Cristalização de Macromoléculas Biológicas

Cristalização de
Macromoléculas Biológicas
Laboratório de Sistemas Biomoleculares
Departamento de Física
IBILCE-UNESP
Aspectos Gerais
A cristalografia de raios X revela as posições
tridimensionais da maioria dos átomos em uma
molécula de proteína.
As características da estrutura terciária
revelam muito sobre as funções das proteínas
e suas evoluções.
Para que obter cristais de
macromoléculas?
O objetivo da cristalização de uma
macromolécula biológica, tal como, proteína ou
ácido nucléico, é o estudo estrutural dessas
macromoléculas, pelo método de difração de
raios X.
Resolução de Estrutura
Purificação da Macromolécula
Cristalização
Coleta de Dados
Densidade Eletrônica
Refinamento do Modelo
Estrutura
•Toxinas:problemas
vasculares, processos
inflamatórios, mecanismos de dor, processos
alérgicos, asma bronquial
drogas anti-trombóticas e drogas anti-convulsivante
Estrutura cristalográfica de toxinas do escorpião Hottentotta
judaica (esquerda) e da bactéria Clostridium tetani.
• Quinases: Sua função é ativar ou desativar cada etapa do
ciclo celular, desde a duplicação do DNA até a separação em
duas células
→ drogas contra o câncer.
Estrutura terciária da quinase dependente de ciclina humana (CDK).
• Hemoglobinas: compreensão dos mecanismos funcionais de
Hbs normais e mutantes, bem como, Hbs talassêmicas e
relacionadas à anemia.
Estrutura quaternária de hemoglobinas, do lobo guará (esquerda) e
humana (direita).
Princípios Gerais para
Cristalização de
Macromoléculas Biológicas
Parte crítica: obter cristais.
Cristais de INHA de Mycobacterium tuberculosis, PNP humana e
Hemoglobina do peixe Hoplosternum littorale.
Pureza da Macromolécula
A purificação
cristalização;
•
é
um
ponto
importante
para
a
A cristalização de uma amostra de proteína não pura,
resulta em cristais pequenos e mal formados;
•
Uma amostra de macromolécula deve estar, no mínimo,
97% pura e um cristal deve ter, no mínimo, 0,2mm de
tamanho.
•
Cristais pequenos e/ou mal formados
Estabilização e
Armazenamento
Armazenadas em soluções com propriedades
próximas às do meio celular;
•
A desnaturação é minimizada evitando-se
condições extremas de pH e temperatura;
•
Agentes bactericidas ou fungicidas podem ser
adicionados.
•
Nucleação, Crescimento e
término do crescimento.
•
Nucleação: formação dos primeiros agregados
ordenados. Requer um estado de supersaturação.
•
Crescimento: É o aumento do cristal.
•
Término
do
crescimento:
Desconsiderando
algumas causas, tais como, remoção da
macromolécula do meio de cristalização, tem-se:
defeitos de crescimento, defeitos das faces,
envelhecimento da macromolécula, etc.
Cristais imperfeitos
Fatores que Afetam a
Cristalização
Temperatura: a solubilidade de uma proteína é
dependente da temperatura, assim, é necessário que os
experimentos de cristalização sejam realizados em
temperatura constante;
•
•pH:
proteínas são polieletrólitos com uma carga líquida
que varia conforme o pH. Quando a carga líquida de uma
proteína é nula, a proteína apresenta uma maior
facilidade em se agregar;
• Compostos Orgânicos e Polímeros: os polietilenoglicóis
influenciam na cristalização diminuindo a atividade de água,
ou seja, diminuindo a quantidade destas moléculas em
solução e assim, a solução é levada a um estado de
supersaturação;
Força Iônica: Os sais podem diminuir ou aumentar a
solubilidade de uma proteína;
Efeito de Solubilização por
Sais
Salting-in
Os íons interagem com os grupos iônicos das moléculas,
diminuindo as interações soluto-soluto e, aumentando a
solubilidade.
Representação esquemática da solubilização por salting-in.
Salting-out
Os íons atraem as moléculas de água
resultando em menor disponibilidade das
mesmas para realizar interações com as
moléculas de proteína.
Diagrama de fases de
Macromoléculas Biológicas
Representação do diagrama de fases de macromoléculas biológicas
Técnicas de Cristalização
O método da Matriz Esparsa
•
Dra. Jaru Jancarick (UC Berkeley);
•
Diversas condições são testadas;
•Três
parâmetros como variáveis principais:
pH, aditivos e agentes precipitantes
Tabela 1. Componentes do método da matriz esparsa.
Sais
Tartarato de Sódio e Potássio; Fosfato de Amônio; Sulfato de Amônio;
Acetato de Sódio; Sulfato de Lítio; Formiato de Sódio e Potássio; Citrato de
Sódio; Formiato de Magnésio.
Não Voláteis
MDP;PEG 400; PEG1500; PEG 4000; PEG 8000
Voláteis
2-Propanol
Mistura
Sulfato de Amônio+PEG; 2-Propanol + PEG
Aditivos
Cloreto de Cálcio, Citrato de sódio, Cloreto de Magnésio, Acetato de
Amônio, Sulfato de Amônio, Acetato de Magnésio, Acetato de Zinco e
Acetato de Cálcio.
Faixa de pH
4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5
Kits para cristalização da
Hampton Research®
Screens
Cristalização em Batch
A macromolécula é misturada ao agente cristalizante
atingindo a supersaturação instantaneamente.
Representação da cristalização em batch.
Cristalização por Difusão de
Vapor
A supersaturação é alcançada por meio da difusão
das espécies voláteis.
Representação da montagem de uma gota de cristalização.
Passos para montagem de um placa de cristalização
Análise das gotas de cristalização
Cristalização por Diálise
A solução precipitante pode ser facilmente trocada.
Cristalização de proteínas por diálise.
Cristalização por
Microdiálise
Cristalização de proteínas pelo processo de microdiálise.
Melhoria das Condições
de Cristalização
Passo 1) Diminuição da concentração da macromolécula.
Após uma semana, se não houver melhora nos cristais:
Passo 2) Manter a concentração da macromolécula biológica e
abaixar a concentração do agente precipitante.
Após uma semana, se ainda não houver melhora nos cristais:
Passo 3) Tentar microssemeadura ou macrossemeadura, ou
tentar variar a temperatura.
Cristais adequados para coleta de dados de difração
de raios X
Como identificar cristais de proteínas?
Cristais de
proteína
corados com
Izit
Cristalização
Coleta de dados
LNLS
Análise
Resolução da
estrutura
cristalográfica
Difração de raios X
Montagem dos
cristais
Analisando o modelo
Qual o grande objetivo da
cristalografia de proteínas?
Cristalizando proteínas na presença de ligantes
Há duas alternativas:
• por co-cristalização, incubando-se a proteína com
o(s) ligante(s)
• Soaking, adicionando o(s) ligante(s) no cristal já
formado
Desenho de Drogas
Sítio ativo da PNP humana, na presença do
substrato e na presença de um inibidor.
Inosina
Imucilina H
Mapa de densidade
eletrônica da região do
sítio ativo da PNP
humana na presença de
ligantes.