Samenvatting

Samenvatting
121
Samenvatting
Actinomyceten zijn Gram-positieve bacteriën die vaak als sporenvormende,
filamenteuze bodembacteriën voorkomen. Actinomyceten staan bekend om het grote
aantal secundaire metabolieten die ze kunnen vormen. In tegenstelling tot de primaire
metabolieten zijn secundaire metabolieten verbindingen die niet noodzakelijk zijn voor
de groei van een organisme. Secundaire metabolieten zijn toch belangrijke verbindingen
omdat vele van deze stoffen nuttig gebruikt kunnen worden bijvoorbeeld als antibioticum,
tumorremmer of onkruidverdelger.
Het merendeel van de, tot nog toe bekende, bacteriële secundaire metabolieten wordt
geproduceerd door actinomyceten. Een hypothese is dat de synthese van secundaire
metabolieten een gevolg is van een niet (goed) gereguleerd primair metabolisme. Een te
hoge concentratie van intermediaren uit het primaire metabolisme zou dan omgezet
kunnen worden in secundaire metabolieten.
Het doel van dit promotie onderzoek was het bestuderen van de regulering van
onderdelen van het glucose metabolisme in twee actinomyceten, Amycolatopsis
methanolica en Streptomyces coelicolor A3(2). In eerste instantie is de aandacht gericht
geweest op het bestuderen van die enzymen waarvan bekend is dat de activiteiten over
het algemeen gereguleerd worden, namelijk fosfofructokinase (PFK), fosfoglyceraat
mutase (PGM) en pyruvaat kinase (PK).
De analyse van de glycolyse in A. methanolica heeft bijzondere aspecten onthuld. In
plaats van de “gewone” ATP-PFK die normaal in bacteriën gevonden wordt is er een
pyrofosfaat (PPi) afhankelijk PFK eiwit gevonden. Dit enzym werd ook in andere
actinomyceten uit de familie van de Pseudonocardiaceae aangetoond. In een andere
groep van de actinomyceten, de Streptomycetaceae, werd echter een ATP-PFK
gedetecteerd. De PPi-PFK activiteit werd tot nog toe vaak gevonden in anaerobe
bacteriën, protisten en in planten maar over het algemeen niet in aerobe bacteriën. De
aanwezigheid van PPi-PFK in organismen gaat vaak samen met de aanwezigheid van
andere PPi-afhankelijk eiwitten zoals fosfoenolpyruvaat carboxytransfosforylase of
pyruvaat dikinase. Deze organismen hebben dan vaak een lage pyrofosfatase activiteit
zodat er voldoende PPi beschikbaar is. Het goedkope afvalprodukt, PPi, vervangt het
kostbare ATP in sommige enzymatische reacties hetgeen energetisch voordeliger zou
kunnen zijn voor de cellen. De pyrofosfatase activiteit in A. methanolica is ongeveer even
hoog als die in organismen met PPi -afhankelijke enzymen maar lager dan in organismen
die deze enzymen niet bevatten.
De vergelijking van de volledige aminozuurvolgorde van het PPi-PFK eiwit van A.
methanolica met die van andere PFK eiwitten geeft aan dat PPi-PFK meer verwant is aan
de ATP-PFK eiwitten dan aan andere tot nog toe bekende PPi-PFK ewitten. Doordat het
PPi-PFK eiwit veel lijkt op het ATP-PFK eiwit van Escherichia coli kan een hypothetisch
model van de drie-dimensionale structuur worden gemaakt. Met behulp van dit model
122
Samenvatting
konden de aminozuren die waarschijnlijk betrokken zijn bij de binding van PPi
geïdentificeerd worden.
De fylogenetische analyses van PFK eiwitten maken een hypothese mogelijk over de
evolutie van deze eiwitten. Er is een duidelijk beeld ontstaan dat PFK enzymen twee
verschillende groepen vormen, ATP-PFK en PPi-PFK. De gemeenschappelijke
voorouder van deze twee groepen zou een simpel PFK eiwit kunnen zijn dat minder strikt
is in het gebruik van de fosfaatbron en waarvan de activiteit niet geremd wordt.
De andere twee glycolytische enzymen die bestudeerd werden in A. methanolica zijn
pyruvaat kinase (PK) en fosfoglyceraat mutase (PGM). Het PK eiwit werd
gekarakteriseerd; de activiteit hiervan wordt geïnhibeerd door Pi en ATP. De PGM
activiteit van A. methanolica werd geactiveerd door 2,3-bisfosfoglyceraat; de
N-terminale aminozuurvolgorde van PGM1 had overeenkomsten met die van andere
PGM eiwitten.
Een gen uit A. methanolica, coderend voor een mogelijk PGM eiwit, werd
geïdentificeerd en in E. coli tot expressie gebracht. De analyse van de PGM activiteit gaf
aan dat dit eiwit inderdaad codeert voor een 2,3-bisfosfoglyceraat afhankelijk PGM eiwit,
PGM2. Het molecuulgewicht van het PGM2 eiwit en de afgeleide aminozuurvolgorde
zijn echter niet gelijk aan die van het gezuiverde PGM1 eiwit. De aanwezigheid van twee
PGM eiwitten in A. methanolica wordt daardoor zeer waarschijnlijk. Biochemisch bewijs
voor de aanwezigheid van isoenzymen van PGM eiwitten werd in bacteriën nog niet
eerder gevonden.
Fylogenetische analyses van 2,3-bisfosfoglyceraat afhankelijke PGM eiwitten laten
zien dat er 2 groepen zijn: een groep waarin A. methanolica PGM2 samen met
hypothetische PGM eiwitten aanwezig is en een tweede groep waarin PGM eiwitten van
organismen aanwezig zijn waarvan de activiteit ook daadwerkelijk bewezen is. De
verwachting is dat als de aminozuurvolgorde van PGM1 bekend is dat deze dan in de
tweede groep terechtkomt, zoals de PGM eiwitten van Mycobacterium leprae.
Verschillende enzymen die in A. methanolica noodzakelijk zijn voor de groei op
methanol zijn ook noodzakelijk voor de groei op glucose. PFK, fructose-1,6-bisfosfaat
aldolase en triosefosfaat isomerase zijn de overeenkomstige enzymen die glucose of
methanol omzetten tot glyceraldehyde-3-fosfaat.
De activiteiten van triosefosfaat isomerase en fructose-1,6-bisfosfaat aldolase zijn bij
groei van A. methanolica op methanol hoger of gelijk aan de activiteiten tijdens groei op
glucose. De activiteit van PPi-PFK daalde bij groei op methanol echter tot een zeer lage
waarde. Tijdens de groei op methanol werd echter een ATP-PFK activiteit gevonden. Er
is aangetoond dat de ATP-PFK activiteit alleen wordt geïnduceerd als de
ribulosemonofosfaat cyclus noodzakelijk is voor de groei.
De resultaten van de zuivering en karakterisering van dit ATP-PFK eiwit maken
aannemelijk dat er een nieuw type ATP-PFK in A. methanolica aanwezig is. De
123
Samenvatting
regulering van de activiteit door PPi, ADP en fructose-2,6-bisfosfaat werd nog niet eerder
in bacteriën aangetoond. De aminozuurvolgorde van de N-terminale aminozuren en de
aminozuurvolgorde van een intern peptide fragment zijn niet gelijk aan die van bekende
PFK eiwitten. A. methanolica is de eerste bacterie waarin zowel een PPi-PFK als een
ATP-PFK eiwit is aangetoond. De fysiologische rol van ADP inhibitie zou kunnen zijn
dat bij een laag energie niveau in de cel (hoge ADP/ATP ratio), het ATP-PFK wordt
geremd zodat meer formaldehyde kan worden gedissimileerd. Hierdoor kan meer energie
worden verkregen nodig voor assimilatie van formaldehyde in celmateriaal. De rol van
fructose-2,6-bisfosfaat is nog onduidelijk. Momenteel is er nog geen hard bewijs voor de
aanwezigheid van fructose-2,6-bisfosfaat in A. methanolica of in andere bacteriën.
Uit het tweede bestudeerde organisme, de actinomyceet S. coelicolor A3(2), werd het
PFK eiwit gezuiverd en gekarakteriseerd. Dit enzym is afhankelijk van ATP en de
activiteit wordt geremd door fosfoenolpyruvaat. Het gen coderend voor het ATP-PFK
eiwit werd gekloneerd en geanalyseerd. De volgorde van de aminozuren heeft een zeer
grote overeenkomst met die van het PPi-PFK eiwit van A. methanolica. Het blijft echter
onduidelijk waarom dit enzym specifiek is voor ATP en geremd wordt door
fosfoenolpyruvaat terwijl de PPi-PFK van A. methanolica geen ATP gebruikt en niet
wordt geremd door fosfoenolpyruvaat. Deze grote verschillen in eigenschappen en de
kleine verschillen in de aminozuurvolgorde maken het mogelijk om de essentiele
verschillen die PPi en ATP specificiteit en PEP (on)gevoeligheid bepalen nader te
onderzoeken.
Uit dit onderzoek blijkt dat de glycolyse van S. coelicolor A3(2) wel degelijk wordt
gereguleerd (ATP-PFK) en dat de productie van secundaire metabolieten niet een simpel
gevolg is van overflow metabolisme. De bestudering van andere enzymen uit de glycolyse
van S. coelicolor A3(2) zal meer inzicht kunnen geven in de aanwezigheid van additionele
reguleringsstappen.
124
Sumário
125
sumário
As actinomicetas são bactérias gram-positivas, formando frequentemente esporos.
Estas bactérias são importantes pois produzem uma grande variedade de metabolitos
secundários entre os quais antibioticos. Ao contrário dos metabolitos primários, os
metabolitos secundarios são substâncias que não são necessárias para o crescimento do
microoganismo. De qualquer forma, os metabolitos secundários têm inumeras funções,
entre as quais são exemplos antibioticos, agentes anti-tumores e agentes bactericidas.
Uma grande percentagem dos antibioticos produzidos por microorganismos são do grupo
das actinomicetas.
Uma hipótese generalizada é de que a síntese destes metabolitos secundários é uma
consequência da falta de regulação dos caminhos metabólicos primários. Assim sendo,
a produção de metabolitos secundários seria uma consequência da acumulação de certos
metabolitos primários (tendo como exemplo o caso da produção do antibiotico
actinorhodina, em que o composto inícial são 7 unidades da molecula malonilCoA e 1
unidade de acetilCoA).
O objectivo deste projecto de doutoramento é o estudo da regulação do metabolismo
da glucose em duas actinomicetas, Amycolatopsis methanolica e Streptomyces coelicolor
A3(2). Este estudo foi fundamentalmente composto pela identificação e caracterização
das enzimas fosfofructocinase (PFK), fosfoglicerato mutase (PGM) e piruvato cinase
(PK).
A analise da glicólise na bactéria A. methanolica revelou novos aspectos. Em vez da
enzima ATP-PFK normalmente presente em bactérias, descobrimos uma outra enzima
que utiliza o pirofosfato como dador de fosfato (em vez do ATP). Esta nova enzima
(PPi-PFK) tem sido encontrada em plantas, bactérias anaerobias e bactérias extremófilas.
Geralmente em organismos em que a sua actividade é detectada, tambem se detectam
outras actividades enzimaticas em que o pirofosfato é o substrato; como é o caso da
fosfoenolpiruvato carboxifosforilase, piruvato dicinase. Também nestes organismos se
verifica uma baixa actividade de pirofosfatase (enzima que degrada PPi).
A comparação da sequência primária dos aminoácidos da enzima PPi-PFK da bactéria
A. methanolica com outras enzimas da mesma família (fosfofructocinases) demostrou
que esta enzima PPi-PFK se enquadra no tipo ATP-PFK. Como a percentagem de
aminoácidos da enzima PPi-PFK da A. methanolica em relação à ATP-PFK enzima da
E. coli é bastante elevada foi possivel construir um modelo tridimensional da PPi-PFK
proteína. Desta maneira, é possivel identificar quais os aminoácidos que em princípio
fazem parte da ligação do pirofosfato à enzima PPi-PFK.
A análise filogenética das proteínas desta familia veio demonstrar que a evolução
destas proteinas (PPi-PFK e ATP-PFK) foi divergente formando assim dois grupos
distintos. Assumindo que a proteína “mais antiga” seria também a mais simples,
encontramos nesta árvore filogenética as proteínas dos organismos Propionibacterium
freudenreichii e Entamoeba histolytica.
126
sumário
As outras duas enzimas da glicólise que foram estudadas nesta tese foram a piruvato
cinase e a fosfoglicerato mutase. A enzima piruvato cinase foi purificada e caracterizada.
Esta enzima apresenta características semelhantes a outras piruvato cinase de origem
bacteriana, como por exemplo, o controlo da actividade enzimática ser feito pelo Pi e
ATP. A caracterização da enzima fosfoglicerato mutase demostrou que, tal como no caso
da PGM de outra actinomiceta Streptomyces coelicolor A3(2), também esta actividade é
aumentada quando se adiciona o composto 2,3-bisfosfoglicerato. O gene que codifica
para a enzima PGM da Amycolatopsis methanolica, foi sequenciado. Para grande surpresa
a sequência de aminoácidos no N-terminal não é semelhante à sequência obtida da
proteína purificada, mas contudo a expressão deste gene resultou num aumento da
actividade enzimática em células de E. coli. Esta evidência bioquímica da existência de
duas isoenzimas PGM em A. methanolica é o primeiro exemplo até ao momento descrito
em bactérias.
Quando a A. methanolica é cultivada em metanol, foram detectadas actividades
enzimáticas de enzimas que são comuns à glicólise e ao caminho da ribulose monofosfato.
Essas actividades enzimáticas correspondem à fosfofructocinase, aldolase e triosefosfato
isomerase. No nosso caso, aquando do crescimento em metanol, os niveis enzimaticos
da triosefosfato isomerase e da aldolase sao superiores ou iguais aos niveis enzimáticos
aquando do crescimento em glucose. No caso da enzima PPi-PFK os niveis enzimaticos
em células cultivadas em metanol são muito baixos. Nestas condições fisiológicas
detectámos uma outra enzima que cataliza a mesma reacção: ATP-PFK.
A purificação desta enzima e a sua caracterização cinética demonstrou que esta
enzima constitui um novo tipo de PFK. Para isso a comparação de sequências de peptídeos
resultantes da digestão da proteína com tripsina, com outras sequências de proteinas do
mesmo tipo resultou numa total ausência de igualdade. A função fisiológica da inibição
da actividade enzimática pelo ADP pode levar a que quando o nível de energia celular
fôr baixo ([ADP][ATP]), esta enzima é inibida, e desta maneira o formaldeido é
dissimilado. Desta maneira há uma produção de energia antes da célula começar a fazer
a assimilação do formaldeido.
O outro organismo estudado nesta tese é a actinomiceta S. coelicolor A3(2). A
purificação e a caracterização da enzima ATP-PFK levou a concluir que esta enzima tem
características semelhantes às das enzimas alostéricas como por exemplo PFK1 da E.
coli. Os estudos seguintes, nomeadamente a clonagem do gene da PFK, sequência e a
análise filogenética demonstraram que esta enzima é muito semelhante à enzima PPi-PFK
da A. methanolica. A análise detalhada dos aminoácidos responsáveis pelo ligação do
substrato ATP da enzima PFK da E. coli e a comparação com os aminoácidos
correspondentes nas sequencias das enzimas PPi-PFK da A. methanolica e ATP-PFK da
S. coelicolor A3(2) são intrigantes, conduzindo assim a necessidade de novas
experiências.
127
sumário
Os estudos apresentados nesta tese confirmam que a glicólise nestas duas
actinomicetas é regulada. Para nossa grande surpresa a actinomiceta A. methanolica
contêm uma enzima (PPi-PFK) que é tipica de organismos que vivem em condições
anaeróbicas. A caracterização desta enzima permitiu reconhecer um elevado grau de
parecença com a enzima ATP-PFK da E. coli. Estudos envolvendo um modelo estrutural
desta enzima permitiu criar ideias sobre a especificidade desta enzima para o substrato
PPi e não para o ATP.
A presença de isoenzimas na glicólise na A. methanolica permitiu confirmar uma
hipótese anterior que sugeria que quando este organismo utiliza o caminho da ribulose
monofosfato, determinadas enzimas são induzidas.
128