Textbausteine Arbeitsanleitung
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Instruções de Utilização Spermatozoa-Ab ELISA Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de autoanticorpos contra antigénios da superfície dos espermatozóides em soro humano. RE52029 96 2-8°C I B L I N T E R N A T I O N A L Flughafenstrasse 52a D-22335 Hamburg, Germany Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 G M B H [email protected] www.IBL-International.com Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) 1. PORTUGUÊS APLICAÇÕES Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de autoanticorpos contra antigénios da superfície dos espermatozóides em soro humano. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO Na sociedade ocidental, a incidência de casais inférteis é estimada em 10-15% da população. O papel dos anticorpos anti-esperma na infertilidade ainda é controverso, dados os métodos diferentes de determinação. Entre os métodos clássicos para detecção de anticorpos anti-esperma, o teste de aglutinação de espermatozóides e do teste de imobilização de espermatozóides têm sido amplamente aplicados. Estes testes e outras variantes de testes de aglutinação são demorados e inconsistentes relativamente ao seu desempenho. Os testes ELISA de anticorpos anti-esperma apresentam diversas vantagens sobre os métodos convencionais. O teste ELISA para anticorpos de espermatozóides IBL combina essas vantagens com alta sensibilidade e especificidade. O teste é de fácil execução e permite o rastreio de grandes quantidades de soro relativamente a infertilidade imunológica. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O teste é baseado num ELISA não-competitivo. Antigénios da superfície dos espermatozóides são extraídos de uma “pool” por um método relacionado com o de Alexander (1984) e com eles revestem-se os poços de tiras de microplaca. Todas as amostras são incubadas em duplicado tanto em poços revestidos como em poços não revestidos (placa amarela). As tiras são incubadas com soros diluídos de pacientes, e após um passo de lavagem, são novamente incubadas com imunoglobulina anti-humana (IgA, IgG and IgM) conjugada com peroxidase. Após um passo final de lavagem, adiciona-se substrato enzimático (TMB) e determina-se o desenvolvimento de cor num leitor de ELISA. A intensidade de cor nos poços é proporcional às imunoglobulinas ligadas. A ligação nãoespecífica é determinada individualmente para cada soro e subtraída da ligação total. Os resultados são lidos a partir de uma curva padrão e expressos em Unidades/mL (mU/100 µL). 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. 10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. Version 2015-11 1/6 Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) 5. PORTUGUÊS ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. A microplaca é estável até 6 sem. na embalagem aberta mas firmemente resselada, quando armazenada a 2–8°C. 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Armazenamento: Estabilidade: 7. 2-8°C 24 h ≤ -20°C (Alíquotas) 6 meses Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. MATERIAIS FORNECIDOS Quantida de Símbolo 1 x 12x8 MTP 1 x 100 µL Componente Microplaca Tiras separáveis. Revestido com antigénios da superfície dos espermatozóides. ENZCONJ CONC Conjugado Enzimático, Concentrado (601x) Contêm: anti-humano IgG, IgA, IgM, conjugado com peroxidase. Padrão, liofilizado 3 x 1 mL CAL LYO 3 x 1 mL CONTROL LYO 3 x 20 mL DILBUF LYO Para concentrações exactas consultar etiquetas ou certificado de Controlo de Qualidade. Para preparação do conjunto de padrões. Controlo, liofilizado Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos. Tampão de Diluição, liofilizado 2 x 50 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem, Concentrado (20x) Contêm: tampão fosfato, Tween, estabilizantes. 2 x 15 mL TMB SUBS Solução de Substrato TMB 1 x 15 mL TMB STOP Solução de Paragem TMB 1 x 12x8 MTP NSB 5x FOIL Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes. Pronto a usar. 1 M H2SO4. Microplaca (NSB) 8. Colorido Amarelo. Tiras separáveis. Para determinação de ligação não-específica. Bloqueado com antigénios não específicos. em embalagem de alumínio com dessecante. Película Aderente MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 0-20 µL; 10-100 µL; 100-1000 µL 2. Tubos de ensaio de vidro descartáveis (12 x 75 mm) 3. Incubador, 37 °C 4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência 600-650 nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro Version 2015-11 2/6 Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) 9. PORTUGUÊS NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Alguns componentes contêm volume de solução ≤ 250 µL. Assegurar que a solução está toda no fundo do recipiente antes de abrir. 5. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 6. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 7. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 8. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 9. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE 10.1. Preparação de componentes liofilizados ou concentrados Os volumes especificados abaixo são suficientes para um procedimento em que se use 4 tiras revestidas e 4 não revestidas (32 determinações) Diluir / dissolver Componente 30 mL WASHBUF CONC ad 600 mL agua bidest. 1:20 15 µL ENZCONJ CONC com 9 mL DILBUF (diluído) 1:601 DILBUF LYO CONTROL LYO CAL LYO Version 2015-11 Diluente Relação com WASHBUF 20 mL (diluído) com WASHBUF 1 mL (diluído) com WASHBUF 1 mL (diluído) Observações Dissolver precipitados de fosfato a 18-25ºC. Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez. Armazenamento Estabilidade 2-8°C 4 semanas 18-25°C 2h 2-8°C ≤ -20°C 2 dias 2 meses 2-8°C ≤ -20°C 2 semanas 4 semanas 2-8°C ≤ -20°C 2 semanas 4 semanas 3/6 Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) PORTUGUÊS 10.2. Preparação de Padrões Dissolver o conteúdo de um frasco de padrão liofilizado com 1 mL de Tampão de Lavagem preparado para obter a solução stock padrão (S5). Diluir S5 em série, com Tampão de Diluição, de acordo com o seguinte esquema: S5 = 500 µL de padrão recém dissolvido S4 S3 S2 S1 S0 = 500 µL S5 + 500 µL DILBUF = 500 µL S4 + 500 µL DILBUF = 500 µL S3 + 500 µL DILBUF = 500 µL S2 + 500 µL DILBUF = 500 µL DILBUF (diluído) (diluído) (diluído) (diluído) (diluído) = Para a concentração exacta consulte o certificado de análise ou frasco rótulo. = Concentração de S5 / 2 = Concentração de S5 / 4 = Concentração de S5 / 8 = Concentração de S5 / 16 = 0 mU/100 µL 500 µL S4 500 µL S5 500 µL S3 500 µL S2 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL S4 S3 S2 S1 com DILBUF (diluído) Relação 500 µL DILBUF S5 S0 10.3. Diluição de Amostras Amostra Soro diluir geralmente 1:51 Observações Armazenamento Estabilidade p.ex. 10 µL + 500 µL 2-8°C 24 h Misturar sem fazer espuma. Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas. 11. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. PROCEDIMENTO DO ENSAIO Prender as tiras de microplaca revestidas e não revestidas (NSB, amarelo) alternadamente no suporte. Para cada Padrão, Controlo e amostra usar 2 dos poços revestidos e 2 dos não revestidos (amarelos). Pipetar 100 µL de cada Padrão, Controlo e amostra diluída para os respectivos poços. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 1 h a 37°C. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 1 h a 37°C. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 3 x com 250 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço. Incubar 10-15 min à TA (18-25°C). Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução Stop TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência: 600-650 nm) nos 30 min a seguir à pipetagem da Solução Stop. Version 2015-11 4/6 Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) 12. PORTUGUÊS CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Corrigir o valor de D.O., do poço revestido, para cada padrão, controlo e amostra com o valor de D.O. correspondente ao poço NSB. Calcular o valor médio dos duplicados. Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. Devido à diluição das amostras os valores obtidos têm que ser multiplicados pelo factor 0.5 para obter as concentrações em U/mL das amostras não diluídas. No caso de amostras diluídas ainda mais, os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Curva de Calibração Típica 2,500 Padrão S0 S1 S2 S3 S4 S5 14. Sperm-Ab. (mU/100 µL) 0.0 31.3 62.5 125 250 500 Média DOrevistido 0.066 0.275 0.493 0.895 1.371 2.200 Média DONSB 0.009 0.011 0.009 0.009 0.018 0.030 DOrevistido - DONSB 0.057 0.264 0.484 0.886 1.353 2.170 OD 450 nm (Exemplo. Não usar para cálculos!) 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 1 10 100 Sperm Ab (mU/100 µL) 1000 VALORES ESPERADOS Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: < 150 mU/100 µL Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade. 15. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO. Version 2015-11 5/6 Spermatozoa-Ab ELISA (RE52029) 16. PORTUGUÊS DESEMPENHO Especificidade Analítica Não foram encontradas reactividade cruzadas com as substâncias típicas testadas. (Reactividade cruzada) Sensibilidade Analítica 0.14 mU/100 µL Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD (Limite de Detecção) Intervalo (mU/100 µL) CV (%) Precisão 47.0 – 151.0 2.7 – 11.9 Intra-Ensaio 42.0 – 130.0 7.9 – 15.4 Inter-Ensaio Linearidade Recuperação Comparação Método Usado versus ELISA 17. Intervalo (mU/100 µL) Diluição em Série até Intervalo (%) 31.4 – 376.9 1:8 95 - 110 Média (%) Intervalo (%) % Recuperação após adição de “reforço” 90.7 77 - 101 Teste IBL =4.0698 x ELIAS ELISA + 1.0441 r = 0.869; n = 38 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. R. Clayton and H. Moore: Immunology and immunpathology of the male genital tract; Human Reproduction Update. Vol.7. No.5. pp. 457 – 459. 2001 2. American society for reproductive medicine: patient´s fact sheet: Diagnostic Testing for Male Factor Infertility; Revised 8/2001 3. Gianni Forti and Csilla Krausz: Evaluation and Treatment of the Infertile Couple; Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. Copyright © 1998 by The Endocrine Societ.Vol. 83. No. 12. pp 4177– 4188 4. F.M. Helmerhorst. M.J.J Finken. J.J Erwich: Antisperm antibodies: Detection assays for the antibody: What do they test?; Human reproduction. Vol.14. No.7. pp 1669 – 1673. 1999 5. Dona M. Lynch and Stephan E. Howe: Comparison of a Direct and Indirect ELISA for Quantitating Antisperm Antibody in Semen; Journal of Andrology July/August 1987; Vol.8. No.4; pp 215 – 220 6. Dana A. Ohl. M.D. and Alan C. Menge. Ph.D.: Assessment of sperm function and clinical aspects of impaired sperm function; Frontiers in Bioscience 1. e96-108. 1 September 1996; pp 96 - 108 Version 2015-11 6/6 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.: LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC LYO IVD Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: E-MAIL: WEB: Tel.: E-MAIL: WEB: + 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11 [email protected] http://www.IBL-International.com +1 (416) 645 -1703 Fax: -1704 [email protected] http://www.IBL-International.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20
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