: 269 ng/dl (TKTT) 227 ng/dl (Kit A) (TKTT) = 1,23 (Kit B) + 16 ng/dl r = 0,987 Mittelwerte: 269 ng/dl (TKTT) 206 ng/dl (Kit B) Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Anwendungsberatung Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an Ihre Niederlassung. www.siemens.com/diagnostics Das Qualitätsmanagement-System der Siemens Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach DIN EN ISO 13485:2003. Español Coat-A-Count Testosterona Total Utilidad del análisis: El kit Coat-A-Count Testosterona Total es un 125 radioinmunoensayo ( I) en fase sólida, diseñado para la determinación cuantitativa de testosterona en suero o plasma heparinizado, sin extracción. Acoplado con un procedimiento de hidrólisis ácida, también es adecuado para analizar muestras de orina. Su uso es estrictamente para diagnóstico in vitro, como una ayuda en el diagnóstico y manejo de las enfermedades en las que hay exceso o deficiencia de este andrógeno. Referencia: TKTT1 (100 tubos), TKTT2 (200 tubos), TKTT5 (500 tubos). El kit de 100 tubos contiene menos de 4 microcurios (148 kilobequerelios) de testosterona 125 marcada con I radioactivo; El kit de 200 tubos contiene menos de 8 microcurios (296 kilobequerelios); y el kit de 500 tubos contiene menos de 20 microcurios (740 kilobequerelios). Resumen y Explicación del Test En los hombres, la testosterona se sintetiza principalmente en las células intersticiales de Leydig en los testículos, y está regulada por la hormona estimulante de las células intersticiales (ICSH), o por la hormona luteinizante (LH) de la pituitaria anterior (el equivalente femenino a la ICSH). La testosterona es la responsable del desarrollo de los caracteres sexuales secundarios, como los órganos sexuales accesorios, la próstata, las vesículas seminales y el Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) crecimiento del vello facial axilar y púbico. Las determinaciones de testosterona son muy útiles en la evaluación de los estadíos hipogonadales. Niveles elevados de testosterona en los hombres se pueden observar en la resistencia androgénica completa (feminización 9 testicular). Las razones más comunes de niveles bajos de testosterona en hombres son: hipogonadismo, orquidectomía, terapia con estrógenos, síndrome de Klinefelter, hipopituitarismo, y cirrosis hepática. En las mujeres, los niveles de testosterona son normalmente mucho más bajos que los encontrados en los hombres sanos. La testosterona en las mujeres procede de tres fuentes. Es secretada en pequeña cantidad por las glándulas adrenales y los ovarios, y en las mujeres sanas el 50–60% de la producción diaria de testosterona se debe al metabolismo periférico de prehormonas, principalmente la androstenediona. Las causas más comunes de niveles elevados de testosterona en mujeres son ovarios poliquísticos (síndrome de SteinLeventhal), tumores ováricos, tumores adrenales e hiperplasia adrenal. La virilización en las mujeres está asociada con la administración de andrógenos y la sobreproducción endógena de testosterona. Parece que hay una correlación entre los niveles séricos de testosterona y el grado de virilización en las mujeres, aunque aproximadamente el 25% de las mujeres con diferentes grados de virilización poseen niveles séricos de testosterona dentro de los valores normales femeninos. Principio del análisis El procedimiento Coat-A-Count es un radioinmunoensayo en fase sólida, basado en un anticuerpo específico para testosterona que está inmovilizado en la pared de un tubo de polipropileno. La 125 testosterona marcada con I compite, durante un periodo de tiempo determinado, con la testosterona de la muestra del paciente por los sitios de unión de los anticuerpos. Luego el tubo se decanta para separar la testosterona unida de la libre, y se cuenta en un contador gama. La cantidad de testosterona presente en la muestra del 19 paciente se determina a partir de una curva de calibración. Reactivos a pipetear: 1 Tiempo total de incubación: 3 horas Cuentas totales en la iodización: aproximadamente 60 000 cpm Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Reactivos: Almacenar a 2–8°C en una cámara preparada para almacenar material radioactivo. Desechar de acuerdo a la legislación en vigor. No usar los reactivos después de su fecha de caducidad. Algunos componentes suministrados en el kit pueden contener material de origen humano y/o otros componentes potencialmente peligrosos que necesiten ciertas precauciones. Siga las precauciones universales y manipule todos los componentes como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos. Los materiales derivados de sangre humana han sido analizados y son negativos para sífilis; para anticuerpos frente al HIV 1 y 2; para el antígeno de superficie de hepatitis B y para los anticuerpos de hepatitis C. Se ha usado Azida sódica, en concentraciones menores de 0,1 g/dl, como conservante. Para su eliminación, lavar con grandes cantidades de agua para evitar la constitución de residuos de azidas metálicas, potencialmente explosivas, en las cañerías de cobre y plomo. Agua: Usar agua destilada o desionizada. Radioactividad Una copia de cualquier certificado de licencia de radioisótopos (específico o general) emitido a la aduana de los EE.UU. se registrará en los ficheros de Siemens Healthcare Diagnostics antes de que se puedan enviar kits o componentes conteniendo material radioactivo. Estos materiales radioactivos pueden adquirirse por cualquier cliente con la licencia específica apropiada. Con una licencia general, estos materiales radioactivos pueden adquirirse solo por médicos, veterinarios en la práctica de la medicina veterinaria, laboratorios clínicos y 20 hospitales — y estrictamente para la clínica in vitro o test de laboratorio que no conlleven la administración interna o externa de material radioactivo o su radiación a humanos u otros animales. Su adquisición, recepción, almacenaje, uso, trasferencia y desecho están regulados y se expenderá una licencia (general o específica) de la Comisión Nuclear de EE.UU. o de un Estado con el NRC para su consiguiente control. Manejar los materiales radioactivos de acuerdo a los requerimientos de su licencia general o específica. Para minimizar la exposición a la radiación, el usuario debe adherirse al cuarto conjunto de guías publicadas por el National Bureau of Standards con el nombre Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) y en las consiguientes publicaciones de las autoridades Federales o Estatales. Limpiar y decontaminar rápidamente las superficies afectadas. Evitar la generación de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos radioactivos de acuerdo con los requerimientos de su licencia. Licencias generales (NRC Form 483) pueden eliminar sus residuos sólidos radioactivos como residuos no radioactivos, después de retirar las etiquetas. Licencias específicas (NRC Form 313) se deben referir al Título 10, Código de Regulaciones Federales, Parte 20. Las licencias en Estados Asociados deben referirse a las normativas de su correspondiente Estado. Licencias generales pueden eliminar sus residuos líquidos radioactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido, quitando las etiquetas de los contenedores y procesándolos como residuos sólidos. Licencias específicas pueden eliminar pequeñas cantidades de residuos líquidos radioactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido. Refiérase a la normativa aplicable a su laboratorio. Materiales Suministrados: Preparación Inicial Se ha encontrado que la testosterona se adsorbe a las superficies de goma; por lo tanto se debe evitar el uso de recipientes y tapas de goma en la manipulación de los reactivos provistos. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Tubos recubiertos de anticuerpo frente a la testosterona total (TTT1) Tubos de polipropileno recubiertos con anticuerpos de conejo frente a la testosterona embalados en bolsas de cierre hermético. Almacenar refrigerados y protegidos de la condensación, cerrando cuidadosamente las bolsas después de su uso. Estable a 2–8°C hasta la fecha de caducidad impresa en la bolsa. Color: amarillo. TKTT1: 100 tubos. TKTT2: 200 tubos. TKTT5: 500 tubos. Radioinmunoanálisis Tubos de ensayo de polipropileno de 12 × 75 mm para su uso como tubos T y NSB, disponibles en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: PPO). 125 Papel gráfico Logit-log I Testosterona Total (TTT2) 105 ml de testosterona radioactiva. Estable a 2–8°C durante 30 días después de su apertura, o hasta la fecha de caducidad impresa en el vial. El trazador debe encontrarse a temperatura ambiente (15–28°C) y mezclarse bien por inversión suave antes de usar. TKTT1: 1 vial. TKTT2: 2 viales. TKTT5: 5 viales. Calibradores de testosterona Total (TTC3–8) Seis viales de calibradores de testosterona, listos para su uso. El calibrador cero A contiene 4,0 ml, y los calibradores restantes, B a G, contienen cada uno 1,0 ml. Estable a 2–8°C durante 30 días después de abrir, o hasta 6 meses (alicuotados) a –20°C. TKTT1: 1 juego. TKTT2: 1 juego. TKTT5: 2 juegos. Los calibradores contienen respectivamente: 0, 20, 100, 400, 800 y 1 600 nanogramos de testosterona por decilitro (ng/dl) en suero humano procesado; equivalentemente: 0, 0,7, 3,5, 14, 28 y 55 nanomoles por litro (nmol/l). Los puntos de calibración intermedios se pueden obtener mezclando los calibradores en las proporciones adecuadas. Materiales Requeridos pero no suministrados Contador Gamma compatible con los tubos de 12 × 75 mm. Vortex Hidrólisis de orina Ver Preparación de la muestra: Sección Hidrólisis de orina. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Micropipetas: 50 µl y 1,0 ml. Baño de agua capaz de mantener la temperatura a 37°C; no es apropiado el uso de una estufa ni de un bloque calefactor. Rack de decantación - disponible en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: FDR). Un control de inmunoanálisis, a tres niveles, basado en suero humano, que contiene testosterona como uno de sus 25 constituyentes, disponible en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: CON6). Recogida de la muestra Suero y Plasma heparinizado: El paciente no necesita estar en ayunas así como tampoco cualquier otro tipo de preparación. Recoger la sangre por 8 venipunción en tubos sin anticoagulante o en tubos heparinizados, registrando el tiempo que se toma la muestra, y separar el suero o plasma heparinizado de las células por centrifugación. El plasma con EDTA produce resultados que en promedio son aproximadamente 10% más bajos. Se recomienda el uso de una ultracentrífuga para aclarar las muestras lipémicas. Las muestras hemolizadas podrían indicar una mala manipulación de la muestra antes de ser recibida por el laboratorio; en este caso, los resultados deben interpretarse con precaución. Los tubos para recoger sangre de distintos fabricantes pueden producir valores diferentes, dependiendo del material del tubo y de los aditivos, incluyendo barreras de gel o barreras físicas, activadores de la coagulación y/o anticoagulantes. El Testosterona Total Coat-A-Count no ha sido analizado con todos los distintos tipos de tubos. Para obtener detalles sobre los tipos tubos que se han analizado, consulte la sección de Tipos de Muestras Alternativos. 21 Volumen requerido: 50 µl por tubo. Conservación: 7 días a 2–8°C, o 9 2 meses a –20°C. Antes del ensayo, llevar todas las muestras a temperatura ambiente (15– 28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si es necesario, para evitar la repetición de congelación y descongelación. No intentar la descongelación de muestras congeladas calentándolas en un baño de agua. Orina: Obtener una muestra de 24 horas, manteniendo la muestra refrigerada durante la recolección. Registrar el volumen total. A menos que el análisis se haga inmediatamente, reservar una alícuota bien mezclada después de añadir 1,0 gramos de ácido bórico por 100 ml de orina. Volumen requerido: 1,0 ml (para la hidrólisis). Conservación: 7 días a 2–8°C o 1 mes a –20°C. Preparación de la muestra: Hidrólisis de orina 1 Marcar un tubo de vidrio o plástico no recubierto para cada muestra de orina. No usar tubos recubiertos con anticuerpo. 2 Pipetear 1,0 ml de cada muestra de orina en el tubo apropiado. Si la muestra está turbia o si se ha formado un precipitado, primero centrifugar la orina y trabajar con el sobrenadante. 3 4 Añadir 200 µl de HCl concentrado (12 N, no suministrado) a cada tubo. Tapar en forma floja e incubar en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Diluir cada muestra hidrolizada 1 en 25 con el calibrador cero: por ejemplo, añadir 10 µl de la muestra hidrolizada a 240 µl del calibrador cero. No usar agua para diluir los hidrolizados; se debe usar el calibrador cero. Procedimiento del Radioinmunoanálisis. Si los hidrolizados no se analizan inmediatamente, guardarlos bien tapados a –20°C, durante no más de 7 días. Si se desea, se pueden modificar los volúmenes a escala, siempre que no se cambien las proporciones especificadas en el procedimiento de hidrólisis. Procedimiento del Radioinmunoanálisis La curva de calibración es la base para determinar las concentraciones de testosterona en suero (o en plasma heparinizado) y en orina. Por consiguiente, los hidrolizados urinarios y las muestras de suero no tratadas pueden procesarse en el mismo análisis. Los calibradores están listos para usar; sólo las muestras de orina deben ser sometidas a hidrólisis, como se describe en Preparación de la muestra: Sección Hidrólisis de orina. Todos los componentes deben llevarse a temperatura ambiente (15–28°C) antes de su uso. 1 Tubos de ensayo: Marcar cuatro tubos de ensayo de polipropileno (sin recubrir) 12 × 75 mm. Tubos T (cuentas totales) y NSB (unión no específica) en duplicado. Al ser característicamente baja la unión no específica en el ensayo Coat-A-Count, los tubos NSB pueden ser omitidos sin comprometer la precisión y control de calidad del ensayo. Tubos recubiertos: Marcar doce tubos recubiertos de anticuerpo frente a la testosterona total: A (máxima unión) y B hasta F por duplicado. Marcar tubos recubiertos de anticuerpo adicionales, también en duplicado, para controles y muestras de pacientes. Calibrador ng/dl A (MB) 0 nmol/l 0 B 20 0,7 C 100 3,5 D 400 14 E 800 28 F 1 600 55 Proseguir con el radioinmunoanálisis, como se describe en la sección de 22 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 2 Pipetear 50 µl del calibrador cero A en los tubos NSB y A, y 50 µl del resto de los calibradores, controles y muestras de los pacientes (suero o plasma heparinizado) en sus correspondientes tubos. Pipetear 50 µl de cada hidrolizado de orina en tubos adecuadamente marcados. Pipetear directamente en el fondo del tubo. Las muestras de los pacientes que se espera que contengan concentraciones de testosterona mayores que la del calibrador más alto (1 600 ng/dl) se deberán diluir con el calibrador cero. 3 125 Añadir 1,0 ml de I Testosterona total a todos los tubos. Mezclar en el Vortex. Los laboratorios que tengan un equipo confiable para dilución automática pueden hacer los pasos 2 y 3 simultáneamente, pero se deberá tener cuidado de evitar la contaminación por arrastre de una muestra a otra. No se debe tardar más de 10 minutos durante la dispensación del trazador. Dejar los tubos T a un lado para su contaje (paso 6); no requieren más procesamiento posterior. 4 Incubar durante 3 horas a 37°C. 5 Decantar. Entonces, determinar la unión de cada pareja de tubos como un porcentaje de la unión máxima (MB), tomando las cuentas corregidas con el NSB de los tubos A como 100%: Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas MB netas) × 100 El cálculo puede simplificarse omitiendo la corrección de las uniones no específicas; las muestras dentro del rango de calibración van a dar virtualmente el mismo resultado cuando el porcentaje de unión es calculado directamente a partir de la media de las CPM). Usando papel gráfico logit-log, representar el porcentaje de unión en el eje vertical frente a la concentración en el eje horizontal (logarítmico) para cada calibrador no cero y dibujar la línea que pase por esos puntos aproximadamente. Los resultados de las muestras pueden ser leídos en la curva por interpolación. Si bien se pueden usar otras aproximaciones, la reducción de datos por el método logit-log recientemente descrito tiene ciertas ventajas en este contexto, por ejemplo, permite reconocer más fácilmente los puntos de calibración anormales, ya que el procedimiento CoatA-Count Testosterona Total ha sido optimizado para la linealidad en esta representación. Cálculo y Control de Calidad Muestras de orina: Para convertir a ng/ml, dividir el resultado en “ng/dl” por 100, como se leyó en la curva de calibración; luego, multiplicar por 30 para obtener la concentración de testosterona en ng/ml de la muestra de orina no hidrolizada original. (Se usa un factor de 30 porque las muestras de orina están diluidas 1 en 1,2 con el ácido clorhídrico y luego 1 en 25 con el calibrador cero). Multiplicar por el volumen total en litros para informar la producción de testosterona de 24 horas en microgramos por día. Para calcular las concentraciones totales de testosterona a partir de una representación logit-log de la curva de calibración, primero hay que calcular para cada pareja de tubos las cuentas medias por minuto corregidas con el NSB: Registro de los ensayos: Es una buena práctica de laboratorio registrar para cada ensayo los números de lote de los componentes usados, así como las fechas en las que fueron abiertos por primera vez y reconstituidos. Eliminar toda la humedad visible para mejorar la precisión. Decantar o aspirar el contenido de todos los tubos (excepto los tubos T) y dejar escurrir durante 2 o 3 minutos. Golpear los tubos contra papel absorbente para eliminar las gotas residuales. 6 Contar durante 1 minuto en un contador gamma. Cuentas netas = (Media CPM) menos (Media NSB CPM) Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Manipulación de la muestra: Se deberá observar cuidadosamente las instrucciones para manipular y guardar las 23 muestras de los pacientes y los componentes. Antes de analizar, diluir las muestras de suero y plasma heparinizado del paciente que se espera que contengan concentraciones de testosterona mayores que la del calibrador más alto (1 600 ng/dl) con el calibrador cero. Se deberán analizar por duplicado todas las muestras, incluyendo los calibradores y los controles. Es una buena práctica el uso de micropipetas con punta desechables, cambiando las puntas entre las muestras, para evitar la contaminación por arrastre. Se puede espaciar los pares de tubos controles a lo largo del ensayo para ayudar a verificar que no haya una desviación significativa. Inspeccionar los resultados para comprobar la concordancia entre los pares de tubos y evitar el arrastre de una muestra a otra. Se ha encontrado que la testosterona se adsorbe a las superficies de goma; por lo tanto, se deberá evitar el uso de recipientes y tapas de goma en la manipulación de los reactivos que se suministran. Controles: Analizar rutinariamente controles o pools de suero de al menos dos niveles de concentración distintos (bajo y alto) de testosterona total, como si fuesen desconocidos, y graficar los resultados diarios como se describe en Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Las muestras repetidas son una herramienta de valor adicional para controlar la precisión interensayo. Reducción de datos: Es una buena práctica crear un gráfico de la curva de calibración para poder controlar visualmente si la transformación usada es adecuada, incluso cuando el cálculo de los resultados se realiza por ordenador. Consultar Davis SE et al. Radioimmunoassay data processing with a small programmable calculator. J Immunoassay 1980;1:15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:126471. %NSB = 100 × (Media cuentas NSB / cuentas totales) %MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales) Y los cortes 20, 50 y 80 por ciento, donde 20% = Concentración al 20 por ciento de unión, etc. Ejemplo: Sólo como ilustración, no se puede utilizar para calcular resultados. (Ver la tabla "Example Run"). Valores esperados En un estudio del intervalo de referencia, se analizaron 87 muestras de suero de hombres y 81 muestras de suero de mujeres mediante el procedimiento CoatA-Count Testosterona Total, obteniéndose los siguientes resultados en ng/dl. n Mediana (ng/dl) Rango central 95% Rango absoluto Mujeres Que ovulan 41 24 ND-80 ND-81 Anticonceptivos 13 orales 15 — ND-28 Posmenopáus27 icas 20 4,0-62 4,0-74 Hombres 20-49 años 68 630 > 50 años 19 427 262-1 593 245-1 836 181-758 181-772 ND: no detectable La comparación del procedimiento CoatA-Count Testosterona Total 50 µl con su predecesor sugiere los siguientes intervalos de referencia de testosterona en orina: 25 a 125 µg/día (con una mediana de 75 µg/día aproximadamente) para los hombres adultos y 5 a 35 µg/día (con una mediana de 15 µg/día aproximadamente) para las mujeres adultas. Los laboratorios deben considerar estos resultados sólo como una guía. Cada laboratorio deberá establecer sus propios intervalos de referencia. Características analíticas Parámetros de control de calidad: Recomendamos mantener un registro de los siguientes parámetros de la reducción de datos: T = Cuentas totales (como cuentas por minuto) 24 Para obtener datos representativos del rendimiento del kit Coat-A-Count Testosterona Total, ver la sección Tablas y Gráficos. Los resultados de testosterona total en las secciones siguientes se expresan en ng/dl. A menos que se Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) especifique lo contrario, los resultados en las secciones siguientes han sido generados en muestras de suero. Factor de Conversión: ng/dl × 0,03467 → nmol/l Intervalo de divulgación: 4 – 1 600 ng/dl. Intervalo de calibración: 20 – 1 600 ng/dl (0,7 – 55 nmol/l), Sensibilidad analítica: 4 ng/dl (0,14 nmol/l), Precisión intraensayo (dentro de una tanda): Se muestra un perfil de precisión de dosis basado en 17 a 21 grados de libertad por punto, el cual representa los CVs a esperarse para muestras ensayadas por duplicado. (Ver el gráfico "Precision Profile".) Precisión entre ensayos (de una tanda a otra): Las estadísticas se calcularon para cada una de las siete muestras a partir de los resultados obtenidos por duplicado en 20 ensayos diferentes. (Ver la tabla "Interassay Precision") Especificidad: El antisuero Coat-A-Count Testosterona Total es altamente específico para la testosterona. El porcentaje de reactividad cruzada se calculó peso en peso a aproximadamente un 50% de unión. (Ver la tabla "Specificity" para resultados representativos.) Linealidad: Las muestras fueron analizadas con varias diluciones. (Ver la tabla "Linearity" para resultados representativos.) Efecto deriva: Ninguno hasta aproximadamente 300 tubos. (Ver la tabla "End-of-Run Effect"). Recuperación: Se han analizado las muestras cargadas 1 a 19 con tres soluciones (5 000, 10 000 y 20 000 ng/dl) de testosterona. (Ver la tabla "Recovery" para resultados representativos). Bilirrubina: La presencia de bilirrubina, en concentraciones hasta 200 mg/l, no tiene ningún efecto sobre los resultados en términos de precisión. Hemólisis: La presencia de eritrocitos hasta concentraciones de 30 µl/ml no tiene efecto en los resultados, en lo concerniente a la precisión del ensayo. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Lipemia: El calibrador de concentración alta (1.600 ng/dl) se diluyó sucesivamente con un pool de suero lipémico. Esto hace que el grado de lipemia aumente a medida que la concentración de testosterona disminuye (debido principalmente al calibrador). Estas diluciones se analizaron junto con el pool lipémico no cargado. Los resultados muestran que aun una lipemia severa no tiene un efecto significativo sobre el análisis. Tipo de Muestra Alternativa: Para determinar si los anticoagulantes interfieren con el análisis, se recogió sangre de 23 voluntarios en tubos vacutainer sin tratar, heparinizados y con EDTA. Todas las muestras fueron analizadas mediante el procedimiento Coat-A-Count Testosterona Total. Por regresión lineal: (Heparina) = 1,02 (Suero) – 1,0 ng/dl r = 0,998 Medias: 273 ng/dl (Heparina) 270 ng/dl (Suero) (EDTA) = 0,91 (Suero) + 3,0 ng/dl r = 0,997 Medias: 250 ng/dl (EDTA) 270 ng/dl (Suero) Los resultados muestran que en el procedimiento Coat-A-Count Testosterona Total, el plasma heparinizado da prácticamente los mismos resultados que el suero, mientras que el plasma con EDTA produce resultados 10% más bajos en promedio. Efecto de la SHBG: Para determinar si variaciones en el nivel de las globulinas que se unen a las hormonas sexuales endógenas (SHBG) afecta el procedimiento, se añadió una solución 1 en 201 de testosterona cargada a cada uno de los calibradores del kit IRMACount SHBG y luego los calibradores cargados y no cargados se analizaron mediante el procedimiento Coat-A-Count Testosterona Total. La cuarta columna muestra los valores aparentes de testosterona (en ng/dl) de los calibradores SHBG cargados, después de corregir las concentraciones observadas de testosterona de los calibradores no cargados. La columna final se calculó tomando la concentración aparente 25 promedio de testosterona corregida de los calibradores SHBG cargados como 100%. (Para datos representativos, ver la tabla “SHBG Effect”). Efecto de las proteínas: Para simular distintas concentraciones de proteínas, se realizaron experimentos en los cuales alícuotas de 2,0 ml de un pool de suero humano se liofilizaron y luego reconstituyeron con varios volúmenes de agua (1,3, 2,0 y 3,0 ml). Luego se analizó cada alícuota reconstituida mediante el procedimiento Coat-A-Count Testosterona Total. (A continuación se tabula el factor para corregir el volumen de reconstitución). Los valores observados y esperados de testosterona total se tabulan en ng/dl. (Para datos representativos, ver la tabla “Protein Effect”). Comparación de los métodos: En un estudio de comparación de pacientes, se comparó el kit Coat-A-Count Testosterona Total con dos radioinmunoanálisis para testosterona comercialmente disponibles, siendo uno un ensayo de doble anticuerpo (Kit A) y el otro un ensayo de tubos recubiertos (Kit B). Los resultados de 37 muestras séricas de hombres y 46 muestras séricas de mujeres se combinaron dando las siguientes relaciones. (TKTT) = 1,10 (Kit A) + 19 ng/dl r = 0,981 Medias: 269 ng/dl (TKTT) 227 ng/dl (Kit A) (TKTT) = 1,23 (Kit B) + 16 ng/dl r = 0,987 Medias: 269 ng/dl (TKTT) 206 ng/dl (Kit B) Asistencia técnica Póngase en contacto con el distribuidor nacional. www.siemens.com/diagnostics El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. está certificado por la ISO 13485:2003. 26 Français Coat-A-Count Testostérone Totale Domaine d'utilisation: La technique Coat-A-Count Testostérone Totale est un dosage radioimmunologique pour la mesure quantitative de la testostérone dans le sérum ou plasma hépariné, sans extraction. Après une hydrolyse acide, ce dosage peut s'appliquer à des échantillons urinaires. Réservé à un usage diagnostique in vitro. Cette analyse est utile au diagnostic et surveillance des pathologies associées à un déficit ou un excès de sécrétion de cet androgène. Référence catalogue : TKTT1 (100 tubes), TKTT2 (200 tubes), TKTT5 (500 tubes). Le coffret de 100-tubes contient moins de 4 micro-curies (148 kilobecquerels) de testostérone marquée à l'iode 125. Le coffret de 200-tubes contient moins de 8 micro-curies (296 kilobecquerels) de testostérone marquée à l'iode 125 et le coffret de 500-tubes contient moins de 20 micro-curies (740 kilobecquerels) de testostérone marquée à l'iode 125. Introduction Chez l'homme, la testostérone est sécrétée essentiellement par les cellules interstitielles de Leydig et dans les testicules. Sa régulation est effectuée dans l'hypophyse antérieure par la I.C.S.H. (interstitial cell stimulating hormone), ou L.H. (luteinizing hormone) équivalente de la I.C.S.H. chez la femme La testostérone est responsable du développement des caractères sexuels secondaires, ainsi que des organes sexuels annexes tels la prostate, les vésicules séminales et du développement de la pilosité. Le dosage de la testostérone est une aide précieuse dans l'évaluation des situations d'hypofonctionnement des gonades. Les taux élevés de testostérone chez l'homme peuvent être rencontrés dans les cas de complète résistance aux androgènes 10 (testicules féminisants). Les causes les plus fréquentes de diminution des taux de testostérone chez l'homme sont : Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) l'hypogonadisme, l'orchidectomie, le traitement par oestrogènes, le syndrome de Klinefelter, l'hypopituitarisme, la féminisation testiculaire et la cirrhose hépatique. Chez la femme, les taux de testostérone sont normalement beaucoup plus faibles que ceux trouvés chez l'homme dépourvu de toute affection. L'origine de la testostérone chez la femme est triple : elle est sécrétée en petite quantité par les glandes surrénales et les ovaires, et pour 50 à 60% de la production journalière, par le métabolisme périphérique des préhormones, principalement l'androstènedione. Les causes les plus courantes des augmentations des taux de testostérone sont les ovaires polykystiques (syndrome de SteinLeventhal), les tumeurs ovariennes, les tumeurs ou hyperplasie des surrénales. La virilisation de la femme est associée avec une administration d'androgènes et une surproduction endogène de la testostérone. Il y aurait une corrélation entre les taux de testostérone sérique et le degré de virilisation chez la femme. Toutefois, environ 25% des femmes présentant des degrés variables de virilisation, ont des taux de testostérone normaux. Principe du test Le dosage Coat-A-Count Testostérone est un dosage radioimmunologique en phase solide. Au cours de l'incubation, il y a compétition entre la testostérone marquée à l'iode 125 et la testostérone de l'échantillon, vis-à-vis des sites de l'anticorps. L'anticorps étant fixé sur la paroi des tubes en polypropylène, après incubation, il suffit d'éliminer le surnageant par décantation pour isoler facilement la fraction radioactive lié à l'anticorps. Le tube est ensuite compté sur un compteur gamma, les cpm étant inversement proportionnels à la concentration de testostérone présente dans l'échantillon qui sera déterminée à l'aide d'une courbe standard. Réactifs à distribuer: 1 Temps d'incubation totale : 3 heures Activité totale en début de marquage : environ 60 000 cpm Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Précautions d'emploi Réservé à un usage diagnostique in vitro. Réactifs : Conserver à +2/+8°C dans un réfrigérateur autorisé à recevoir du matériel radioactif. Éliminer les déchets conformément aux lois en vigueur. Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur date d'expiration. Certains composants fournis avec ce coffret peuvent contenir des agents humains et/ou d'autres éléments potentiellement infectieux qui nécessitent certaines précautions. Respecter les précautions d'emploi et manipuler tous les composants du coffret comme des produits potentiellement infectieux. Les réactifs dérivés de produits humains et utilisés dans ce coffret ont subi un test sérologique pour la Syphilis et des tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-VHC et pour l'antigène de surface de l'hépatite B, qui se sont tous avérés négatifs. De l'azide de sodium à des concentrations inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme conservateur ; lors de l'élimination, l'évacuer avec de grandes quantités d'eau pour éviter une accumulation d'azides métalliques explosifs dans les canalisations. Eau : utiliser de l'eau distillée ou désionisée. Radioactivité Ce coffret de réactif est reservé à l'usage in vitro (Autorisation DGSNR). Règles de base de protection contre les rayonnements ionisants et précautions d'emploi. Ce produit radioactif ne peut être reçu, acheté, détenu ou utilisé que par des personnes autorisées à cette fin et dans des laboratoires dotés de cette autorisation. Cette solution ne peut en aucun cas être administrée à l'homme ou aux animaux. Respecter impérativement les dates de péremption indiquées sur l'emballage extérieur et sur les étiquettes des différents réactifs du coffret. Tous les réactifs, dont les tubes revêtus d'anticorps, doivent être conservés à + 4/+ 8° C dans leur conditionnement d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la possession, l'utilisation et l'échange de 27 matières radioactives sont soumis aux réglementations en vigueur dans le pays de l'utilisateur. Les règles de base de protection contre les rayonnements ionisants doivent être respectées selon des procédures en vigueur. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. Eviter le contact direct avec la peau ou les muqueuses de tout produit radioactif en utilisant des blouses et gants de protection. Toute manipulation de matières radioactives se fera dans un local ad hoc éloigné de tout passage. Les produits radioactifs seront stockés dans leur conditionnement d'origine dans un local approprié. Un cahier de réception et de stockage de produits radioactifs sera tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la verrerie qui ont été contaminés doivent être éliminés au fur et à mesure afin d'éviter une contamination croisée de plusieurs isotopes. Chaque contamination ou perte de substance radioactive devra être réglée selon les procédures établies. Toute mise aux déchets de matière radioactive se fera en accord avec les réglementations en vigueur. Ne pas manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer des cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Les réactifs radioactifs ne peuvent être vendus qu'à des personnes habilitées à manipuler des substances radioactives. Matériel fourni : Préparation Initiale Il a été prouvé que la testostérone est absorbée par des surfaces caoutchoutées, aussi il est recommandé d'éviter d'utiliser des récipients ou bouchons de cette matière pour les réactifs fournis avec ce coffret. Tubes revêtus d'anticorps antiTestostérone (TTT1) Tubes en polypropylène revêtus d'anticorps anti-testostérone dans des sachets à glissière. Les conserver réfrigérés et protégés de l'humidité, bien refermer les sachets après utilisation. Stable à +2/+8°C jusqu'à la date d'expiration notée sur le sachet. Couleur: Jaune. TKTT1: 100 tubes. TKTT2: 200 tubes. TKTT5: 500 tubes. Testostérone marquée à l'iode 125 (TTT2) Chaque flacon contient 105 ml de testostérone marquée à l'iode 125. Stable à +2/+8°C pendant 30 jours après ouverture, ou jusqu'à la date d'expiration notée sur le flacon. Le traceur doit être à température ambiante (15–28°C) et mélangé par retournement avant emploi. TKTT1: 1 flacon. TKTT2: 2 flacons TKTT5: 5 flacons. Standards Testostérone (TTC3–8) Six flacons de standards de testostérone prêts à l'emploi, le standard A contient 4,0 ml, et les standards B à F contiennent 1,0 ml chacun. Stable à +2/ +8 °C pendant 30 jours après ouverture, ou 6 mois (aliquoté) à –20 °C. TKTT1: 1 jeu. TKTT2: 1 jeu. TKTT5: 2 jeux. Les standards contiennent respectivement, 0, 20, 100, 400, 800 et 1 600 nanogrammes de testostérone par décilitre (ng/dl) en matrice sérum humain traité équivalents à : 0, 0,7, 3,5, 14, 28 et 55 nanomoles par litre (nmol/l). Des points intermédiaires peuvent être obtenus en mélangeant des standards dans des proportions compatibles. Matériel requis mais non fourni Compteur Gamma – permettant l'utilisation de tubes standards 12x75 mm Agitateur de type Vortex Hydrolyse des échantillons urinaires Se reporter au paragraphe « préparation des échantillons urinaires ». Dosage radioimmunologique Tubes secs en polypropylène 12x75 mm – à utiliser comme les tubes LNS, disponibles chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : PPO) Micropipettes: 50 µl et 1,0 ml. Bain-marie pouvant maintenir une température d'incubation de 37°C. Ni étuve ni bloc chauffant ne sont adaptés à ce dosage. Un portoir de décantation – disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : FDR) Papier graphe Logit-log 28 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Un contrôle immunodosage, à base de sérum humain, à trois niveaux de concentration, contenant de la testostérone (parmi plus de 25 constituants dosables), est disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : CON6). après chaque recueil. Noter le volume total. Si le dosage n'est pas effectué immédiatement, conserver un échantillon bien homogène en ajoutant 1 g d'acide borique pour 100 ml d'urine. Recueil des échantillons Conservation : 7 jours à 2–8°C ou 1 mois à –20°C. Sérum et Plasma hépariné: Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et aucune préparation spéciale n'est requise. 8 Prélever le sang par ponction veineuse et le recueillir sur tubes secs (sans anticoagulant) ou héparinés, en notant l'heure de prélèvement. Séparer le sérum ou le plasma des cellules, par centrifugation. Volume nécessaire : 1,0 ml pour la procédure d'hydrolyse. Préparation des échantillons urinaires: 1 Etiqueter un tube en verre ou plastique (non coaté) pour chaque échantillon urinaire. 2 Pipeter 1,0 ml de chaque échantillon dans le tube approprié. N.B.:des plasmas EDTA fourniront des résultats sousévalués d'environ 10%. Si l'échantillon est trouble ou s'il y a formation de précipité, centrifuger préalablement et utiliser le surnageant clarifié pour le dosage. Il est recommandé de clarifier les échantillons hyperlipémiques par ultracentrifugation. Des échantillons hémolysés peuvent être révélateurs d'une préparation inadéquate du prélèvement avant son envoi au laboratoire ; il faudra donc interpréter les résultats avec prudence. 3 Ajouter 200 µl d' HCl concentré (12N, non fourni) à chaque tube. Boucher non hermétiquement et incuber 15 minutes dans un bain d'eau bouillante. Des tubes pour prélèvements sanguins provenant de fabricants différents peuvent donner des résultats différents, selon les matériaux et additifs utilisés, y compris gels ou barrières physiques, activateurs de la coagulation et/ou anticoagulants. Le coffret Testostérone Coat-A-Count n'a pas été testé sur tous les types de tubes possibles. Veuillez consulter le chapitre intitulé Autres Types d'Échantillons pour plus de renseignements sur les tubes qui ont été évalués. 4 Diluer chaque échantillon hydrolysé au 1/25 dans le standard zéro (A), par exemple, 10 µl d'urine avec 240 µl du standard zéro. Volume nécessaire : 50 µl par tube. Conservation: 7 jours à +2/+8° C ou 2 9 mois à –20°C. Avant le dosage, laisser les échantillons revenir à température ambiante (15– 28°C), mélanger doucement par rotations ou retournement. Aliquoter, si nécessaire, afin d'éviter de répéter les cycles congélation / décongélation. Ne pas tenter de décongeler les spécimens congelés à l'aide d'un bain marie. Urine: Recueillir les échantillons urinaires sur 24 heures en les conservant au réfrigérateur Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Ne pas utiliser d'eau pour cette dilution ; seul le standard zéro doit être utiliser. Poursuivre le protocole de dosage radioimmunologique ainsi qu'il est décrit ci-après. Si le dosage n'est pas effectué immédiatement, les hydrolysats doivent être conservés bouchés à –20°C pour une durée maximale de 7 jours. Les volumes pour l'hydrolyse peuvent être modifiés sous conditions de respecter les proportions indiquées. Protocole de dosage Une courbe standard unique permet de déterminer les concentrations de testostérone dans le sérum (ou plasma) et dans l'urine. En conséquences, il est possible d'effectuer dans la même série les dosages des hydrolysats urinaires et des sérums (non extraits). Les standards sont prêts à l'emploi: seuls les échantillons urinaires doivent subir l'hydrolyse décrite 29 précédemment. Tous les composants doivent être à température ambiante avant leur utilisation (15–28°C). 1 Tubes secs : Etiqueter deux séries de tubes (non revêtus) en polypropylène 12x75 mm tubes T et LNS (Liaison Non Spécifique) en duplicate. la distribution du traceur. Les tubes T peuvent être mis de côté jusqu'au comptage (étape 6); ils n'ont besoin d'aucun autre traitement. 4 Incuber 3 heures à 37°C. 5 Décanter complétement. Eliminer toute trace d'humidité pour améliorer la précision du dosage. A l'aide d'un portoir de décantation, décanter ou aspirer le contenu de tous les tubes (excepté les tubes T) et laisser les tubes retournés pendant 2 ou 3 minutes. Puis appliquer les fortement sur du papier absorbant afin d'éliminer les gouttelettes résiduelles. La valeur du LNS dans la technique Coat-A-Count étant très faible, elle peut être négligée sans que la précision ou le contrôle de qualité ne soient modifiés. Tubes revêtus d'anticorps: Etiqueter 12 tubes revêtus d'anticorps antiTestostérone, A (liaison maximale B0) et de B à F en duplicate. Etiqueter les tubes revêtus d'anticorps anti- Testostérone supplémentaires, également en duplicate, pour les contrôles et les échantillons patients. 2 Standards ng/dl A (B0) 0 nmol/l 0 B 20 0,7 C 100 3,5 D 400 14 E 800 28 F 1 600 55 Pipeter 50 µl du standard zéro A dans les tubes de LNS et les tubes A (B0). Pipeter 50 µl de chacun des autres standards, contrôles et échantillons de patients dans les tubes correspondants préparés. Pipeter 50 µl de chaque hydrolysat urinaire dans les tubes appropriés. Pipeter directement au fond du tube. Les échantillons de patients suspectés de contenir des concentrations de testostérone supérieures au standard le plus élevé (1 600 ng/dl) doivent être dilués avec le standard zéro avant le dosage. 3 Ajouter 1,0 ml de Testostérone marquée à l'iode 125 dans chaque tube. Vortexer. Les laboratoires équipés d'un pipeteur-diluteur fiable peuvent procéder aux étapes 2 et 3 simultanément. Pas plus de 10 minutes ne doivent s'écouler pendant 30 6 Compter 1 minute dans un compteur gamma. Calcul des Résultats Afin d'obtenir des résultats en concentrations à partir d'une représentation logit-log de la courbe de calibration, calculer pour chaque doublet de tubes les coups corrigés: CPM corrigés = (Moyenne cpm) moins (Moyenne cpm LNS) Puis déterminer pour chaque doublet la capacité de liaison en pourcentage de liaison maximale (B0), corrigée des cpm dus au LNS des tubes A tubes considérés à 100%: % liaison = (cpm corrigés / cpm corrigés LM) × 100 Les échantillons dans la gamme de calibration donnent des résultats pratiquement identiques quand la capacité de liaison est calculée directement à partir de la moyenne des CPM. : sans correction de LNS. En utilisant un papier logit-log, on porte en ordonnée les pourcentages de liaison en fonction des concentrations des standards qui ne sont pas à zéro, en abscisse. On trace une ligne droite passant approximativement par ces points. Les concentrations des échantillons inconnus sont déterminées par interpolation sur la courbe standard. Bien que d'autres méthodes soient acceptables, la représentation logit-log a un avantage certain car la procédure Coat-A-Count Total Testostérone a été Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) optimisée pour donner une droite de calibration dans cette représentation. Echantillons urinaires : Pour obtenir la concentration en testostérone de l'échantillon urinaire avant hydrolyse, multiplier le résultat lu sur la courbe en ng/dl, par 100 pour obtenir des ng/ml, puis par 30 (dilution avec l'acide 1/1,2 puis 1/25 avec le standard zéro) enfin multiplier par le volume total des urines de 24 heures en litre, pour déterminer la production de testostérone en microgramme/jour. Record Keeping : Il est bon d'enregistrer pour chaque dosage les numéros de lots des composants utilisés ainsi que la date à laquelle ils ont été reconstitués ou ouverts. reporter à Davis SE et al. Radioimmunoassay data processing with a small programmable calculator. J Immunoassay 1980;1:15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:126471. Paramètres de contrôle qualité: Nous recommandons le suivi des paramètres suivants : T = Activité totale (cpm) %LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS / cpm Totaux) %LM = 100 × (cpm corrigés LM / cpm totaux) Et les intercepts à 20, 50 et 80 % avec 20% = Concentration à 20% de liaison, etc. Traitement des échantillons: Les instructions de stockage des échantillons et des réactifs doivent être scrupuleusement observées. Diluer les sérums (ou plasma) des patients supposés avoir des concentrations élevées (supérieure à 1 600 ng/dl) avec le standard zéro avant le dosage. Tous les échantillons, standards et contrôles doivent être dosés en double. Il est bon d'utiliser des embouts de micropipettes jetables, de changer d'embout entre les échantillons de manière à éviter toute contamination. Les doublets de tubes de contrôles doivent être espacés au long de la série de dosage afin de vérifier l'absence de dérive significative. Vérifier la concordance des résultats entre les doublets de tubes. Exemple de série : A titre d'exemple uniquement, et non pour calculer des résultats provenant d'une autre série. (Voir le tableau « Example Run ».) Phase Ovulatoire 41 24 ND–80 ND–81 L'adsorption de la testostérone sur des surfaces en caoutchouc a été démontré, éviter l'utilisation de ce matériel pour conserver ou boucher les réactifs fournis. Sous contraceptifs oraux 13 15 — ND–28 Post27 menopausées 20 4,0–62 4,0–74 De 20-49 ans 68 630 262–1 593 245–1 836 > 50 ans 427 181–758 181–772 Valeurs de référence Dans une étude de valeurs normales, 87 sérums d'hommes et 81 sérums de femmes ont été dosés avec la technique Coat-A-Count Total Testostérone, pour donner les résultats suivants, exprimés en ng/dl. n Médiane Domaine (ng/dl) 95% perc. Femmes Contrôles : Les contrôles (ou pools de sérums) avec au moins deux taux de concentration de testostérone, haut et bas, doivent être dosés en routine comme des échantillons inconnus, et les résultats notés jour après jour comme décrit par exemple dans Westgard JO, et al. A multirule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Noter qu'un redosage d'échantillon peut être précieux pour suivre la précision inter essai. ND : non détectable Exploitation des résultats: Il est conseillé de représenter graphiquement la courbe d'étalonnage, même si les données sont traitées par ordinateur. Se Adultes Hommes 25 à 125 µg/jour (Médiane 75 µg/jour) Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Domaine Absolu Hommes 19 Par comparaison avec la méthode qui a précédé la technique Coat-A-Count 50 µl Total Testostérone, il est suggéré d'utiliser les valeurs de référence urinaires suivantes: 31 Femmes 5 à 35 µg/jour (Médiane 15 µg/jour) tableau « Recovery » pour des données représentatives.) Ces valeurs sont données à titre indicatif uniquement.Chaque laboratoire devra établir ses propres valeurs de référence. Bilirubine : La présence de bilirubine ne présente aucun effet sur les résultats ni sur la précision du dosage si la concentration ne dépasse pas 200 mg/l. Performances du test Hémolyse : La présence d'agrégat d'hématies jusqu'à une concentration de 30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats quant à la précision du dosage. Consulter les tableaux et graphiques pour obtenir les données représentatives des performances de ce test. Les résultats sont exprimés en nanogrammes de Testostérone par décilitre (ng/dl). Tous les résultats ont été obtenus à partir d'échantillons sériques. Facteur de conversion : ng/dl × 0,03467 → nmol/l Domaine de mesure: 4 – 1 600 ng/dl. Intervalle de linéarité : 20 – 1 600 ng/dl (0,7 – 55 nmol/l) Sensibilité analytique : 4 ng/dl (0,14 nmol/l) Précision intra-dosage (au sein d'une même série) : Un profil de précision, établi sur 17 à 21 degrés de liberté par point, montre les coefficients de variation attendus pour chaque échantillon dosés en double. (Voir le graphe “Precision Profile”.) Précision inter-dosage (entre plusieurs séries) : Les résultats ont été calculés pour chacun des 7 échantillons à partir des résultats de 20 séries en duplicate. (Voir le tableau “Interassay Precision”.) Spécificité : L'antisérum utilisé dans le coffret Coat-A-Count Total Testostérone est très spécifique pour la testostérone. Les réactions croisées ont été calculées sur la base poids pour poids à 50% de liaison. (Voir le tableau "Specificity") Test de dilution : Des échantillons ont été dosés à différentes concentrations. (Voir le tableau « Linearity » pour des données représentatives.) Effet de la position des tubes : Aucun jusqu'à 300 tubes. (Voir le tableau « Endof-Run Effect ».) Test de récupération : 5 échantillons sont mélangés dans la proportion 19/1 avec 3 solutions de testostérone de concentrations (5 000, 10 000 et 20 000 ng/dl) puis dosés avec le coffret Coat-A-Count Total Testostérone (Voir le 32 Lipémie : Des dilutions en séries du standard (1 600 ng/dl) ont été effectuées avec un pool de sérums lipémiques, le taux de lipides augmentant tandis que la concentration de testostérone provenant du standard diminuait, le dosage de ces dilutions et du pool lipémique a montré que même en présence d'une lipémie sévère, les pourcentage de récupération restaient bons Autres types d'échantillons: Afin de déterminer le rôle éventuel des anticoagulants sur la technique, le sang de 23 volontaires a été recueilli sur tubes vacutainers secs, héparinés et avec EDTA. Tous les échantillons ont été dosés avec le coffret Coat-A-Count Testostérone Totale Les résultats analysés par régression linéaire donnent : (Héparine) = 1,02 (Sérum) – 1,0 ng/dl r = 0,998 Moyennes : 273 ng/dl (Héparine) 270 ng/dl (Sérum) (EDTA) = 0,91 (Sérum) + 3,0 ng/dl r = 0,997 Moyennes : 250 ng/dl (EDTA) 270 ng/dl (Sérum) Ce dosage donne les mêmes résultats sur sérum et plasma hépariné, par contre, des plasmas EDTA donneront des résultats en moyenne 10% plus bas. Effet de la SHBG: Pour déterminer si la technique de dosage est influencée par des variations du taux de la SHBG (Sex – Hormon –Binding Globulin) endogène, des standards du coffret IRMA-Count SHBG ont été mélangés à 1/201 avec une solution de testostérone. Cette solution et les standards surchargés ont été dosés avec la méthode Coat-A-Count Total Testostérone : les résultats montrent que même pour des concentrations de SHBG élevées, les taux apparents de Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) testostérone trouvés restent inchangés dans la limite de précision du dosage (Voir le tableau"SHBG Effect") Effet des protéines: Pour simuler différentes concentrations en protéines, des expériences ont été effectuées en reconstituant des aliquotes de 2 ml de sérums humains lyophilisés avec différents volumes d'eau (1,3 ; 2 ; et 3 ml). Chaque aliquote reconstitué a été dosé à l'aide de la méthode Coat-A-Count Testostérone Totale. (Se reporter au tableau "Protein Effect" pour des données représentatives.) Comparaison de méthodes: La technique Coat-A-Count Testostérone Totale a été comparée sur 83 échantillons sériques (37 hommes et 46 femmes) avec un autre radio-immunodosage avec double anticorps (Coffret A). et un coffret B avec tubes coatés. Par régression linéaire : (TKTT) = 1,10 (Coffret A) + 19 ng/dl r = 0,981 Moyennes : 269 ng/dl (TKTT) 227 ng/dl (Coffret A) (TKTT) = 1,23 (Coffret B) + 16 ng/dl r = 0,987 Moyennes : 269 ng/dl (TKTT) 206 ng/dl (Coffret B) Assistance technique Contacter votre distributeur national. www.siemens.com/diagnostics Le Système Qualité de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003. Italiano Coat-A-Count Testosterone Totale Uso: Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale è un dosaggio radioimmunologico in fase solida marcato 125 con I per la misurazione quantitativa del testosterone in siero non estratto o in plasma eparinizzato. In associazione con un procedura di idrolisi in acido, può essere utilizzato anche per dosare Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) campioni di urina. E' a solo uso diagnostico in vitro quale ausilio nella diagnosi e nella gestione di patologie cliniche dove compare un eccesso o una mancanza di questo androgeno. Codice: TKTT1 (100 provette), TKTT2 (200 provette), TKTT5 (500 provette). Il kit da 100 determinazioni contiene meno di 4 microcurie (148 kilobecquerel) di 125 testosterone marcato con I testosterone; il kit da 200 determinazioni contiene meno di 8 microcurie (296 kilobecquerel), ed il kit da 500 determinazioni contiene meno di 20 microcurie (740 kilobecquerel). Riassunto e spiegazione del Test Nel maschio, il testosterone viene principalmente sintetizzato nelle cellule intestiziali di Leydig e nei testicoli, ed è regolato dall'ormone che stimola le cellule interstiziali (ICSH), o dall'ormone luteinizzante (LH) dell'ipofisi anteriore (l'equivalente femminile dell'ICSH). Il testosterone è responsabile dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari, quali gli organi sessuali accessori, la prostata, le vescicole seminali e la crescita della barba, dei peli pubici ed ascellari. Le misurazioni di testosterone si sono rivelate utili nella valutazione dei vari stadi dell'ipogonadismo. Un aumento nei livelli di testosterone nei maschi viene riscontrato nella resistenza androgenica 10 completa (feminilizzazione testicolare) Cause comuni che provocano un decremento nei livelli di testosterone includono: ipogonadismo, orchidectomia, terapia estrogenica, Sindrome di Klinefelter, ipopituitarismo, e cirrosi epatica. Nella femmina, i livelli di testosterone sono normalmente molto più bassi di quelli riscontrati nei maschi sani. Il testosterone nella femmina proviene da tre sorgenti diverse. Viene secreta in piccole quantità sia dal surrene che dalle ovaie e nelle donne sane dal 50 al 60% della produzione giornaliera di testosterone proviene dal metabolismo periferico dei preormoni, principalmente dell'androstenedione. Tra le cause comuni che provocano un innalzamento dei livelli 33 di testosterone sierico nelle donne vi è la sindrome dell'ovaio policistico (sindrome di Stein-Leventhal), tumori ovarici, tumori ed iperplasia del surrene. La virilizzazione nella donna è associata con la somministrazione di androgeni e con la superproduzione endogena di testosterone. Sembra che esista una correlazione tra i livelli di testosterone sierico ed il grado di virilizzazione nelle donne, benché circa il 25% delle donne con vari gradi di virilizzazione presenti livelli di testosterone sierico che rientrano entro il range di riferimento femminile. Procedura del Dosaggio La procedura del dosaggio Coat-A-Count Testosterone è costituita da un radioimmunodosaggio in fase solida, basato su un anticorpo specifico per il testosterone adeso alle pareti di una provetta di polipropilene. Il testosterone 125 marcato con I compete per i siti anticorpali in un tempo prefissato con il testosterone presente nel campione del paziente. La provetta viene quindi decantata per separare il materiale legato da quello libero e contata in un gamma counter. La quantità di testosterone presente nel campione del paziente viene determinata dalla curva di calibrazione. Reagenti da Dispensare: 1 Tempo Totale di Incubazione: 3 ore Conte Totali alla iodinazione: circa 60 000 cpm Avvertenze e precauzioni Per uso diagnostico in vitro. Reagenti: Conservare a 2–8°C in un frigorifero appositamente destinato al materiale radioattivo. Eliminare secondo le normative di legge vigenti. Non utilizzare reagenti oltre la data di scadenza. Alcuni componenti forniti in questo kit possono contenere materiale di origine umana e/o altri ingredienti potenzialmente pericolosi che necessitano di precauzioni di utilizzo: Seguire le precauzioni universali, e manipolare tutti i componenti come se potessero trasmettere agenti infettivi. Sono stati analizzati i materiali origine umana e sono stati trovati non reattivi per 34 la sifilide; per gli anticorpi anti HIV 1 e 2; per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B; e per gli Anticorpi anti-Epatite C. E' stata aggiunta Sodio Azide a concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come conservante. Al momento dell'eliminazione, irrorare con molta acqua per evitare la formazione di azidi metalliche potenzialmente esplosive nelle tubature di piombo e di rame. Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o deionizzata. Radioattività Una copia di tutti i certificati di Autorizzazione per radioisotopi (Specifica o Generica) rilasciata ad un cliente americano deve essere conservata in file presso la Siemens Healthcare Diagnostics prima che i kit o i componenti contenenti materiale radioattivo possano essere spediti. Questi materiali radioattivi possono essere acquisiti da qualsivoglia cliente in possesso dell'Autorizzazione Specifica. Con l'Autorizzazione Generica questi materiali radioattivi possono essere acquistati solo da medici, veterinari che esercitino la professione, laboratori clinici ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di test clinici o di laboratorio in vitro che non implichino somministrazione interna o esterna del materiale radioattivo o delle sue radiazioni alle persone o animali. La sua acquisizione, ricevimento, conservazione, utilizzo, trasferimento ed eliminazione sono soggette a regolamentazioni e ad Autorizzazione (Generica o Specifica) della Commissione Statunitense per il Nucleare o dello Stato con il quale l'NRC abbia stipulato un accordo per l'esercizio del controllo regolatorio. Manipolare i materiali radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione Generica o Specifica. Per minimizzare l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore deve attenersi alle linee guida stabilite dal National Bureau of Standards publication su “Safe Handling of Radioactive Materials” “Norme per una corretta manipolazione dei Materiali Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9 Marzo 1964) e successive edizioni pubblicate dallo Stato e dalle Autorità Federali. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Assorbire immediatamente le fuoriuscite e decontaminare le superfici contaminate. Evitare la formazione di aerosol. Eliminare i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione. Le licenze generiche (possessori di NRC Form 483) possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi come non radioattivi, dopo aver rimosso l'etichetta. I detentori di autorizzazioni specifiche (NRC Form 313) devono fare riferimento al Titolo 10, Codice delle Regolamentazioni Federali Parte 20. I detentori di Autorizzazioni negli Stati che hanno stipulato un accordo con l'NRC dovrebbero far riferimento alle regolamentazioni idonee dei loro stati. I detentori di Autorizzazioni Generali possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi del tipo contenuto in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. I detentori di autorizzazione devono eliminare o rendere illeggibili le etichette dei contenitori vuoti di materiali radioattivi prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori di autorizzazioni specifiche possono eliminare piccoli quantitativi di rifiuti radioattivi liquidi del tipo utilizzato in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. Fare riferimento alle regolamentazioni appropriate applicabili al Vostro laboratorio. Materiali Forniti: Preparazione Iniziale E' stato riscontrato che il testosterone viene assorbito dalle superfici in gomma; quindi, contenitori e tappi in gomma devono essere evitati nell'utilizzo dei reagenti forniti. Provette Coattate con Anticorpi antiTestosterone Totale (TTT1) Provette di polipropilene coattate con anticorpi anti-testosterone e confezionate in buste a cerniera sigillate. Conservare refrigerate al riparo dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo. Stabili a 2– 8°C fino alla data di scadenza indicata sulla confezione. Colore: giallo. TKTT1: 100 provette. TKTT2: 200 provette. TKTT5: 500 provette. 125 Testosterone Totale marcato con I (TTT2) 105 mL di testosterone iodinato. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura, o fino Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) alla data di scadenza indicata sulla provetta. Il tracciante deve essere a temperatura ambiente (15–28°C) e ben mescolato capovolgendo il flacone prima dell'utilizzo. TKTT1: 1 flacone. TKTT2: 2 flaconi TKTT5: 5 flaconi. Calibratori Testosterone Totale (TTC3–8) Sei flaconi di calibratori testosterone, pronti all'uso. Il calibratore zero A contiene 4,0 mL, ed i calibratori rimanenti da B fino ad F contengono 1,0 mL ciascuno. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura, e per 6 mesi (aliquotato) a –20°C. TKTT1: 1 set. TKTT2: 1 set. TKTT5: 2 set. I calibratori contengono rispettivamente, 0, 20, 100, 400, 800 e 1 600 nanogrammi di testosterone per decilitro (ng/dL) in siero umano processato equivalente a: 0, 0,7, 3,5, 14, 28 e 55 nanomoli per litro (nmol/L). I punti intermedi della calibrazione possono essere ottenuti mescolando i calibratori in proporzioni idonee. Materiali Richiesti Ma Non Forniti Gamma counter – compatibile con le provette standard 12x75 mm Vortex mixer Urina Idrolizzata Vedi Preparazione del Campione: Sezione Idrolisi delle Urine. Radioimmunodosaggio Provette semplici di polipropilene da 12x75 mm— da utilizzarsi con le provette NSB, disponibili presso Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: PPO). Micropipette: 50 µL e 1,0 mL. Bagnetto termostatato — in grado di mantenere la temperatura 37°C — non possono essere utilizzati forni o piastre riscaldate. Foam per la decantazione delle provette – disponibile presso la Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: FDR). Carta per grafici Logit-log Un controllo a tre-livelli basato su siero umano, contenente testosterone tra oltre 25 altri costituenti dosati, disponibile 35 presso Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: CON6). Volume richiesto: 1,0 mL (per la procedura con idrolisi). Prelievo dei Campioni Conservazione: 7 giorni a 2–8°C o 1 mese a –20°C. Siero e Plasma Eparinizzati: Non è necessario che il paziente sia a digiuno, non sono necessarie preparazioni 8 particolari. Prelevare il sangue in provette semplici (senza anticoagulante) o provette eparinizzate, annotando l'ora del prelievo e separare il siero o il plasma eparinizzati dalle cellule attraverso centrifugazione. Il plasma EDTA produce risultati che sono circa il 10% più bassi. Preparazione dei Campioni: Idrolisi dell'Urina 1 Non utilizzare provette coattate con anticorpo. 2 Si consiglia l'utilizzo di un'ultracentrifuga per schiarire i campioni lipemici. I campioni emolizzati posson indicare il trattamento non idoneo del campione prima dell'arrivo al laboratorio; per questo motivo, i risultati devono essere interpretati con prudenza. Provette per il prelievo di sangue di produttori diversi possono dare valori differenti, a seconda dei materiali e degli additivi usati, incluso gel o barriere fisiche, attivatori di coaguli e/o anticoagulanti. L'Coat-A-Count Testosterone Totale non é stato verificato con tutte le possibili variazioni di tipi di provette. Consultare la sezione riguardante Campioni Alternativi per dettagli sulle provette testate. Volume richiesto: 50 µL per provetta. Conservazione: a 2–8°C per 7 giorni, o 9 fino a due mesi congelato a –20°C. Prima del dosaggio, consentire ai campioni di raggiungere temperatura ambiente (15–28°C) e mescolare scuotendo leggermente o capovolgendo la provetta. Aliquotare, se necessario per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Non tentare di scongelare i campioni congelati riscaldandoli in un bagnetto termostatato. Urina: Ottenere un campione nelle 24 ore, mantenendo lo stesso refrigerato durante il prelievo. Annotare il volume totale. Se l'analisi non viene effettuata immediatamente, conservare un'aliquota ben mescolata dopo l'aggiunta di 1,0 grammi di acido borico per 100 mL di urina. 36 Etichettare una provetta di vetro o di plastica non coattata per ciascun campione di urina. Dispensare 1,0 mL di ciascun campione di urina nella provetta appropriata. Se il campione risulta torbido, o se si è verificata la formazione di precipitato, occorre centrifugare l'urina e lavorare con il sovranatante chiaro. 3 Aggiungere 200 µL di HCl concentrato (12N, non fornito) ad ogni provetta. Tappare ed incubare il un bagnetto d'acqua bollente per 15 minuti. 4 Diluire ciascun campione idrolizzato 1:25 con il calibratore zero: ad esempio, aggiungere 10 µL di campione idrolizzato a 240 µL del calibratore zero. Non utilizzare acqua per diluire gli idrolizzati; deve essere utilizzato il calibratore zero. Procedere con il radioimmunodosaggio, come descritto più sotto nella sezione Procedura del Dosaggio. Se non dosati immediatamente, gli idrolizzati devono essere sigillati e conservati a –20°C per non più di 7 giorni. I volumi possono essere progressivamente aumentati, se lo si desidera, a patto che le proporzioni specificate nella procedura di idrolisi rimangano inalterate. Dosaggio Radioimmunologico Una singola curva di calibrazione fornisce la base per determinare le concentrazioni di testosterone nel siero (o nel plasma eparinato) e nelle urine. In maniera conforme, sia gli idrolizzati urinari che i campioni di siero non trattato possono essere processati nello stesso dosaggio. I calibratori sono pronti all'uso; solo i campioni di urina possono essere soggetti ad idrolisi, come descritto nella Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Preparazione dei Campioni: sezione Idrolisi delle Urine. Tutti i componenti devono essere a temperatura ambiente (15–28°C) prima dell'utilizzo. 1 Provette Semplici: Etichettare con T (conte totali) quattro provette semplici (non coattate) 12x75 mm di polipropilene e NSB (legame non specifico) in duplicato. devono passare più di 10 minuti nella dispensazione del tracciante. Mettere da parte le provette T per la conta (al punto 6); non sono necessari ulteriori passaggi. 4 Incubare per 3 ore a 37°C. 5 Decantare completamente. Rimuovere tutta l'umidità visibile aumentando così la precisione. Utilizzare un foam per la decantazione, decantare o aspirare i contenuti di tutte le provette (ad eccezione delle provette T) e fare in modo che si asciughino per 2 o 3 minuti. Tamponarle su carta assorbente per eliminare completamente i liquidi. Poiché il legame non specifico nel dosaggio Coat-A-Count è caratteristicamente basso, le provette NSB possono essere anche omesse senza compromettere l'accuratezza o il controllo di qualità. Provette Coattate: Etichettare con A dodici Provette Coattare con Anticorpo Testosterone Totale (legame massimo) e da B ad F in duplicato. Etichettare altre provette coattate con l'anticorpo, anch'esse in duplicato, per i controlli ed i campioni del paziente. Calibratori 2 ng/dL nmol/L A (MB) 0 0 B 20 0,7 C 100 3,5 D 400 14 E 800 28 F 1 600 55 Dispensare 50 µL del calibratore zero A nelle provette NSB ed A, e 50 µL di ciascuno dei calibratori, dei controlli e dei campioni rimanenti (siero o plasma eparinizzato) nelle provette preparate. Dispensare 50 µL di ciascun idrolizzato urinario in provette adeguatamente etichettate. Pipettare direttamente al fondo. I campioni dei pazienti con concentrazioni attese di testosterone superiori al calibratore più elevato (1 600 ng/dL) devono essere diluiti con il calibratore zero. 3 Aggiungere 1,0 mL di Testosterone 125 Totale marcato con I ad ogni provetta. Vortexare. I laboratori forniti di un pipettatorediluitore affidabile possono eseguire il punto 2 e 3 simultaneamente, occorre fare attenzione ad evitare il carryover da campione a campione. Non Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 6 Contare per 1 minuto in un gamma counter. Calcolo e Controllo di Qualità Per calcolare le concentrazioni di testosterone totale da una rappresentazione logit-log della curva di calibrazione, calcolare inizialmente per ogni coppia di provette la media delle conte per minuto corrette con NSB: Conte Nette = (Media dei CPM) Meno (Media CPM NSB) Quindi determinare il legame di ogni coppia di provette come percentuale del legame massimo (MB), con le conte corrette-NSB delle provette A prese al 100%: Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte Nette MB) × 100 Il calcolo può essere semplificato omettendo la correzione per il legame non specifico; i campioni entro il range dei calibratori producono virtualmente gli stessi risultati quando il Legato Percentuale viene calcolato direttamente dalla media dei CPM. Utilizzando la carta logit-log, tracciare la Percentuale di Legato sull'asse verticale (probabilità) verso la Concentrazione sull'asse orizzontale (logaritmica) per ciascuno dei calibratori non zero e tracciare una linea retta approssimativamente lungo il tracciato di questi punti. I risultati per i campioni sconosciuti possono essere letti dalla retta attraverso interpolazione. 37 Benché altri approcci siano accettabili, il calcolo dei dati con un metodo logit-log appena descritto ha alcuni vantaggi in questo contesto – ad esempio – facilitare il riconoscimento dei punti devianti della calibrazione – poiché il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale è stato ottimizzato per la linearità in questa rappresentazione. Campioni di Urina: Dividere il risultato ottenuto in "ng/dL" come si legge dalla curva di calibrazione per 100, per ottenere il risultato in ng/mL; quindi moltiplicare per 30, per ottenere la concentrazione di testosterone, in ng/mL, del campione originario di urina non idrolizzata. (Viene utilizzato un fattore di 30, poiché i campioni di urina sono diluiti 1:1.2 con acido idroclorico, quindi 1:25 con il calibratore zero.) Moltiplicare per il volume totale in litri per ottenere la produzione di testosterone in microgrammi per giorno nelle 24 ore. Annotazioni: Si consiglia per ogni dosaggio di annotare i numeri di lotto dei componenti utilizzati, le date di ricostituzione o di apertura dei reagenti. Manipolazione dei Campioni: Le istruzioni per la manipolazione e la conservazione dei campioni e dei camponenti devono essere scrupolosamente seguite. Diluire i campioni di siero e di plasma eparinizzato che ci si attende contengano concentrazioni di testosterone superiori al calibratore più elevato (1 600 ng/dL) con il calibratore zero prima del dosaggio. Tutti i campioni inclusi i calibratori ed i controlli devono essere dosati in duplicato. Si consiglia di utilizzare un puntale monouso, cambiando il puntale tra un campione e l'altro, per evitare la contaminazione da carryover. Coppie di provette di controllo possono essere inserite lungo tutto il dosaggio per aiutare nella verifica dell'assenza di deviazioni significative. Verificare la concordanza dei risultati all'interno delle coppie di provette e fare attenzione ad evitare il carryover da un campione all'altro. Controlli: I controlli o i pool di siero con alMeno due livelli di concentrazione di testosterone (basso ed alto) devono essere dosati nella routine come campioni sconosciuti, ed i risultati devono essere riportati giorno dopo giorno come descritto in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493501. I campioni ripetuti sono un valido strumento per il monitoraggio della precisione interdosaggio. Calcolo dei Dati: E' buona norma costruire un grafico della curva di calibrazione quale verifica visiva dell'appropriatezza della trasformazione utilizzata, anche laddove il calcolo dei risultati venga effettuato con il computer. Vedi Davis SE et al. Radioimmunoassay data processing with a small programmable calculator. J Immunoassay 1980;1:15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Parametri di Q. C.: Consigliamo di annotare le seguenti modalità per stabilire le prestazioni del dosaggio: T = Conte Totali (conte al minuto) %NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte Totali) %MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali) E le “intercette” al 20, 50 ed 80%, dove 20% = Concentrazione al 20% di Legato ecc. Seduta Esemplificativa: a solo scopo illustrativo e non per calcolare i risultati di un'altra seduta. (vedi tabella "Example Run"). Valori Attesi In uno studio sui range di riferimento, sono stati dosati 87 campioni di siero maschile e 81 campioni di siero femminile con il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale, con i seguenti risultati in ng/dL. E' stato riscontrato che il testosterone viene assorbito dalle superfici in gomma; quindi, contenitori e tappi in gomma devono essere evitati nell'utilizzo dei reagenti forniti. 38 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Mediana n (ng/dL) Range Centrale 95% Range Assoluto Femmine Ovulazione 41 24 ND–80 ND–81 Contraccettivi 13 Orali 15 — ND–28 Campioni PostMenopausa 20 4,0–62 4,0–74 27 Maschi 20–49 anni 68 630 262–1 593 245–1 836 > 50 anni 19 427 181–758 181–772 ND: non determinabile La comparazione tra il dosaggio Coat-A-Count 50 µL Testosterone Totale con i propri predecessori suggerisce i seguenti range di riferimento per il testosterone urinario: da 25 a 125 µg/giorno (con una mediana di circa 75 µg/giorno) per i maschi adulti, e da 5 a 35 µg/giorno (con una mediana di circa 15 µg/giorno) per le femmine adulte. I laboratori devono considerare questi risultati soltanto come linee guida. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri range di riferimento. Prestazioni del Dosaggio Vedi Tabelle e Grafici per i dati rappresentativi delle prestazioni del kit Coat-A-Count Testosterone Totale. I risultati del Testosterone Totale di seguito riportati sono espressi in ng/dL. Se non diversamente specificato, i risultati sono stati generati da campioni di siero. Fattore di Conversione: ng/dL × 0,03467 → nmol/L Range: 4 – 1 600 ng/dL. Range di Calibrazione: 20 – 1 600 ng/dL (0,7 – 55 nmol/L). Sensibilità analitica: 4 ng/dL (0,14 nmol/L). Precisione Intra-Dosaggio (All'interno della stessa seduta) E' stato preparato un profilo di precisione legato alla dose, basato da 17 a 21 gradi di libertà per punto che riportava i CV attesi per i campioni dosati in duplicato. (Vedi grafico “Precision Profile”.) Inter-Dosaggio (Da seduta-a-Seduta): Sono state calcolate statistiche per Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) ciascuno dei sette campioni dai risultati di coppie di provette in 20 dosaggi diversi. (Vedi tabella “Interassay Precision”.) Specificità: L'antisiero Coat-A-Count Testosterone Totale è altamente specifico per il testosterone. La crossreattività percentuale è stata calcolata peso/peso a circa il 50% del legame. (Vedi tabella “Specificità”) per dati rappresentativi. Linearità: I campioni sono stati provati sotto varie diluizioni. (Vedi tabella “Linearity” per dati rappresentativi.) Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa 300 provette. (vedi tabella "End-of-Run Effect"). Recupero: Sono stati dosati campioni 1:19 cui sono state aggiunte tre soluzioni di Testosterone (5 000, 10 000 e 20 000 ng/dL). (Vedi tabella “Recovery” per dati rappresentativi). Bilirubina: La presenza di bilirubina in concentrazioni fino a 200 mg/L non ha nessun effetto sui risultati entro il range di precisione del dosaggio. Emolisi: La presenza di globuli rossi impaccati in concentrazioni fino a 30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il range di precisione del dosaggio. Lipemia: Il calibratore alto (1 600 ng/dL) è stato diluito serialmente con un pool di sieri lipemici. Ciò ha provocato un incremento della lipemia in relazione al decremento della concentrazione di testosterone (dovuto principalmente al calibratore). Queste diluizioni sono state dosate con il pool lipemico non diluito. I risultati mostrano che anche in presenza di una lipemia grave non vi sono effetti significativi sul dosaggio. Tipo di Campione Alternativo: Per determinare se gli anticoagulanti interferiscano con il dosaggio, è stato prelevato del sangue da 23 volontari in provette semplici, eparinizzate e vacutainer EDTA. Tutti i campioni sono stati dosati con il Dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale. Attraverso regressione lineare (Eparina) = 1,02 (Siero) – 1,0 ng/dL r = 0,998 Valore medio: 273 ng/dL (Eparina) 270 ng/dL (Siero) 39 (EDTA) = 0,91 (Siero) + 3,0 ng/dL r = 0,997 (TKTT) = 1,10 (Kit A) + 19 ng/dL r = 0,981 Valore medio: 250 ng/dL (EDTA) 270 ng/dL (Siero) Valore medio: 269 ng/dL (TKTT) 227 ng/dL (Kit A) I risultati mostrano che i campioni di plasma eparinizzato producono virtualmente gli stessi risultati del siero nel dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale, mentre il plasma EDTA produce risultati che sono in media circa il 10% più bassi. (TKTT) = 1,23 (Kit B) + 16 ng/dL r = 0,987 Effetto dell'SHBG: Per determinare se il dosaggio subisca delle variazioni nel livello di globulina endogena legante gli ormoni sessuali (SHBG), ciascun calibratore del kit IRMA-Count SHBG è stato diluito 1:201 con una soluzione di testosterone, quindi sono stati dosati, sia diluiti che non diluiti con il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale. La quarta colonna mostra i valori di testosterone appartente (in ng/dL) dei calibratori SHBG diluiti dopo correzione delle concentrazioni di testosterone osservate per i calibratori non diluiti. L'ultima colonna è stata calcolata prendendo al 100% la media apparente della concentrazione corretta di testosterone dei calibratori diluiti SHBG. (Vedi tabella "SHBG Effect" per valori rappresentativi). All'estero: Si prega di contattare il proprio Distributore Nazionale. Effetto delle Proteine: Per simulare varie concentrazioni proteiche, sono stati effettuati esperimenti nei quali aliquote da 2,0 mL di pool di sieri umani sono state liofilizzate e quindi ricostituite con diversi volumi d'acqua (1,3, 2,0 e 3,0 mL). Ciascuna aliquota ricostituita è stata quindi dosata con il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale. (Il fattore utilizzato per correggere il volume di ricostituzione è tabulato di seguito). I valori osservati ed attesi di testosterone totale sono tabulati in ng/dL. (Vedi tabella “"Protein Effect" per dati rappresentativi) Comparazione di Metodi: In uno studio comparativo effettuato su pazienti il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Totale è stato comparato a due radioimmunodosaggi disponibili in commercio, un dosaggio a doppioanticorpo (Kit A), e l'altro un dosaggio coated-tube (Kit B). Sono stati combinati i risultati di campioni di siero provenienti da 37 maschi e 46 femmine, con la seguente relazione: 40 Valore medio: 269 ng/dL (TKTT) 206 ng/dL (Kit B) Assistenza Tecnica www.siemens.com/diagnostics Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003. Português Testosterona Total Coat-ACount Utilização: Testosterona Total Coat-A-Count é um radioimunoensaio de 125 fase sólida marcado com I designado para o doseamento quantitativo da testosterona em soro ou plasma heparinizado sem extracção. Associada com um procedimento de hidrólise ácida, o mesmo também é adequado para o ensaio de amostras de urina. Destina-se exclusivamente ao diagnóstico in vitro como auxiliar do diagnóstico e tratamento de condições envolvendo o excesso ou deficiência deste andrógeno. Números de catálogo: TKTT1 (100 tubos), TKTT2 (200 tubos), TkTT5 (500 tubos) O Kit com 100 tubos contém Menos que 4 microcuries 125 (148 kilobecquerels) de I radioactivo ligado a testosterona; o Kit com 200 tubos contém Menos que 8 microcuries (296 kilobecquerels), e o kit com 500 tubos contém Menos que 200 microcuries (740 kilobecquerels). Sumário e Explicação do Teste No homem, a Testosterona é sintetizada principalmente nas células intersticiais de Leydig no testículo, e é regulada pelo Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) hormónio estimulante da célula intersticial (ICSH) ou hormónio luteinizante (LH) da pituitária anterior (a forma feminina equivalente da ICSH). A testosterona é responsável pelo desenvolvimento das características sexuais secundárias, como órgãos sexuais acessórios, próstata, vesícula seminal e o crescimento dos pêlos faciais púbicos e axilares. Os doseamentos da Testosterona tem sido muito úteis na avaliação dos estados hipogonadais. Níveis elevados de testosterona em homens podem ser encontrados em resistência androgênica 10 completa (feminização testicular). Causas comuns da diminuição dos níveis de testosterona em homens incluem: hipogonadismo, orquidectomia, terapia estrogênica, síndroma de Klinefelter, hipopituitarismo, e cirrose hepática. Na mulher, os níveis de testosterona são normalmente inferiores ao encontrado num homem saudável. A testosterona na mulher é proveniente de três diferentes origens. Ela é secretada em pequenas quantidades tanto pelas glândulas adrenais como pelos ovários, e em mulheres saudáveis 50–60% da produção diária de testosterona provém do metabolismo periférico dos préhormônios, principalmente a androstenediona. Causas comuns do aumento dos níveis de testosterona sérica em mulheres incluem ovários policístico (Síndroma de Stein Leventhal), tumores ovarianos, tumores adrenais e hiperplasia adrenal. A virilização na mulher está associada com a administração de andróginos e a superprodução endógena da testosterona. Parece haver uma correlação entre os níveis de testosterona sérica e o grau de virilização na mulher, embora aproximadamente 25% das mulheres com graus variantes de virilidade possuem nível de testosterona no soro dentro dos valores de referência feminina. Princípio do Procedimento O procedimento Coat-A-Count é um radioimunoensaio fase sólida, baseado nos anticorpos específicos à Testosterona imobilizados nas paredes dos tubos de polipropileno. A Testosterona marcada 125 com I compete por um período fixo de tempo com a testosterona da amostra do paciente para os sítios do anticorpo. O Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) tubo é decantado, para separar a forma ligada da livre, e é contado em um contador gama. A quantidade de Testosterona presente na amostra do paciente é determinada a partir de uma curva de calibração. Reagentes para Pipetar: 1 Tempo de Incubação Total: 3 horas. Contagens Totais na Marcação com o Iodo: aproximadamente 60 000 cpm Precauções Para uso de diagnóstico in vitro. Reagentes: Conservar a 2–8°C num frigorífico destinado para materiais radioactivos. Eliminar de acordo com as leis aplicáveis. Não utilize reagentes com prazo de validade expirado. Alguns componentes fornecidos com este kit podem conter matéria de origem humana e/ou outros ingredientes potencialmente perigosos que necessitem de algumas precauções. Manipule com as devidas precauções todos os materiais capazes de transmitir doenças infecciosas. As matérias primas, obtidas de soro humano, foram testadas, revelando resultados negativos para a sífilis, para os anticorpos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2; para o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus da hepatite C. Azida de sódio foi adicionada como conservante; para evitar acumulações de azidas metálicas explosivas em canalizações de cobre e alumínio, os reagentes devem ser rejeitados no esgoto apenas se estiverem diluídos e forem lavados com grandes volumes de água. Água: Utilize água destilada ou deionizada. Radioactividade Uma cópia da licença de uso de produtos radioactivos (especifico ou geral) enviada pelo cliente, deve estar em poder da Siemens Healthcare Diagnostics antes do envio dos kits ou componentes contendo material radioactivo. Estes materiais radioactivos podem ser adquiridos por qualquer cliente que possua a necessária licença especifica. Com uma licença 41 generalista estes produtos radioactivos só podem ser adquiridos por médicos, veterinários na prática de medicina veterinária, laboratórios clínicos e hospitais. E somente para uso clinico in vitro ou testes laboratoriais não envolvendo administração externa ou interna do material radioactivo ou da sua radiação para o ser humano ou outros animais. A sua aquisição, receita, armazenamento uso, transporte e eliminação estão sujeitas aos regulamentos e à licenciada Comissão de Regulação Nuclear ou do Estado respectivo de acordo com a lei em vigor. Tratar os materiais radioactivos de acordo com a regulamentação da sua licença, específica ou generalista. De modo a minimizar a exposição à radiação deve o utilizador seguir as instruções da publicação do Departamento Nacional de Padrões (Utilização segura de materiais radioactivos - Livro No. 92, publicado em Março de 1964) e publicações seguintes do Estado e Autoridades Federais. Limpar os derrames prontamente e descontamine as superfícies afectadas. Evitar os aerossóis. Elimine os lixos radioactivos de acordo com a regulamentação da licença. As licenças generalistas (portadores da licença NRC 483) podem eliminar os lixos sólidos radioactivos como lixo não radioactivo depois de remover os rótulos. Licenças Especificas (Licença NRC 313) devem ter em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do Código de Regulamentações Federais. Cada Estado deve referir a legislação em vigor aprovada para o seu território. As licenças generalistas podem eliminar os lixos radioactivos líquidos do tipo deste produto para um esgoto de laboratório. Os licenciados devem remover os rótulos dos frascos vazios de materiais radioactivos antes de os colocar no esgoto sólido. As licenças especificas podem eliminar pequenas quantidades de lixo radioactivo deste tipo de produto para o esgoto normal do laboratório. Ter em atenção as regulamentações em vigor para o seu laboratório. Materiais fornecidos: Preparação inicial devem ser evitados no manuseio dos reagentes fornecidos. Tubos revestidos com Anticorpos de Testosterona Total (TTT1) Tubos de polipropileno revestidos com anticorpos à testosterona embalados em sacos com fecho de segurança. Conservar refrigerado e protegido da humidade, selar os sacos cuidadosamente após cada abertura. Estável a 2–8°C até à data de validade inscrita na embalagem. Cor: Amarelo. TKTT1: 100 tubos. TKTT2: 200 tubos. TkTT5: 500 tubos. 125 I Testosterona Total (TTT2) 125 105 mL de testosterona marcada com I. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de aberto, ou até à data de validade inscrita no frasco. O frasco deve estar à temperatura ambiente (15–28C°) e ser adequadamente misturado por inversão antes do uso. TKTT1: 1 frasco. TKTT2: 2 frascos. TKTT5: 5 frascos Calibradores de Testosterona Total (TTC3–8) Seis frascos de calibradores de testosterona pronto para uso. O calibrador zero A contém 4,0 mL, e os calibradores remanescentes de B a F contém 1,0 mL cada. Estável, após a abertura, durante 30 dias a 2–8°C ou por 6 meses (aliquotado) a –20°C. TKTT1: 1 conjunto. TKTT2: 1 conjunto. TKTT5: 2 conjuntos Os calibradores contém respectivamente, 0, 20, 100, 400, 800 e 1 600 nanogramas de testosterona por decilitro (ng/dL) em soro humano processado; equivalente a: 0, 0,7, 3,5, 14, 28 e 55 nanomoles por litro (nmol/L). Pontos de calibração intermediários podem ser obtidos pela mistura dos calibradores em proporções apropriadas. Materiais Necessários mas não Fornecidos Contador Gama – compatível com os tubos normais (12x75 mm). Agitador Vórtex Tem sido observado que a Testosterona é absorvida por superfícies de borracha. Assim tampas e recipientes de borracha 42 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Hidrólise da Urina Ver preparação de amostra: secção Hidrólise da Urina. variações originadas pelos tipos de tubos. Consultar a secção Tipos de Amostras Alternativas para obter detalhes sobre os tubos que foram testados. Radioimunoensaio Tubos não revestidos de polipropileno (12x75 mm) – para uso como tubos T e NSB, disponíveis na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: PPO). Volume de Amostra: 50 µL por tubo. Micropipetas: 50 µL e 1,0 mL. Banho-maria – capaz de manter 37°C – nem forno ou bloco de calor são adequados. Espuma de decantação– disponível na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: FDR) Armazenamento: 7 dias à 2–8°C ou por 9 até 2 meses congelados à –20°C. Deixar as amostras atingirem a temperatura ambiente (15–28°C) e agitar suavemente ou por inversão. Aliquotar se necessário para evitar repetidos congelamentos/descongelamentos. Não descongelar as amostras por aquecimento em banho-maria. Controle de imunoensaios, com três níveis, baseado em soro humano, contendo testosterona como um dos mais de 25 constituintes ensaiados; disponíveis na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: CON6). Urina: Obter uma amostra de 24 horas, mantendo a espécime refrigerada durante a colheita. Anotar o volume total. A Menos que a análise não seja realizada imediatamente, reservar uma alíquota muito bem misturada adicionando 1,0 grama de ácido bórico por cada 100 mL de urina. Colheita Volume de amostra: 1,0 mL (para cada procedimento de hidrólise). Papel logit-log Soro e Plasma heparinizado: O paciente não necessita estar em jejum e nenhuma preparação especial é necessária. Colher o sangue por punção venosa em tubos comuns (sem anticoagulante) ou tubos heparinizados, anotando-se a hora da colheita, e separar o soro ou plasma heparinizado das células por centrifugação. O plasma com EDTA gera resultados os quais são em média por volta de 10% mais baixos. Armazenamento: 7 dias à 2–8°C ou 1 mês à –20°C. Preparo das Amostras: Hidrólise da Urina 1 Não utilizar tubos revestidos com anticorpo. 2 Recomenda-se o uso de uma ultra centrífuga para clarear amostras lipémicas. Amostras hemolisadas podem indicar tratamento incorrecto de uma amostra antes do envio para o laboratório; portanto os resultados devem ser interpretados com cuidado. Os tubos para colheita sanguínea de diferentes fabricantes, podem originar diferentes valores, dependendo dos materiais e aditivos, incluíndo gel ou barreiras fisicas, activadores do coágulo e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count Testosterona Total não foram ainda testados com todas as possiveis Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Rotular um tubo de vidro ou de plástico não recoberto para cada amostra de urina. Pipetar 1,0 mL de cada amostra de urina nos tubos apropriados. Se a amostra se apresentar turva ou se houver precipitado formado, primeiramente centrifugar a urina e trabalhar com o sobrenadante límpido. 3 Adicionar 200 µL de HCl concentrado (12N, não fornecido) a cada tubo. Tampar firmemente e incubar em banho de água fervente por 15 minutos. 4 Diluir cada amostra hidrolisada em 1/25 com o calibrador zero: por exemplo, adicionar 10 µL de amostra hidrolisada à 240 µL de calibrador zero. 43 Não utilizar água para diluir o hidrolisado; tem que se usar o calibrador zero. Continuar com o procedimento do radioimunoensaio como descrito abaixo no secção procedimento de radioimunoensaio. Caso não forem ensaiados imediatamente, os hidrolisados devem ser armazenados fortemente tampados à –20°C por não mais que 7 dias. Os volumes podem ser trocados, se desejado, desde que as proporções especificadas no procedimento de hidrólise permaneçam as mesmas. 2 Técnica de Radioimunoensaio Uma única curva de calibração fornece a base para a determinação da concentração de Testosterona no soro (ou plasma heparinizado) e na urina. Desta maneira, ambos, o hidrolisado urinário e amostras de soro, não tratadas, podem ser processados no mesmo ensaio. Os calibradores estão prontos para uso, somente as amostras de urinas devem ser submetidas à hidrólises, como descrita em preparação da amostra; Secção hidrólise da Urina. Todos os componentes devem estar à temperatura ambiente (15–28°C) antes do uso. 1 3 0 nmol/L 0 B 20 0,7 C 100 3,5 D 400 14 E 800 28 F 1 600 55 Pipetar 50 µL do calibrador zero A nos tubos NSB e A, e 50 µL de cada calibradores remanescentes, controles e amostra de paciente (soro ou plasma heparinizados) nos tubos preparados. Pipetar 50 µL de cada hidrolisado urinário nos tubos apropriadamente marcados. Pipetar directamente para a base dos tubos. Adicionar 1,0 mL de Tetosterona 125 Total I em todos os tubos. Misturar em vórtex. Laboratórios equipados com um pipetador diluidor adequado podem manusear os itens 2 e 3 simultaneamente, mas deve Ter o cuidado para evitar o arraste de amostra à amostra. Adicionar o 125 marcador I no espaço de 10 minutos após pipetar os calibradores, controles e amostras. Deixar os tubos T para as contagens (nº 6); pois os mesmos não necessitam mais processamento. Devido ao fato das ligações não especificas no método de Coat-A-Count serem geralmente baixas os valores de NSB podem ser omitidos sem comprometer a precisão ou controle de qualidade. 4 Incubar por 3 horas a 37°C. 5 Decantar vigorosamente. Removendo todo o líquido remanescente melhora-se bastante a precisão. Usar uma espuma de decantação, decante ou aspire o conteúdo de todos os tubos (excepto os T) e deixar invertidos durante 2 ou 3 minutos. Eliminar todas as gotas residuais com papel absorvente. 6 44 ng/dL A (MB) As amostras de pacientes das quais se esperam conterem concentrações de Testosterona superiores ao calibrador mais alto (1 600 ng/dL) devem ser diluídas com o calibrador zero. Tubos lisos: Rotular quatro tubos de polipropileno (não revestidos) de 12x75 mm – T (contagens totais) e NSB (ligações não especificas) em duplicado. Tubos revestidos: Rotular doze tubos revestidos com anticorpos de testosterona em tubos A (máxima ligação) e de B a F em duplicado. Rotular tubos revestidos de anticorpos adicionais também em duplicata, para os controles e amostras de pacientes. Calibradores Contar 1 minuto em contador gama. Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Cálculo e Controle de Qualidade Para calcular os resultados de concentrações de Testosterona Total duma representação logit-log da curva de calibração, deve em primeiro lugar calcular-se para cada par de tubos a média de NSB-contagens por minuto corrigidas: Contagens reais = (Média CPM) minutos (Média NSB CPM) Determine a ligação de cada par de tubos como porcentagem do máximo de ligação (MB), com o NSB-contagens por minuto corrigidas dos tubos A tidas como 100%: Percentagem de Ligação = (Contagens reais / Contagens MB reais) × 100 O cálculo pode ser simplificado omitindo a correcção para a ligação não especifica; amostras dentro da faixa de calibração originam virtualmente os mesmos resultados quando a Porcentagem de Ligação é calculada directamente da Média de CPM. Usando um papel milimétrico logit-log, represente a Porcentagem de Ligação no eixo vertical (probabilidade) contra a Concentração no eixo horizontal (logarítmico) para cada um dos calibradores diferentes de zero, e representar uma linha recta em função da trajectória destes pontos. Resultados de amostras desconhecidas podem então ser lidas nessa recta por interpolação. Apesar de outras aproximações serem aceitáveis, o cálculo do resultado pelo método logit-log acima descrito possui certas vantagens neste contexto – por exemplo, permite um fácil reconhecimentos dos pontos de calibração desviantes – pois o procedimento Testosterona Total Coat-ACount foi optimizado para a linearidade nesta representação. Amostras de Urina: Divida o resultado em ng/dL, como lida na curva de calibração por 100 para converter à ng/ml; então multiplique por 30 para obter a concentração de Testosterona em ng/ml, da amostra original de urina não hidrolisada. (Um factor de 30 é usado em razão das amostras de urina serem diluídas em 1,2 ácido hidrocloridrico, e então em 1 para 25 com o calibrador Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) zero). Multiplique pelo volume total em litros para reportar a Testosterona de 24 horas como sendo em microgramas por dia. Manutenção dos Registros: È boa prática laboratorial registrar para cada ensaio o número de lote dos componentes usados, bem como as datas de quando foram inicialmente reconstituídas ou abertas. Manuseio da Amostra: As instruções para manuseio e armazenagem das amostras dos pacientes e dos componentes devem ser cuidadosamente observadas. Diluir as amostras de soro do paciente e as amostras de plasma heparinizado dos quais se esperam conterem concentrações de Testosterona superiores ao calibrador mais alto (1 600 ng/dL) com o calibrador zero antes do ensaio. Todas as amostras incluindose os calibradores e controles devem ser ensaiadas em duplicata. É uma boa prática o uso de micropipetas com ponteiras descartáveis, trocando as mesmas entre as amostras, de maneira a evitar a contaminação. Pares de tubos controles podem ser espaçados ao longo do ensaio para auxiliar a verificação da ausência de queda significante. Inspeccionar os resultados para a sua concordância dentro dos pares de tubos, e evitar o arraste entre as amostras. Tem se demonstrado que a Testosterona pode ser absorvida por superfícies de borracha, assim recipientes de borracha e suas tampas devem ser evitados para o manuseio dos reagentes fornecidos. Controles: Controles (ou pools de soros) com pelo Menos dois níveis de concentração de Testosterona Total (baixo e alto) devem ser rotineiramente ensaiados como desconhecidos, e os resultados devem ser plotados dia a dia como descrito por Westgard JO, et al. A multi rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27-493-501). A repetição das amostras é uma ferramenta adicional disponível para a monitoração da precisão interensaio. Cálculo dos Resultados: É uma boa prática a construção de um gráfico da curva de calibração como um acompanhamento visual das transformações usadas, ainda que os cálculos sejam feito por computador. Ver 45 Davis Se et al, (Processamento dos dados de Radioimunoensaio com um pequeno calculador programável. J Immunoessay 1980; 1: 15-25; and Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Parâmetros de Q.C. Nós recomendamos o acompanhamento destas medidas de performance: T = Contagens Totais (como contagens por minuto) %NSB = 100 × (Média Contagens NSB / Contagens Totais) %MB = 100 × (Contagens reais / Contagens Totais) E os 20, 50 e 80 porcento "intercept," onde 20% = Concentração a 20 por cento de Ligação, etc. Exemplo de Ensaio: Apenas para ilustração, não para calcular resultados de outro ensaio. (Ver tabela “Exemplo de Ensaio”.) Valores de Referência Como um estudo de faixa de referência, amostras de soro de 87 homens e amostras de soro de 81 mulheres foram ensaiadas pelo procedimento de Testosterona Total Coat-A-Count, com os seguintes resultados em ng/dL. n Mediana Faixa Central Faixa (ng/dL) de 95% Absoluta Mulheres Ovulantes 41 24 ND–80 ND–81 Contraceptivos Orais 13 15 — ND–28 PósMenopausa 27 20 4,0–62 4,0–74 20–49 anos 68 630 > 50 anos 19 427 Homens 262–1 593 245–1 836 181–758 181–772 ND: não detectável A comparação do procedimento de Testosterona Total Coat-A-Count 50 µL com o seu predecessor sugere as seguintes faixas de referência para Testosterona Urinária: 25 a 125 µg/dia (com uma mediana de aproximadamente 75 µg/dia) para homens adultos, e 5 a 35 µg/dia (com uma mediana de 46 aproximadamente 15 µg/dia) para mulheres adultas. Os laboratórios devem considerar estes resultados apenas como directrizes. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência. Características do Ensaio Ver tabelas e gráficos para os dados representativos do performance do kit de Testosterona Total Coat-A-Count. Os resultados de Testosterona Total nas secções abaixo estão expressos como ng/dL. A não ser de outra maneira especificado os resultados das secções abaixo foram gerados em amostras de soro. Factor de conversão: ng/dL × 0,03467 → nmol/L Faixa reportável: 4 – 1 600 ng/dL Calibração: 20 – 1 600 ng/dL (0,7 – 55 nmol/L). Sensibilidade Analítica: 4 ng/dL (0,14 nmol/L). Precisão Intra-ensaio (dentro do ensaio): Um perfil de precisão da dose está mostrado, baseado em 17 a 21 graus de liberdade por ponto e descreve os CVs que são esperados para as amostras ensaiadas em duplicata. (Ver gráfico Perfil de Precisão). Precisão Inter-ensaio (ensaio a ensaio): As estatísticas foram calculadas para cada 7 amostras dos resultados de pares de tubos em diferentes ensaio (Ver tabela Precisão Interensaio). Especificidade: O antisoro da Testosterona Total Coat-A-Count é altamente específico para a Testosterona. A porcentagem de reacção cruzada foi calculada em base peso a peso para aproximadamente 50% de ligação. (Ver tabela Especificidade para os dados representativos. Linearidade: As amostra foram doseadas sob várias diluições. (Consulte a tabela “Linearidade” para dados representativos). Efeito fim-de-série: Nenhum até aproximadamente 300 tubos. (Ver tabela “Efeito fim-de-série”). Recuperação: Amostras misturadas na proporção de 1 para 19 com 3 soluções de Testosterona (5 000, 10 000 e Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) 20 000 ng/dL), foram ensaiadas. (Ver tabela de Recuperação para dados representativos). Bilirrubina: A presença de bilirrubina em concentrações até 200 mg/L não tem efeito em resultados, dentro da precisão do ensaio. Hemólise: A presença de eritrócitos em concentrações até 30 µL/mL não tem efeito no resultado, dentro da precisão do ensaio. Lipemia: O calibrador mais alto (1 600 ng/dL) foi diluído em série com um “pool” de soro lipêmico. Isto causa um grau crescente de lipemia como um decréscimo na concentração de Testosterona (devido primariamente a contribuição do calibrador). Estas diluições foram ensaiadas ao longo de um “pool” lipêmico não misturado. Os resultados mostraram que lipemia severa não possui efeito clinicamente significante no ensaio. Tipo de amostra alternativa: Para determinar o quanto os anticoagulantes interferem com o ensaio, foi colectado sangue de 23 voluntários em tubos lisos, heparinizados e a vácuo com EDTA. Todas as amostras foram ensaiadas pelo procedimento Coat-A-Count. Por Regressão Linear. (Heparina) = 1,02 (Soro) – 1,0 ng/dL r = 0,998 Médias: 273 ng/dL (Heparina) 270 ng/dL (Soro) (EDTA) = 0,91 (Soro) + 3,0 ng/dL r = 0,997 Médias: 250 ng/dL (EDTA) 270 ng/dL (Soro) Os resultados mostram que o plasma heparinizado gera virtualmente os mesmos resultados que o soro no procedimento Testosterona Total Coat-ACount, enquanto que o plasma com EDTA gera resultados que são me média por volta de 10% inferiores. Efeitos da SHBG: Para verificar o quanto este procedimento é afectado pela variação no nível endógeno da globulina ligadora dos hormónios sexuais (SHBG), os calibradores do kit de SHBG IRMA Count foram, cada um deles, misturados em 1 em 201 com soluções de Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Testosterona, e ensaiados, ambos misturados e não misturados, pelo procedimento Testosterona Total Coat-ACount. A quarta coluna mostra os valores aparentes de Testosterona (em ng/dL) dos calibradores de SHBG misturados, após a correcção para as concentrações observadas de Testosterona nos calibradores não misturados. A coluna final foi calculada tomando-se como 100% a média corrigida de concentração aparente de Testosterona dos calibradores de SHBG misturados. (Ver tabela Efeito do SHBG para os dados representativos). Efeito de Proteína: Para simular várias concentrações de proteína, foram realizados experimentos nos quais 2,0 mL de alíquotas de “pools” de soro humano foram congelados e secos, sendo então reconstituídos com vários volumes de água (1,3, 2,0, 3,0 mL). Cada alíquota reconstituída foi então ensaiada pelo procedimento Testosterona Total Coat-ACount. (O factor de correcção para o volume de reconstituição está tabulado abaixo). Os valores observados e esperados de Testosterona Total estão tabulados em ng/dL. (Ver tabela Efeito de Proteína para dados representativos). Comparação de Métodos: Em um estudo de comparação de pacientes, o kit de Testosterona Total Coat-A-Count, foi comparado à dois kits de Testosterona por radioimunoensaio comercialmente disponíveis, um é um ensaio duploanticorpo (Kit A) e o outro um ensaio com tubo revestido (Kit B). Os resultados de 37 amostras de soro de homens, e 46 de mulheres foram combinados, gerando as seguintes relações. (TKTT) = 1,10 (Kit A) + 19 ng/dL r = 0,981 Médias: 269 ng/dL (TKTT) 227 ng/dL (Kit A) (TKTT) = 1,23 (Kit B) + 16 ng/dL r = 0,987 Médias: 269 ng/dL (TKTT) 206 ng/dL (Kit B) Assistência Técnica Por favor contacte o seu Distribuidor Nacional. www.siemens.com/diagnostics 47 O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare Diagnostics Inc. está registado sob a norma ISO 13485:2003. Coat-A-Count® and IRMA-Count® are trademarks of Siemens Healthcare Diagnostics. ©2010 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. All rights reserved. Origin: US Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Los Angeles, CA 90045 USA Siemens Healthcare Diagnostics Ltd. Sir William Siemens Sq. Frimley, Camberley, UK GU16 8QD 2010-10-21 PITKTT – 8 Changes in this Edition: cc#19759: In Materials Required But Not Provided section, added FDR catalog number for foam decanting rack and PPO catalog number for polypropylene tubes; removed “available from Siemens” claim for graph paper ZP797. Understanding the Symbols Understanding the Symbols En English Erklärung der Symbole De Deutsch Descripción de los símbolos Es Español Explication des symboles Fr Français Comprensione dei simboli It Descrição dos símbolos Pt Português Italiano The following symbols may appear on the product labeling: / Die folgenden Symbole können auf dem Produktetikett verwendet werden: / Los siguientes símbolos pueden aparecer en la etiqueta del producto: / Les symboles suivants peuvent apparaître sur les étiquettes des produits : / Sull'etichetta del prodotto possono essere presenti i seguenti simboli: / Os seguintes símbolos podem aparecer no rótulo dos produtos: 48 Symbol Definition En: In vitro diagnostic medical device De: Medizinisches Gerät zur In-vitro Diagnose Es: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Fr: Dispositif médical de diagnostic in vitro It: Dispositivo medico per diagnostica in vitro Pt: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro En: Catalog Number De: Katalog-Nummer Es: Número de referencia Fr: Numéro de référence catalogue It: Numero catalogo Pt: Número de catálogo En: Manufacturer De: Hersteller Es: Fabricante Fr: Fabricant It: Produttore Pt: Fabricante En: Authorized Representative in the European Community De: Autorisierte Vertretung in der Europäischen Union Es: Representante autorizado en la Unión Europea Fr: Représentant agréé pour l’Union européenne It: Rappresentante autorizzato nella Comunità europea Pt: Representante Autorizado na Comunidade Europeia En: CE Mark De: CE-Kennzeichen Es: Símbolo de la CE Fr: Marque CE It: Marchio CE Pt: Marca CE En: CE Mark with identification number of notified body De: CE-Kennzeichen Identifikationsnummer der benannten Stelle Es: Marca de la CE con número de identificación del organismo notificado Fr: Marque CE avec numéro d’identification du corps notifié It: Marchio CE con numero identificativo dell'ente notificato Pt: Marca CE, com número de identificação do órgão notificado Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) Symbol Definition En: Consult instructions for use De: Bedienungshinweise beachten Es: Consulte las instrucciones de uso Fr: Consulter le mode d’emploi It: Consultare le istruzioni per l'uso Pt: Consulte as instruções de utilização Symbol Definition En: Lower limit of temperature (≥2°C) De: Mindesttemperatur (≥2°C) Es: Temperatura maxima (≥2°C) Fr: Limite inférieure de température (≥2°C) It: Limite inferiore di temperature (≥2°C) Pt: Limite inferior de temperatura (≥2°C) En: Caution! Potential Biohazard De: Vorsicht! Biologisches Risikomaterial Es: ¡Precaución! Peligro Biológico Potencial Fr: Avertissement ! Risque biologique potentiel It: Attenzione! Potenziale Pericolo Biologico Pt: Precaução! Potenciais Riscos Biológicos En: Do not freeze (> 0°C) De: Nicht einfrieren (> 0°C) Es: No congelar (> 0°C) Fr: Ne pas congeler (> 0°C) It: Non congelare (> 0°C) Pt: Não congele (> 0°C) En: Keep away from sunlight De: Vor Sonneneinstrahlung schützen Es: Mantener protegido de la luz solar Fr: Maintenir hors de portée de la lumière du soleil It: Non esporre alla luce del sole Pt: Manter protegido da luz solar En: Radioactive Materials De: Radioaktives Material Es: Materiales radiactivos Fr: Matériaux radioactifs It: Materiali radioattivi Pt: Materiais Radioactivos En: Caution De: Vorsicht Es: Precaución Fr: Avertissement It: Attenzione Pt: Precaução En: Temperature limitation (2–8°C) De: Temperaturgrenze (2–8°C) Es: Limitación de la temperatura (2–8°C) Fr: Limites de température (2–8°C) It: Limiti di temperatura (2–8°C) Pt: Limites de temperatura (2–8°C) En: Upper limit of temperature (≤ -20°C) De: Obere Temperaturgrenze (≤ -20°C) Es: Limitación superior de la temperatura (≤ -20°C) Fr: Limite supérieure de température (≤ -20°C) It: Limite superiore di temperatura (≤ -20°C) Pt: Limite máximo de temperatura (≤ -20°C) Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21) LOT En: Batch code De: Chargenbezeichnung Es: Código de lote Fr: Numéro de code du lot It: Codice lotto Pt: Código de lote En: Contains sufficient for (n) tests De: Es reicht für (n) tests Es: Contiene material para (n) pruebas Fr: Suffisant pour (n) tests It: Contiene materiale sufficiente per (n) test Pt: Contém o suficiente para (n) testes 2008-01 En: Date format (year-month) De: Datumsformat (Jahr-Monat) Es: Formato de fecha (año-mes) Fr: Format de la date (année-mois) It: Formato data (anno-mese) Pt: Formato de data (ano-mês) En: Use by De: Verwendbar bis Es: Fecha de caducidad Fr: A utiliser avant It: Usare entro Pt: Use até 49 Symbol Definition En: Harmful De: Gesundheitsschädlich Es: Nocivo Fr: Nocif It: Nocivo Pt: Nocivo En: Corrosive De: Ätzend Es: Corrosivo Fr: Corrosif It: Corrosivo Pt: Corrosivo En: Toxic De: Giftig Es: Tóxico Fr: Toxique It: Tossico Pt: Tóxico En: Dangerous for the environment De: Umweltgefährlich Es: Peligroso para el medio ambiente Fr: Dangereux pour l'environnement It: Pericoloso per l'ambiente Pt: Perigoso para o ambiente 50 Coat-A-Count Total Testosterone (PITKTT-8, 2010-10-21)
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